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Actualización Profesional en Manejo de Recursos Naturales, Agricultura Sostenible y Pobreza Rural Introducción a la Biotecnología Vegetal William M. Roca, Ph.D. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) Hernando Ramírez, M.Sc. Universidad Nacional de Colombia Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc. CEDAF Octubre, 2000 Introducción a la Biotecnología CEDAF William M. Roca / Hernando Ramírez © Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc. (CEDAF), Santo Domingo, República Dominicana. Octubre del 2000. Derechos exclusivos de edición en castellano reservados para todo el mundo: CEDAF. Calle José Amado Soler No. 50, Ensanche Paraíso. Apartado Postal 567-2. Santo Domingo, República Dominicana. Teléfono (809) 544-0616 / Fax: (809) 544-4727 Sitio Web: http://www.cedaf.org.do Correo Electrónico: cedaf@cedaf.org.do El material consignado en estas páginas se puede reproducir por cualquier medio, siempre y cuando no se altere su contenido. El CEDAF agradece a los usuarios incluir el crédito institucional correspondiente en los documentos y eventos en los que se utilice. Las ideas y planteamientos contenidos en los artículos firmados, o en los artículos institucionales con específica mención de autores, son propias de ellos y no representan necesariamente el criterio del CEDAF. Hecho el depósito que prevé la ley 418. Impreso en la República Dominicana. Cita correcta: William M. Roca, Hernando Ramírez. 2000. Introducción a la Biotecnología Vegetal. Coordinador de la Producción de Documentos Originales: Vicente Zapata S., Ed. D., Cali , Colombia. 174p. Palabras Claves: 1. Biotecnología 2.Cultivo de Tejido 3. Marcadores Moleculares 4. Genética de Plantas 5. Perspectivas Futuras. ISBN: 99934-821-4-5 Octubre del 2000 Santo Domingo, República Dominicana CEDAF Introducción a la Biotecnología William M. Roca / Hernando Ramírez Tabla de Contenido Presentación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .i Agradecimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .ii Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .iii Autoevaluación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .v Autoevaluación - Información de retorno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .vi Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .vii Estructura General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .viii Originales para transparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .ix Sección 1Una Introducción a la Biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1 ¿Qué es la Biotecnología?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2 Breve Historia de la Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.3 La Nueva Biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Originales para Transparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 Sección 2Cultivo de Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo De Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 Originales para Transparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35 Introducción a la Biotecnología CEDAF William M. Roca / Hernando Ramírez Sección 3Tecnología del DNA Recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43 Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genética?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genética. . . . . . . . . . . . . 47 3.3 Aislamiento de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52 3.4 Secuenciación del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54 3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58 Originales para Transparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Sección 4Marcadores Moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69 Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1 El genoma y la variabilidad genética. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 4.2 Los marcadores moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74 4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75 4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85 CEDAF Introducción a la Biotecnología William M. Roca / Hernando Ramírez Sección 5 Transformación Genética de Plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .94 5.1 ¿Porqué transformar plantas?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .94 5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas. . . . . . . . . . . . . . . .955.3 Transformación genética de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens. . . . . . . . 98 5.4 Transformación por introducción directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 5.5 Logros de la ingeniería genética de plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101 5.6 Ejercicio 5.1 Transformación genética de plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .107 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Originales para transparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Sección 6 Perspectivas Futuras de la Biotecnología Vegetal. . . . . . . . . . . . . . . . . . .117 Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 6.1 Relaciones institucionales y la biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .121 6.2 Costo - beneficio de la biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123 6.3 Propiedad intelectual y comercialización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .124 6.4 Producción de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125 6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnología Vegetal. . . . . . . . . . . . . . . .125 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .126 Originales para trasparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .127 Introducción a la Biotecnología CEDAF William M. Roca / Hernando Ramírez Anexos Anexo 1. Evaluación final de conocimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135 Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno. . . . . . . . . . . . . 138 Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .142 Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .144 Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145 Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana. . . . . . . . . . . . . . . . .146 Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149 Presentación Numerosos diagnósticos aseveran un grave deterioro de la base de recursos naturales de la República Do- minicana. Estos estudios indican que la cobertura forestal, de cuestionable calidad y uniformidad, no pasa del 12 por ciento y que una parte importante de los 2.8millones de hectáreas con aptitud forestal en el país han sido y están siendo utilizadas inadecuadamente. Al igual que en la mayoría de los países tropicales, el mal manejo de los suelos y de los sistemas de cultivo ha resultado en una acentuada perdida de su fertili- dad, estructura y materia orgánica; así como en erosión y contaminación. El resultado ha sido una dismi- nución de la productividad agrícola y un incremento significativo en los costos de producción. Se han logrado avances significativos en las regiones tropicales en el desarrollo de tecnologías adecuadas para mejorar la productividad agropecuaria en sistemas sostenibles. Sin embargo, estos resultados raras veces llegan al campo, debido principalmente a deficiencias en el entendimiento de las relaciones entre los componentes de los sistemas agrícolas tropicales por aquellos que dirigen el sector, incluyendo profe- sionales agropecuarios y extensionistas. En el orden institucional, se observan organismos del sector pú- blico débiles y con duplicidad de funciones, con escasos recursos para atender problemas que sobrepasan sus capacidades. Más aún, faltan liderazgos institucionales que coordinen la formulación e implementa- ción de las políticas. Quizás, el mayor de todos los problemas que enfrenta la sociedad dominicana es la falta de entendimiento de la profundidad y complejidad de problemas relacionados con el deterioro de los recursos naturales del país. Ese entendimiento podría variar si científicos, administradores, profesionales y líderes tuvieran la oportunidad de discutir, informar y persuadir a la comunidad en general acerca de la necesidad de enfren- tar los problemas ambientales en general y en particular aquellos relacionados a la sostenibilidad de los recursos naturales y la agricultura. Brindar esa oportunidad es precisamente lo que pretende el Proyecto Ágora. El Proyecto Ágora es, en esencia, un cambio del enfoque tradicional de un proyecto piloto para promover cambios sistemáticos. El mismo propone un atajo: agricultores claves, líderes y tomadores de decisiones en los sistemas alimentario y agropecuario, expertos, políticos, periodistas y ONG son convocados y apo- yados técnicamente, para que lleguen a un entendimiento de consenso en temas claves relacionados al manejo de los recursos naturales, la sostenibilidad de la agricultura y el combate de la pobreza rural. Basa- do en ese entendimiento, ellos guiarán o dirigirán sus propias instituciones o negocios para que sean más compromisarios a las necesidades de un mejoramiento sostenible de la calidad de vida de los pobladores rurales. El componente Actualización Profesional de Ágora busca dotar al profesional dominicano de co- nocimientos actualizados sobre aspectos conceptuales de desarrollo reciente y sobre tecnologías de punta de uso potencial en el país. Por esta razón se han elaborado los documentos de capacitación que ponemos a disposición del país. Altagracia Rivera de Castillo Directora Ejecutiva del CEDAF William M. Roca / Hernando Ramírez i CEDAF Introducción a la Biotecnología Agradecimientos La estrategia para la elaboración de los documentos de la Serie Proyecto Ágora ha sido muy interesante y ardua. Después de muchos meses identificando autores dominicanos para la elaboración de los documen- tos, nos dimos cuenta que no disponían de tiempo para escribirlos. De ahí vino la idea de Vicente Zapata, Gerente de La Organización que Aprende de Colombia, de contratar especialistas colombianos para ela- borar los documentos y a expertos dominicanos que colaborarían con éstos en el suministro de informa- ciones y datos dominicanos así como en la revisión de los contenidos. Por eso debemos agradecer al Dr. Vicente Zapata por la idea, por diseñar la metodología para la elaboración de los documentos y por la co- ordinación general de los trabajos. De la misma manera debemos reconocer y agradecer el esfuerzo de los autores William M. Roca, del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), y Hernando Ra- mírez, de la Universidad Nacional de Colombia. En diferentes momentos varios especialistas dominicanos aportaron sus ideas y recomendaciones sobre el documento. Entre ellos debemos agradecer a Rafael Ortiz Quezada de la Universidad Nacional Pedro Henríquez Ureña (UNPHU), a Rafael Pérez Duvergé del CEDAF, y a Bienvenido Cabral del Instituto Su- perior de Agricultura (ISA) por sus aportes iniciales y sugerencias en la estructura del documento. Agra- decemos además a Bernarda Castillo, del Centro de Biotecnología Vegetal de la Secretaría de Estado de Agricultura y Expedito Diloné, del Jardín Botánico Nacional, por su participación y sugerencias en las etapas avanzadas de edición. Todo el personal del CEDAF ha participado de alguna forma en la elaboración, revisión, digitación e im- presión de los documentos que ha originado el Proyecto Ágora. A todos ellos muchas gracias por su dedi- cación y cooperación. Finalmente, queremos agradecer a todas las personas, incluyendo a profesores y técnicos que ofrecieron sus sugerencias sobre los documentos durante los talleresy reuniones que para esos fines se celebraron durante los casi dos años de trabajo que duró el proceso completo de elaboración y edición de los docu- mentos. Gracias a todos. Teófilo Suriel E. Coordinador Proyecto Ágora ii William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Introducción La agricultura moderna se basa en la utilización de variedades mejoradas (generalmente híbridos) en combinación con paquetes tecnológicos de producción agrícola, como fertilización, protección de plantas y técnicas de riego y cosecha. Esta alta tecnología agrícola ha tenido gran éxito, especialmente en los paí- ses desarrollados. Sin embargo, aún se presentan altas pérdidas en los cultivos, debido principalmente al ataque de enfermedades y plagas y por estreses abióticos, como salinidad, acidez y toxicidad por metales pesados. Estos problemas son la principal causa del aumento en el uso de los agroquímicos, lo cual ha contribuido al incremento no sólo del costo de la producción agrícola sino también al deterioro del medio ambiente. Mientras tanto, aumenta la demanda de alimentos, especialmente en los países en desarrollo, que tienen una alta tasa de crecimiento poblacional, por lo cual se requiere con urgencia incrementar la productivi- dad agrícola. Para lograr este objetivo se precisa la obtención de variedades mejoradas con menor requerimiento de in- sumos, reduciendo significativamente los costos de producción y el daño ambiental. En aproximadamente 25 años los avances en biología molecular y celular se han traducido en una tecno- logía emergente (la biotecnología) que encuentra aplicación en diversos sectores de la actividad humana. La salud humana, la agroalimentación, la producción de energía y la protección del medio ambiente son los sectoresmás importantes que utilizan la biotecnología. Hasta el presente la biotecnología aplicada a la salud humana ha tenido el desarrollo más rápido. Unos cuarenta medicamentos y vacunas se han aproba- do y más de cien están en fase avanzada de estudio y/o pendientes para su aprobación. Gracias a la bio- tecnología, disponemos o están a punto de comercializarse productos terapéuticos para tratar deficiencias de la sangre, enfermedades autoinmunes, cardiovasculares, inflamatorias, algunos tipos de cáncer, o para combatir agentes infecciosos como el virus de la hepatitis B, el HIV, o el virus del papiloma. En el ámbito de la agricultura, la producción de semillas resistentes a plagas, a herbicidas, o que mejoran la calidad del fruto ya son realidad. Las ventajas de estas nuevas variedades son evidentes para los secto- res productivos, incluyendo, en algunos casos, al consumidor. Será preciso que los consumidores tengan la información necesaria para poder elegir basados en la cali- dad y/o el precio y la seguridad de los productos. El desarrollo de la biotecnología está en sus inicios y el crecimiento previsto para la primera década del si- glo XXI significará duplicar el valor de sus ventas cada cinco años. Se prevé un aumento significativo de las aplicaciones en la agricultura, ya que se estima un crecimiento anual cercano al 20%. Es evidente que si no es posible aumentar el área de la tierra cultivable, y la población de los países en desarrollo crece al ritmo actual, la agrobiotecnología se constituye en una solución para producir los alimentos que necesi- tará la humanidad en el futuro próximo. William M. Roca / Hernando Ramírez iii CEDAF Introducción a la Biotecnología La biotecnología vegetal comprende una serie de técnicas que incluyen: a. Las técnicas de cultivo de células y tejidos in vitro, muy utilizadas para la clonación de plantas y la transformación genética; b. Las técnicas de DNA recombinante, que permiten hacer las construcciones genéticas para la transformación de plantas; c. Los marcadores moleculares que permiten "marcar" los genes de interés; para la construcción de mapas genéticos y para estudios de caracterización y filogenéticos. El objetivo de este módulo, Introducción a la Biotecnología Vegetal, es presentar a los participantes, en forma clara y amena los principios básicos de la Biotecnología Vegetal y su aplicación en la obtención de materiales mejorados. Este módulo ha sido concebido de tal forma que el participante, al finalizar su lectura, no sólo tendrá un concepto actualizado de la biotecnología vegetal, sino que tendrá nuevos elementos de juicio para ser uti- lizados en el desarrollo agrícola. iv William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Autoevaluación 1. Elabore una definición de lo que usted considera es biotecnología. _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 2. ¿Por qué cree usted que la cerveza, el vino el queso y el pan son productos biotecnológicos? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 3. Defina qué es el cultivo de tejidos vegetales _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 4. ¿Qué aplicación práctica le vería usted a esta técnica? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 5. ¿Qué conoce usted de la ingeniería genética? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 6. ¿Qué es un gen? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 7. ¿Qué es un genoma? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 8. ¿Qué entiende por marcador molecular? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 9. ¿Qué son plantas transgénicas? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 10. ¿Usted cree que es posible introducir un gen de una bacteria a una planta? Explique. _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 11. ¿Qué entiende usted por bioseguridad en biotecnología? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ 12. ¿Usted considera que el consumo de cultivos transgénicos representan un peligro para la salud humana? _________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ William M. Roca / Hernando Ramírez v CEDAF Introducción a la Biotecnología Autoevaluación - Información de Retorno Respuestas Para la pregunta 1 Biotecnología es la aplicación de principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de materiales por medio de agentes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes biológicos se refieren principalmen- te a microorganismos,celulares de animales y plantas, enzimas, material genético aislado y clonado. Para la pregunta 2 La cerveza, porque se obtiene por un proceso de fermentación. El queso: es un producto obtenido por un proceso enzimático. El vino: Se obtiene por un proceso de fermentación. El pan : en su elaboración interviene un proceso de fermentación. Para la pregunta 3 El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que consiste en aislar una porción de una planta (tejido, órgano o célula), lla- mado explante, para cultivarlo en unmedio nutritivo en condiciones físicas y químicas artificiales, para regenerar una plan- ta completa. Para la pregunta 4 El cultivo de tejidos vegetales puede ser útil para la recuperación de cultivos que estén en vía de extinción, o para la propa- gación masiva de plantas ornamentales, como el caso de rosas, orquídeas, etc. Para la pregunta 5 La Ingeniería genética es un conjunto de técnicas que permiten la manipulación del DNA y del RNA. Gracias a la Ingenie- ría genética se pueden aislar y modificar genes que luego son utilizados para producir animales y plantas transgénicas. Para la pregunta 6 Un gen es un pequeño segmento de DNA que contiene información para una característica genética. Unidad básica de la herencia. Para la pregunta 7 Genoma es el contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por el contenido genético del DNA mitocondrial, del cloroplasto y del DNA nuclear. Para la pregunta 8 Unmarcador molecular es un segmento específico de DNA que está ligado a una característica genética y se utiliza para el monitoreo de esta característica en un programa de mejoramiento. Para la pregunta 9 Las plantas transgénicas son plantas a las que se les ha introducido un gen "extraño", el cual les confiere ciertas ventajas so- bre las que no lo tienen, como por ejemplo, resistencia a una enfermedad, plaga, herbicida, o el aumento en la producción de un producto de uso comercial. Para la pregunta 10 Sí es posible. Algunos genes que confieren resistencia al ataque de insectos en las plantas son aislados de bacterias. El caso más conocido es el de los genes de Bt, que confieren resistencia a algunos insectos lepidópteros. Para la pregunta 11 La Bioseguridad consiste de políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnología del DNA recombinante en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad. Para la pregunta 12 No. En una planta transgénica sólo se introduce uno o pocos genes cuyos productos han sido cuidadosamente evaluados antes de ser introducidos a las plantas para descartar cualquier riesgo en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad. Mientras que en el mejoramiento tradicional se introducen muchos genes, de los que se desconocen sus productos y su po- sible riesgo para la salud, medio ambiente y biodiversidad. vi William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Objet ivos • Presentar a los participantes los principios básicos de la biotecnología vegetal en la obtención de materiales mejorados. Sección 1 • Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general. • Conocer algunas etapas de su desarrollo. • Diferenciar algunos tipos de biotecnologías. Sección 2 • Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales. • Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas. Sección 3 • Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante. • Describir las herramientas más importantes de esta tecnología. • Conocer algunas de sus aplicaciones. Sección 4 • Entender los principios básicos de los marcadores moleculares. • Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal. Sección 5 • Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas. • Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas. • Conocer algunas aplicaciones de esta tecnología. Sección 6 • Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes. • Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción de cultivos transgénicos al campo. • Entender por qué los cultivos transgénicos son seguros. William M. Roca / Hernando Ramírez vii CEDAF Introducción a la Biotecnología Estructura general Explicación Este flujograma muestra la interacción de las diferentes metodologías de la Biotecnología Vegetal (mar- cadores moleculares, ingeniería genética o DNA recombinante, la técnica de cultivo de tejidos y la trans- formación genética de plantas), que en forma lógica permiten la obtención de un cultivo transgénico, desde la caracterización del germoplasma para la búsqueda de genes útiles, hasta la introducción de estos genes a los cultivos, que luego son sometidos a todo un proceso de valuación antes de ser comercializa- dos. viii William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Marcadores y Mapas Moleculares Ingeniería Genética Marcadores y Mapas Molecular Cultivo de Tejidos y Trans formación Genética Cultivo de Tejidos • Marcadores Moleculares • Cruzamientos • Caracterización de la biodivers idad • Identificación de genes útiles • Mapeo de caracte res comple jos (QTLs) Clonación y modificación de genes Introducción y expres ión de genes Plantas Transgénicas Mejoramiento Multiplicac ión Ens ayos de Evaluac ión Originales para transparencias William M. Roca / Hernando Ramírez ix CEDAF Introducción a la Biotecnología x W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Marcadores y Mapas Moleculares Ingeniería Genética Marcadores y Mapas Molecular Cultivo de Tejidos y Transformación Genética Cultivo de Tejidos · Marcadores Moleculares · Cruzamientos · Caracterización de la biodiversidad · Identificación de genes útiles · Mapeo de caracteres complejos (QTLs) Clonación y modificación de genes Introducción y expresión de genes Plantas Transgénicas Mejoramiento Multiplicación Ensayos de Evaluación W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z xi C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía Presentar a los participantes los principios básicos de la biotecnología vegetal en la obtención de materiales mejorados. Objetivo General xii W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Secciones - Una introducción a la biotecnología - Cultivos de tejidos vegetales - Tecnología del DNA recombinante - Marcadores moleculares - Transformación genética de plantas - Perspectivas futuras de la Biotecnología vegetal Una Introducción a la Biotecnología William M. Roca / Hernando Ramírez 1 CEDAF Introducción a la Biotecnología Sección 1 Sección 1 . Una Introducción a la Biotecnología 2 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla de Contenido Estructura de la Sección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 1.1 ¿Qué es la Biotecnología?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 1.2 Breve Historia de la Biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 1.3 La Nueva Biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.4 Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Estructura de la Sección Objetivos • Conocer los conceptos básicos de la biotecnología en general. • Conocer algunas etapas de su desarrollo. • Diferenciaralgunos tipos de biotecnologías. Preguntas Orientadoras 1. ¿Algún participante nos puede explicar que es biotecnología? 2. ¿Algún participante puede dar ejemplos de productos biotecnológicos? 3 ¿Sabían ustedes que el queso, el pan la cerveza son productos biotecnológicos? William M. Roca / Hernando Ramírez 3 CEDAF Introducción a la Biotecnología Primera Generac ión Fermentac ión • Bebidas • Alimentos • Combus tibles Práctica empírica Poco conocimiento c ientífico Segunda Generac ión Fermentac ión Indus trial • Fármacos • Alimentos • Proces amiento de des echos Conocimiento c ientífico y de ingeniería Tercera Generac ión Técnicas de Fermentación y bioprocesos Cultivo in vitro de células y te jidos DNA recombinante y transformación genética BIOTECNOLOGÍA 1.1 ¿Qué es la Biotecnología? La biotecnología se puede definir como: "la aplica- ción de principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de materiales por medio de agen- tes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes biológicos se refie- ren principalmente a microorganismos, células de animales y plantas, enzimas, y material genético aislado y clonado" (Sasson, 1989). El concepto de biotecnología fue ampliado a partir de 1970, cuando se inician las tecnologías que per- miten la manipulación de la molécula del DNA, dando origen a la ingeniería genética y con ella nace la "nueva biotecnología". La biotecnología comprende un conjunto de técni- cas aplicables a diversas actividades de la socie- dad, cuya base fundamental es multidisciplinaria, con disciplinas básicas como la biología celular, la biología molecular, la bioquímica, la genética, la microbiología, la inmunología, la ingeniería química y la ingeniería de procesos. 1.2 Breve Histor ia de la Biotecnología Históricamente el desarrollo de la Biotecnología puede ser dividido en tres generaciones o etapas: La biotecnología de primera generación se basó en la fermentación como proceso básico para la pro- ducción de bebidas, alimentos y combustibles. Esta práctica era esencialmente empírica, se hacía en pequeña escala, y estaba caracterizada por el mínimo conocimiento científico y de ingeniería. La biotecnología de segunda generación se carac- terizó por la utilización de los conocimientos cien- tíficos y de ingeniería para la obtención de procesos a escala industrial. Estos procesos esta- ban basados en la aplicación integrada de la micro- biología (usando procesos de mutación y de selección), bioquímica e ingeniería química. Esta segunda generación incluye: la utilización de fer- mentaciones (bioconversiones y biocatálisis) para la producción de fármacos, combustibles, alimen- tos y procesamiento de desechos. En esta segunda fase también se incluye el desarrollo de algunas técnicas recientes, como las de inmovilización de enzimas y las de cultivo de tejidos vegetales y animales. La biotecnología de tercera generación, también denominada "Nueva Biotecnología" surge a co- mienzos de 1970 y se inicia con el descubrimiento de la tecnología del DNA recombinante. Esta ge- neración se basa en la biología molecular, la cual tuvo un acelerado desarrollo después del descubri- miento de la estructura del DNA en 1953. Este evento y el posterior descubrimiento de las enzi- mas de restricción dieron origen a la ingeniería ge- nética y con esta nace la nueva biotecnología. Estas nuevas tecnologías dieron origen a empresas biotecnológicas, que explotan las técnicas de inge- niería genética para "cortar" y "confeccionar" los genes que son colocados en microorganismos, como bacterias o levaduras, para que "fabriquen por encargo" productos químicos y farmacéuticos de interés. 1.3 La Nueva Biotecnología Los inicios de la biotecnología se caracterizan por un lento progreso de los conocimientos. La rápida expansión llegó con el descubrimiento de la es- tructura del DNA. La comercialización de mu- chos de estos descubrimientos ha abierto un mercado de gran envergadura, que incluye no sólo la medicina y la genética, sino también, la indus- tria alimentaria, la agrícola, la zootecnia y espe- cialmente la farmacéutica, con un aumento de la propiedad intelectual. 4 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Los eventos más importantes del desarrollo de la biotecnología incluye: � 1944 Avery, McCarty y McLeod demuestran que el DNA puede transfer i r una característ ica he- redi tar ia de una cepa bacter iana a otra. � 1948 Beadle y Tatun establecen que el papel de los genes es especi f icar la información necesar ia para la producción de proteínas. � 1951 Wilkins y Frankl in obt ienen las pr imeras imá- genes de un cr istal de DNA. � 1952 Hershey y Chase conf i rman que el DNA es el mater ia l genét ico. � 1953 Watson y Crick establecen la estructura de la doble hél ice, proponiendo un modelo tr id i - mencional en el que las cuatro bases del DNA se acoplan entre sí , s iguiendo reglas muy pre- cisas. � 1957 Kornberg ident i f ica la DNA pol imerasa, enzi- ma que permite la dupl icación de la doble hé- l ice del DNA. � 1958 Steward logra la regeneración de una planta completa a part i r de células somáticas del f loema de la zanahor ia, mediante la embrio- génesis somática. � 1961 Jacob y Monod proponen un modelo de regu- lación de los genes basado en la act iv idad inhibidora de ciertas proteínas. � 1966 Khorana y Nirenberg desci f ran el lenguaje del código genét ico: la lectura del DNA se produce en grupos de tres bases (tr ip letas). � 1970 Khorana sintet iza de forma química el pr imer gen. � 1970 Smith y Wilcox descubren las enzimas de res- tr icción. � 1973 -1974 Berg produce la pr imera molécula de DNA re- combinante (un plásmido) mediante el corte y poster ior unión de dos fragmentos dist intos de DNA. � 1975 Sanger, Maxam y Gilbert desarrol lan técnicas para la secuenciación del DNA. � 1975 En Asi lomar, Cal i fornia, se real iza la pr ime- ra conferencia sobre la biosegur idad en el uso del DNA recombinante y los organismos ge- nét icamente manipulados. � 1977 Se descubre que no todo el DNA de un gen sirve para la síntesis de una proteína, la cual ocurre sólo en los "exones", es decir , las par- tes que son transcr i tas en el RNA mensajero. Los " intrones" son el iminados del RNA. � 1978 La compañía Genetech (EE. UU.) ut i l iza bac- ter ias para la producción de insul ina humana recombinate, que se comercial iza cuatro años después. 1982 Palmiter y Brinster crean el pr imer animal transgénico, introduciendo la hormona de crecimiento de rata en un ratón. � 1982 La compañía Calgene (EE.UU.) clona el gen responsable de la resistencia a un herbic ida. � 1982 VanMontagu y Schel l producen la pr imera planta transgénica (tabaco) usando el plásmi- do Ti del Agrobacter ium tumefaciens. � 1983 Mull is pone a punto la técnica de la reacción en cadena de la pol imerasa (PCR), que permi- te ampl i f icar (mult ip l icar) secuencias de DNA. William M. Roca / Hernando Ramírez 5 CEDAF Introducción a la Biotecnología � 1984 Sanford logra transformar tej idos de plantas mediante el bombardeo de part ículas (biol ís- t ica). � 1985 Jeffreys descubre que el DNA de cada indiv i- duo produce fragmentos característ icos al ser tratados con enzimas de restr icción. Por lo tanto sirven como "huel las dact i lares" mo- leculares. � 1985 Se aprueba el patentamiento de plantas trans- génicas en EE. UU. � 1986 Tanksley crea los pr imeros mapas genét icos moleculares usando RFLPs. � 1987 La compañía Cetus Corporat ion (EE. UU.) automat iza la técnica del PCR. � 1988 Se patenta of ic ia lmente en EE.UU. el pr imer animal transgénico, el "oncoratón". � 1988 Se inic ia el proyecto del "Genoma Humano", con el f in de ident i f icar todos los genes que conforman el DNA del hombre. � 1990 Wil l iams desarrol la la técnica de RAPD para la marcación y mapeo de genes. � 1991 Se anal izan los componentes genét icos (QTLs) responsables de característ icas com- plejasusando marcadores moleculares. � 1993 Se desarrol la la biotecnología de biorreacto- res para el cul t ivo de células y tej idos vegeta- les de forma masiva. � 1994 La compañía Calgene recibe la aprobación para comercial izar tomates transgénicos de maduración retardada. � 1995 Se desarrol lan los pr imeros secuenciadores automat izados de DNA. � 1996 Nace la oveja "Dol ly" , la pr imera oveja clo- nada: el núcleo de una célula somática de una oveja adul ta donante fue introducido en un óvulo enucleado. � 1996 Se siembran los pr imeros cul t ivos comercia- les de plantas transgénicas (EE.UU.): 3 mi- l lones de hectáreas. � 1998 La siembra de cul t ivos transgénicos comer- ciales cubren 30 mil lones de hectáreas, pr in- c ipalmente en EE.UU., Canadá, Argent ina, China y Mexico. � 1998 Se fabr ican sistemas automat izados (robots) para la extracción, distr ibucción y plaqueo de muestras de DNA y otras act iv idades de biolo- gía molecular. � 1998 Se producen los l lamados "chips" de DNA: matr ices diminutas de plást ico para f i jar gran numero de muestras de DNA para el tamizado y/o lectura masiva de expresión de genes. � 1999 Se inic ia la "nanobiotecnología" (miniatur i- zación del anál is is, detección y separación de mater ia l genét ico de manera masiva). � 1999 Se da impulso a la bioinformát ica: la obten- ción , acumulación, anál is is, comparación e ident i f icación de datos moleculares / genét i- cos que son ut i l izados para la ident i f icación de nuevas secuencias y genes. 6 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Un aspecto importante de la nueva biotecnología es que es extensiva en el uso del conocimiento científico. En el período anterior a Pasteur, la bio- tecnología se limitaba a la aplicación de una expe- riencia práctica que se transmitía de generación en generación. Con Pasteur, el conocimiento científi- co de las características de los microorganismos comienza a orientar su utilización práctica, pero las aplicaciones industriales se mantienen fundamen- talmente como artesanales, con la excepción de unas pocas áreas en la industria química y farma- céutica (como los antibióticos), en las cuales se ini- cia la actividad de investigación y desarrollo en el seno de la corporación transnacional. En todos es- tos casos, la innovación biotecnológica surgió en el sector productivo; en cambio, los desarrollos de la nueva biotecnología se originan en los centros de investigación, generalmente localizados en el seno de las universidades. Las nuevas biotecnologías pueden agruparse en tres categorías básicas: 1. Técnicas para el cultivo in vitro de células y tejidos, incluyendo el cultivo de microorganismos. 2. Técnicas de fermentación y bioprocesos, incluyendo técnicas de inmovilización de enzimas. 3. Técnicas para la identificación, mapeo, clonación, manipulación y transferencia de genes. Aún cuando los tres grupos se complementan en- tre sí, existe una diferencia fundamental entre los dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el conocimiento de las características y compor- tamiento de las células y microorganismos y en el uso deliberado de estas características (de cada or- ganismo en particular), para el logro de objetivos específicos en materia de nuevos productos y pro- cesos. Mientras que el tercer grupo se caracteriza por su potencialidad para manipular la genética y las características estructurales y funcionales de los organismos y de la aplicación práctica de esta capacidad para superar ciertos límites naturales para el desarrollo de nuevos productos o procesos. Entre los eventos claves de la nueva biotecnología que permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal se incluyen: a. La regeneración de plantas completas a partir de par- tes de plantas (explante), cultivadasin vitro; b. Técnicas para identificar y mapear genes y para de- tectar diferencias entre individuos comparando di- rectamente sus genomas ; c. Técnicas para aislar, modificar y clonar genes; d. Técnicas que permiten la transferencia de estos ge- nes a plantas. Estas metodologías serán explicadas más adelante. Las aplicaciones a corto plazo de la nueva biotec- nología en la agricultura incluyen: el manejo y conservación de recursos genéticos; la propaga- ción masiva de plantas; los métodos para detec- ción de plagas y enfermedades y la construcción de mapas moleculares para agilizar los programas de mejoramiento tanto animal como vegetal; la in- troducción y expresión de genes para obtener re- sistencia a insectos; patógenos, herbicidas; o para el mejoramiento de la calidad de proteínas, car- bohidratos y aceites o grasas. A largo plazo: la manipulación de caracteres com- plejos, lo cual requiere de un previo entendimiento de los mecanismos bioquímicos y genéticos de las características poligénicas de interés. Por esta razón, las actuales investigaciones en bio- tecnología vegetal están encaminadas al aisla- miento y caracterización de genes de importancia económica, sobre todo de secuencias reguladoras, tales como: floración, fotosíntesis, fijación bioló- gica de nitrógeno, etc. Mientras tanto, las aplica- ciones más importantes incluyen: a. El uso de mapas genéticos y marcadores molecula- res para la identificación de genes de resistencia a plagas y enfermedades; William M. Roca / Hernando Ramírez 7 CEDAF Introducción a la Biotecnología b. Transferencia de caracteres de interés de especies silvestres a cultivadas mediante cruces interespecí- ficos o distantes; c. Producción de plantas transgénicas usando genes simples de resistencia a virus, insectos y herbicidas, de calidad de proteína de semillas, contenido de al- midón y para retardar la maduración del fruto; d. Utilización de marcadores moleculares para el estu- dio de la diversidad genética de plantas, animales y microorganismos. La Tabla 1.1 presenta algunas aplicaciones de la nueva biotecnología en la produc- ción vegetal. Un paso crucial para la aplicación de la biotecno- logía en la solución de problemas de la agricultura es la identificación de problemas recalcitrantes a una solución por métodos convencionales, segui- do de un análisis de costo/beneficio de la aplica- ción biotecnológica. La biotecnología tradicional y la nueva biotecnolo- gía ofrecen también una amplia aplicación no sólo en la industria alimenticia y farmacéutica, sino también en muchos procesos industriales (Tabla 1.2). Tabla 1.1 Aplicaciones de la nueva biotecnología. Fuente: Roca, W. 1986. 1. En la Producción Vegetal: • Recursos genéticos Conservación Caracterización Utilización • Mejoramiento genético Cruzamientos distantes Haploidía Mapas y marcadores moleculares Transformación genética • Control biológico Biopesticidas • Biofertilizantes • Agroindustria Propagación masiva Control de calidad Valor agregado 2. En el Manejo (Reciclaje) de Productos Agrícolas • Bioconversión 3. En la Protección del Ambiente (Aguas y Suelos) • Biorremediación Tabla 1.2 Aplicaciones de la biotecnología en el sector industrial. Fuente: Bull et al. 1982. Química Producción de: • Orgánica • Etanol, Acetona, Butanol, Acidos orgánicos • Enzimas • Perfumes • Polímeros (principalmente polisacáridos) • Inorgánica • Bioacumulación y Lixiviación Farmacéutica Producción de: • AntibióticosAgentes para diagnóstico (enzimas, anticuerpos) • Inhibidores de enzimas • Esteroides Vacunas Energía Producción de: • Etanol (gasohol) • Metanol (biogas) Alimentos Producción de : • Lácteos, productos de pescado y de carne • Bebidas (alcohólicas, té y café) • Levadura para panadería • Aditivos para alimentos (antioxidantes, colorantes, saborizantes, estabilizadores) • Producción de champiñones • Aminoácidos, vitaminas • Producción de almidón • Glucosa y jarabe de alta fructosa • Modificaciones funcionales de proteínas, Pectinas Remoción de toxinas. Agricultura Producción de: • Alimentos para animales • Vacunas para animales • Ensilaje y procesos de descomposición • Pesticidas microbianos• Rhizobium y otros inoculantes bacteriológicos para la fijación de nitrógeno • Inoculantes de micorrizas Servicios Industriales • Purificación de agua • Tratamiento de afluentes • Manejo de desechos • Recuperación de aceites 8 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 1.4 Ejercic io 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal Objetivos • Elaborar el concepto de biotecnología y sus aplicaciones. • Diferenciar productos biotecnológicos de uso cotidiano. Orientaciones para el Instructor Con el siguiente ejercicio se busca reafirmar el concepto de Biotecnología, a través de la identifi- cación y clasificación de productos elaborados me- diante procesos biotecnológicos. La idea es crear un escenario donde los participan- tes puedan tener contacto directo con productos de uso cotidiano, muchos de los cuales obtenidos por procesos biotecnológicos, para motivar una discu- sión sobre su obtención y las aplicaciones de algu- nos productos biotecnológicos, muchos de los cuales hacen parte de nuestra vida cotidiana. Para la realización de este ejercicio se recomienda que el Instructor lea atentamente las siguientes ins- trucciones: • Suministrar información sobre los objetivos del ejercicio. • Ubique en un salón cuatro mesas grandes. En cada una de ellas colocar los productos mencio- nados en la lista de recursos. • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique cada grupo en cada una de las mesas (con los productos). • En cada grupo de trabajo, los participantes de- ben separar aquellos productos que ellos consi- deren son de origen biotecnológico. • Hacer un listado de los productos selecciona- dos, argumentando por que consideran que son productos biotecnológicos en cada selección. • Luego, solicite a los participantes que clasifi- quen los productos biotecnológicos selecciona- dos en productos biotecnológicos de primera, se- gunda y tercera generación. • Motive una discusión con base a las respuestas dadas al ejercicio. • Proporcione la información de retorno, señalan- do los productos de origen biotecnológico y su clasificación de primera, segunda o tercera gene- ración. Recursos necesarios • Papelógrafo, papel, marcadores • Cuatro mesas grandes • Un sitio de trabajo ( un salón) • Los siguientes productos: Queso, pan, cerveza, vino, papel, insulina, penicilina (antibiótico), ve- las (de parafina), un "tarro" de grasa, azúcar, sal, una planta de tomate, tomate (fruto), vinagre. • Fotocopias de las instrucciones e información de retorno para los participantes. Tiempo sugerido: 60 minutos. Instrucciones para el participante De acuerdo con la información suministrada en la Sección 1, y mediante el reconocimiento de produc- tos de origen biotecnológico, los participantes ten- drán la oportunidad de desarrollar el concepto de biotecnología. Pasos a seguir: • Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo con las instrucciones dadas por el instructor. • Nombren un relator por grupo, el cual presentará en plenaria los resultados obtenidos por el grupo. • Realice un listado de los productos de origen bio- tecnológico. Argumenten sus selecciones. • De los productos biotecnológicos selecciona- dos, realizar un listado de los que corresponden a la primera, segunda o tercera generación. Ar- gumenten sus selecciones. • Al finalizar, el Instructor les proporcionará la información de retorno. William M. Roca / Hernando Ramírez 9 CEDAF Introducción a la Biotecnología Bibl iograf ía Bul l , A.T. , Hol t , G. and Li l ly , M.D. 1982. Internat ional Trends and Perspect ives in Biotechnology: A State of Art , Par is, OECD. Banco Interamericano de Desarrol lo (BID). 1988. Biotecnología: Perspect iva general y desarrol lo en América Lat ina, p. 207-302. En: Progreso Económico y social en América Lat ina. Informe 1988. Tema especial : Ciencia y Tecnología. Roca, W. 1993. El papel de la biotecnología en la agr icul tura de los países en desarrol lo. Innovación y Ciencia. Vol . 2. 18-25 p. Roca, W. 1990. La Nueva Biotecnología: Apl icaciones en la agr icul tura de los países en desarrol lo, p. 1-11. En: Jarami l lo, J. y Agudelo, O. (eds.) . La Nueva Biotecnología, Fundamentos, usos y perspect ivas. Seminar io real izado en ICA en Mayo 15-26 de 1989. Palmira, Colombia. Roca, W. 1986. Biotecnología de plantas: Nuevas oportunidades para la agroindustr ia. En: Agroindustr ia 2000, SAG. Cal i , Colombia. p. 107- 116. Sasson, A. 1989. Biotechnologies and Developing Countr ies: Present and Future, p. 23-46. In: Sasson, A. and N. Costar in i . (eds.) . Plant Biotechnologies for Developing Countr ies. Proceedings of an Internat ional Symposium Organized by Nal CTA/FAO, Luxemburg, 1989. 10 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Ejercicio 1.1 Introducción a la Biotecnología Vegetal - Información de retorno Producto Clasificación Argumento Queso Biotecnología 1ra.Generación Proceso enzimático Para elaboración de quesos Pan Biotecnología 1ra generación Levadura y proceso enzimático. Cerveza Biotecnología 2da generación Fermentación Vino Biotecnología 1ra generación Fermentación Insulina Biotecnología 3ra generación DNA recombinante Penicilina Biotecnología 2da generación Bioprocesos Grasa N O ------- Azúcar N O ------- Sal N O ------- Planta de tomatetransgénica Biotecnología 3ra generación Ingeniería genética Fruto de tomateRetarda en madurar Biotecnología 3ra generación Ingeniería genética Vinagre Biotecnología 1ra generación Fermentación Originales para Transparencias William M. Roca / Hernando Ramírez 11 CEDAF Introducción a la Biotecnología 1 2 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Primera Generación Fermentación • Bebidas • Alimentos • Combustibles Práctica empírica Poco conocimiento científico Segunda Generación Fermentación Industrial • Fármacos • Alimentos • Procesamiento de desechos Conocimiento científico y de ingeniería Tercera Generación Técnicas de Fermentación y bioprocesos Cultivo in vitro de células y tejidos DNA recombinante y transformación genética BIOTECNOLOGÍA William M. Roca / Hernando Ramírez 13 CEDAF Introducción a la Biotecnología • C on oc er lo s co nc ep to s bá si co s de la bi ot ec no lo gí a en G en er al . • C on oc er al gu na s et ap as de su de sa rr ol lo . • D ife re nc ia r al gu no s tip os de bi ot ec no lo gí as . OO bb jj ee tt ii vv oo ss 1 4 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Es la aplicación de principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de materiales por medio de agentes biológicos para producir bienes y servicios. Los agentes biológicos se refieren a: • Microorganismos • Células de animales y plantas • Enzimas • Material genético aislado y clonado (Sasson, 1989) ¿¿QQuuéé eess llaa BBiiootteeccnnoollooggííaa?? W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 5 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Biotecnología de Primera Generación • Se basó en la fermentación como proceso básico para producir: bebidas, alimentos y combustibles. • Práctica esencialmente empírica. • Se realizaba en pequeña escala. • Mínimo conocimiento científico y de ingeniería. DDeessaarrrrooll lloo hhiissttóórr iiccoo ddee llaa BBiiootteeccnnoollooggííaa 1 6 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Biotecnología de Segunda Generación • Se caracterizó por la utilización de los conocimientos científicos y de ingeniería. • Obtención de procesos a escala industrial. • Se basa en la aplicación integrada de la microbiología, la bioquímica y la ingeniería química. • Utiliza bioconversiones y brocatálisis para producir fármacos, combustibles, alimentos y procesamiento dedesechos. • También incluye: • Técnicas de inmovilización de enzimas • Técnicas de cultivos de tejidos DDeessaarrrrooll lloo HHiissttóórr iiccoo ddee llaa BBiiootteeccnnoollooggííaa W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 7 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía Molecular y la Ingeniería genética. • Biotecnología De Tercera Generación También llamada “Nueva Biotecnología” Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante. Se basa principalmente en la biología Nacen las empresas biotecnológicas - - - - DDeessaarrrrooll lloo HHiissttóórr iiccoo ddee llaa BBiiootteeccnnoollooggííaa 1 8 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F • Extensiva en el conocimiento científico • Se agrupa en tres categorías básicas Técnicas de cultivo de tejidos y microorganismos Técnicas de fermentación y bioprocesos y de inmovilización de enzimas. Técnicas para: Identificación mapeo clonación, manipulación y transfer genes. 1. 2. 3. encia de La nueva Biotecnología Cult ivo de Tej idos Vegetales William M. Roca / Hernando Ramírez 19 CEDAF Introducción a la Biotecnología Sección 2 Sección 2 . Cul t ivo de Tej idos Vegetales 20 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla de Contenido Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Preguntas Orientadoras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo de Tejidos Vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Estructura de la Sección Objetivos • Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales. • Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas. Preguntas Orientadoras 1. ¿Sabían ustedes que a partir de una célula somática del floema de la raíz de la zanahoria se puede desarrollar una planta completa de zanahoria? 2. ¿Algún participante puede dar una definición de cultivo de tejidos vegetales? 3. ¿Sabían ustedes que las flores naturales que venden en floristerías y supermercados son producidas por cultivo in vitro? William M. Roca / Hernando Ramírez 21 CEDAF Introducción a la Biotecnología Cultivo de meristemos Ápices y yemas Cultivo de ovulos y embriones Cultivo de anteras Cultivo de suspensión celulares Propagación masiva Eliminación de enfermedades Cruces interespecífico s Producción de haploides Metabolitos secundarios Micropropagación Contribución al fitomejoramiento Cultivo de Tejidos Vegetales Producción de protoplastos para transformación o hibridación somática Introducción El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que consiste en aislar una porción de una planta (tejido, órgano o célula), llamado explante, para cultivarlo en un medio nutritivo en condiciones físicas y quí- micas artificiales. El objetivo es conseguir que las células expresen su totipotencialidad, o sea, la ca- pacidad que tienen las células vegetales de regene- rar una planta completa cuando son separadas del organismo. La totipotencialidad de las células ve- getales cultivadasin vitro fue establecida por Steward y colaboradores en 1958, quienes descri- bieron el desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticas del floema de la raíz de zanahoria. (Figura 2.1). Cuando los explantes se cultivan en condiciones apropiadas, es posible inducir la formación de es- tructuras organizadas y la formación de plantas completas. Si la formación de la planta completa se realiza mediante la formación de brotes o yemas adventicias y posterior enraizamiento de éstos, se dice que el proceso es de organogénesis. Pero si la regeneración se obtiene a través de estructuras se- mejantes a los embriones sexuales, se dice que la vía es embriogénesis somática. Puede suceder que al cultivarin vitro un explante vegetal no se obtengan células diferenciadas o es- tructuras organizadas, sino la proliferación celular para formar un tejido amorfo no diferenciado. Este tejido recibe el nombre de callo. El callo puede ser sometido a agitación en un medio de cultivo líqui- do lo cual logra separar sus células constituyentes para formar un cultivo de células en suspención. La técnica de cultivo de tejidos puede cubrir un amplio rango de aplica- ciones, tales como: 1. Investigación básica so- bre procesos bioquími- cos y morfológicos de la diferenciación celular; 2. Investigación aplicada; 3. Desarrollo de técnicas para la propagación clo- nal o para el mejora- miento genético de plantas. El objetivo de este ca- pítulo es mostrar los fundamentos básicos de esta metodología para que el participante conozca la importancia de esta herramienta de la Biotecnología Vege- tal. 22 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Figura 2.1. Desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticas del floema de la raíz. Fuente: Villée y Colaboradores, 1998. 2.1 Fundamentos del Cul t ivo de Tej idos Vegetales En el cultivo in vitro n vitro de tejidos vegetales, un explante (células, tejido, órgano), se cultiva asépti- camente en un medio de composición definida y en condiciones ambientales controladas. En la Tabla 2.1 se presenta un cronograma de los eventos cien- tíficos y tecnológicos más importantes que contri- buyeron al desarrollo del cultivoin vitro de células y tejidos de plantas. Tabla 2.1 Eventos científicos y tecnológicos claves en la evolución del cultivo in vitro de células y tejidos vegetales. Fuente: Villalobos (1990). 1665 Hooke Primera descripción de una célula. 1674 Leeuwenhoek Observación de la vida celular. 1835 Von Mohl Descripción de la vida; protoplasta. 1838 Schilden Conjunto celular de las plantas; totipotencia de la célula vegetal. 1839 Schwann Aplicación del concepto a animales. 1846 Nageli Células vegetales se forman por divisiones de células existentes. 1855 Virchow Aforismo: Omnis cellula e cellula. 1888 1902 Haberlandt Pruebas de cultivo de células de mesófilo; predicciones. 1922 Kotte Cultivo de ápices de raíces por poco tiempo 1926 Went Descubrimiento de las auxinas. 1928 Kuster Trabajos con protoplastos obtenidos mecánicamente. 1934 White Cultivo de raíces con crecimiento activo. 1934 Gautheret Cultivo del cambio de árboles. 1937 White Importancia de la vitamina B para el crecimiento de las raíces. 1937 When & Thimann Trabajos intensivos con auxinas. 1939 Gautheret Uso de las auxinas en los cultivos; proliferación; potencialmente crecimiento sin límites. 1939 Nobecourt Cultivo de raíces de zanahoria, proliferación de células. 1939 While Subcultivos sucesivos de Nicotiana. 1942 Van Overbeek Rescate de embriones en cruzas interespecíficas. 1949 Camus Diferenciación vascular. 1952 Steward Agua de coco, embriogénesis somática. 1953 Muir Cultivo de suspensiones celulares; ailslamento de células individuales. 1953 Tulecke Cutivo de polén. 1953 1955 Skoog Descubrimiento de la cinética. 1956 Nichel Subcultivos durante 4 años de suspensiones celulares. 1957 Skoog & Miller Diferenciación del callo en vástago y raíz. 1960 Bergmann Cultivo y pruebas de regeneración de células aisladas. 1960 Cocking Obtención de protoplastos empleando enzimas. 1962 Murashige & Skoog Medio MS. 1964 Morel Cultivo de meristemos, eliminación de virus. 1964 Nitsch Inducciónde flores in vitro. 1964 Guha & Maheshwar Plantas haploides a partir de anteras. 1965 Ledoux Introducción de DNA extraño en células. 1966 Lutz Totipotencia: uso de la célula aislada. 1970 Backs – Husemann Reinert Técnicas de regeneración completa a partir de una célula. 1970 1971 Kao et al Pruebas de regeneración de plantas a partir de protoplastos. 1971 Tabeke Regeneración de plantas a partir de protoplastos. 1972 Carison Et al. Función de protoplastos y regeneración de híbridos. 1978 Melchers Pomato. Topato. Para el establecimiento del cultivoin vitro de una especie en particular se debe tener en cuenta una serie de factores, de cuyo manejo depende el éxito del cultivo. Cada sistema de cultivoin vitro presenta caracte- rísticas particulares que permiten producir plantas completas a partir de explantes. Estas característi- cas tienen que ver con: el explante, las normas de asepsia, los medios de cultivo y las condiciones ambientales de incubación. La interacción de estos factores es lo que determina la respuesta del ex- plante al cultivoin vitro. La formación de plantas por medio del cultivo de tejidos puede ocurrir como una continuación del crecimiento y desarrollo de estructuras organiza- das, por ejemplo, meristemas apicales y axilares del tallo; o puede ser el resultado de un proceso de William M. Roca / Hernando Ramírez 23 CEDAF Introducción a la Biotecnología formación de novo, a partir de células donde no existía organización alguna; estas células pueden derivarse de los órganos vegetativos (somáticos) o de las estructuras sexuales (gaméticas) de la planta. (Figura 2.2). La formación de plantas de novo puede ocurrir a través de la diferenciación de embriones que se ini- cia en células individuales o en grupos de células (embriogénesis somática o asexual) o vía diferen- ciación de órganos vegetativos (organogénesis) que se inicia en grupos de células. Como se mencionó antes, la regeneración de plan- tasin vitro depende de varios factores, siendo los más importantes: la variedad de la planta (genoti- po), la clase de tejido a cultivar (explante), la com- posición química del medio de cultivo (factor químico) y las condiciones ambientales de la incu- bación (factor físico). Las técnicas de cultivo de meristemos, ápices y ye- mas pueden considerarse como clásicas dentro del cultivo de tejidos y su aplicación, en la propaga- ción clonal de plantas, la recuperación de la sani- dad, así como en la conservación e intercambio de germoplasma, están ampliamente diseminadas. Por otro lado, el cultivo de microsporas y de ante- ras para la producción de haploides es una herra- mienta importante para el mejoramiento genético de plantas. Para cultivar células, tejidos y órganosin vitro se deben seguir los siguientes pasos: 1. Seleccionar y separar de la planta el explante que se desea cultivar. 24 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 1 2A 2 2B Figura 2.2 Formación de plantas in vitro. 1. Cultivo de meristemos y yemas del tallo. 2. Regeneración de plantas. 2A. Vía organogénesis; 2B. Vía embriogénesis somática. Fuente: George y Sherrington, 1984. 2. Desinfectar el explante. 3. Sembrar el explante en un medio de cultivo apro- piado. 4. Cultivar el explante en condiciones ambientales controladas. Entre los factores químicos que influyen en el cul- tivo in vitro están: los nutrientes (macro y microe- lementos y fuentes de carbohidratos) y algunos compuestos orgánicos (vitaminas) y los regulado- res de crecimiento. Entre los factores físicos están: la luz, la tempera- tura, el pH y la concentración de O2 y CO2. Estos factores ejercen un papel importante en el desarro- llo y diferenciación celular. El tipo de diferenciación que ocurre en un cultivo in vitro en general depende de la relación de dos ti- pos de reguladores de crecimiento: las auxinas y las citocininas. Cuando la relación auxina/citoci- nina es alta se puede dar la formación de raíces, la inducción de embriogénesis y la inducción de ca- llos. Mientras que si la relación de auxina/citocini- na es baja se puede dar el desarrollo de yemas axi- lares, o la inducción de brotes adventicios. Manipulando las combinaciones y concentracio- nes de los reguladores de crecimiento, es posible regenerar plantas completas a partir de células, te- jidos u órganos. 2.2 Apl icaciones del Cul t ivo de Tej idos Vegetales Las aplicaciones de esta técnica se dan básicamen- te en tres áreas fundamentales: a. La micropropagación, b. La contribución del cultivoin vitro en el mejora- miento vegetal y c. La producción de metabolitos secundarios. (Tabla 2.2). 2.2.1 Micropropagación Uno de los mayores usos del cultivoin vitro de teji- dos es la propagación vegetativa de plantas, la cual se realiza en forma extensiva. Esta metodología William M. Roca / Hernando Ramírez 25 CEDAF Introducción a la Biotecnología Tecnologías Aplicaciones Plazos para utilización Cultivo de Meristemas, ápices, yemas, embriogénesis somática 1. Propagación masiva - Inmediato 2. Eliminación de enfermedades - Inmediato 3. Conservación de germoplasma - Inmediato 4. Intercambio de germoplasma. - Inmediato Cultivo de embriones, cultivo de óvulos, fertilización in vitro 1. Obtención de híbridos entre especies de géneros distintos - Inmediato Cultivo de anteras, Cultivo de microsporas, Cultivo de embriones 1. Obtención rápida de líneas genéticamente puras - Inmediato 2. Obtención de variación genética nueva - Mediano 3. Aumento de heterosis Cultivo de células, callos 1. Obtención de variantes somaclonales - Mediano 2. Acelerar mejoramiento genético intravarietal - Mediano 3. Selección de líneas resistentes a enfermedades, estrés, etc. - Mediano 4. Transformación genética - Largo Funsion de Protoplastos 1. Obtención de híbridos asexuales. - Largo 2. Transferencia de genes citoplasmáticos - Largo Tabla 2.2 Técnicas de cultivo in vitro de células y tejidos vegetales y sus aplicaciones en la agricultura. Fuente: Roca (1986). permite la multiplicación masiva de plantas en es- pacio y tiempo reducidos, ganancia que es bastante significativa cuando se compara con los métodos convencionales de propagación asexual. En general, la micropropagación se puede conse- guir a través de tres vías: a. Por medio de la proliferación de yemas axilares; b. Por la inducción de yemas o brotes adventicios y c. Por embriogénesis somática (Figura 2.2). Las yemas apicales o axilares se pueden desarro- llar in vitro promoviendo el crecimiento de las ye- mas latentes o de las yemas activas. Un segmento de la planta que contenga una sola yema puede ori- ginar un solo tallo o puede producir tallos múlti- ples (Figura 2.3). A medida que el tallo o las ramas se desarrollan producen a su vez más yemas axila- res; por el subcultivo periódico se podrán producir tallos o ramas indefinidamente. Este método de micropropagación ha sido el más popular debido a su aplicabilidad a un mayor número de especies vegetales y a susimple implementación. Los brotes o yemas adventicias son estructuras que se originan de novo en áreas diferentes a los sitios de formación de las yemas axilares o apicales. Los brotes, raíces, bulbos adventicios y otras estructu- ras similares se pueden inducir en segmentos de ta- llo, hojas, tubérculos, cormos, bulbos, rizomas o estructuras florales. Normalmente el número de propágulos se incrementa por subdivisión de los propios órganos inducidosin vitro. Esta vía puede resultar en un sistema de multiplicación mayor que la propagación por proliferación de yemas axila- res. La embriogénesis somática es el sistema de mayor potencial para la propagación clonal rápida. A tra- vés de este método es posible obtener miles de em- briones somáticos a partir de unos pocos gramos de callo o de pocos mililitros de una suspensión ce- lular. Durante este proceso cada célula o grupo de células es capaz de dividirse y diferenciarse en un embrión somático, que luego puede dar origen a una planta completa. Debido a su similitud conlos embriones cigóticos, los embriones somáticos se utilizan para la producción de las llamadas semi- llas artificiales. La ventaja de la embriogénesis somática, compara- da con los dos métodos de micropropagación men- cionados anteriormente, se debe principalmente al manejo de un alto volumen de material propagado y a un bajo costo de producción. Sin embargo, el principal problema de este sistema es el reducido número de especies que pueden ser propagadas por esta vía. La micropropagación tiene una amplia aplicación en cul t ivos comerciales como plantas ornamentales, frutales, forestales y especies hortícolas comestibles. En América Latina existen unos 180 laboratorios de micropropagación de variada capacidad. De éstos, sólo 50 desarrollan propagación de plantas a nivel comercial. Sin embargo, son pocos los que alcanzan niveles de 26 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF MICRO-PROPAGACIÓN I. INICIACIÓN II. ENRAIZAMIENTO Figura 2.3. Cultivos de meristemos de yuca en dos etapas de micropropagación por cultivo de nudos. Fuent: Roca, W. 1980. producción superior al millón de plantas al año (Tabla 2.3). Las plantas para las cuales se han desarrollado técnicas de micropropagación incluyen principalmente ornamentales, herbáceas, frutales y forestales, aunque la propagación masiva (a nivel comercial) es más utilizada con las ornamentales (Tabla 2.4). Tabla 2.3 Laboratorios de micropropagación comercial. País Número de laboratorios Estados Unidos 105* Australia 35* Inglaterra 15* Nueva Zelandia 15* Francia 10* China 10* Brasil 10* Israel 7* Italia 6 Argentina 6 Holanda 5* Canadá 5* Rep. Dominicana 5* México 5* Colombia 5 Costa Rica 5* Sur Africa 5 Filipinas 4 Tailandia 4 Indonesia 3 Singapur 3* Venezuela 3 Kenya 2 Malasia 2 Taiwan 2* * Producción mayor de 1 millón de plantas. El mercado potencial para las plantas micropropagadas es muy grande, siendo Holanda el pr incipal país productor de plantas micropropagadas, seguido por los Estados Unidos de América y por Israel. Es importante anotar que no todas las especies ve- getales responden con facilidad a la micropropaga- ción, como es el caso de especies forestales. Sin embargo, se debe enfatizar que la micropropaga- ción es recomendable para la multiplicación rápida de materiales en vía de extinción y materiales va- liosos o de alto valor agregado para el comercio. Tabla 2.4 Plantas propagadas in vitro. Fuente: Compilado por Roca, W., (1995). Número de Variedades o Tipos Tipo de planta Micropropagadas Propagación masiva Ornamentales Herbáceas 189 85 Leñosas 96 9 Frutales 50 40 Forestales Angiospermas 60 24 Gimnospermas 30 15 Hortalizas 60 10 Gramíneas 50 10 Orquídeas 37 28 Medicinales 43 5 Plantaciones 20 3 Oleaginosas 14 6 Fibras 17 1 Raíces y tubérculos 8 2 Total 672 238 % 100 35 Micropropagación comercial Existen numerosas compañías comerciales que producen millones de plántulas al año por micro- propagación. Compañías de este tipo se hallan lo- calizadas en EE. UU, Australia, Reino Unido, e Israel principalmente, donde el principal mercado son las plantas ornamentales de flores para corte (Tabla 2.3). Eliminación de virus y otros patóge- nos Las plantas son susceptibles a muchos agentes pa- tógenos como bacterias, hongos, virus, viroides y nemátodos. Aunque la esterilización superficial de los explantes elimina agentes superficiales, este tratamiento no permite la eliminación de infeccio- nes sistémicas, de tipo bacteriano o víricas. Aun- que resulta relativamente sencillo eliminar los patógenos de etiología fúngica o bacteriana por tratamiento químico u otros medios, la eliminación de los virus representa un verdadero problema. William M. Roca / Hernando Ramírez 27 CEDAF Introducción a la Biotecnología De la observación de que la distribución de las par- tículas virales en la planta es irregular y que existe menor número de partículas virales en los meriste- mos apicales, fue posible llegar a una soluciónde este problema. Los meristemas apicales son grupos de células lo- calizadas en el extremo del ápice de crecimiento y que normalmente se dividen activamente y de modo organizado. El meristema apical de brotes esterilizados superficialmente pueden ser cortados conteniendo las células apicales y los primordios foliares adyacentes, y cultivados en un medio de cultivo y condiciones de crecimiento adecuados para obtener plantas completas. Las plantas producidas por este procedimiento ge- neralmente no presentan infección viral, compro- bada por la técnica ELISA (prueba inmunológica para detección de virus en tejidos vegetales) con indicadores o con sondas de DNA. Para que este procedimiento sea eficiente se deben tener en cuenta factores como: el tamaño del ápice que se extrae para el cultivo, factores del medio y tratamientos químicos o térmicos antes o durante el cultivoin vitro. De todos ellos, el factor más im- portante es el tamaño del explante; generalmente el porcentaje de obtención de plantas aumenta con el tamaño del explante, pero si el meristemo es relati- vamente pequeño, la proporción de plantas sin vi- rus será relativamente elevada. En algunos casos resulta efectivo el tratamiento térmico (por ejem- plo, durante 10 - 20 días a 35 - 38oC) antes de que se efectúe la extracción del meristemo, ya que la multiplicación viral es sensible a las temperaturas elevadas (Figura 2.4). La técnica del cultivoin vitro de meristemos ha sido efectiva para la propagación de plántulas li- bres de virus en por lo menos unas 65 especies de plantas. 28 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF PRUEBAS DE DETECCIÓN MATERIAL CLONAL TERMOTERAPIA Día: 35°C Noche: 35°C Día: 40°C Noche: 35°C CULTIVO DE MERISTEMAS SEMBRAR EN POTES PRUEBAS DE DETECCIÓN PROPAGACIÓN PLANTAS SANAS PLANTAS SANAS (-) (+) CLONES INFECTADOS DESTRUCCIÓN PLANTAS ENFERMAS Figura 2.4. Procedimientos para la producción de plantas de yuca libres de virus mediante la termopterapia y el cultivo de meristemos. Fuente. Roca y Jayasinghe, 1982. 2.2.2 Contr ibución del cul t ivo in vi t ro en el mejoramiento vegetal Rescate de embriones zigót icos Las barreras que se oponen al logro de la produc- ción de híbridos entre especies distantes taxonómi- camente pueden ser superadas mediante las técnicas de cultivoin vitro. En aquellos casos en que la fecundación tiene éxito, pero el embrión no consigue desarrollarse, es posible aislar los em- briones cigóticos inmaduros y cultivarlos en me- dios y condiciones apropiadas para regenerar plantas híbridas (Figura 2.5). Producción de plantas haploides me- diante el cul t ivo de anteras y de ova- r ios Las plantas haploides contienen el número gaméti- co de cromosomas, es decir la mitad del número to- tal de cromosomas de la planta. Son de gran utilidad en los programas de mejoramiento, tanto para la producción rápida de líneas homocigóticas, como para la detección y selección de mutantes re- cesivos. La producción de haploides puede ocurrir por medio de la regeneración de plantas a partir del cultivo de granos de polen inmaduros aislados (cultivo de microsporas) o contenidos en la antera (cultivo de anteras). En la cebada, por ejemplo, que posee del orden de 2 - 3x103granos de po- len por antera y 60 anteras aprovechables por cada espiga, existen potencialmente 105 microesporas por espiga que pueden ser aprovechadas para el cultivo in vitro. Mediante el cultivo de anteras es posible regenerar plantas haploides en más de 50 especies vegetales, siendo la mayoría de ellas de las familias Grami- nae, Solanaceae y Cruciferae. Estas familias inclu- yen muchas especies agrícolas de importancia económica como el trigo, la cebada, el maíz, el arroz, el centeno, los pastos, las brassicas, la papa, el tomate y el tabaco. Los factores más importantes para la producción eficiente de plantas haploides son los siguientes: 1. El crecimiento de las plantas donantes en condicio- nes óptimas, 2. Una muestra adecuada de diferentes genotipos;3. Elección del estadio adecuado del desarrollo del polen ; 4. Condiciones del pretratamiento de las anteras, es- pecialmente el tratamiento por frío o por calor; 5. Efecto de los aditivos en el medio de cultivo, por ejemplo, el nitrógeno orgánico, un aumento en el contenido de sacarosa, carbón activado, etc. En el mejoramiento tradicional son necesarias 5 - 6 generaciones del material segregante para obtener líneas uniformes, las cuales nunca son 100% ho- mocigotas. Estas generaciones requieren además de tiempo y mano de obra intensa. El cultivo de anteras permite eliminar varias generaciones se- William M. Roca / Hernando Ramírez 29 CEDAF Introducción a la Biotecnología P. vulgaris Embrión P. coccineus P. acutifolius P. lunatus Callo Plantas x Figura 2.5 Producción de plantas híbridas de cruzas interespecíficas mediante el rescate y cultivo in vitro de embriones inmaduros. Fuente: Muñoz y Colaboradores, 1990. gregantes, economizando tiempo, espacio y cos- tos. El cultivo de anteras para la producción de haploides es ya un proceso rutinario en muchos cultivos. Tal es el caso del arroz, que en 7 - 8meses es posible obtener semilla totalmente homocigota, que por el método tradicional tomaría 3 - 4 años (Figura 2.6). La consecuencia genética del cultivo de anteras en el fitomejoramiento se presenta en la Tabla 2.5 30 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Actividad Selección de progenitores Cruzamientos Selección de plantas F . Cultivo de anteras Inducción de callos Regeneración de plantas R . Obtención de semilla R . (homocigótica) Evaluación de líneas R calidad de grano, tipo de planta, resistencia a enfermedades y tolerancias fisiológicas. Ensayos de rendimiento con líneas R Ensayos regionales en campos de agricultores con líneas R Ensayos comerciales con líneas R Liberación de la variedad 1 1 2 2. 3. 4 5 Número Aproximado 25-50 plantas/cruce 100 anteras/frasco; 100 frascos/cruzamiento (10,000 anteras/cruzamiento) 700-4000 callos/100 anteras 7%-40% 50-700 plantas verdes/100 anteras 0.5%, 0.7% 50% R son DH 25-350 líneas R /cruzamiento. 5-70 líneas R seleccionadas/cruzamiento (aprox. 20% selección) 1 2 2 Duraci ón calculada 3 meses 1.5 meses 1.5 meses 4 meses 6 meses 3-4 años Figura 2.6 Procedimiento general para el mejoramiento de arroz mediante el cultivo de anteras. Fuente: Lentini y colaboradores, 1997. para plantas autógamas. La determinación del be- neficio / costo del cultivo de anteras es un paso ne- cesario para la implementación del cultivo de anteras en un programa de mejoramiento (Tabla 2.6). Tabla 2.5 Consecuencia genética del cultivo de anteras. Hibrido Gametos Cultivo de Anteras Plantas Homocigotas AB AABB AaBb aB aaBB Ab AAbb ab aabb Tabla 2.6 Análisis de costo-beneficio del cultivo de anteras para el mejoramiento de arroz: costo total estimado para obtener una variedad de arroz usando el cultivo de anteras, y comparación con el método de pedigrí. Fuente: Sanint, y colaboradores, (1.993). Método Costo en Dólares Indica Japonica Método de pedigrí 203.791 348.483 Cultivo de anteras 121.385 195.438 Ahorro respecto al método de pedigrí 82.046 153.044 % de ahorro 29 44 Capacidad de operación óptima (número de anteras por semana) 60.000 5.500 2.2.3 Producción de metabol i tos secundar ios usando cul t ivo de tej idos Los metabolitos secundarios son compuestos que no tienen una función reconocida en los procesos fisiológicos de los organismos que los sintetizan. Estos compuestos, entre los que se incluyen los al- caloides, terpenoides, esteroides, antocianinas, an- traquinonas y fenoles simples o polifenoles, tienen de manera característica una distribución limitada. Un gran número de compuestos químicos impor- tantes desde el punto de vista comercial provienen directamente de plantas y estos incluyen los meta- bolitos secundarios. La aplicación de estos pro- ductos puede clasif icarse en cinco grupos: fármacos, aromas, perfumes, pigmentos y plagui- cidas. La importancia biotecnológica de los metabolitos secundarios es triple: 1. Puede tratarse de compuestos químicos de valor co- mercial; 2. Algunos de ellos son tóxicos y deben eliminarse de los alimentos; y 3. Podrían actuar como agentes protectores, utilizados por la planta contra agentes patógenos, insectos y animales herbívoros. Existen dos estrategias generales para la produc- ción a gran escala de metabolitos secundarios ve- getales. Éstas estrategias se basan en : 1. Sistemas de fermentadores en el que las células en suspensión crecen libremente hasta una fase esta- cionaria en un proceso de una o dos etapas. Estas se cosechan para extraer el producto; 2. Sistema de células inmovilizadas, en los que las cé- lulas son embebidas o atrapadas en una matriz poli- mérica inerte, como gel, espuma o cartuchos de fibra hueca. En este último sistema el objetivo es conseguir un proceso de producción continuo o se- micontinuo, que requiere a su vez que el producto se libere naturalmente, o que la liberación pueda in- ducirse permeabilizando reversiblemente las célu- las. William M. Roca / Hernando Ramírez 31 CEDAF Introducción a la Biotecnología 2.3 Ejercic io 2.1 El cul t ivo de tej idos vegetales Objetivos • Elaborar el concepto de cultivo de tejidos vege- tales y sus aplicaciones. • Identificar el explante y la técnica de cultivo de tejidos más adecuada para: a. el rescate de germoplasma en vía de extin- ción, b. la eliminación de patógenos de materiales "preciosos", c. la multiplicación masiva de materiales co- merciales (flores) y d. la producción de plantas haploides para ser utilizadas en mejoramiento vegetal. Orientaciones para el instructor El siguiente ejercicio busca que los participantes seleccionen los explantes y técnicas de cultivo de tejidos apropiados para el rescate de germoplasma en vía de extinción, la eliminación de patógenos de materiales "preciosos", la multiplicación masiva de materiales comerciales (flores) y la producción de plantas haploides para ser utilizadas en mejora- miento vegetal. Con este ejercicio, se busca que los participantes fijen el concepto de cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones. Para la realización de este ejercicio se recomienda que el instructor lea atentamente las siguientes ins- trucciones: • Suministre orientación general sobre los objeti- vos del ejercicio. • Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. • Coloque en cada mesa las cuatro especies vege- tales recomendadas. • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique cada grupo en cada una de las mesas de trabajo. • En cada grupo, los participantes deben indicar: a. El cultivo de más difícil propagación por vía convencional; b. El cultivo que podría ser usado como modelo para la eliminación de patógenos (virus); c. el cultivo que podría ser usado como modelo para propagación masiva; d. el cultivo que podría ser utilizado como mo- delo para la producción de plantas haploides. • En cada caso seleccione el explante y la técnica de cultivo de tejidos más apropiada para cum- plir con cada uno de los objetivos planteados. • Elaborar una lista del explante(s) y la técnica(s) de cultivoin vitro seleccionados para cada cul- tivo. • Motive una discusión con base a las respuestas dadas. • Proporcione la información de retorno, seña- lando los explantes y técnicas de cultivoin vitro más apropiadas en cada cultivo para lograr el objetivo planteado. Recursos necesarios • Papelógrafo, papel, marcadores. • Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo. • Las siguientes plantas en materas pequeñas o en bolsas de plástico: Palma, yuca, rosa, y arroz. • Fotocopia de las instrucciones e información de retorno para los participantes. Tiempo sugerido: 60 minutos. 32 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Instrucciones para el participante De acuerdo con la información suministrada en a Sección 2, y mediante la selección del explante y técnica de cultivo más apropiadapara: a. el rescate de germoplasma en extinción, b. eliminación de patógenos en materiales "precio- sos", c. la multiplicación masiva de materiales comerciales y d. la producción de plantas haploides para ser usadas en mejoramiento vegetal, los participantes tendrán la oportunidad de construir el concepto de cultivo de tejidos vegetales. • Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo con las instrucciones dadas por el instructor. • Nombrar un relator por grupo, el cual presenta- rá en plenaria los resultados obtenidos por el grupo. • Realizar un listado de los explantes y técnicas de cultivoin vitro para cada cultivo, de acuerdo con su objetivo particular. • Al final el instructor les proporcionará la infor- mación de retorno. William M. Roca / Hernando Ramírez 33 CEDAF Introducción a la Biotecnología Especie Vegetal Caso particular Explante (s) Seleccionado(s) Técnica de Cultivo in vitro Producto Palma Multiplicación Apices laterales Micropropagación Multiplicación rápida Yuca Limpieza clonal por ter- moterapia Meristemos Micropropagación Plantas libres de virus Rosa Propagación masiva Yemas axilares Micropropagación Incremento en la produc- ción de plántulas Arroz Producción de plantas haploides Anteras Cultivo de anteras Producción de plantas ha- ploides para ser usadas en un programa de mejo- ramiento Bibl iograf ía George, E.F., and Sherrr ington, P.D. 1984. Plant Propagat ion by Tissue Culture. Basingstoke, Exeget ics. Lent in i , Z. , Mart ínez, C., y Roca, W. 1997. Cult ivo de Anteras de Arroz en el Desarrol lo de Germoin vi tro. P. 25-27. En: Rosel l , C.H., y Vi l la lobos, V.M. (eds.) . Fundamentos Teór ico-Práct icos del Cul t ivo de Tej idos Vegtales. FAO, Roma. Roca, W. M. 1986. Biotecnología de Plantas: Nuevas oportunidades para la agroindustr ia SAG. Cal i , Colombia. p. 167-116. Roca, W. M. 1980. El Cul t ivo de Meristemas de Yuca. Guía de estudio. CIAT, Cal i , Colombia. 40 p. Roca, W.M. y Jayasinghe, U. 1982. El Cul t ivo de Meristemas para el Saneamiento de Clones de Yuca. Guía de estudio. CIAT, Cal i , Colombia. 45 p. Sanint , L.R. Mart ínez, C.P., Ramírez, A., y Lent in i , Z. 1993. Rice Anther Culture Versus Convent ional Breeding: A Cost/Benef i t Analysis. En: Trends in CIAT Commodit ies. Documento de trabajo No. 128. CIAT, Cal i , Colombia. p. 74-96. Vi l la lobos, V. M. 1990. Histor ia del Cul t ivo de Tej idos Vegetales. p. 3-7. En: Rosel l , C.H., y Vi l la lobos, V.M. (eds.) . Fundamentos Teór ico Práct icos del Cul t ivo de tej idos Vegetales. FAO, Roma. Vi l lee, C.A., Solomon, E.P., Mart ín, C.E., Mart in, D.W., Berg, L.R. y Davis, P.W. 1992. Biología. Interamericana - McGraw-Hi l l . Mexico. 1407 p. 34 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Originales para Transparencias William M. Roca / Hernando Ramírez 35 CEDAF Introducción a la Biotecnología 3 6 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Cultivo de meristemos Ápices y yemas Cultivo de ovulos y embriones Cultivo de anteras Cultivo de suspensión celulares Propagación masiva Eliminación de enfermedades Cruces interespecífico s Producción de haploides Metabolitos secundarios Micropropagación Contribución al fitomejoramiento Cultivo de Tejidos Vegetales Producción de protoplastos para transformación o hibridación somática W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 3 7 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía OObbjjeett iivvooss • Entender los principios básicos de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales. • Conocer algunas aplicaciones de estas técnicas. CCuull tt iivvoo ddee TTeejj iiddooss VVeeggeettaalleess 38 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF E s un a té cn ic a qu e co ns is te en ai sl ar un a po rc ió n de un a pl an ta (T ej id o, ór ga no o cé lu la ), lla m ad o ex pl an te , pa ra cu lti va rlo en un m ed io nu tr iti vo en co nd ic io ne s fís ic as y qu ím ic as ar tif ic ia le s. ¿¿ QQ uu éé ee ss ee ll CC uu ll tt ii vv oo dd ee TT ee jj ii dd oo ss VV ee gg ee tt aa ll ee ss ?? W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 3 9 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía Explante EmbriogénesisOrganogénesisCallo (brotes o yemas, raíz adventicia) (producción de embriones) Planta Celulas en suspensión 4 0 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F UUtt ii ll iizzaacciióónn ddee llaass TTééccnniiccaass ddee CCuull tt iivvoo ddee TTeejj iiddooss VVeeggeettaalleess • Investigación básica sobre procesos bioquímicos y morfológicos de la diferenciación celular. • Investigación aplicada. • Desarrollo de técnicas para propagación clonal o para el mejoramiento genético de plantas. W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 4 1 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía PPaassooss aa SSeegguuii rr eenn eell CCuull tt iivvoo ddee TTeejj iiddooss VVeeggeettaalleess • Selección y separación del explante. • Desinfección del explante. • Siembra en un medio apropiado. • Cultivar el explante en condiciones ambientales controladas. 4 2 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F AAppll iiccaacciioonneess ddeell CCuull tt iivvoo ddee TTeejj iiddooss VVeeggeettaalle 1. Micropropagación • Micropropagación comercial • Eliminación de virus y otros patógenos 2. Contribución al mejoramiento vegetal • Rescate de embriones • Cultivo de anteras para la producción de plantas haploides 3. Producción de metabolitos secundarios ss Tecnología del DNA Recombinante William M. Roca / Hernando Ramírez 43 CEDAF Introducción a la Biotecnología Sección 3 Sección 3 . Tecnología del DNA recombinante 44 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla de Contenido Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Preguntas Orientadoras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genética?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genética. . . . . . . . . . . 47 3.3 Aislamiento de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.4 Secuenciación del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 3.5 Ejercicio 3.1 Tecnología del DNA recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Estructura de la Sección Objetivos Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante Describir las herramientas más importantes de esta tecnología. Conocer algunas de sus aplicaciones. Preguntas Orientadoras 1. ¿Sabían ustedes que la insulina, hormona que regula los niveles de azúcar en la sangre es producida a nivel in- dustrial por una bacteria que vive en su intestino? 2. ¿Algún participante puede decir que es la ingeniería genética? 3. ¿Sabían ustedes que pequeños segmentos de DNA pueden ser aislados secuencias modificados y transferidos de un organismo a otro.? William M. Roca / Hernando Ramírez 45 CEDAF Introducción a la Biotecnología Enzimas de restricción • Enzimas modificadoras del DNA • Vectores • Hospederos Generación de fragmentos de DNA Unión de los fragmentos a un vector molecular Introducción del vector a una célulahospedante para la amplificación Utilizand o “sondas" Utilizando anticuerpos específicos Selección de una secuencia (gen) específica Tecnología del DNA recombinante Herramientas Clonación y aislamiento de genes • 3.1 ¿Qué es la Ingeniería Genét ica? En muchos laboratorios alrededor del mundo, ya es una rutina el aislamiento de fragmentos específi- cos de DNA de un organismo para determinar su secuencia de bases y utilizar esta información para determinar su función. Lo que es realmente interesante es que es posible su acceso, a nivel ex- perimental básico, con muy poco equipo y a un costo relativamente bajo. Ingeniería genética es el término más utilizado para referirse al conjunto de técnicas involucradas en la manipulación del material genético (DNA y RNA). La ingeniería o manipulación genética se basa en la tecnología del DNA recombinante. La tecnología delDNA recombinante básica- mente consiste en aislar segmentos específicos de DNA (genes) e introducirlos en vectores especia- les (plásmidos) para formar moléculas de DNA recombinantes. Este proceso es posible gracias a un grupo de enzimas que permiten la manipula- ción del DNA, tales como lasenzimas de restric- ción, que reconocen y cortan en sitios específicos la molécula de DNA, y lasligasas, que sellan per- manentemente los fragmentos insertados en el vec- tor. Los vectores recombinantes son introducidos a una célula hospedera (generalmente a la bacteria Escherichia coli) para el mantenimiento y amplifi- cación (multiplicación) de las moléculas de DNA recombinante. El proceso por el cual un segmento específico de DNA o un gen es amplificado en forma selectiva se llamaclonación. En este caso, el DNA foráneo se inserta in vitro en un plásmido pequeño (por ejem- plo, al plásmido comercial pUC19). El plásmido recombinante se introduce por transformación a una célula hospedera (la bacteriaE. coli) en la que se mantiene mediante selección a través de un gen de resistencia a un antibiótico presente en el plás- mido vector (Figura 3.1). Hay cuatro áreas principales en las cuales la tecno- logía del DNA recombinante es de gran utilidad. a. Investigación básica de la estructura y función de los genes. b. Identificación y mapeo de genes c. Nuevos métodos de producción de proteínas útiles. d. Producción de plantas y animales transgénicos. La clonación genética es el aislamiento de una se- cuencia específica de DNA del genoma. La esencia de la clonación de genes se puede resumir en las cuatro etapas mostradas en la Figura 3.2, cuyo pro- ducto es el aislamiento de una secuencia específica de DNA la cual puede ser utilizada para varios pro- pósitos. 46 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF DNA de otro organismo AAGCTT TTCGAA AAGCTT TTCGAA Un gen de interés A G C T T A A T T C G A A G C T T A A T T G C A La mezcla hace que los extremos complementarios se apareen y que la DNA ligasa una estos extremos Plásmidio bacteriano a b c Figura 3.1 Principio básico de la tecnología del DNA recombinante. Fuente: Villée y colaboradores, 1992. 3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnológicos de la Ingeniería Genét ica 3.2.1 Los ácidos nucleicos Las características hereditarias que se transmiten de los parentales a su descendencia se hallan loca- lizadas en los cromosomas, cuyo principal consti- tuyente es la molécula del DNA. Los segmentos de esta gran molécula que codifican las diferentes características de un individuo se denominan ge- nes. Los genes de los organismos eucarióticos están conformados básicamente de tres regiones: la es- tructural, la promotora y la reguladora. Laregión estructural está constituida por secuencias codifi- cadoras, llamadas exones y secuencias no codifica- doras, denominadas intrones, las cuales son removidas del mRNA después de la transcripción. La región estructural está además flanqueada en su extremo 5' por un sitio de iniciación de la trans- cripción y en su extremo 3' por un sitio de termina- ción. Laregión promotora contiene secuencias específicas que interactúan con varios factores proteínicos para regular la transcripción, y lare- gión reguladoradetermina cuando el gen debe co- menzar a transcribirse. Estos reguladores son de dos tipos: los amplificadores, que incrementan la velocidad de la transcripción y los silenciadores, que son los que la disminuyen. En la Figura 3.3, se muestran los componentes más importantes de los genes de los organismos eucarióticos. William M. Roca / Hernando Ramírez 47 CEDAF Introducción a la Biotecnología Generación de Fragmentos de ADN Unión de los Fragmentos a un Vector Molecular Introducción del Vector a una Célula Hospedante, para la Amplificación Selección de una Secuencia Específica Figura 3.2 Las cuatro etapas básicas para la clona- ción de genes. Potenciador Elementos cuesta arriba Elementos cuesta arriba TATA Exón Intrón IntrónExón Potenciador Sitio de iniciación de la transcripción 100 pares de bases Sitio de iniciación de la transcripción a b TATA Exón Intrón Exón Intrón Exón hnRNA hnRNA Figura 3.3 Componentes de un gen eucariótico. Fuente: Villée y colaboradores, 1992. El flujo de la información genética es unidireccio- nal: DNA � mRNA � proteína El proceso que permite copiar la información ge- nética (a través de una molécula intermediaria de- nominada mRNA) se llamatranscripción, y la conversión de la información genética en el pro- ducto final (una proteína) se denominatraduc- ción. Este concepto del flujo de la información ge- nética es conocido como elDogma Central de la Biología. Dos excepciones que se deben agregar al dogma central de la biología son los siguientes: 1. La duplicación de material genético, que ocurre an- tes de la división celular, representada como DNA⇒ DNA, se denominareplicación y 2. La información genética de algunos organismos, como los retrovirus, se halla codificada en la molécu- la de RNA en vez de DNA. Estos virus contienen una enzima llamadatranscriptasa reversa que pro- duce una molécula de DNA de doble cadena a partir de la cadena simple del RNA genómico. En este caso el flujo de la información genética será en "reversa", comparado con la convención normal, de modo que el dogma central completo de la biología se esque- matiza en la Figura 3.4. Los ácidos nucleicos son conglomerados en forma de cadena (heteropolímeros) formados por unida- des (monómeros) llamadasnucleótidos; por esta razón una cadena de ácido nucleico se le conoce como unpolinucleótido. Las unidades o nucleóti- dos estan formados por tres componentes: un azú- car (2-desoxirribosa para DNA y ribosa para RNA), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Las bases nitrogenadas son de dos tipos: laspuri - nasque presentan doble anillo y se llaman adenina y guanina, designadas por las letras A y G,respec- tivamente; y laspirimidinas, que presentan un solo anillo, y se llaman timina, citosina y uracilo, designados por las letras T, C y U, respectivamen- te. La timina no se presenta en el RNA, en su lugar se encuentra el Uracilo. La estructura del DNA tiene la forma de una doble hélice, donde las bases nitrogenadas se hallan en el interior. Cada base se aparea con la base de la ca- dena complementaria a través de puentes de hidró- geno (H), que unen a la A con la T mediante dos puentes de hidrógeno y a la G con la Cmediante tres puentes. Hay tres tipos de moléculas de RNA en las células: RNA mensajero (mRNA), RNA ribosomal (rRNA ) y RNA de transferencia (tRNA). El rRNA es el más abundante de los tres (85% del RNA total) y está asociado con losribosomas, que son parte esencial de la maquinaria de traducción. El tRNA (10% del RNA total) se encarga de insertar ami- noácidos siguiendo un orden codificado por el mRNA. El mRNA (5% del RNA total), actúa como transportador de la información genética 48 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF DNA mRNA Transcripción Traducción PRO TEINA Transcripción Reversa Replicación Figura 3.4 El dogma central de la biología.desde el DNA hasta el sitio de traducción (los ribo- somas), cuyo producto final son las proteínas. El arreglo lineal de la secuencia de aminoácidos de una proteína está determinado por la secuencia de bases en el mRNA, cuyo orden es especificado por el DNA, de donde se copió o transcribió. Una secuencia de tres bases que codifica para un aminoácido se llama uncodon. Como hay cuatro bases diferentes entonces existen 64 codones posi- bles para los 20 aminoácidos esenciales diferentes. Tres de esos codones son utilizados como señales de terminación de la traducción, el resto correspon- de a los aminoácidos. Por ejemplo, hay seis codo- nes para leucina, cuatro para treonina, uno para metionina, uno para triptofano, etc. El ingeniero genético necesita cortar y unir seg- mentos de DNA de diferentes fuentes (Figura 3.1). Además, es necesario realizar ciertas modificacio- nes en el DNA en la diferentes etapas requeridas para producir, clonar e identificar moléculas de DNA recombinante. Lasherramientasque hacen posible todas esas manipulaciones sonenzimas. Algunas de estas enzimas utilizadas en la ingenie- ría genética, son las siguientes : 3.2.2 Las enzimas de restr icción Las enzimas de restricción permiten cortar el DNA de doble cadena por sitios específicos o secuencias de reconocimiento (Figura 3.5). Estas enzimas son extraídas de bacterias, en donde funcionan como parte de un mecanismo de protección de la bacteria contra la invasión de DNA extraño. Para prevenir la digestión o la hidrólisis del DNA de la propia cé- lula, una enzima (una metilasa) que modifica el DNA de la célula, metilando ciertas bases de la se- cuencia de reconocimiento, lo cual evita que la en- zima de restricción corte su propio DNA. La mayoría de las enzimas de restricción usadas en ingeniería genética presentan un modo de acción relativamente simple. Estas enzimas sonnuclea- sasy como cortan una sección interna del DNA son denominadasendonucleasas de restricción. La nomenclatura para nombrar las enzimas de res- tricción se basa en algunas convenciones: Por ejemplo, Hind III: Se refiere a la tercera enzima de restricción caracterizada de la cepa Rd de la bacteria Haemophilus influenzae. EcoRV Se refiere a la quinta enzima de restricción caracterizada de la cepa RY13 de la bacteria Escherichia coli William M. Roca / Hernando Ramírez 49 CEDAF Introducción a la Biotecnología G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G G A-A-T-T-C C-T-T-A-A G G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G DNA Ligasa Eco RI a) b) Figura 3.5 Enzimas que cortan y ligan moléculas de DNA. a) La enzima de restricción EcoRI reco- noce y corta en la secuencia GAATTC, generando segmentos con extremos pegajosos. b) En condi- ciones apropiadas, los segmentos con extremos pegajosos complementarios se realinean y los cortes son reparados con la enzima DNA Ligasa. Fuente: Astec, 1993. Cada enzima de restricción reconoce una secuen- cia específica de pares de bases en la molécula de DNA, siendo las secuencias más comunes las de cuatro, cinco o seis pares de bases. 3.2.3 Otras enzimas importantes para la ingeniería genét ica DNA Ligasas Estas enzimas catalizan la formación de enlaces entre dos nucleótidos contiguos en una cadena de DNA de doble banda, por lo que uno de los usos de esta enzima es para reparar "huecos" en una de las bandas del DNA. Esta enzima también se usa para unir fragmentos en un vector de clonación, origi- nando un vector recombinante (Figura 3.5). DNA Polimerasas Estas enzimas son las que permiten la formación de cadenas (polímeros) de DNA, como se puede apreciar en la Figura 3.6. La síntesis es exclusiva- mente en la dirección 5'⇒ 3' con respecto a la ban- da que se está sintet izando. Cada desoxirribonucleótido que es incorporado durante la polimerización es complementario al de la ban- da molde (dA es complementaria a dT y dG es complementaria a dC). La transcriptasa reversa Es una DNA polimerasa que forma polímeros de DNA de cadena sencilla usando como molde una cadena de RNA. Esta enzima es utilizada para sin- tetizar cadenas de DNA a partir mRNA en el pro- ceso de producción de cDNA (DNA complementario), paso importante en la construc- ción de bancos de cDNA, los cuales son muy úti- les para el aislamiento de genes de interés. La Taq polimerasa Es una DNA polimerasa extraída de la bacteria Thermus aquaticus, que habita en los baños terma- les. Por esta razón, esta enzima no pierde su activi- dad catalítica cuando se incuba a una temperatura de 94oC. Debido a esta propiedad la Taq polimera- sa es utilizada en la técnica de la Reacción en Ca- dena de la Polimerasa (PCR) utilizado para la multiplicaciónin vitro de DNA a partir de poca cantidad de éste. 3.2.4 Vector genét ico Un vector genético es una molécula pequeña de DNA con un origen de replicación autónomo y que posee zonas que no son esenciales para su multipli- cación. Al eliminar estas regiones, éstas pueden ser reemplazadas por DNA foráneo. Estos vecto- res actúan como portadores y multiplicadores de DNA exógeno, cuando el vector se replica dentro de la célula hospedera. En general, el DNA del vector es fácilmente separable del DNA genómico 50 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Figura 3.6. Replicación del DNA, antes de la di- visión celular. Las dos cadenas del DNA se se- paran y sirven de moldes para la síntesis de dos nuevas cadenas. Fuente: Astec, 1993. del hospedero, pudiéndose obtener buenas cantida- des del DNA exógeno insertado en el vector. Los vectores más comúnmente utilizados en inge- niería genética son algunosplásmidosdeEscheri- chia coli y el bacteriófago Lambda (l). 3.2.5 Los plásmidos Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de DNA de doble banda, que están presentes en al- gunas bacterias como elementos extracromosoma- les. Los plásmidos confieren a sus hospederos bacterianos una variedad de características fenotí- picas que no son necesarias para su reproducción, pero que pueden conferirle alguna ventaja, como por ejemplo, la resistencia a un antibiótico. Para que un plásmido pueda ser utilizado como vector en ingeniería genética debe poseer las si- guientes propiedades: a. Tener una replicación autónoma en la célula hospedera; b. Conferirle a la célula hospedera resistencia a uno o varios antibio- ticos, para identificar aquellas bacterias que lo contienen; c. Poseer una región con secuencias de reconocimiento y corte único para varias enzimas de restric- ción de manera que sea inactiva- do en los eventos de inserción del DNA exógeno, permitiendo la selección de los plásmidos re- combinantes; d. Desde el punto de vista de biose- guridad, los plásmidos usados como vectores no deben ser transmisibles ni móviles, y deben tener hospederos específicos que sólo sobrevivan en medios de cultivos específicos. Dos vectores plasmídicos comúnmente utilizados son el plásmido pBR322 y el plásmido pUC19 (Fi- gura 3.7). 3.2.6 Hospederos Un hospedero ideal debe ser de fácil manipulación y propagación. Debe estar disponible en un amplio rango de cepas definidas genéticamente, y debe aceptar un amplio rango de vectores. La bacteria Escherichia coli reúne todos estos requisitos, por lo cual es utilizada en muchos protocolos de clona- ción. La entrada de un vector al interior de un hospedero se denomina transformación cuando el vector es un plásmido o transfección si el vector es un fago como el fagoλ. William M. Roca / Hernando Ramírez 51 CEDAF Introducción a la Biotecnología AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT 400 420 440 460 EcoRI Sacl Kpnl Smal Xmal BamHi Xbal Hincll Accl Sail Pstl Sphl Hin dlll lacZ´ ThrlleMetThr(Met) Ppal 1766 Cfr10l 1779 Gsul 1784 Scal 2177 Xmnl 2294 Sspl 2501 Aatll 2617 EcoO 109 2674 Ndel 183 Narl 235 396 EcoRl Sacl Kpnl Smal Xmal BamHl Xbal Hincl Pstl Hindll 447 Afllll 806 ´lacl Plac lac´z amp´ pUC19 2686bp ori Figura 3.7 Mapa de un vector comercial (el plásmido pUC19). Fuente: Ausubel y colaboradores,1988. Algunos vectores comerciales como los plásmidos de la serie pUC, presentan una región de clona- miento múltiple (polilinker) dentro de la secuencia que codifica por la subunidad alfa de la enzima be- ta-galactosidasa, la cual se complementa con otra subunidad codificada en el cromosoma del hospe- dero, para formar la enzima activa. La enzima be- ta-galactosidasa actúa sobre el sustrato X-gal, liberando el colorante azul índigo, tiñendo de azul las colonias bacterianas que expresan la enzima. Cuando se inserta un segmento de DNA foráneo en la región de clonamiento múltiple del vector, se inactiva la enzima y las colonias bacterianas pre- sentan su color blanco natural. Esta estrategia ofrece la posibilidad de identificar rápidamente las colonias con plásmidos recombinantes a través de esta sencilla prueba. 3.3 Aislamiento de genes Uno de los principales usos de la tecnología del DNA recombinante es el aislamiento y clonación de genes de interés de un organismo. Sin embargo, esta tarea es más complicada cuando se trata de ais- lar genes de organismos complejos, como son los animales y plantas. Existen algunas estrategias para aislar un gen espe- cífico de entre los miles presentes en el genoma ve- getal. Primero, hay que construir un banco de "genes", ya sea un banco genómico o un banco de cDNA y seguir procedimientos específicos para aislar el gen de interés de los bancos de genes. 3.3.1 Banco de DNA genómico Un banco genómico es una colección de vectores recombinantes (en un hospedero comoE. coli ) que contienen segmentos de DNA, los cuales represen- tan el genoma del organismo. En un banco genómico están presentes todas las se- cuencias del DNA genómico, como son los exo- nes, los intrones, y secuencias regulatorias. El número de clones requeridos para tener un banco genómico completo depende del tamaño del geno- ma de la planta y del tipo de vector de clonaje utili- zado. Los pasos básicos que se siguen para la construc- ción de un banco genómico son los siguientes: (Fi- gura 3.8). • Aislamiento de DNA genómico de alta calidad y de alto peso molecular. • Digestión con una endonucleosa de restricción. • Separación de los fragmentos por electroforesis o por cromatografía de columna. • Selección de fragmentos del tamaño deseado. • Unión de los fragmentos a un vector. • Introducción del vector a un hospedero, para la multiplicación de los vectores recombinantes. 52 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Selección de Colonias con Insertos DNA Genómico Fragmentos de Restricción Separación por Electroforesis Electroclución Fragmentos de 500-3000 bp Lac Z Lac Z AMP Plásmidio Plásmidio Abierto AMP Bacteria Competente Figura 3.8. Pasos básicos para la construcción de un banco de DNA genómico. 3.3.2 Banco de cDNA Un banco de cDNA es una colección de vectores recombinantes que contienen cDNAs de todos los mRNAs presentes en un tejido o célula, en un de- terminado estado de desarrollo, y en condiciones de crecimiento definido. En un banco de cDNA no están representados to- dos los genes de un organismo, pues la proporción de cada tipo de cDNA particular depende de: a. Los genes expresados al momento de la toma de la muestra; b. Los genes expresados en el tejido utilizado par ex- traer el mRNA y, c. La abundancia relativa de los mRNAs del tejido seleccio- nado. Los pasos básicos para la construcción de un banco de cDNA son los siguientes: • Aislamiento del RNA to- tal del tejido selecciona- do. • Aislamiento del mRNA . • Síntesis del cDNA . • Adición de adaptadores al cDNA . • Unión de los cDNA al vector. • Introducción del vector recombinante a un hospe- dero para la multiplica- ción de los vectores recombinantes. Los dos tipos de bancos (ge- nómico y de cDNA) son in- crementados en cepas bacterianas especiales. De éstas se pueden aislar colo- nias; y en su turno, de éstas se aislan los vectores recombinantes portadores de las secuencias presentes en cada uno de los ban- cos. 3.3.3 Ident i f icación y ais lamiento de genes Existen varios métodos para la identificación y aislamiento de secuencias de genes específicas, a partir de un banco genómico o de cDNA : 1. Hibridación de ácidos nucleicos, utilizando sondas construidas a partir de una secuencia parcial de la proteína codificada por el gen (Figura 3.9). 2. Utilizando anticuerpos específicos que pueden de- tectar la presencia del producto génico (proteína). William M. Roca / Hernando Ramírez 53 CEDAF Introducción a la Biotecnología Colonias de un banco de cDNA Transferencia de las colonias a una membrana de nylon Las cadenas de DNA se separan y se ligan a la membrana Sonda radioactiva La sonda radioactiva se hibridiza a una secuencia complementaria en la membrana de nylon Autorradiografía Identificación de la colonia con el "gen" en la caja madre Película fotográfica colocada sobre la membrana de nylon Membrana sumergida en una solución con la sonda radioactiva Membrana sumergida en solución alcalina Lisis de la bacteria y liberación del DNA Figura 3.9 Aislamiento de un gen a partir de un banco de DNA genómico. Fuente: Astec, 1993. 3.4 Secuenciación del DNA Cuando se ha aislado un gen de interés es necesario conocer la secuencia lineal de sus nucleótidos para estudios sobre la estructura génica y las secuencias que controlan su expresión. Este conocimiento además permite la modificación necesaria para que dicho gen pueda ser transferido y expresado en otro organismo. Existen dos técnicas para secuenciar segmentos de DNA: 1. El método enzimático (Método de Sanger) y, 2. El método químico (Método de Maxam y Gilbert). El método más utilizado es el método enzimático (Figura 3.10). Este método consiste en sintetizar una cadena complementaria a una cadena molde que se quiere secuenciar, de tal forma que el creci- miento de la cadena complementaria se puede de- tener en posiciones específicas, lo cual se logra utilizando compuestos análogos a los cuatro deso- xinucleótidos (dNTPs) que conforman la molécula de DNA. Estos compuestos análogos son denomi- nados dideoxinucleótidos (ddNTPs). La alta resolución de esta técnica permite separar por tamaño segmentos de DNA que se diferencian en tan sólo un nucleótido. La secuencia del frag- 54 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF O N NN NH2 PO= =O O O PO= =O O PO= =O O PO= =O O CH2 H H Grupo 3´ desoxi Trifosfato de didesoxiadenosina (ddATP) Fragmento de la cadena sencilla de DNA cuya secuencia se determinará A T G C T A T G C T C C 5´ Todas las mezclas de reactivos contienen dATP, dTTP, dGTP y dGTP y DNA polimerasa A T G C T A T G C T C C 5´ dd A C G A T A C G A G G ddA T A C G A G G ddA C G A G G ddA G G ddA ddC ddG ddT T A C G A T A C G A G G Fragmentos Mayores Fragmentos Menores Sentido de la síntesis (a) (b) (c) GCAT 400 350 300 250 200 150 100 75 50 (d) (e) +ddATP +ddCTP +ddGTP +ddTTP Productos de la reacción en la mezcla con dideoxiATP Figura 3.10 Secuenciación de segmentos de DNA por el método enzimático. Fuente: Villée y colaboradores, 1998. mento de DNA analizado se puede determinar de un modo directo mediante lectura del gel, visuali- zando las bandas que aparecen escalonadamente leyendo el gel de abajo hacia arriba los cuatro "ca- rriles" de la autorradiografía. Actualmente existen secuenciadores automáticos que permiten secuenciar hasta 96 muestras dife- rentes de DNA en pocas horas. Dado que la resolu- ción de esta tecnología l lega hasta un solo nucleótido, la secuenciación se ha convertido en la forma más precisa de medir la variabilidad y diver- sidad genética. La masificación también ha redu- cido signi f icat ivamente el costo de la secuenciación. 3.5 Ejercic io 3.1 Tecnología del DNA recombinante Objetivos • Desarrollar el concepto de DNA recombinante. • Analizar e interpretar los patrones electroforé- ticos: a) de un segmento de DNA digerido con dos enzimas de restricción; y b) de un plásmido recombinante,digerido con una enzima de res- tricción. Orientaciones para el instructor El siguiente ejercicio consiste en el análisis de dia- gramas con muestras de un segmento de DNA di- gerido con dos enzimas de restricción y un diagrama de electroforesis de un plásmido sin in- serto, con inserto y de un plásmido recombinante digerido con la enzima de restricción EcoRI. En este ejercicio se busca que los participantes fijen el concepto de DNA recombinante y sus aplicacio- nes. Para la realización de este ejercicio se recomienda que el instructor lea cuidadosamente las siguientes instrucciones: • Suministre orientación general sobre los objeti- vos del ejercicio. • Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. • Colocar en cada mesa un juego de los diagra- mas de los geles suministrados. • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique cada grupo en cada una de las mesas de trabajo. • En cada grupo, los participantes deben analizar e interpretar los diagramas de los patrones elec- troforéticos y responder las siguientes pregun- tas: a. Los sitios de reconocimiento y de corte de las enzimas de restricción EcoRI y Hind III en el segmento de DNA son los mismos o diferentes. Explique. b. ¿Cuántos sitios de reconocimiento y de corte se presentan en el segmento de DNA para cada una de las enzimas de restricción del ejercicio? c. ¿Por qué el segmento de DNA sin digerir mi- gra poco? Explique. d. ¿Por qué el plásmido pUC19: - Sin inserto, - con inserto y - con inserto y digerido con EcoRI presentan di- ferente patrón de bandas? Explique. e. Haga un dibujo de un gel que presenta las si- guientes muestras. 1. Plásmido pUC19 sin inserto. 2. Plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb. 3. Plásmido pUC19 con inserto de 2Kb William M. Roca / Hernando Ramírez 55 CEDAF Introducción a la Biotecnología 4. Un inserto de 1Kb 5. Un inserto de 2Kb • Motive una discusión a base de las respuestas dadas. • Proporcione la información de retorno, con las respuestas de este ejercicio. Recursos necesarios • Papelógrafo, papel, marcadores. • Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo. • Diagramas de los patrones electrofréticos : a. de un segmento de DNA digerido con EcoRI y Hind III, (Figura 1) y b. de un plásmido recombinante digerido con EcoRI (Figura 2). • Fotocopias con las Instrucciones e información de retorno para los participantes. Tiempo sugerido: 60 minutos. Instrucciones para el participante De acuerdo con la información suministrada en la sección 3 y mediante el análisis e interpretación de los diagramas de geles con un segmento de DNA digerido con las enzimas de restricción EcoRI y Hind III y del gel con el plásmido pUC19: a. sin inserto, b. con inserto y c. con inserto y digerido con Eco RI, los participantes deberán desarrollar el concepto de DNA recombi- nante. Pasos a seguir • Conforme cuatro grupos de trabajo de acuerdo con las instrucciones dadas por el Instructor. • Nombrar un relator por grupo, el cual presenta- rá en plenaria las respuestas dadas por el grupo. • Analizar e interpretar los diagramas suminis- trados y contestar las siguientes preguntas. a. Los sitios de reconocimiento y de "corte" de las enzimas de restricción EcoRI y Hind III en el segmento de DNA son los mismos o diferen- tes. Explique. b. ¿Cuántos sitios de reconocimiento y de "cor- te" se presentan en el segmento de DNA para cada una de las enzimas de restricción del ejer- cicio? c. ¿Por qué el segmento de DNA sin digerir mi- gra poco? Explique. d. ¿Por qué el plásmido pUC19: - Sin inserto, - Con inserto y - Con inserto y degerido con EcoRI presen- tan diferente patrón de bandas? Explique. e. Haga un dibujo de un gel que presenta las si- guientes muestras. 1. Plásmido pUC19 sin inserto. 2. Plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb. 3. Plásmido pUC19 con inserto de 2Kb 4. Un inserto de 1Kb 5. Un inserto de 2Kb • Al finalizar el Instructor les proporcionará la in- formación de retorno. Respuestas a las preguntas del ejercicio. Para la pregunta a Son diferentes. • Primero, porque el número de fragmentos ge- nerados conEcoRI son 3, mientras que con Hind III son 4. • Segundo, porque el tamaño de los fragmentos generados con cada una de las enzimas son di- ferentes. 56 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Para la pregunta b Hay 2 paraEcoRI y 3 para Hind III. Para la pregunta c El segmento de DNA sin digerir es un DNA de gran tamaño y la migración en el gel (en la electro- foresis) es proporcional al tamaño. Fragmentos grandes migran poco, fragmentos pequeños mi- gran mucho. Para la pregunta d El plásmido pUC19 sin inserto tiene un tamaño de ≈3Kb, el plásmido pUC19 con un inserto de 1Kb tiene un tamaño de 4 Kb y el plásmido pUC19 con un inserto de 1 Kb digerido con EcoRI libera el in- serto, presentando 2 segmentos de DNA uno del plásmido de≈3 Kb y el otro que corresponde al in- serto de 1 Kb. En una electroforesis migración así: 1. pUC19 (abierto) 2. pUC19 + I (1 Kb) 3. pUC19 + I (1 Kb) digerido con Eco RI. Para la pregunta e 1. pUC19 2. pUC19 + I (1 Kb) 3. pUC19 + I (2 pK) 4. Inserto (1 Kb) 5. Inserto (2 Kb) William M. Roca / Hernando Ramírez 57 CEDAF Introducción a la Biotecnología Plásmido pUC19. 1) sin inserto, 2) con un sinderto de 1 kb, y 3) con inserto de 1 kb y digerido con Eco - RI. Segmento de DNA de 25 kb. 1) Sin digerir. 2) Dige- rido con EcoRI y 3) Digerido con Hind III. Bibl iograf ía Austral ian Science and Technology Counci l (astec). 1993. Gene Technology Issues for Austral ia. Occasional Paper No. 27. Austral ian Government Publ ishing Service. Canberra. 151 p. Ausubel , F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Seidman, J. G., Smith, J.A., y Struhl , K. 1988. Current Protocol in Molecular Biology. USA. Bustamante, R. R., Pacheco, I . T. , Garzon-Tiznado, J. A., y Herrera Estrel la, L. (eds.) . 1991. Introducción a la Biología Molecular e Ingeniería Genét ica de Plantas. Pr imera Edición. Celaya, Gto. Mexico. 222p. Nichol l , D. S. T. 1996. An Introduct ion to Genet ic Engineer ing Cambridge Universi ty y Press. Cambridge, U. K. 168 p. Pel lón, J. R. 1986. La Ingeniería Genét ica y sus Apl icaciones. Edi tor ia l Acr ib ia, S. A. Zaragoza, España. 237 p. Vicente, M., y Renart , J. (eds.) . 1987. Ingeniería Genét ica. Consejo Superior de Invest igaciones Cientí f icas. Madrid España. 288 p. Vi l lée, C.A., Solomon, E.P., Mart ín, C.E., Mart in, D.W., Berg, L.R. y Davis, P.W. 1998. Biología. Interamericana - McGraw-Hi l l . Mexico. 1407 p. 58 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Originales para Transparencias William M. Roca / Hernando Ramírez 59 CEDAF Introducción a la Biotecnología 6 0 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Enzimas de restricción • Enzimas modificadoras del DNA • Vectores • Hospederos Generación de fragmentos de DNA Unión de los fragmentos a un vector molecular Introducción del vector a una célula hospedante para la amplificación Utilizand o “sondas" Utilizando anticuerpos específicos Selección de una secuencia (gen) específica Tecnología del DNA recombinante Herramientas Clonación y aislamiento de genes • W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 6 1 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante • Describir las herramientas más importantes de esta tecnología. • Conocer algunas de sus aplicaciones. OObbjjeett iivvooss 6 2 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F ¿¿QQuuéé eess llaa IInnggeenniieerrííaa GGeennéétt iiccaa?? Es el conjunto de técnicas involucradas en la manipulación del material genético (DNA o RNA), la cual se basa en la tecnología del DNA recombinante. En DNA recombinante consiste en aislar segmentos específicos de DNA para introducirlos en vectores( p l á s m i d o s ) a f i n d e f o r m a r m o l é culas de DNA recombinantes que son introducidas por transformación a un hospedero ( ) para el mantenimiento y ampl i f icación del DNA recombinante. E. Coli W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 6 3 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía Investigación básica (estructura y función de los genes). Identificación y mapeo de genes. Producción de Enzimas y proteínas po r clonación de genes. Producción de animales y plantas transgénicas. UUtt ii ll iizzaacciióónn ddeell DDNNAA RReeccoommbbiinnaannttee 64 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF G en er ac io n de fr ag m en to s de A D N U ni ón de lo s fr ag m en to s a un ve ct or m ol ec ul ar In tr od uc ci on de l v ec to r a un a cé lu la ho sp ed an te , p ar a la am pl ifi ca ci ón S el ec ci ón de un a se cu en ci a es pe cí fic a EE tt aa pp aa ss BB áá ss ii cc aa ss pp aa rr aa ll aa CC ll oo nn aa cc ii óó nn dd ee GG ee nn ee ss William M. Roca / Hernando Ramírez 65 CEDAF Introducción a la Biotecnología D N A m R N A Tr an sc rip ci ón Tr ad uc ci ón P R O T E IN A Tr an sc rip ci ón R ev er sa R ep lic ac ió n E l D og m a C en tr al de la B io lo gí a 66 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF • La s en zi m as de re st ric ci ón • La s en zi m as m od ifi ca do ra s de l D N A • Lo s ve ct or es • Lo s ho sp ed er os HH ee rr rr aa mm ii ee nn tt aa ss dd ee ll aa II nn gg ee nn ii ee rr íí aa GG ee nn éé tt ii cc aa W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 6 7 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía Construcción de un banco del cDNA. Identificación y aislamiento de genes de un banco de cDNA. • Utilizando “Sondas” construidas a partir de una secuencia parcial de la proteína codificada por el gen. • Utilizando anticuerpos específicos que pueden detectar la presencia del producto génico (proteina). PPaassooss ppaarraa eell AAiissllaammiieennttoo ddee GGeenneess 1 2 68 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Marcadores Moleculares William M. Roca / Hernando Ramírez 69 CEDAF Introducción a la Biotecnología Sección 4 Sección 4 . Marcadores Moleculares 70 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla de Contenido Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 Preguntas Orientadoras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72 4.1 El genoma y la variabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 4.2 Los marcadores moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 Originales para transparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Estructura de la Sección Objetivos • Entender los principios básicos de los marcadores moleculares. • Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal. Preguntas Orientadoras 1. ¿Sabían ustedes que cada uno de nosotros tiene un huella digital a nivel molecular llamada DNA fingerprin- ting? 2. ¿Algún participante puede dar una definición de genoma? 3. ¿Sabían ustedes que los marcadores moleculares nos permiten detectar cualquier cambio en los genomas de los individuos y nos permite diferenciar individuos idénticos fenotipicamente? William M. Roca / Hernando Ramírez 71 CEDAF Introducción a la Biotecnología RFLPs Microsatelites RFLPs Microsatelites RAPDs Microsatelites RFLPs RFLPs RFLPs Microsatélites AFLPs RFLPs Microsatélites Marcardores Molecurales • Caracterizac ión y análisis de la variabilidad genética • Identificación de acervos genéticos Mapeo de genes cualitativos y cuantitativos Estrategias de fitomejoramiento Majoramiento asistido por marcadores moleculares Clonación de genes con base a mapas genéticos Selección asistida por marcadores moleculares Identificación y transferencia de QTLs de germoplasma silvestre Introgresión de transgenes Introducción El estudio de la diversidad genética y la relación entre y dentro individuos de especies animales y vegetales es un tema de mucho interés no sólo para los mejoradores sino también para otras disciplinas biológicas, incluyendo ecología, medio ambiente y biodiversidad. La evaluación de la variabilidad genética entre in- dividuos de una misma especie puede realizarse mediante el uso de marcadores morfológicos (fe- notipo), marcadores bioquímicos (isoenzimas) y marcadores moleculares basados en el DNA (ge- notipo). Los dos primeros permiten realizar el es- tudio indirecto del genoma, ya que ambos son producto de la expresión génica. Estos fueron de gran utilidad en el desarrollo de los primeros siste- mas de clasificación y las primeras versiones de mapas genéticos. Los marcadores moleculares sin embargo, permiten realizar la caracterización y evaluación directa de los genomas de los indivi- duos. Un marcador molecular es un segmento específico de DNA correspondiente a regiones codificantes o no codificantes del genoma y cuya secuencia pue- de o no ser conocida. El objetivo de esta sección es presentar en forma didáctica los principios y usos de los marcadores moleculares, más utilizados. En las Tablas 4.1 y 4.2 se presenta un análisis comparativo de las ca- 72 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Variable RFLPs RAPDs Microsatélites AFLPs Modo de observación del polimorfismo Fragmentos de restricción de DNA detectado por hibridización con una sonda de DNA genómico o de DNA Segmentos de DNA amplificados aleatoriamente Ampliación específica de regiones con secuencias repetitivas. Segmentos amplificados vía PCR después de digestión con 2 enzimas de restricción Expresión genética Co – Dominante Dominante Co – Dominante Dominante Número de alelos por locus Multialético 2 alelos (binarios) Altamente Multialético 2 alelos (binario) Disponibilidad de marcadores en el genoma Prácticamente ilimitada Prácticamente ilimitada Prácticamente ilimitada Prácticamente Ilimitada Distribución en el genoma Regiones con bajo número de copias; mediante repetitivas en telomeros y centromeros (minisatelite) Más o menos en todo el genoma Más o menos en todo el genoma Más o menos en todo el genoma Transferencia de la ocurrencia de los marcadores Intra – específica; alta para especies próximas Intra– poblacional; media Intra – específica Intra – específica; baja para especies próximas Intrapoblacional y media intraespecífica Pasos para su detección. · Extracción de DNA · Digestión con Enzima de restricción · Electroforesis (agoniza) · Transferencia membrana Nylon · Hibridación con sonda · Autorradiografía · Extracción del DNA . Amplificación vía PCR · Electroforesis (agarosa) · Tincion con bromuro del etidio · Visualización de bandas con luz U.V · Extracción del DNA · Amplificación específica vía PCR · Electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa · Autorradiografía o coloración con bromuro del etidio. · Extracción de DNA · Digestión con EcoRI y MseI · Ligación de adaptadores · Amplificación vía PCR · Electroforesis (acrilamida) · Autorradiografía. Información previa para la aplicación de la técnica Construcción de banco de DNA genómico o de cDNA de la especie para obtenciónde las sondas Utilización inmediato de “Primers” arbitrarios disponibles en el mercado. · Construcción de banco de DNA genómico · Selección de clones con microsatélites adecuados · Secuenciación de los clones. · Construcción de los primers · Ensayo del polimorfismo con estos primers · Ensayos de combinaciones de enzima / primers con bases arbitrarias adecuados. Accesibilidad Media Muy alta Muy baja Media Costo de implementación / costo de operación Medio / medio Bajo / bajo Muy alto / medio Bajo / bajo Tabla 4.1 Análisis comparativo de los principales marcadores moleculares utilizados para el análisis genético de plantas. Fuente: Ferreira y Grattapaglia, 1995. racterísticas de los cuatro principales marcadores moleculares utilizados en el mejoramiento genético de plantas. Tabla 4.2 Análisis de la eficiencia de los marcadores moleculares en diferentes aplicaciones del análisis gené- tico. Fuente: Ferreira y Grattapaglia (1995). RFLPs RAPDs MICRO- SATELITES AFLPs Identificación de genotipos Alta Muy alta Muy alta Muy alta Evaluación de germoplasma Alta Alta Alta Muy alta Mapeo genético Alta Alta Muy alta Alta Mapeo direccionado a regiones específicas Media Muy alta Media Muy alta Mapeo comparativo Muy alta Baja Alta Baja Genética de autógamas Media Alta Muy alta Muy alta Genética de alógamas Muy alta Muy alta Muy alta Muy alta Análisis filogenético Muy alta media Alta Media 4.1 El genoma y la var iabi l idad genét ica El término genoma se refiere al contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por el contenido genético nuclear y orga- nelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el término genoma casi siempre se utiliza para referirse a la información genética presente sólo en el genoma nuclear. Los cromosomas de las plantas contienen una gran cantidad de DNA y su organización es muy compleja (Figura 4.1). Presenta regiones codifican- tes (genes) separados por largas regiones de DNA no codificante; éstas a su vez estan formadas por blo- ques de secuencias repetitivas denominadas VNTRs (del inglés variable number of tandem repeats), que fueron identificados por primera vez en el genoma humano. Además dentro de las regiones codificantes (genes) hay pequeñas regiones no codificantes (Intro- nes), que también están formadas por secuencias re- petidas (Figura 4.2). William M. Roca / Hernando Ramírez 73 CEDAF Introducción a la Biotecnología Telómero Satélites Variables rDNA Genes Repeticiones en Tandem Centrómero Telómero Genes Figura 4.1 Distribución de la información en un cro- mosoma. Fuente: Tohme, J., (Comunicación perso- nal, 1998) GEN GEN DNA Flanqueador DNA Flanqueador DNA Codificante Figura 4.2 Organización del DNA en el cromosoma. El DNA en el cromosoma está organizado en genes y DNA espaciador. El DNA espaciador adyacente a los ge- nes se llama DNA flanqueador. El DNA codificante, codifica para proteínas y el DNA flanqueador regula la expresión de los genes. Por ejem - plo: · Secuencias de Iniciación · Secuencias de terminación · Promotores · Activadores · Silenciadores Fuente: Astec, 1993. Existen además copias de genes no funcionales (seudogens) que son incapaces de expresarse debi- do a deleciones u otras alteraciones en su secuen- cia. En resumen, los genes de los organismos eucariotes pueden presentarse como copia única o como copias múltiples organizados en familias de genes, o dispersos en los diferentes cromosomas. Durante la división celular cada organismo repro- duce una copia fiel de su genoma. Sin embargo, existen muchos mecanismos que pueden causar al- teraciones en el DNA durante la evolución y se- lección natural y / o artificial. Los cambios pueden ser simples, es decir que afectan sólo un par de ba- ses (mutación puntual); o grandes cambios como resultado de inversiones, translocaciones, delecio- nes o transposiciones. Si a esto le sumamos los in- tercambios genéticos que ocurren en los procesos de recombinación, durante la reproducción sexual, resulta una gran variabilidad en las secuencias de los genomas de los individuos. Esta variabilidad es aprovechada en el mejoramiento genético de plantas y animales; y es fuente de genes para la biotecnología. La variabidad genética puede ser detectada de di- ferentes maneras: a. Usando marcadores morfológicos y marcadores bioquímicos (isoenzimas) que son productos de la expresión de los genes y b. Usando los marcadores moleculares, que permiten detectar diferencias entre individuos directamente a nivel de las secuencias del DNA de su genoma. Los marcadores visibles (fenotipo) como son las mutaciones en genes con consecuencias en la mor- fología, por ejemplo, el color de los ojos en la mosca de la fruta (Drosófila melanogaster) han sido usados en estudios genéticos desde comienzos del siglo XX. En 1959, Market y Moller mostraron diferencias genéticas usando cambios en la tasa de migración de isoenzimas a través de un gel de almidón, en un campo eléctrico (electroforesis). Estos marcadores (morfológicos y bioquímicos) fueron útiles para la construcción de los primeros mapas genéticos de algunos organismos en la dé- cada del 70. Sin embargo, estos marcadores pre- sentan algunos inconvenientes para una buena evaluación del genoma de un organismo: a. Un reducido número de marcadores que no permite hacer un buen cubrimiento del genoma; b. Efecto ambiental en la expresión de ellos; c. "Enmascaramiento" de la expresión de los genes recesivos; d. Efectos epistáticos, etc. Con el descubrimiento de las enzimas de restric- ción, el desarrollo de las técnicas del DNA recom- binante, y de la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa), se desarrolla una nueva clase de marcadores, denominados marcadores moleculares, los cuales son el objetivo de esta sec- ción. 4.2 Los marcadores moleculares Los marcadores moleculares (MM) son un grupo de técnicas que permiten el estudio del genoma de un organismo a nivel del DNA. Los MM están ba- sados en el grado depolimorfismo (diferencias) que ocurre naturalmente en el material genético de los organismos eucarióticos superiores, debido a la gran complejidad en la estructura de sus genomas. Para ser útil, un marcador molecular debe reunir las siguientes propiedades: a. Que sea altamente polimórfico, es decir, que permita claramente diferenciar dos indivíduos; b. Que sea codominante, para que permita discriminar un individuo homocigoto de uno heterocigoto; c. Que este distribuido a través del genoma; 74 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF d. Que no presente efecto pleiotrópico , es decir, que un gen no afecte más de una característica; e. Que sea de fácil y rápida ejecución, con mira a una posible automatización; f. Que tenga alta reproducibilidad; g. Que permita el fácil intercambio de datos entre laboratorios. Los marcadores moleculares permiten estimar : • El número de genes responsables de una carac- terística. • La localización cromosómica de genes, por ejemplo, ¿cerca de qué marcador molecular? • El efecto fenotípico, es decir, ¿cuánto afecta cada gen la característica? • La dosis génica (o acción génica): ¿un indivi- duo con dos copias del gen es diferente de aquel que presente una sola copia? • La pleiotropía: ¿un gen afecta más de una ca- racterística? • La sensibilidad ambiental: ¿la función de los genes es similar en diferentes ambientes? • La epistasis: ¿el efecto de un gen influencia el efecto de otros genes? Es concepto de marcadores mo- leculares ha revolucionado la habilidad de detectar regiones (segmentos) dentro del genoma, responsables de caracteres im- portantes (cuantitativos), y ha acelerado el proceso de cons- trucción de mapas genéticos lo cual permite un mejoramiento más dirigido. Los MM son dis- cretos, codominantes, no deleté- reos, sin efecto ambiental, libre de epístasis y pueden ser genera- dos en número ilimitado, permi- tiendo una cobertura saturada del genoma. 4.3 Breve reseña de algunos marcadores moleculares4.3.1 Pol imorf ismo en la longi tud de los fragmentos de restr icción (en inglés RFLPs) La presencia o ausencia de sitios de reconocimien- to para una determinada enzima de restricción pue- de variar en los genomas de los diferentes individuos, lo cual puede generar un polimorfismo (Figura 4.3). Las diferencias en los sitios de reco- nocimiento para una enzima de restricción puede ser debido a la ocurrencia de : mutaciones puntua- les, inserciones, deleciones, o rearreglos en el ge- noma debido a translocaciones o inversiones, alterando asi la distancia entre los sitios de corte de la enzima. Esto genera segmentos de DNA (frag- mentos de restricción) de diferentes tamaños. Cuando el genoma es pequeño (por ejemplo, de una bacteria o de un virus), estos fragmentos pue- den ser separados por electroforesis en un gel de William M. Roca / Hernando Ramírez 75 CEDAF Introducción a la Biotecnología A __ __ ___________________________ __ __ B __ __ ________________________ __ __ A B A B Sonda 1 2 ER Figura 4.3 Base molecular del polimorfismo de los marcadores moleculares RFLPs. 1. Digestión de segmentos homólogos de DNA genómico de dos indi - viduos (A y B) con una misma enzima de restricción (ER). 2. Separación de los fragmentos por electroforesis. El polimorfismo se aprecia en la diferencia de los tamaños de los fragmentos de restricción. Fuente: Bernatzky, R., 1988. agarosa y visualizados al "teñir" el gel con una so- lución de bromuro de etidio (Figura 4.4). Cuando el genoma es grande (por ejem- plo, plantas o animales), los fragmentos generados son separados por electrofore- sis, transferidos a una membrana de nylon (Southern blot), donde son fijados a la membrana con luz ultravioleta. Las membranas se tratan con una solución al- calina para abrir las cadenas y luego se hibridiza con una sonda radioactiva o no radioactiva (hibridización). Finalmente la membrana se expone a una película de rayos X que al revelar se obtiene una au- torradiografía que permite visualizar el polimorfismo. (Figura 4.5). Los RFLPs presentan ventajas que los hacen atractivos y útiles en programas de mejoramiento. Algunas de éstas son: el número de RFLPs es ilimitado, no presentan efectos pleio- trópicos ni epistáticos, la herencia de los fragmen- tos es mendeliana y estable, y son codominantes. (Figura 4.6). También los RFLPs pueden ser anali- zados en todas los tejidos y a cualquier edad fisio- lógica del individuo; las muestras de DNA pueden ser almacenadas por largos períodos de tiempo; se puede obtener un número ilimitado de combinan- ciones enzimas/sondas; los genes heterólogos pue- den ser usados como sondas y se puede analizar varios loci con una sonda. 76 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF DNA Genómico 7kb 3kb 5kb 10kb 1.5kb Fragmentos de Restricción 7kb 3kb 5kb 10kb 1.5kb 0 (-) (+) Separación de los fragmentos por su tamaño Digestión con enzima de Restricción Figura 4.4 Separación y visualización de los fragmentos de restricción utilizando la técnica de electroforesis en geles de agarosa. Ezimas de restricción Pst 1 Fragmentos de DNA Fragmentos de 500 A 2500 bp Plásmidio abierto + Fragmento Análisis Transferencia a membrana de nitrocelulosa Sonda radiactiva Fragmentos de DNA (Muchas copias PstI) Hibridación Plásmido con fragmento de DNA Autorradiografía Fragmentos de DNA Extracción de DNA Célula transformada por el plásmido Ligamiento Plásmido Colonias de Plásmidos Selecciona colonias con plásmido que contienen los fragmentos Genoteca Células Competentes Figura 4.5 Secuencia del proceso de detección de los RFLPs en ge - nomas grandes (por ejemplo, animales y plantas). Pst1= Endonucleasa de restricción obtenida de la bacteria Providen - cia Stuartii; bp= pares de bases. Fuente: Ramírez y colaboradores, 1991. 4.3.2 Marcadores moleculares basa- dos en la reacción en cadena de la pol imerasa (PCR) La reacción cadena de la polimerasa (PCR) es un método para la multiplicaciónin vitro de secuen- cias específicas de DNA. Se utilizan "primers" (ce- badores) que delimitan la región de interés en el DNA que se va a amplificar o multiplicar. El PCR fue descubierto por K. Mullis en la década de los 80s. En 1988, Saiki y colaboradores aislaron una DNA polimerasa de la bacteria termofílicaTher- mus aquaticus, denominada "Taq polimerasa", la cual es termoestable a altas temperaturas. Este ha- llazgo permitió la automatización del PCR. La técnica PCR consiste de una serie repetitiva de ciclos (20-40), consistiendo cada una de tres eta- pas: a. Desnaturalización del segmento de DNA que se va a amplificar, generalmente se utiliza una temperatura de 94oC; b. Alineamiento de los "primers" a las cadenas del DNA patrón, a una temperatura muy cercana al Tm (temperatura a la cual el 50% del DNA está desnaturalizado), generalmente entre 37-60 oC; c. Extensión de los "primers": la Taq polimerasa incorpora desoxirribonucleótidos a la cadena nueva, produciendo una copia complementaria del DNA patrón, a una temperatura de 72 oC. Las copias de DNA aproximadamente se duplican en cada ciclo. En la práctica la amplificación no es 100% eficiente, pues en 20 ciclos, la producción es de 105 a 108 veces la cantidad inicial de segmentos de DNA. Esta escala de amplificación permite ini- ciar el proceso con cantidades mínimas de DNA (del orden de picogramos o nanogramos), y termi- nar con grandes cantidades de una secuencia espe- cífica de DNA. (Figura 4.7). William M. Roca / Hernando Ramírez 77 CEDAF Introducción a la Biotecnología F1 F2 6 kb 8 kb 6kb/6kb 8kb/8kb 6 kb 8 kb 8kb/6kb 6 kb 6kb/6kb 6 kb 8 kb 8kb/6kb 6 kb 8 kb 8kb/6kb 8 kb 8kb/8kb R/R r/r R/r R/R R/r R/r r/r Figura 4.6 Análisis genético de plantas utilizando marca- dores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989. DNA Original Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4, etc. Secuencia que se va a amplificar Figura 4.7. Principio de la reacción en cadena de la poli - merasa (PCR).Fuente: Weising y colaboradores, 1995. La técnica del PCR es aplicable a muchas áreas bá- sicas y prácticas; por ejemplo: diagnóstico, investi- gaciones médicas, medicina forense, y es base para la utilización práctica de los marcadores molecu- lares como: RAPDs, microsatélites, AFLPs, etc. 4.3.3 Pol imorf ismo de DNA ampl i f ica- do aleator iamente (en inglés RAPDs) Esta metodología permite detectar polimorfismos de secuencias de nucleótidos, utilizando solamente un "primer" (decanucleótido) de secuencia "arbi- traria" para la amplificación del DNA. La mayor ventaja de esta técnica es que no se re- quiere información de la secuencia del DNA, ade- más el protocolo es relativamente rápido y fácil de realizar y no utiliza radioctividad. Como esta técni- ca esta basada en la amplificación de segmentos por medio del PCR, se necesita poca cantidad de DNA genómico (nanogramos La naturaleza molecular del polimorfismo de los RAPDs no está totalmente conocida. Evidencias experimentales indican que diferencias de apenas un par de bases (mutación puntual) es suficiente para que no haya una perfecta complementaridad del "primer" con el sitio de iniciación, impidiendo la amplificación de este segmento. El polimorfismo genético detectado por los marca- dores RAPD también son de naturaleza binaria, esto significa que un segmento amplificado (banda en el gel) puede estar presente o ausente (Figura 4.8). Una limitación de los RAPDs (por ser marcadores dominantes), es la dificultad de discriminar direc- tamente los genotipos homocigotos. Además, los perfiles de amplificación pueden va- riar de un laboratorio a otro debido a diferencias en los termocicladores utilizados. 78 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 3kb 5kb 1.5kb 1.0kb Primers Separación de los fragmentos por e lectrofores is 1.5 kb 1.0 kb 3.0 kb 1.5 kb 2.5 kb 3.0 kb Individuo A Individuo B 5´ Figura 4.8 Base molecular del polimorfismo de los RAPDs. Fuente: Adaptado por Ramírez, H., 1993. 4.3.4 Microsatéli tes Los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSR - Simple Sequence Repeats) son secuencias pequeñas de 1a 4 nucleótidos que se repiten en blo- ques. En los genomas de los organismos eucarióti- cos, estas secuencias simples son más frecuentes, bién distribuidas y presentan loci genéticos alta- mente polimórficos. Este tipo de secuencias varían entre animales y ve- getales. Por ejemplo, en mamíferos las secuencias más comunes son (GT)n y (CA)n, donde n repre- senta el número de veces que se repite la secuencia. En plantas, las secuencias más comunes son (AA)n y (AT)n. Wu y Tanksley encontraron en 1993 que en el genoma de maíz y arroz las secuencias más comunes son (GA)n, (GT)n y las complementarias (CT)n y (CA)n. Los microsatélites pueden ser amplificados indivi- dualmente vía PCR, utilizando un par de "primers" especialmente diseñados (de 20-30 bases), com- plementarios a las secuencias únicas que limitan (flanquean) los microsatélites. Los segmentos am- plificados son separados por electroforesis en un gel de agarosa y visualizados, después de la tinción con bromuro de etidio, en una pantalla con luz ul- travioleta. La base molecular del polimorfismo radica en la diferencia del número de unidades repetidas en los diferentes loci de microsatélites. Cada segmento, de tamaño diferente (amplificado generalmente desde varias decenas hasta centenas de pares de bases) representa un alelo diferente de un locus. Los microsatélites amplificados vía PCR ofrece ventajas como: a. Su alto polimorfismo, y por consiguiente son altamente informativos; b. Son codominantes, lo que permite diferenciar individuos homocigotos y heterocigotos; c. Disponibilidad de una buena colección de diferentes microsatélites, algunos de los cuales ocurren en alto número de copias; d. Están más o menos dispersos a través del genoma; e. La técnica puede ser automatizada. Por estas características, los microsatélites son ideales para el mapeo genético y mapeo físico de genomas, para la identificación y discriminación de genotipos y para estudios de genética de pobla- ciones. 4.3.5 Pol imorf ismo en la longi tud de fragmentos ampl i f icados (en in- glés AFLPs) La técnica AFLP se basa en la amplificación selec- tiva, vía PCR, de fragmentos de restricción de DNA genómico. La técnica comprende cuatro eta- pas: 1. Generación de fragmentos de restricción de DNA genómico. 2. Ligación de adaptadores específicos a los fragmentos. 3. Amplificación selectiva de un grupo de fragmentos vía PCR. 4. Separación de los fragmentos amplificados por electrosforesis y análisis de los fragmentos amplificados. La base molecular del polimorfismo de los AFLPs, al igual que el de los RFLPs, se debe a las diferen- cias en los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción utilizados en el estudio (en este caso EcoRI y MseI). Estos cambios se deben a mutacio- nes puntuales, inserciones, deleciones, o rearreglos en el genoma debido a translocaciones e inversio- nes, lo cual causa la pérdida o ganancia de secuen- cias de reconocimiento. Los AFLPs, al igual que los RAPDs, son marcado- res dominantes, lo cual no permite diferenciar in- dividuos homcigotos de heterocigotos. William M. Roca / Hernando Ramírez 79 CEDAF Introducción a la Biotecnología El poder de la técnica de AFLP se basa en las varia- ciones genéticas que existen entre especies, varie- dades o cultivares estrechamente relacionados. Estas variaciones en su secuencia del DNA son ex- plotadas por esta técnica para la obtención rutina- ria de "fingerprintings" (huellas dactilares) de un genotipo en particular. Estos "fingerprintings" son simples RFLPs amplificados selectivamente vía PCR. Desde su desarrollo, esta técnica ha sido utilizada para discriminar genotipos, para mapeo genético localizado (Bulk Segregant Analysis) y para la construcción de mapas genéticos. 4.3.6 Marcaje de secuencias expresa- das (en inglés ESTs) Los ESTs son secuencias cortas de DNA (200-500 pb) de clones seleccionados al azar de un banco de cDNA. El propósito de estas secuencias es realizar un monitoreo rápido de todos los genes que confor- man el genoma de un cultivo en particular, con el fin de "marcar" su localización en los cromosomas. Una aplicación obvia de los ESTs es la identifica- ción, localización y aislamiento de nuevos genes, en donde la secuencia EST es utilizada como "son- da" para "pescar" el gen completo en un banco ge- nómico o en bancos de cromosomas artificiales YACs (yeast artificial chromosomes) o BACs (bacterial artificial chromosomes). Los ESTs también se utilizan para identificar y ais- lar genes homólogos en cultivos relacionados. En especies no relacionadas, la comparación de los ESTs permite la identificación de secuencias alta- mente conservadas que luego se utilizan para dise- ñar "primers" apropiados para aislar los genes completos en bancos genómicos o de cromosomas artificiales de los respectivos cultivos. Los ESTs son útiles para la construcción de "son- das" de genes específicos para el análisis de la ex- presión diferencial de familias multigénicas. Además se usan para el mapeo y secuenciación del genoma, utilizando clones de cromosomas artifi- ciales (YACs o BACs). En conclusión, los ESTs constituyen una valiosa herramienta que es muy útil en los programas de mejoramiento animal y vegetal. 4.3.7 Minisatél i tes Los organismos superiores presentan gran abun- dancia de DNA repetitivo, que podría comprender más del 90% del DNA total en ciertos genomas de plantas. El término minisatélite designa a una fa- milia de secuencias repetitivas organizadas en blo- ques. Esta clase de DNA consiste de pequeñas unidades (10-60 pb) y presentan un bajo grado de repetición en locis determinados. En 1985 Alec J. Jeffreys y su grupo, describieron la presencia de minisatélites en el genoma humano y aislaron dos regiones conservadas: una llamada 33.6 de 16 pb, y otra denominada 33.15 de 20 pb. Ambas regiones conservadas son conocidas como las sondas de "Jeffreys". Genomas humanos hibridizados con una sonda de Jeffreys produce un patrón de bandas un poco complejo. Este patrón de muchas bandas es lo que constituye un "fingerprinting" de DNA el cual es único para cada individuo. Esto se debe a la gran variabilidad en los minisatélites dentro de la espe- cie Homo sapiens. En los últimos años, no sólo se han descubierto marcadores moleculares de gran poder de resolu- ción, sino que también se ha simplificado y masifi- cado su uso. Entre los usos más importantes de los 80 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF MM en el mejoramiento genético de plantas se encuentran: 1. En el manejo de germoplasma: caracterización y análisis de la variabilidad genética, identificación de acervos genéticos y de parentales para el mejoramiento. Los marcadores más apropiados para estas aplicaciones son los RFLPs, y los microsatélites. 2. El mapeo de genes cualitativos y cuantitativos (QTLs). Los marcadores más usados: RFLPs, microsatélites y RAPDs. 3. En estrategias de fitomejoramiento: selección asistida por marcadores (marcador apropiado: microsatélites), identificación y transferencia de QTLs de germoplasma silvestre (marcador: RFLPs) e introgresión de transgenes (marcadores apropiados: RFLPs y microsatélites). 4. Mejoramiento asistido por marcadores moleculares (marcador: RFLP). (Figura 4.9). 5. Clonación de genes con base a mapas genéticos (marcadores apropiados: RFLPs, microsatélites y AFLPs). Para realizar numerosas aplicaciones, la construcción de mapas genéticos mo- leculares es un paso previo necesario (Fi- gura 4.10). Actualmente existen mapas genéticos basados en marcadores mole- culares para un número grande de espe- cies económicamente importantes. Entre estas se encuentran : maiz, tomate, arroz, soya, frijol, yuca, algodón, caña de azúcar, naranjo, tabaco, manzano, ceba- da, zanahoria, espárrago, alfalfa y gira- sol. William M. Roca / Hernando Ramírez 81 CEDAF Introducción a la Biotecnología 12 19 11 16 4 8 6 20 2 13 5 25 10 23 7 18 9 13 21 14 15 17 24 Mapa Molecular con RFLPs Ensayo de Campo con Poblaciones de Interés Correlación de datos de campo con marcadores de RFLP Los marcadores RFLPs con correlaciones positivas son útiles para el monitoreo de los caracteres Un programa de mejoramiento con estas población puede tener éxito si se seleccionan los marcadores RFLPs apropiados Figura 4.9 Utilización de un mapa molecular en un programa de mejora- miento vegetal. Fuente: Tohme, J. (comunicación personal, 1997). Cromosoma 4 REC Frac. Diat cM Marcador Id Nombre (45) RG 143 (10.3%) 10.4 (11) RG 463 (7.7%) 7.8 (23) RG214 (2.6%) 2.6 (36) RG864 (17.9%) 18.8 (2.8%) 2.8 (3) Pi (t) (3.2%) 3.2 (25) B10700 (15) B8350 (16.9%) 17.6 (33) C15600 Figura 4.10 Ejemplo de un grupo de ligamiento construido con marca - dores moleculares. Fuente: Tohme, J., 1996. 4.4 Ejercic io 4.1 Marcadores moleculares Objetivos • Desarrollar el concepto de marcadores molecu- lares . • Identificar individuos homocigotos y heteroci- gotos utilizando: a) marcadores morfológicos, y b) marcadores moleculares. • Confirmar el poder de discriminación que tie- nen los marcadores moleculares. Orientaciones para el instructor Este ejercicio consiste en identificar en un diagra- ma, individuos homocigotos y heterocigotos utili- zando marcadores morfológicos y marcadores moleculares (RFLPs). Con este ejercicio se busca que los participantes fi- jen el concepto de marcadores moleculares y sus aplicaciones. Para la realización de este ejercicio se recomienda que el Instructor lea cuidadosamente las siguientes instrucciones: • Suministre orientación general sobre los objeti- vos del ejercicio. • Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. • Colocar en cada mesa 5 plantas con flores rojas ( por ejemplo, claveles) y dos plantas con flores blancas. • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique cada grupo en cada una de las mesas. • En cada grupo los participantes deben respon- der las siguientes preguntas: Si el color de la flor es un carácter monogénico (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una planta de flor roja homocigótica (RR) con una planta de flor blanca (rr) : a. ¿De qué color serán las flores de las plantas de la F1? Explique. b. Si se cruzan dos plantas F1, ¿de qué color serán las flores de las plantas de la F2? c. ¿En la F2 es posible diferenciar las plantas de flores rojas homocigotas de las plantas de flores rojas heterocigotas? Explique. d. Utilizando marcadores moleculares, ¿cómo haría usted para diferenciar plantas de flor roja homocigotas de plantas de flor roja heterocigotas? e. Explique con un ejemplo, cómo se puede utilizar un marcador molecular en un programa de mejoramiento. - Presentar por escrito las respuestas a las preguntas de este ejercicio. - Motive una discusión con base en las respuestas dadas. - Proporcione la información de retorno suministrando las respuestas a las preguntas a este ejercicio. Recursos necesarios - Papelógrafo, papel, marcadores. - Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo. - 20 plantas con flores rojas (por ejemplo, claveles) y ocho plantas con flores blancas en materas o bolsas de plástico. Tiempo sugerido: 60 minutos. Instrucciones para el participante Con la información suministrada en la Sección 4 y con la identificación de un marcador molecular para diferenciar plantas de flores rojas homocigóti- cas de plantas de flores rojas heterocigóticas, los participantes deberán construir el concepto de marcadores moleculares. 82 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Pasos a seguir • Conforme cuatro grupos de trabajo de acuerdo con las instrucciones dadas por el Instructor. • Nombrar un relator por grupo, el cual pre- sentará en plenaria las respuestas dadas por el grupo. • Contestar por escrito las respuestas a las siguientes preguntas: Si el color de la flor es un caracter monogéni- co (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una planta de flor roja homocigótica (RR) con una planta de flor blanca (rr) : a. ¿De qué color serán las flores de las plantas de la F1? Explique. b. Si se cruzan dos plantas F1, ¿de qué color serán las flores de las plantas de la F2? c. ¿En la F2 es posible diferenciar las plantas de flores rojas homocigotas de las plantas de flores rojas heterocigotas? Explique. d. Utilizando marcadores moleculares, ¿cómo haría usted para diferenciar plantas de flor roja homocigotas de plantas de flor roja heterocigotas? e. Explique con un ejemplo, cómo se puede utilizar un marcador molecular en un programa de mejoramiento. • Al final el instructor les proporcionará la información de retorno a las preguntas planteadas. Información de retorno Respuestas a las preguntas realizadas en este ejercicio. Si el color de la flor es un caracter monogéni- co (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una planta de flor roja homocigótica (RR) con una planta de flor blanca (rr) : Respuestas Para la pregunta a Serán rojas, porque: Porque el alelo R es dominante sobre el alelo r. Para la pregunta b Serán de flores rojas y de flores blancas en una propor- ción de 3 : 1. William M. Roca / Hernando Ramírez 83 CEDAF Introducción a la Biotecnología P1 RR (roja) P2 rr (blanca) X Rr (roja) F1 Rr (rojas) Rr (rojas) X (rojas) RR Rr Rr (blancas) rr 3 1: F2 Porque: Para la pregunta c No es posible. Las plantas RR y Rr son de flores ro- jas porque el alelo R es dominante sobre el alelo r. Para la pregunta d Para la pregunta e En tomate, la resistencia a nemátodos es un carác- ter monogénico. Este carácter está asociado a un marcador molecular (RFLP). A través de este mar- cador molecular, es posible seleccionar los mate- riales de tomate resistentes a nemátodos, en un programa de mejoramiento para este carácter. Bibl iograf ía Austral ian Science and Technology Counci l (astec). 1993. Gene Technology Issues for Austral ia. Occasional Paper No. 27. Austral ian Government Publ ishing Service. Canberra. 151 p. Bernatzky, R. 1988. Restr ict ion Fragment Length Polymorphism. Plant Molecular Biology Manual. C2: 1-18. Kluwer Academic Publ ishers. Dordrecht, Belgium. Biotechnology Research Unit (BRU). Annual Report 1991. CIAT, Cal i , Colombia. p. 56. Ferreira, M. E. y Grattapagl ia, D. 1995. Introdu?ao do uso de marcadores RAPD e RFLP em Anál ise Genét ica. EMBRAPA-CENARGEN. Documento No. 20. Brasi l ia. 220 p. Kochert , G. 1989. Introduct ion to RFLP mapping and Plant Breeding Appl icat ions. The Rockefel ler Foundat ion Internat ional Program on Rice Biotechnology. Universi ty of Georgia, Anthens, USA. 15 p. Ramírez, H., Calderón, A., y Roca, W. M. 1991. Técnicas Moleculares para Evaluar y Mejorar el Germoplasma Vegetal . En: Roca, W. y Mroginski , L. A. (eds.) . Cul t ivo de Tej idos en la Agricul tura, Fundamentos y Apl icaciones. Publ icación CIAT No. 151. CIAT, Cal i , Colombia. p. 825-855. Tohme, J. 1996. BRU, Annual Report , CIAT. Weising, K., Nyborn, H., Wolf f , K. , y Meyer, W. 1995. DNA Finger pr int ing in Plants and Fungi. CRC Press. Boca Raton. USA. 322 p. 84 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF F1 F2 6 kb 8 kb 6kb/6kb 8kb/8kb 6 kb 8 kb 8kb/6kb 6 kb 6kb/6kb 6 kb 8 kb 8kb/6kb 6 kb 8 kb 8kb/6kb 8 kb 8kb/8kb R/R r/r R/r R/R R/r R/r r/r Figura 4.6 Análisis genético de plantas utilizando mar- cadores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989. Originales para transparencias William M. Roca / Hernando Ramírez 85 CEDAF Introducción a la Biotecnología 8 6 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F RFLPs Microsatelites RFLPs Microsatelites RAPDs Microsatelites RFLPs RFLPs RFLPs Microsatélites AFLPs RFLPs Microsatélites Marcardores Molecurales • Caracterizac ión y análisis de la variabilidad genética • Identificación de acervos genéticos Mapeo de genes cualitativos y cuantitativos Estrategias de fitomejoramiento Majoramiento asistidopor marcadores moleculares Clonación de genes con base a mapas genéticos Selección asistida por marcadores moleculares Identificación y transferencia de QTLs de germoplasma silvest re Introgresión de transgenes William M. Roca / Hernando Ramírez 87 CEDAF Introducción a la Biotecnología • E nt en de r lo s pr in ci pi os bá si co s de lo s m ar ca do re s m ol ec ul ar es . • C on oc er al gu na s de su s ap lic ac io ne s en el m ej or am ie nt o ve ge ta l. OO bb jj ee tt ii vv oo ss 8 8 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Son un grupo de técnicas que permiten el estudio de gemona de los organismos a nivel del DNA. Están basados en el grado de polimorfismo (diferencias) que ocurre naturalmente en el material genético de los organismos eucarióticos superiores, debido a la gran complejidad de sus genomas. ¿Qué son los marcadores moleculares? W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 8 9 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Que sea altamente polimorfico. • Que sea co – dominante. • Que esté distribuido a través del genoma. • Que sea de fácil y rápida ejecución. • Que tenga alta reproducibilidad. PPrrooppiieeddaaddeess ddee uunn mmaarrccaaddoorr mmoolleeccuullaarr 9 0 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F • Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs). • Polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente (RAPDs). • Microsatélites. • Polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs). Marcaje de secuencias expresadas (ESTs). Minisatélites. Breve reseña de algunos grupos moleculares • • Transformación genét ica de plantas William M. Roca / Hernando Ramírez 91 CEDAF Introducción a la Biotecnología Sección 5 Sección 5 . Transformación genét ica de plantas 92 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla de Contenido Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Preguntas Orientadoras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .94 5.1 ¿Porqué transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .94 5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas. . . . . . . . . . . . . 95 5.3 Transformación genética de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens. . . . . . 98 5.4 Transformación por introducción directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 5.5 Logros de la ingeniería genética de plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 5.6 Ejercicio 5.1 Transformación genética de plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Estructura de la Sección Objetivos • Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas. • Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas. • Conocer algunas aplicaciones de esta tecnología. Preguntas Orientadoras 1. ¿Sabían ustedes que es posible producir hormona de crecimiento humana en plantas de tabaco? 2. ¿Algún participante nos puede decir que es una planta transgénica? 3. ¿Sabían ustedes que el Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo, ha venido realizando ingeniería genética desde hace miles de años? William M. Roca / Hernando Ramírez 93 CEDAF Introducción a la Biotecnología Construcción Genética BBoommbbaarrddeeoo ddee ppaarrtt ííccuullaass oo bbiiooll íísstt iiccaass Explante o protoplastos Transformación genética vía Agrobacterium CO - cultivo RReeggeenneerraacciióónn ddee ppllaannttaass eenn mmeeddiioo ddee sseelleecccciióónn Plantas Transgénicas PPrruueebbaa ddee ttrraannssggéénneessiiss PPrruueebbaass ggeennéétt iiccaass Mercado Mejoramiento convencional Transformación Genética de Plantas Explante EEnnssaayyooss aaggrroonnóómmiiccooss yy ddee bbiioosseegguurriiddaadd Introducción La transformación genética de plantas se refiere a la introducción de genes modificados (llamados genes quiméricos) al genoma de las células vegeta- les, utilizando un método apropiado. Los métodos de transformación más utilizados son: mediante Agrobacterium tumefaciens y mediante el bombar- deo de partículas o biolística. El gen o genes intro- ducido (s) es (son) incorporado (s) al genoma de la célula vegetal, al que debe integrarse de manera es- table y expresarse en la biosíntesis de proteínas es- pecíficas. La célula o tejido transformado se cultiva in vitro para regenerar plantas normales que expresen el transgen. La transformación genética amplía grandemente el rango de genes disponibles para el mejoramiento de plantas. En el mejoramiento convencional, los genomas de dos parentales se combinan en alto grado, a pesar de que el mejorador esté interesado en la transferencia de una sola característica, la cual podría estar controlada por un gen simple. Para eliminar las características indeseables del hí- brido resultante, deben realizarse varios ciclos de retrocruzamiento hacia el parental deseable, proce- so que toma varios años, para finalmente obtener un material mejorado. En contraste, con las técnicas de ingeniería genéti- ca de plantas, un gen de interés puede ser identifi- cado, aislado, clonado y transferido de una planta a otra en una forma directa, lo que significa que por esta vía el mejoramiento de un cultivo es más diri- gido. Por otro lado, en el método tradiconal los fi- tomejoradores solo pueden trabajar con plantas que sean compatibles (cruzables), mientras que por ingeniería genética se puede transferir cualquier gen de interés sin importar su procedencia (virus, bacterias, hongos, animales o plantas). El objetivo de esta sección en mostrar en forma sencilla los dos métodos más utilizados para la transformación genética de plantas: La víaAgro- bacterium y la vía biolística. Además, se presenta- rán algunos logros de esta metodología que están contribuyendo a la solución de algunos problemas agrícolas. 5.1 ¿Porqué transformar plantas? Las plantas ocupan el primer eslabón de la cadena alimenticia. A través de la fotosíntesis, utilizan la energía lumínica del sol para producir carbohidra- tos que son la fuente del 90% de las calorías consu- midas por los humanos. Además, las plantas proporcionan el 80% de las proteínas que consumi- mos en nuestras dietas alimenticias. Por miles de años, el hombre ha manipulado las ca- racterísticas genéticas de las plantas. Primero, por selección consciente o inconsciente de caracteres específicos; luego, por cruces dirigidos basados en las leyes de la herencia. Sin embargo, muchas características genéticas de interés agronómico tales como: resistencia a enfer- medades y plagas, tolerancia a heladas, salinidad, sequía, etc., presentes en otras especies no pueden ser transferidas por cruzamiento genético conven- cional debido principalmente a barreras de incom- patibilidad. La ingeniería genética y la transformación de plan- tas constituye una poderosa herramienta para supe- rar estas barreras de cruzabilidad, permitiendo la transferencia de genes de interés a las plantas, cual- quiera que sea su procedencia. Esta alternativa permitirá un mejoramiento más dirigido, con una reducción significativa del tiempo en la produc- ción de nuevas variedades. Así, la transformación 94 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF genética contribuirá no solamente a la reducción del costo de la producción agrícolasino también a una mayor protección del medio ambiente como consecuencia de la disminución sustancial del uso de los agroquímicos. 5.2 Un vector natural para introducir genes foráneos a las plantas Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que infecta a un buen número de especies ve- getales, principalmente dicotiledones, producien- do la enfermedad denominada Agalla de la Corona (un tumor vegetal) (Figura 5.1). La producción de esta enfermedad es el resultado de un evento natu- ral de ingeniería genética en el que una región es- pecífica del plásmido Ti (inductor de tumores) de la bacteria, se integra al genoma de la célula infec- William M. Roca / Hernando Ramírez 95 CEDAF Introducción a la Biotecnología Plasmido Ti DNA-T PLANTA S Fotosintesis CO2 + H2O Compuestos orgánicos Genes para crecimiento tumorigénico Genes para sintesis de opina T-DNA Infección con plasm ido Ti Transferencia de T -D N A Fotosintesis aminoácidos Agalla de la corona DNA de la planta + T-DNA En zi m as C at ab ol iz a op in as co m o so la fu en te de C y N Genes Catabolicos Plásmido Ti 1.2 x 108 Cromosoma 4 x 109 BACTERIA aminoácidos oPINAS Agalla de la corona Proliferación de con Plasmido Ti Catabólicos y Plasmido asociado Ti Agrobacterium Figura 5.1 Principios de colonización genética. Fuente: Calderón, A. 1990. T-DNA DNA cromosómico Plasmido Ti Agrobacterium DNA cromosómico de la planta Integrado al genoma de la célula vegetal Herida Agrobacterium infecta la herida Agalla de la corona (tumor vegetal) Figura 5.2 La bacteria Agrobacterium tumefaciens es la causante de la enfermedad Agalla de la Corona. Fuente: Watson y colaboradores, 1992. tada. Este proceso es el resultado de miles de años de evolución de la bacteria. (Figura 5.2). El plásmido Ti presenta dos regiones claves para el proceso de transformación: la región T-DNA que es la región que se transfiere desde el plásmido Ti al genoma vegetal; y la región vir (región de viru- lencia) que presenta ocho operones (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG, y virH), cuyos pro- ductos procesan el T-DNA y coordinan todo el proceso de transferencia del T-DNA al genoma de la planta (Figura 5.3). La región que se transfiere se llama T- DNA (DNA transferible) y contiene genes responsables para la biosíntesis de dos hormonas vegetales una auxina (ácido indolacético) y una citoquinina (riboxido de zeatina). Estas son los responsables del sobrecre- cimiento del tejido infectado. La región T-DNA presenta otros genes que promueven la síntesis de opinas (derivados de aminoácidos) que son utiliza- dos por la bacteria como fuente de carbono y de ni- trógeno. La región T-DNA esta compuesta por tres elementos importantes: la secuencia de bordes del T-DNA conteniendo secuencias repetidas, los genes de biosíntesis de fitohormonas (región onc) y los genes de biosíntesis de opinas (región ops) (Figura 5.3). Los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens han sido explotados como vectores para la intro- ducción de DNA foráneo en las plantas. Para que estos plásmidos puedan ser utilizados como vecto- res de transformación, la región onc (oncogene) debe ser removida, para producir plásmidos Ti 96 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Genes onc Producción decitocinina Síntesis de opina Borde derecho (24pb) Transferencia conjugativa Producción deauxina Región T Borde izquierdo (24 pb) Plásmido TiRegión de virulencia Replicador Catabolismo de opinas Figura 5.3 Mapa genético de un plasmidio Ti de Agrobacterium tumefaciens. Fuente: Beijersbergen y Hooykaas, 1993. "desarmados", y en su reemplazo se coloca un gen quiméri- co, portando la secuencia de interés que se va a transferir al genoma de la planta. Además se colocan secuencias fácil- mente identificables en los tejidos transformados (genes re- porteros), como el gen de la b-glucuronidasa comúnmente llamada gus. También es necesario colocar en la región T-DNA un gen de selección, como el gen nptII que codifi- ca para la enzima neomicina fosfotrans- ferasa. Esta permite el crecimiento de células transformadas en medios de cul- tivo que contienen el antibiótico kana- micina (Figura 5.4). Un gen quimérico de interés, es un gen donde el promotor, la secuencia codifi- cante y las secuencias de terminación provienen de organismos diferentes. Un ejemplo de un gen quimérico típico con- tiene: el promotor 35s del virus del mo- saico de la coliflor (CaMV35s), la secuencia codificante CryIA(b), que co- difica para una d-endotoxina de la bac- teria Bacillus thurigiensis; y la secuencia de terminación la región 3' nos del gen nopalina sintetasa de la bac- teria Agrobacterium tumefaciens. Ge- neralmente el promotor se identifica y se aisla de la planta que se pretende transformar (Figura 5.5). Existen dos clases de vectores derivados del plásmido Ti: vectores cis ó co-inte- William M. Roca / Hernando Ramírez 97 CEDAF Introducción a la Biotecnología Figura 5.4 Proceso de transferencia de la región T-DNA del plásmido Ti del Agrobacterium al genoma de una célula vegetal. Fuente: Lindsey y Jones, 1992. Figura 5.5 Mapa de una región de T-DNA de una construcción genética que contiene el gen CryIA(b), el gen reportero gus-intron y el gen de selección nptII que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. Fuente: Mancilla, L. 1997. (comunicación personal) grados y vectores trans o binarios. En los vectores co-integrados tanto el T-DNA como la región vir están presentes en el mismo plásmido; mientras que en los vectores binarios el T-DNA y la región vir se hallan en plásmidos separados dentro de la misma bacteria hospedera (Agrobacterium). De estos dos tipos de vectores el más utilizado para la transformación genética de plantas es el sistema binario (Figura 5.6). 5.3 Transformación genét ica de plantas ut i l izando Agrobacter ium tumefaciens La metodología general para la transformación ge- nética de plantas se presenta en la Figura 5.7. La transformación de plantas con Agrobacterium tu- mefaciens, básicamente consiste en cultivar con- juntamente los explantes ( tejidos, órganos, célu- las) con una cepa de Agrobacterium tumefaciens portadora de un vector apropiado con el gen de in- terés y los genes marcadores (reportero y de selec- ción), que se va a transferir al genoma vegetal. El cultivo se incuba a 28 °C por un período sufi- ciente (24-48 horas) para garantizar la transferen- cia del T-DNA del vector (plásmido Ti) a las células de la planta. La bacteria se elimina con un antibiótico y el tejido se coloca en un medio de re- generación (vía embriogénesis o vía organogéne- sis) en presencia de un agente de selección (por ejemplo un antibiótico) para permitir el desarrollo de sólo los tejidos transformados. 98 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Célula de Agrobacterium L ROncogenes Gen de síntesis de opina Plásmido Ti tipo salvaje 200 kb Oncogenes L R Genes VIR Origen de replicación Plásmido Ti desarmado 100 kb Plásmido T-DNA binario 25 kb Gen seleccionable Origen de replicación Origen de replicación L R Gen extraño Vir Gen opina L RGen seleccionable Gen extraño Características: Producción de hormona vegetal Formación de tumor Producción de opina No se regeneran plantas Características: Plásmido con amplio espectro de hospedadores que puede ser construido en No hay producción en exceso de hormonas vegetales solo los transformantes seleccionados que contengan el gen extraño regenerarán plantas normales E Coli T-DNA transferido e integrado en el cromosoma vegetal Figura 5.6 Sistemas de vectores empleados en la transformación genética de plantas vía Agrobacterium . a) Vector cointegrado (plásmido Ti en estado silvestre). En este sistema la región T-DNA y la región vir están en el mismo plásmido. b) Vector binario. En este sistema, las regiones T-DNA y vir están en plásmidos separados. Fuente: Lindsey y Jones, 1992. La selección de células transformadas debe cum- plirlas siguientes características: a .las células transformadas deben tener un alto nivel de resistencia al agente de selección; b. las células no transformadas deben ser totalmente eliminadas por el agente de selección; c. los tejidos transformados deben ser fácilmente detec- tables para distinguir posibles "escapes" que pue- dan crecer a expensas de los tejidos transformados, degradando el agente de selección. Después de la formación de callos a partir de las células transformadas, éstos se transfieren a me- dios apropiados conteniendo el agente de selec- ción, para la inducción de brotes y luego plántulas. En la etapa de enraizamiento se reduce el agente de selección (si éste es un antibiótico) para favorecer el enraizamiento de las plántulas. William M. Roca / Hernando Ramírez 99 CEDAF Introducción a la Biotecnología CO-CULTIVO EXPLANTEIntroducción a una Cepa de Agrobacterium Construcción Gen(s) de interés Gen reportero Gen de selección Secuencia reguladoras Regeneración de plantas en medio de selección Prueba de transgénesis Pruebas genéticas Ensayo agronómicos: Bioseguridad Integración del gen (s) al genoma vegetal Expresión del gen (s) Nivel de RNA Nivel De Proteína Herencia del transgen Resistencia/tolerancia/ biosíntesis Invernadero Campo Mercado Mejoramiento convencional Figura 5.7 Secuencia de pasos para la transformación genética de plantas vía Agrobacterium. 5.4 Transformación por introducción directa de DNA En las gramíneas, y en concreto, en los cereales, la transformación vía Agrobacterium ha tenido poco éxito. Debido a esto, se ha desarrollado métodos alternativos que permiten la introducción directa de DNA al genoma vegetal (Figura 5.8). Algunos de estos métodos son: a. Transferencia mediada por agentes osmóticos b. Microinyección c. Electroporación d. Bombardeo de partículas o Biolística 5.4.1 Transferencia mediada por agentes osmóticos Fue el primer sistema desarrollado para la intro- ducción directa de DNA a protoplastos (células ve- getales a las cuales se les ha removido la pared celular). Los protoplastos se tratan con el osmótico polietilenglicol (PEG) con fostato de calcio, en presencia del DNA foráneo. El tratamiento PEG/Ca++ permite un aumento en la permeabilidad de la membrana del protoplasto facilitando así la entrada del DNA foráneo. Aun- que la incorporación de DNA a los protoplastos no depende de la especie, la regeneración de plantas completas a partir de protoplastos puede resultar difícil, lo cual constituye una gran limitación para el uso generalizado de esta metodología. 5.4.2 Microinyección Esta técnica consiste en inmovilizar una célula en la punta de un microtúbulo, usando presión ne- gativa ligera para inyectar una solución de DNA usando un capilar de vidrio fino. Este atraviesa la membrana citoplasmática de la célula y llega al núcleo sin producirle ningún daño. Utilizando esta metodología se ha logrado trans- formar algunas plantas como el tomate y la za- nahoria. Algunas desventajas de este método son: la baja viabilidad de las células inyectadas, el alto nivel técnico y experiencia requeridas, y el hecho de que sólo se pueda inyectar una célula a la vez. Todo esto hace que éste método sea poco eficiente. 5.4.3 Electroporación En esta técnica, protoplastos son sometidos a im- pulsos eléctricos de alto voltaje por fracciones de segundos. Este tratamiento permeabiliza la mem- brana induciendo la formación reversible de po- 100 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Por tratamiento con PEG Y Ca++ Por electrochoque Por microinyección Por biolística A B C D Figura 5.8 Métodos utilizados para la introducción directa de DNA al interior de las células vegetales. A) Transferencia mediada por agentes osmóticos. B) Electroporación. C) Micro-inyección y D) Bombardeo de partículas o biolística. Fuente: Calderón y colaboradores, 1991. ros que permiten la introducción de macromoléculas como el DNA. Este método ha permitido la transformación de especies como: arroz y maíz. 5.4.4 Bombardeo de part ículas o biol íst ica Este método fue desarrollado por Klein y colabora- dores en 1987. Esta metodología utiliza un dispo- sitivo que dispara microproyectiles (esferas diminutas de tungsteno o de oro, de 4 mm de diá- metro) recubiertos con el DNA foráneo que se quiere introducir en las células. El proceso se basa en la aceleración de las micro- partículas, a través de un tubo en el cual se ha pro- ducido vacío, a velocidades tales que permiten su paso a través de la pared y membrana celulares, y la integración del DNA foráneo al genoma de las células de los tejidos bombardeados (Figura 5.9). De los métodos de transformación directa, el mé- todo biolístico es el más utilizado. Actualmente se ha transformado un número grande de especies, muchas pertenecientes al grupo de la gramíneas. 5.5 Logros de la ingeniería genét ica de plantas En la actualidad se han transformado aproximada- mente 50 especies de plantas con características de interés como resistencia a insectos, virus y herbici- das. Esto se debe a la disponibilidad de muy bue- nos sistemas de regeneración y de transformación para muchos cultivos de importancia económica (Tabla 5.1). El carácter con mayor modificación por ingeniería genética ha sido la resistencia a her- bicidas, seguido por la resistencia a insectos y a vi- rosis; y los cultivos más utilizados han sido la soya, el maíz, la colza y el algodón. Tabla 5.1 Siembras comerciales con cultivos transgénicos en 1997. Fuente: James ,1997. Cultivo % Caracteres % Países % Soya 40 Resist. herbicidas 55 EE.UU 65 Maíz 25 Resist. Insectos 30 China 14 Tabaco 13 Resist. Virus 15 Argentina 11 Algodón 11 Otras ≈ 1 Canadá 10 Canola 10 Australia <1 Tomate 1 México <1 Papa 1 William M. Roca / Hernando Ramírez 101 CEDAF Introducción a la Biotecnología Figura 5.9 Diseño del equipo utilizado para la transformación genética de plantas mediante el bombardeo de partículas o biolísticas. Fuente: Calderón, A. 1990. Aunque la transferencia de características genéticas que dependen de muchos genes (poligénicas), está todavía a nivel de investigación, la transferencia de características monogénicas ya son procesos de ruti- na para muchos cultivos. La rapidez con que se ob- tienen plantas transformadas con características deseables es bastante sorprendente, por ejemplo: tres meses en arroz, cuatro meses en soya, etc. La meta es utilizar esta tecnología para el mejora- miento de características que no podrían ser mani- puladas por los métodos tradicionales (Tabla 5.2). Hay que reconocer que la transformación de plantas ha sido uno de los mayores logros de la biotecnolo- gía y las aplicaciones futuras parecen estar limita- das sólo a nuestra imaginación. Tabla 5.2 Algunas metas de la ingeniería genética de plantas. Fuente: Chrispeels y Sadava (1994) 1. Mejoramiento para el control de plagas y malezas • Tolerancia a Herbicidas • Resistencia a virus • Resistencia a bacterias • Resistencia a hongos 2. Mejoramiento de propiedades agronómicas • Tolerancia a heladas • Tolerancia al estrés hídrico • Tolerancia a la salinidad • Tolerancia a toxicidad por aluminio 3. Mejoramiento de la calidad postcosecha • Retardar la maduración del fruto • Retardar la senescencia floral • Tomates con alto contenido de sólidos solubles • Papas con alto contenido de almidón • Hortalizas más dulces 4. Contribuyendo al mejoramiento vegetal • Esterilidad masculina para la producción de semilla híbrida 5. Mejoramiento de la calidad nutricional • Semillas con alto contenido de metionina y lisina • Forrajes ricos en animoácidos sulfurados 6. Mejoramiento de Compuestos de Uso Industrial • Aceites • Almidón • Plástico • Enzimas • Fármacos 7. Detoxificación de suelos contaminados Los cultivos transgénicos de primera generación (resistencia a herbicidas, a insectos y a virus) es- tán impactando la agricultura, principalmente en países desarrollados. El crecimiento del área cul- tivada a nivel comercial,con cultivos transgéni- cos ha sido espectacular en los últimos años: de tres millones de hectáreas en 1990, pasó a 12 mi- llones en 1997 y a 30 millones de hectáreas en 1998. De éstas, cinco millones se cultivaran en América Latina: cuatro en Argentina y una en México. Los cultivos más impactados han sido la soya, el maíz, el algodón, la colza y la papa. Ade- más de la ganancia económica para los agriculto- res por el aumento en las cosechas y el menor uso de pesticidas, un beneficio importante del uso de cultivos transgénicos ha sido en la protección am- biental : En 1997, en México y Argentina, el uso de insumos químicos se redujo entre el 50 al 90%, debido al cultivo comercial de transgénicos con Bt resistentes a insectos. A continuación se presentan algunos de los logros de la ingeniería genética de plantas en la solución de algunos problemas que afectan los cultivos modernos como es el ataque de enfermedades y plagas, el control de malezas, el manejo de post- cosecha, etc. 5.5.1 Resistencia a herbic idas Los herbicidas son ampliamente utilizados en la agricultura para minimizar las pérdidas en los cul- tivos debido a la presencia de malezas. Algunos de estos herbicidas actúan inhibiendo ciertos procesos como la fotosíntesis, otros inhi- ben vías biosintéticas por ejemplo de aminoáci- dos esenciales. Mediante la transgénesis, se modifica el genoma de la planta para que produz- ca una acción metabólica que lo proteja de un de- terminado herbicida. 102 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Un herbicida bien conocido es el glifosato (N-fos- fonometil-glicina). Este herbicida inhibe la enzima 5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato (EPSP) sinta- sa, bloqueando la vía biosintética de aminoácidos aromáticos. La producción de plantas transgénicas resistentes a este herbicida se puede conseguir a través de dos vías: a .Por la introducción al genoma de un gen de origen bacteriano (Aerobacter aerogenes) que codifica para la enzima EPSP sintasa, que inhibe la acción del herbicida. b .Por la introducción al genoma vegetal del gen EPSP sintasa de origen vegetal bajo el control del promo- tor CaMV35s. El resultado es el incremento de 40 veces la actividad enzimática de la EPSP sintasa. En ambos casos la tolerancia al herbicida fue debi- do a una sobreproducción de la enzima, por la ex- presión del transgen. Se obtuvieron plantas transgénicas de tomate y papa utilizando la primera estrategia y plantas transgénicas de petunia, soya, maíz y otras, utili- zando la segunda estrategia. Otro herbicida muy conocido es el Basta (fosfino- tricina o PPT), el cual es un análogo del ácido glu- támico y actúa inhibiendo la enzima glutamina sintetasa encargada del metabolismo del amonio en la planta. El efecto del herbicida es inhibido por la enzima fosfinotricina acetiltransferasa, codifica- da por el gen "bar" cuyo origen es el hongoStrep- tomyces hygroscopicus (Figura 5.10). Una planta transgénica resistente a este herbicida se obtiene por la introducción al genoma vegetal del gen "bar" bajo el control del promotor CaMV35s, u otros promotores. Se produce altos niveles de la enzima fosfinotricina acetiltransfera- sa la cual inhibirá el efecto del herbicida. Con este sistema se obtuvo plantas transgénicas re- sistentes al herbicida Basta en arroz y otros culti- vos. 5.5.2 Resistencia a insectos Las pérdidas en la producción agrícola debido a enfermedades y plagas es bastante considerable. De los insectos plagas en la agricultura los más im- portantes son los Lepidopteros, siendo el costo por su control, sólo los Estados Unidos de 400 millo- nes de dólares para el año de 1995. El alto costo del control químico de los insectos plagas, justifica el desarrollo de plantas transgénicas resistentes, no sólo para reducir los costos de producción, sino también el deterioro del medio ambiente. Una estrategia clásica para el control de insectos Lepidopteros ha consistido en el uso de bioinsecti- cidas basados en cepas de Bacilus thuringiensis (Bt). El Bt produce una toxina que se liga a recep- tores específicos de las células epiteliales del intes- William M. Roca / Hernando Ramírez 103 CEDAF Introducción a la Biotecnología FOSFINOTRICINA • Modo de acción: GLUTAMATO NH4 L– GLUTAMINA Glutamato sintasa (GS) Inhibición FOSFINOTRICINA (PPT) • Producto del GEN BAR: Fosfinotricina Acetil Transferasa (PAT) Acetil– CoA Fosfinotricina (Activa) PAT Acetil Fosfinotricina (inactiva) Figura 5.10 Tolerancia a la fosfinotricina. Fuente: Adaptado por Roca, W. (1997) tino medio de la larva, desencadenando una serie de eventos que conducen a la muerte de la misma. Para la producción de plantas transgénicas resis- tentes a Lepidopteros, se transfiere al genoma de la planta genes que codifican para las endotoxinas de Bt (genes cry). El uso del promotor CaMV35s lo- gra una alta expresión del gen. Las plantas trans- génicas expresan constitutivamente la toxina, que al ser ingerida por las larvas producirá su muerte. Otros genes usados para la producción de plantas transgénicas resistentes a Lepidopteros son los inhibidores de proteinasas (Inhibidores de Tripsina y de Quimiotripsina). Estos inhibidores bloquean la actividad proteolítica de las enzimas digestivas de los insectos. Estos genes han sido aislados y transferidos a tabaco reduciendo significativamen- te el desarrollo de larvas comoManduca sexta. Otros genes como las proteínas insecticidas vege- tativas (ViPs), la colesterol oxidasa, las quitinasas, las peroxidasas, pueden ser utilizados para la ob- tención de resistencia contra los insectos plagas de la agricultura. 5.5.3 Resistencia a virus Las enfermedades virales de las plantas constitu- yen un serio problema para la agricultura, ya que estos patógenos disminuyen significativamente el rendimiento de los cultivos. Una de las estrategias utilizadas para la protección de las plantas contra el ataque de virus es la deno- minadaprotección cruzada. Al infectar una plan- ta con una cepa atenuada del virus, la planta adquiere resistencia al ataque de la cepa virulenta del mismo virus. Aunque el mecanismo de la pro- tección no es muy claro, se cree que se debe a la sobreproducción de proteína de la cubierta del vi- rus causada por la infección con la cepa atenuada. Esto impide la liberación del DNA de la partícula viral de la cepa virulenta. Utilizando esta estrategia se han obtenido plantas transgénicas resistentes a ciertas cepas de virus, mediante la introducción al genoma de la planta del gen que codifica para la proteína de la cubierta del virus. Un ejemplo de esta estrategia son las plantas transgénicas de tabaco con resistencia al virus del mosaico del tabaco (TMV), plantas transgénicas de tomate y papa resistentes a un am- plio espectro de virus, incluyendo el virus del mo- saico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino y los virus X y Y de lapapa. Otra estrategia para inhibir la infección de algunos virus RNA en las plantas es a través deRNAs saté- lites los cuales atenúan los síntomas de la enfer- medad en las plantas infectadas. Los RNAs satélites, son secuencias cortas de RNA no necesa- rias para la propagación de los virus con que están asociados, pero son replicadas y encapsidadas con- juntamente con las partículas virales. Utilizando esta estrategia se obtuvo plantas transgénicas de ta- baco resistentes al virus del mosaico del pepino (CMV). Una tercera estrategia para reducir la infección vi- ral en plantas infectadas es mediante la técnica del RNA antisentido. Esta técnica se basa en la pro- ducción de un mRNAss (sin sentido) que es com- plementario al mRNAcs (con sentido) formando un híbrido de doble cadena que impide la traduc- ción del mRNAcs (figura 5.11). Plantas transgénicas que produzcan mRNAs sin sentido de alguna secuencia clave para la propaga- ción del virus, inhibirá su síntesis y por consi- guiente no se podrá formar la partícula viral. 104 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 5.5.4 Resistenciaa hongos Las pérdidas económicas de los cultivos debido al ataque de hongos patógenos es alta y la aplicación química es la vía clásica usada para el control de estos patógenos. Una estrategia transgénica empleada para produ- cir plantas resistentes al ataque de hongos patóge- nos es la introducción al genoma de la planta genes que codifiquen para enzimas que degraden la pared celular del hongo. La pared celular del hongo con- siste de dos polímeros: el glucan y la quitina que pueden ser hidrolizados por las enzimas glucana- sas y quitinasas, respectivamente. Sin embargo, la quitina de algunas especies de hongos puede ser algo diferente a la de otras especies, por lo que una quitinasa en particular puede ser efectiva contra una especie de hongo pero no necesariamente con- tra otra especie. Por esta razón las plantas transgénicas con genes de quitinasa serán resistentes sólo a aquellas espe- cies de hongos cuya pared celular sea degradada con la quitinasa específica. William M. Roca / Hernando Ramírez 105 CEDAF Introducción a la Biotecnología AUGAUC (A) -3N + 3 -(A) UACUAG1 N Formación del RNA de doble cadena que inhibe la expresión genética a nivel de la traducción del mensaje genético ATGATC TACTAG GATCAT CTAGTA mRNA Traducción Producto Proteico Transcripción Gen que será controlado Gen que codifica para el micRNA Transcripción RNA de antisentido (micRNA) V IA N O R M A L V IA C O N T R O LA D A Transcripción m RNA Figura 5.11 Mecanismo de la inhibición de la expresión genética mediante la técnica del RNA antisentido. Fuente: Calderón y colaboradores, 1991. 5.5.5 Regulación de la maduración de frutos La maduración de los frutos esta asociada con cambios fisiológicos como el ablandamiento, la conversión de almidón en azúcar, la pérdida de clo- rofila, la síntesis de pigmentos rojos y la síntesis de compuestos aromáticos. Todos estos procesos es- tán regulados por la fitohormonaetileno. En la biosíntesis del etileno (Figura 5.12) hay dos enzi- mas claves que al ser bloqueadas se producirá su inhibición. Estas son: laACC sintasa que catali- za la formación del ácido 1-aminociclopropano-1- carboxilico (ACC) a partir de S-adenosilmetionina y la ACC oxidasa que cataliza la formación de eti- leno a partir de ACC. La estrategia transgénica utilizada para retardar la maduración del fruto es bloquear la actividad de la enzima ACC sintasa, utilizando la estrategia de RNA antisentido. Las plantas transgénicas expresan una versión in- vertida del gen ACC sintasa, produciendo un RNA sin sentido que forma un híbrido con el mRNA con sentido de la ACC sintasa, lo cual bloquea la tra- ducción (Figura 5.8). Esta técnica fue aplicada con éxito en tomate donde se observó una gran re- ducción en la síntesis de etileno y como conse- cuencia un retardo en la maduración del fruto. 106 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF METIONINA S – ADENOSILMETIONINA ACC SINTASA ÁCIDO 1 – AMINO – CICLOPROPANO – 1 CARBOXÍLICO ACC OXIDASA Señales C2H4 Estimula la síntesis de etileno Degradación de la pared celular Producción de carotenoides pigmentados Producció n de sabores y aromas volátiles ACC Sintasa Y ACC oxidasa Celulasa Poligalacturonasa pectinesterasa Fitoenosintasa Desaturasa etc. Percepción por receptor de C 2H4 Figura 5.12 Regulación genética de la maduración del fruto del tomate. Fuente: Hobson y Grierson, 1993 5.6 Ejercic io 5.1 Transformación genét ica de plantas Objetivos • Desarrollar el concepto de transformación ge- nética de plantas. • Identifiar métodos que permitan detectar la pre- sencia y la expresión de un transgen en un culti- vo transgénico. Orientaciones para el instructor El siguiente ejercicio busca que los participantes realicen un análisis sobre posibles metodologías que se pueden utilizar para diferenciar plantas transgénicas de plantas no transgénicas en materia- les de una misma especie. Con este ejercicio se busca que los participantes fi- jen el concepto de transformación genética de plantas y sus aplicaciones. Para la realización de este ejercicio se recomienda que el instructor lea atentamente las siguientes ins- trucciones: • Suministre orientación general sobre los objeti- vos del ejercicio. • Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. • Colocar en cada mesa dos plantas de tomate ro- tuladasA y B respectivamente. • Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique cada grupo en cada una de las mesas. En cada grupo los participantes deben responder las siguientes preguntas: La planta A es transgénica, con un gen que le con- fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la planta B, es una planta no transgénica. a. ¿Las plantas A y B son fenotípicamente diferentes? Explique. b. ¿Las plantas A y B son genotípicamente diferentes? Explique. c. Cómo podría diferenciar las plantas A y Butilizando: Un bioensayo. Un método inmunológico. Un métodomolecular. • Presentar por escrito sus respuestas. • Motive una discusión con base en las respues- tas dadas. • Proporcione información de retorno, suminis- trando a los participantes las respuestas de este ejercicio. Recursos necesarios • Papelógrafo, papel, marcadores. • Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo. • ocho plantas de tomate en materas o bolsas de plástico. • Fotocopias con las instrucciones e información de retorno para los participantes. Tiempo estimado : 60 minutos. Instrucciones para el participante Con la información suministrada en la sección 5 y a través de la identificación de métodos biológicos, inmunológicos y moleculares para evaluar la inte- gración y expresión de genes en materiales trans- génicos, los participantes deberán construir el concepto de transformación genética de plantas. • Conformen cuatro grupos de trabajo de acuer- do con las instrucciones dadas por el Instructor. • Nombre un relator por grupo, el cual presentará en plenaria las respuestas dadas por el grupo. • Presentar por escrito las respuestas a las si- guientes preguntas: La planta A es transgénica, con un gen que le con- fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la planta B, es una planta no transgénica. a. ¿Las plantasA y B son fenotípicamente diferentes? Explique. b. ¿Las plantasA y B son genotípicamente diferentes? Explique. William M. Roca / Hernando Ramírez 107 CEDAF Introducción a la Biotecnología c. Cómo podría diferenciar las plantasA y B utilizan- do: Un bioensayo. Un método inmunológico. Un método molecular. • Al final el instructor les proporcionará la infor- mación de retorno de las respuestas a las pre- guntas planteadas en este ejercicio. Tiempo sugerido: 60 minutos. Respuestas a las preguntas realizadas en este ejercicio. La plantaA es transgénica, con un gen que le con- fiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la plantaB, es una planta no transgénica. Para la pregunta a No son diferentes fenotípicamente. Lo único que tiene diferente la plantaA es el transgen que le confiere resis- tencia al cogollero (Tuta absoluta). La diferencia es fi- siológica no morfológica. Para la pregunta b Sí son genotípicamente diferentes. El genoma de la plantaA presenta un gen adicional, que es el transgen que le confiere resistencia al cogollero, el cual no está presente en el genoma de la plantaB. Para la pregunta c Un bioensayo Infestando las plantasA y B con larvas del cogollero. Las plantas sobrevivientes o menos afectadas serán plantasA (transgénicas). Las plantas afectadas por el cogollero serán plantasB. Un método inmunológico Si se tienen anticuerpos contra el producto génico (toxi- na) marcados con el radioisótopo yodo 125, es posible detectarin situ o a través de una electroforesis de pro- teínas de un extracto crudo foliar de las plantasA y B. Después de una autorradiografía se presentará una "se- ñal" en el extracto crudo de proteínas de la plantaA, in- dicando la presencia del producto del transgen. Un método molecular Mediante extracciones de DNA genómico de las plan-tasA y B. Se preparan filtros (Southernblots) con las digestiones de estos DNAs con una enzima de restric- ción. Los filtros son hibridizados con una "sonda" construída con el transgen incorporado en la planta transgénica. Después de una autorradiografía sólo en el DNA de la plantaA se presentará una "mancha" (ban- da) indicacdo la presencia del transgen en la plantaA. Esta "señal" no se presentará en el DNA de la plantaB. Bibl iograf ía Bei jersbergen, A., Hooykaas, P.J. 1993. The Virulence System of Agrobacter ium tumefaciens. En: Nester, E. W., Verna, D. P. S. (eds.) . Advances in Molecular Genet ics of Plant -Microbe Interact ions. Kluwer Academic Publ ishers. The Nether lands. P. 37-49. Calderón, A. 1990. Técnicas básicas de Ingeniería Genét ica en Plantas. En: Jarami l lo, J. , Agudelo, O. (eds.) . La Nueva Biotecnología, Fundamentos, Usos y Perspect ivas. Seminar io real izado en ICA en Mayo 15-26 de 1989. ICA, Palmira, Colombia. p. 177-191. Calderón, A., Roca, W. M. y Jaynes, J. 1991. Ingeniería Genét ica y Cult ivo de Tej idos. En: Roca, W. , Mroginski , L. A. (eds.) . Cul t ivo de Tej idos en la Agricul tura, Fundamentos y Apl icaciones. Publ icación CIAT No. 151. CIAT, Cal i , Colombia. p. 733-753. Chrispeels, M. J. , Sadava, D. E. 1994. Plant, Genes, and Agricul ture. Jones and Bart let Publ ishers. Boston. USA. 478 p. Internat ional Service for the Acquis i t ion of Agr i -Biotech Appl icat ions (ISAAA). 1997. James, C. 1997. Global Status Of Transgenic crops in 1997. Isaa Briefs No 5. ISAAA. I thaca, N.Y. Lindsey, K., y Jones, M. G. K. 1992. Biotecnología Vegetal Agrícola. Edi tor ia l Acr ib ia, S.A. Zaragoza, España. 276 p. Watson, J.D., Gi lman, M., Witkowski , J. , y Zol ler , M. 1992. Recombinant DNA. A short Course. Second edi t ion. Scient i f ic American Books. W. H. Freeman and Company. New York. USA. 626 p. 108 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Originales para transparencias William M. Roca / Hernando Ramírez 109 CEDAF Introducción a la Biotecnología 1 1 0 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Construcción Genética BBoommbbaarrddeeoo ddee ppaarrtt ííccuullaass oo bbiiooll íísstt iiccaass Explante o protoplastos Transformación genética vía Agrobacterium CO - cultivo RReeggeenneerraacciióónn ddee ppllaannttaass eenn mmeeddiioo ddee sseelleecccciióónn Plantas Transgénicas PPrruueebbaa ddee ttrraannssggéénneessiiss PPrruueebbaass ggeennéétt iiccaass Mercado Mejoramiento convencional Transformación Genética de Plantas Explante EEnnssaayyooss aaggrroonnóómmiiccooss yy ddee bbiioosseegguurriiddaadd W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 1 1 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Conocer los fundamentos de la transformación genética de plantas. • Conocer los dos métodos más utilizados para transformar plantas. • Conocer algunas aplicaciones de esta tecnología. OObbjjeett iivvooss 1 1 2 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Es la introducción de genes modificados (genes quiméricos) al interior de las células vegetales utilizando un método apropiado. El gen introducido es incorporado de manera estable al genoma vegetal. ¿¿QQuuéé eess llaa ttrraannssffoorrmmaacciióónn ggeennéétt iiccaa ddee ppllaannttaass?? W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 1 3 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Es la introducción de genes modificados (genes quiméricos) al genoma de las células vegetales, utilizando un método apropiado (vía Agrobacterium o mediante el bombardeo de partículas o biolística). • El gen introducido debe incorporarse de manera estable al genoma de la célula vegetal y ésta debe regenerar una planta normal que exprese el transgen. ¿¿QQuuéé eess llaa ttrraannssffoorrmmaacciióónn ggeennéétt iiccaa ddee ppllaannttaass?? 1 1 4 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F • Las plantas proporcionan el 90% de las colonias y el 80% de las proteínas que consumimos en nuestras dietas. • Muchas características de interés agronómico, presentes en espacies no re lacionadas, no pueden ser transformadas por mejoramiento convencional. ¿¿PPoorr qquuéé ttrraannssffoorrmmaarr ppllaannttaass?? W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 1 5 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Superan las barreras de cruzabilidad permitiendo la transferencia de genes de interés. • Permiten un mejoramiento dirigido (transferencia de uno o pocos genes). • Reducen significativamente el tiempo en la producción de nuevas variedades. • Reducen significativamente el costo de la producción agrícola. • Contribuyen a la protección del medio ambiente, por la disminución en el uso de agroquímicos. LLaa IInnggeenniieerrííaa GGeennéétt iiccaa yy llaa ttrraannssffoorrmmaacciióónn ggeennéétt iiccaa ddee ppllaannttaass 116 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Perspect ivas futuras de la Biotecnología Vegetal William M. Roca / Hernando Ramírez 117 CEDAF Introducción a la Biotecnología Sección 6 Sección 6 . Perspect ivas futuras de la Biotecnología Vegetal 118 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla de Contenido Estructura de la Sección. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .119 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .119 Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .119 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 6.1 Relaciones institucionales y la biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .121 6.2 Costo - beneficio de la biotecnología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 6.3 Propiedad intelectual y comercialización. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 6.4 Producción de alimentos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnología Vegetal. . . . . . . . . . . . . 125 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 Originales para trasparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .127 Estructura de la Sección Objetivos • Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes. • Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción de cultivos transgénicos al campo. • Entender por que los cultivos transgénicos son seguros. Preguntas orientadoras 1. ¿Sabían ustedes que en un futuro no muy lejano muchos de los productos como fármacos, vitaminas, vacunas hormonas, etc., van a ser producidos en plantas las cuales serán utilizadas como bioreactores? 2. ¿Algunos de los participantes nos puede decir que es bioseguridad en biotecnología? 3. ¿Ustedes piensan que los cultivos transgénicos representan un riesgo para la salud humana, el medio ambiente o la biodiversidad? William M. Roca / Hernando Ramírez 119 CEDAF Introducción a la Biotecnología Bioseguridad • Ensayos de Riesgo Perspectivas Futuras de La Biotecnología Vegetal Costo / Beneficio de la Biotecnología Propiedad Intelectual • Patentes Introducción No cabe duda de que estamos entrando al siglo de la biotecnología. El mapeo y secuenciación de ge- nomas está en rápida transición hacia la genómica funcional. Esta se refiere al uso de la información de la genómica estructural para identificar funcio- nes y secuencias que permitan descubrir y clonar fragmentos de DNA grandes en cromosomasarti- ficiales de bacterias (BAC). Por otro lado, cada vez es más factible las transformaciones oligogénicas, abriendo así paso a las modificaciones de caracte- res complejos (QTLs) de plantas. Debido al in- menso volumen de información y de datos que se generan en los estudios genómicos, se han diseña- do sistemas electrónicos de manejo y comparación de datos para la masificasión de las operaciones genómicas. Así, se produce una convergencia en- tre la biología y la computación, lo que se ha deno- minado "bioinformática". De igual manera, la física y la mecánica se han unido para dar paso al uso de la "robótica" en biotecnología. Actualmente se han logrado avances con plantas modelo. Una de estas plantas es laArabidopsis, que es la planta floral con genoma más pequeño. La secuenciación del genoma de Arabidopsis avanza a una tasa de 200 genes por mes. Una vez se tenga descifrado todo el genoma deArabidopsis (año 2001), se tendrá un catálogo completo de to- dos los genes que participan en todo el ciclo de vida de una planta superior. La secuenciación del genoma del arroz también avanza rápidamente. En la actualidad se dispone de un buen número de vectores para la transferencia de genes foráneos a la plantas. Los genes transferidos se integran al ge- noma de la planta donde se expresan y son hereda- dos de una generación a otra. Aunque en este momento no es posible la transferencia de genes a todos los cultivos de importancia económica, mu- cha de la investigación está encaminada en encon- trar vectores apropiados para la transformación genética de dichos cultivos. Existe una gran prioridad por la identificación de genes de importancia agronómica y/o económica para ser introducidos a los cultivos que son la base de nuestra alimentación y economía. También es importante el estudio de la regulación de la expre- sión génica durante el desarrollo de la planta para saber en que momento se pueden "activar" o "de- sactivar" genes, en el sitio apropiado de la planta y en el tiempo preciso. Con este conocimiento es po- sible modificar algunos procesos de desarrollo de las plantas tales como: floración, la formación de semilla, el tiempo de formación del fruto, etc. Además es posible manipular los procesos de for- mación gamética para la obtención de plantas an- droestériles cuando se desee, o alterar los factores de la incompatibilidad para lograr la fertilización entre especies no relacionadas. Los efectos de genes indeseables podrán ser con- trolados mediante la técnica de RNA antisentido como en el caso del bloqueo de la biosíntesis del etileno para retardar la maduración de los frutos. A mediano-largo plazo, la biotecnología ofrece he- rramientas para un mejor manejo de la agricultura, con el componente de sostenibilidad. Entre las aplicaciones más notables se encuentran: 1. La reducción de insumos químicos, por medio de la generación de biopesticidas, contribuyendo a estra- tegias de control biológico. 2. El mejoramiento de sistemas biológicos naturales, como la fijación biológica de nitrógeno, el aumento de la eficiencia del reciclaje de nutrientes en la ri- zosfera y el desarrollo de variedades tolerantes a problemas de suelo como toxicidad por aluminio, deficiencia de fósforo y azufre, tolerancia a sequía y salinidad. 3. Reforestación, mediante la multiplicación masiva de plantas para la siembra. 4. Recuperación de aguas y suelos contaminados, por medio de la bioremediación (por microorganis- mos). Considerando sólo a la bioingeniería estamos pa- sando por una rápida evolución de los productos generados, por ejemplo: 1. Entre 1995 - 2001 : Rasgos agronómicos como resis- tencias a insectos, virus y herbicidas. 2. 2002 - 2005 : Rasgos de calidad de alimentos: aceites vegetales, carbohidratos (almidón, azúcares) 120 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 3. 2006 - 2010 : modificación de la arquitectura y pro- cesos fisiológicos de la planta (fotosíntesis). 4. 2011 - 2020: modificaciones para usar a plantas como bioreactores para producir productos de alto valor agregado: fármacos, vitaminas, vacunas, etc. La transformación genética de plantas ofrecen un gran potencial para la producción de productos de importancia para la salud y la economía como: factores sanguíneos, hormonas de crecimiento, neuropeptidos, biopolímeros, etc. De igual mane- ra, muchos otros productos de la industria de ali- mentos y farmacéutica podrán ser obtenidos a más bajo costo. Ahora que reconocemos que tales perspectivas son posibles en un futuro muy cercano, es importante conocer las implicaciones económicas, sociales y medio ambientales de la biotecnología vegetal en los países desarrollados y en los países en desarro- llo. 6.1 Relaciones inst i tucionales y la Biotecnología La biotecnología moderna ofrece gran potencial para alterar, controlar y monitorear la genética de las plantas. Este poder tecnológico puede impactar directa e indirectamente en la agricultura, el co- mercio, el medio ambiente y la biodiversidad. Como consecuencia se han generado preocupacio- nes biológicas y socioeconómicas en la sociedad, lo que se ha traducido en regulaciones de la investi- gación y desarrollo de la biotecnología. 6.1.1 Biosegur idad Este término se refiere a las políticas y mecanis- mos que se establecen para prevenir posibles ries- gos de la tecnología del DNA recombinante y de la transformación genética de plantas en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad. En 1975, apenas tres años después del descubri- miento de la tecnología del DNA recombinante, los científicos se autoimpusieron regulaciones para seguir prácticas seguras en la investigación genética molecular. Posteriormente las institucio- nes oficiales de salud, alimentos, y ambientales, de varios países crearon regulaciones para evaluar po- sibles riesgos de plantas transgénicas, sobretodo al realizar ensayos de campo. 6.1.2 Evaluación de r iesgo La evaluación de riesgo de las plantas transgénicas no se realiza porque éstas sean intrínsecamente pe- ligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente, o la biodiversidad. La razón fundamental para esta evaluación reside en la poca experiencia que tene- mos en el manejo de las plantas y alimentos trans- génicos. Por el contrario la ingeniería genética, en contraste al mejoramiento comercial, aumenta grandemente el factor precisión a lo referente a la composición genética que se usa en la transferen- cia a nivel de secuencias específicas del gen de in- terés, el promotor, las secuencias de iniciación y terminación de la lectura y los marcadores de se- lección. A mayor precisión, debemos esperar ma- yor predictibilidad del resultado de la recombinación genética mediante transformación, en contraste a la recombinación que se obtiene en el mejoramiento comercial. Mientras que la evaluación de riesgo es un paso científico estratégico, el manejo del riesgo es insti- tucional y depende de cada país. La experiencia ganada indica que la evaluación debe estar basada en la naturaleza del organismo y el ambiente al que se introduce y el transgen en cuestión, y el grado de familiaridad que se tiene para cada factor. Entre los posibles factores a considerar en la eva- luación de riesgo de la introducción de cultivos transgénicos al campo, se encuentra: a. Flujo de transgenes a parentales silvestres, b. Toxicidad del transgen para humanos y mamíferos, c. Adquisición de caracteres de maleza, d. Efectos alergénicos de la planta / alimento transgé- nico, e. Creación de nuevos patógenos por efecto del trans- gen (por ejemplo, virus), f. Flujo del transgen a microorganismos del suelo, etc. William M. Roca / Hernando Ramírez 121 CEDAF Introducción a la Biotecnología A continuación haremos una breve descripción de los posibles riesgos más importantes: a. Flujo de transgenes a otros cultivos. Cultivos como el maíz, trigo, fríjol, etc. han experimentado durante el curso de su evolución, hibridizaciones con sus parientes silvestres más cercanos. Dado que esos cultivos son altamentedomesticados, es poco posi- ble que un solo trasngen, o unos pocos transgenes, sean capaces de convertirlos en malezas pernicio- sas. Se estima que el carácter maleza depende de por lo menos de la acción conjunta de 6 - 7genes. En el caso de cultivos semidomesticados, el análisis debería ser más cuidadoso. b. Flujo de genes a plantas silvestres. Cuando los culti- vos transgénicos crecen muy próximos a parientes silvestres cercanos, es posible que ocurra la transfe- rencia del transgen por hibridización. En algunos casos, el efecto podría ser un aumento de la agresi- vidad de la maleza, o la adquisición del razgo o ca- rácter, conferido por el transgen, por parte del silvestre. La evaluación del riesgo debe incluir el análisis caso por caso del flujo de genes y su posible efecto o impacto en los silvestres y/ o malezas. c. Plantas transgénicas conteniendo secuencias de vi- rus. Algunas de las preocupaciones expresadas in- cluyen: • Las proteínas virales podrían desencadenar reacciones alérgicas si se encuentran en los ali- mentos. Dado que muchos alimentos se consu- men estando infectados por virus sin efectos deletéreos en humanos, esta preocupación se está descartando. • Plantas resistentes a virus, pueden tener venta- ja competitiva en el campo, y ser fuente de ge- nes que se transfieren a malezas. Como se discutió arriba, debe ser evaluado caso por caso. • Pueden crearse nuevos virus por recombina- ción entre el transgen y el virus que infectan si- multáneamente la planta. Se conoce que muchas plantas son infectadas simultáneamen- te con virus múltiples. Sin embargo, en pocos casos se ha confirmado la recombinación gené- tica entre virus diferentes. Pero no hay eviden- cia que la recombinación sea más frecuente en plantas transgénicas que en situaciones típicas de infección viral. • La proteína del virus producida por el cultivo transgénico podría combinarse con virus natu- rales y producir cepas más virulentas. Mientras que esto puede ser teóricamente posible, el rie- go es demasiado bajo. • Genes virales diferentes a los genes de la capa proteica. Los genes que codifican por RNAs y no proteínas pero que confieren resistencia, científicamente no presentan riesgo. Otros ge- nes virales que decrecen la infección de un vi- rus pero que aumenta la de otro, deberán ser mutados para poder recibir aprobación. d. Efecto de bioinsecticidas transgénicos en objetivos no intencionales. Las plantas transgénicas Bt son las más relevantes. Las proteínas Bt son altamente específicas en su efecto tóxico, a nivel del grupo de insectos, (por ejemplo: lepidopteros) y de su "blan- co", en el tracto digestivo de la larva. Algunas de esas proteínas han mostrado efecto negativo en los insectos benéficos. Se ha demostrado también que las proteínas Bt se digieren rápidamente en el tracto humano, por lo que no sería un riesgo para la salud humana. e. Adquisición de resistencia por el insecto plaga. Esta es una gran preocupación sobre todo referida al caso de los genes Bt. Hay dos estrategias que se siguen para minimizar esta posibilidad : 1. La siembra de cultivos transgénicos intercalados con no transgénicos en forma de mosaico, de tal manera que ofrecen plantas "refugio" para los insectos sus- ceptibles y así bajar la presión. 2. Desarrollar construcciones genéticas conteniendo dos o mas genes Bt con sitios de acción diferentes (receptores diferentes) en las membranas del intesti- no medio de las larvas del insecto. Estudios realiza- dos han mostrado que la resistencia adquirida por el insecto en condiciones artificiales es recesiva, lo cual indica que se requerirá doble copia del alelo re- cesivo para ser efectiva. Las plantas refugio son una estrategia para retardar la resistencia del insecto a las toxinas de Bt. f. Flujo de transgenes a microorganismos. Muy poco se conoce sobre este tema, lo cual hace difícil la evaluación de este riesgo potencial. Se sabe que las 122 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF bacterias del suelo pueden obtener DNA de su am- biente y que el DNA puede permanecer adherido a partículas del suelo, pero esta posibilidad es poco probable. Cualquier riesgo potencial se elimina ha- ciendo construcciones que no pueden ser usadas por las bacterias, por ejemplo, construcciones conte- niendo intrones. Es aún menos probable la transfe- rencia de DNA a hongos del suelo, dado que es mucho más difícil. g. Efectos sobre la biodiversidad. Se refiere principal- mente a dos casos: 1. Flujo de transgenes de cultivos transgénicos a male- zas o silvestres emparentados. Como se discutió arriba, este posible riesgo debe ser evaluado caso por caso, dependiendo de la cercanía taxonómica, cercanía del cultivo a sitios de variabilidad nativa, grado de polinización cruzada, duración de vida del polen después de la dehiscencia, sincronización de la floración, presencia de insectos u otro tipo de vec- tores, etc. Es importante tomar en cuenta que este tema es más relevante en los trópicos que en áreas tempe- radas. En el trópico, la biodiversidad es mucho mayor y los cultivos son continuos, debido a que no se presentan las cuatro estaciones que ocurren en las áreas temperadas. 2. Erosión genética. La preocupación va dirigida al he- cho de que las variedades transgénicas reemplaza- rían a las variedades utilizadas por el agricultor, disminuyendo de esta forma la biodiversidad. Aun- que esto es teóricamente posible, en la práctica se espera que las variedades transgénicas sean cultiva- das principalmente en áreas de agricultura comer- cial, donde tradicionalmente se cultivan las variedades mejoradas y material transgénico. Lo importante es incentivar a los agricultores para la conservación in situ de la biodiversidad. 6.2 Costo - benef ic io de la Biotecnología Toda tecnología nueva debe ser evaluada en térmi- nos de sus beneficios y costos. Algunos de los problemas que se presentaron hace 30 años con la llamada Revolución Verde, deberán ser enfrenta- dos una vez más en el caso de biotecnología agrí- cola. Dos preguntas pueden hacerse en relación a este tema: 1. El transgen incorporado cumplirá una función im- portante en el área geográfica escogida? Algunas evidencias demuestran que los genes utilizados para el control de una plaga en un país temperado, no funciona en un país tropical. Por ejemplo, para el logro de la resistencia al virus del anillado de la pa- paya vía transformación genética, las construccio- nes tuvieron que ser diseñadas con cepas locales del virus. Un caso similar se presentó con el control de larvas de ciertos lepidopteros del algodón. También se debe tener en cuenta el sistema agríco- la de la región. Por ejemplo, mientras que en cier- tos países temperados el agricultor adquiere la semilla híbrida cada año, en algunos países tropi- cales sólo lo hacen cada tres años. Una resistencia transgénica perderá su valor en un porcentaje con- siderable de la semilla híbrida después del segun- do y tercer año. Esto amerita una mayor inversión de recursos para encontrar genes mas apropiados y un sistema más eficiente de distribución de la se- milla acorde con el lugar. 2. ¿Por cuánto tiempo el transgen continuará sirvien- do?. Este tema se refiere a la posibilidad de adapta- ción de insectos, patógenos, y malezas a los pesticidas y a las variedades que contienen el trans- gen. Este punto ya se discutió arriba en relación al caso de genes Bt. Lo importante de las estrategias actuales es lograr la disminución de los insectos re- sistentes mediante métodos y técnicas de manejo del cultivo y de la plaga. Es necesario recordar que la variedad transgénica por si sola muchas veces no es la solución, sino que es un componente importante para ser integrado en sistemas de manejo del cultivo y de la plaga. La Tabla 6.1 muestra el aumento significativo de ensayos de campo con plantas transgénica y el área sembrada comercialmente con cultivos transgéni- cos tanto en países desarrollados como en desarro- llo. Se estima que para el año 2006, el 60% de losproductos derivados de soya y el 80% de los del maíz tendrán su origen en cultivos transgénicos a nivel global. William M. Roca / Hernando Ramírez 123 CEDAF Introducción a la Biotecnología 6.3 Propiedad intelectual y comercial ización Desde sus inicios en 1973 - 75 la biotecnología lla- mó la atención por su potencial de comercializa- ción. Lo interesante es que aún los experimentos más básicos de laboratorio rápidamente encuen- tran un camino hacia la productividad y comercia- lización. Numerosas compañías de biotecnología han sido creadas, sobre todo en los países desarro- llados. La mayoría de estas compañías tenían ob- jetivos más tecnológicos que comerciales. Las exitosas compañías pequeñas fueron rápidamente adquiridas por multinacionales dedicadas a la co- mercialización de semillas y/o agroquímicos. En otros casos, estas pequeñas compañías recibían ju- gosos contratos de las multinacionales para la ela- boración de productos o procesos específicos. Los últimos años han sido testigos de asociaciones, ad- quisiciones, fusiones y compras de muchas de es- tas compañías biotecnológicas por parte de multinacionales de semillas, agroquímicos y fár- macos. La motivación más importante de estos procesos ha sido la conquista y colonización del mercado mundial de los productos biotecnológi- cos, sobre todo el de semillas y fármacos. Para te- ner una idea de la importancia económica de la industria biotecnológica, vale la pena mencionar que en 1998 el monto total de estas transaciones a nivel global fue de 8 mil millones de dólares. Una forma de asegurar el acceso a la tecnología y a productos para su comercialización ha sido a tra- vés de arreglos de propiedad intelectual. A parte del clásico registro de variedades para asegurar el derecho de obtentor (UPOV), la biotecnología ha generado una ola de patentamiento de genes, se- cuencias, mapas genómicos, sondas, tecnologías, y otros procesos. En países como EE.UU., sólo hasta ahora fue posible el patentamiento de plantas transgénicas. Se estima que cada mes se registran entre 50 - 100 nuevas patentes en biotecnología a nivel global. 6.3.1 Patentes Entre 1992 - 96 , el 35% de todas las patentes ha- bían sido registradas en EE.UU., y un porcentaje igual en el Japón. Seguido se encuentran Europa (18%), Rusia (6%), y el resto del mundo (6%), con China y Corea como las más importantes. La carrera de patentamiento y otras formas de pro- tección de la propiedad intelectual ha traído consi- go cambios importantes en las estrategias de investigación, sobre todo en biotecnología: Por ejemplo, antes de iniciar un trabajo de transforma- ción genética, es necesario determinar el número de patentes y derechos distintos que existen en los diferentes países al igual que de los procesos del plan de investigación. Es necesario llegar a arre- glos con los dueños de las patentes para obtener la 124 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Tabla 6.1 Número de ensayos de campo con plantas transgénicas y áreas sembradas con cultivos transgénicos comerciales. Fuente: James, C. (1998). Número de ensayos de campo (evaluación de bioseguridad) Periodo No. de países No. de cultivos No. de caracteres Total número de ensayos 1986 - 95 34 56 6 15,000 1996 - 97 45 60 10 10,000 Total 1986 - 1997 45 60 10 25,000 Area con cultivos comerciales transgénicos (millones de hectáreas) 1996 1997 1998 TOTAL 3 13 30 (*) (**) * EE.UU. (70%), Canadá (15%), Otros (15%) ** Países en Desarrollo: Argentina (4 millones hectáreas), México (1 millón hectáreas libertad de operación necesaria. Otro aspecto es el que se refiere a las patentes que confieren derecho sobre toda la estructura genética de la variedad, sobre todos los genes que se aíslen y aún aquellas que confieren derechos genéticos sobre una meto- dología y su aplicación. Sin embargo, ya existen casos de revisión por parte del poder judicial de aquellas patentes genéricas. El desafío que presen- ta el patentamiento en biotecnología es promover la innovación a través de la incentivación del inno- vador y evitando monopolios, para facilitar inno- vaciones futuras. Para lograr este objetivo, el Estado debe cumplir un papel importante evitando la propiedad intelectual de procesos fundamenta- les, permitiendo solamente la propiedad intelec- tual de procesos y productos finales, con el fin de incentivar la innovación futura. El aumento sus- tancial de la inversión en fitomejoramiento y bio- tecnología depende mucho de las campañas promocionales que motiven la cooperación entre el sector público y privado. 6.4 Producción de al imentos La seguridad alimentaria depende del desarrollo social, económico y tecnológico de un país o re- gión. Por lo tanto, el papel de la biotecnología, así como el de otras tecnologías de punta, debe ser vi- sualizado en el contexto de dicha realidad. Es ne- cesario tener en cuenta la posición del país en el contexto de la economía regional y global, el desa- rrollo de su exportación/importación de productos agrícolas, la importancia de la pequeña, mediana y grande agricultura en la economía del país, la capa- cidad de investigación y el potencial tecnológico de este, la existencia de instituciones y normas/re- gulaciones para estimular el desarrollo tecnológi- co. De esta forma, países con una tecnología fuerte pueden utilizar la biotecnología para aumentar su agricultura hacia la diversificación de productos, si es un país buen agroexportador, o pueden aumen- tar su agricultura hacia la autosuficiencia, si se tra- ta de un país agro importador. 6.5 Ejercic io 6.1 Perspect ivas futuras de la Biotecnología Vegetal Objetivos • Elaborar el concepto de bioseguridad. • Identificar algunos factores que deben ser consi- derados en la evaluación de riesgo cuando los cultivos transgénicos son introducidos al campo. Orientaciones para el instructor Con este ejercicio se pretende que los participantes asimilen el concepto de bioseguridad a través de la identificación de algunos factores que deben ser considerados en la evaluación de riesgo debido a la introducción de cultivos transgénicos al campo. Para la realización de este ejercicio se recomienda que el instructor lea atentamente las siguientes ins- trucciones: • Suministre información general sobre los objeti- vos del ejercicio. • Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo. • Colocar en cada mesa, una planta de tomate. • Conforme cuatro grupos de trabajo y ubique cada grupo en cada una de las mesas. • En cada grupo de trabajo los participantes deben identificar factores que ellos consideren deben ser tenidos en cuenta en la evaluación de riesgo cuando cultivos transgénicos de tomate son in- troducidos al campo. • Elaborar una lista de los factores que fueron con- siderados para la evaluación de riesgo en culti- vos transgénicos de tomate. • Motive una discusión con base a las respuestas dadas. • Proporcionar la información de retorno, con la lista de algunos factores que deben ser conside- rados para la evaluación de riesgo para el cultivo transgénico de este ejercicio. Recursos necesarios • Papelógrafo, papel, marcadores. • Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo. William M. Roca / Hernando Ramírez 125 CEDAF Introducción a la Biotecnología • Cuatro plantas de tomate en materas o bolsas de plástico. • Fotocopia de las instrucciones e información de retorno. Tiempo sugerido: 60 minutos. Instrucciones para el participante Los participantes tendrán la oportunidad de cons- truir el concepto de bioseguridad de acuerdo a la in- formación suministrada en la Sección 6 y mediante la identificación de algunos factores que deben ser considerados para la evaluación de riesgo cuando se liberan al campo plantas transgénicas de tomate. Instrucciones • Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo a las instrucciones dadas por el instructor. • Nombren un relator por grupo, el cual presentará en plenaria los resultados obtenidos por el gru- po. • Realizar un listado de los factores que ustedes piensen debenser considerados en la evaluación de riesgo cuando cultivos transgénicos de toma- te son introducidos al campo. • Al final del ejercicio, el instructor le proporcio- nará la información de retorno. Bibl iograf ía James, C. 1998. Global Review of Commercial ized Transgenic Crops. 1998. ISAAA Briefs No 8. ISAAA Ithaca, N.Y. Persley, G. J. , Giddings, L. V., and Juma, C. 1992. Biosafety: The Safe Appl icat ion of Biotechnology in Agricul ture and the Environment. The World Bank/Internat ional Service for Nat ional Agr icul tural Research ( isnar) . Krat t iger, A. F., and Rosemarin, A. (eds.) . 1994. Biosafery for Sustainable Agricul ture: Shar ing Biotechnology Regulatory Exper iences of the Western Hemisphere Internat ional Service for the Acquis i t ion of Agr i - b iotech Appl icat ions (ISAAA): I thaca and Stockholm Environment Inst i tute (SEI) . Stockholm. Sweden. 278 p. 126 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Cultivo transgénico Factores de riesgo en la evaluación Tomate 1 Flujo del transgen a parientes silvestres. 2 Toxicidad del transgen para la salud humana y animal. 3 Efectos alergénicos de la planta transgénica usada como alimento. 4 Flujo del transgen a microorganismos. 5 Flujo de polen (vectores), viabilidad del polen. Originales para trasparencias William M. Roca / Hernando Ramírez 127 CEDAF Introducción a la Biotecnología 128 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF B io se gu rid ad • E ns ay os de R ie sg oP er sp ec tiv as F ut ur as de La B io te cn ol og ía V eg et al C os to / B en ef ic io de la B io te cn ol og ía P ro pi ed ad In te le ct ua l • P at en te s W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 2 9 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes. • Conocer algunos factores que se consideran podrían ser causa de riesgo por la introducción de cultivos transgénicos al campo. • Entender por que los cultivos transgénicos son seguros. OObbjjeett iivvooss 1 3 0 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F Son las políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnología del DNA recombinante y de la transformación genética de plantas en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad. ¿¿QQuuéé eess bbiiooddiivveerrssiiddaadd?? W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z 1 3 1 C E D A F In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía • Se realiza, no , porque las plantas transgénicas sean peligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente o la biodiversidad. • Se realiza para ganar experiencia en el manejo de este tipo de cultivos. ¿¿PPoorr qquuéé ssee rreeaall iizzaa llaa eevvaalluuaacciióónn ddee rr iieessggoo?? 1 3 2 W illia m M . R o c a / H e rn a n d o R a m íre z In tro d u cció n a la B io te cn o lo g ía C E D A F EEvvaalluuaacciióónn ddee aallgguunnooss ffaaccttoorreess ddee rr iieessggoo • Flujo de genes de cultivos transgénicos a otros cultivos. • Flujo de genes de cultivos transgénicos a malezas. • Flujo de genes de cultivos transgénicos a plantas silvestres. • Efecto de bioinsecticidas transgénicos con objetivos no intencionados. • Desarrollo de resistencia del insecto plaga al bioinsecticida del transgen. • Flujo de genes a microorganismos. • Erosión genética. William M. Roca / Hernando Ramírez 133 CEDAF Introducción a la Biotecnología Anexos 134 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Anexos Anexo 1. Evaluación final de conocimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .135 Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno. . . . . . . . . . 138 Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .142 Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .144 Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación. . . . . . . . . . . . . . . . . . .145 Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana. . . . . . . . . . . . . . 146 Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 Anexo 1. Evaluación final de conocimientos 1. Defina en forma amplia el concepto de biotecnología. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 2. En el siguiente cuadro colocar las principales diferencias entre biotecnología de primera, segunda y tercera genera- ción. Biotecnología Características De primera generación De segunda generación De tercera generación 3. ¿Qué eventos claves permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 4. La totipotencia es la capacidad que tienen las células somáticas vegetales de regenerar una planta completa cuando son cultivadas en medios y condiciones adecuados. Explique como fue demostrado este fenómeno. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 5. En el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos vegetales generalmente se siguen cuatro pasos fundamentales. Expli- que cuales son. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 6. La aplicación del cultivo de tejidos vegetales se da básicamente en tres áreas. Explique cuáles son. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ William M. Roca / Hernando Ramírez 135 CEDAF Introducción a la Biotecnología 7. ¿Qué es la ingeniaría genética? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 8. ¿Cuáles son las cuatro etapas básicas para la clonación de genes? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 9. Escriba el dogma central de la biología ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 10. Defina que es un gen. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 11. ¿Qué entiende usted por genoma? ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 12. ¿Qué estrategias se utilizan para el estudio de la variabilidad genética de una especie? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 13. ¿Qué propiedades deben reunir un marcador molecular para que sea útil? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 136 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 14. ¿Cuáles son los usos más importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético de plantas? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 15. ¿Qué es una planta transgénica? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 16. Si usted esta interesado en transformar tomate (especie dicotiledonea), ¿ que sistema de transformación eligiría? Ex- plique. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 17. En la siguiente tabla presente tres ejemplos de cultivos transgénicos, indicando el tipo de gen introducido y la función de este gen en el cultivo transgénico. Cultivo transgénico Gen introducido Características del cultivo transgénico 1 2 3 18. ¿Qué es bioseguridad? ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ 19. Un tomate transgénico al cual se le ha introducido el gen Bt para conferirle resistencia a un insecto plaga, será noci- vo para la salud humana? Explique su respuesta. ________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________ William M. Roca / Hernando Ramírez 137 CEDAF Introducción a la Biotecnología Anexo 2. Evaluación final de conocimientos - Información de retorno A continuación se presentan posibles respuesta a las preguntas formuladas en la evaluación final de cono- cimientos, estas pueden ser ampliadas por el instructor. Respuestas Para la pregunta 1 Biotecnología es la aplicación de los principios científicos y de ingeniería para el procesamiento de mate- riales por medio de agentes biológicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes biológicos se refieren principalmente a microorganismos, células de animales y plantas, enzimas y mate- rial genético aislado y clonado. Para la pregunta 2 Biotecnología Características De primera generación · Se basó en la fermentación como proceso básico para la producción de bebidas, alimentos y combustibles. · Practica esencialmente empírica y en pequeña escala. ·Había poco conocimiento científico y de ingeniería. De segunda generación · Usa el conocimiento científico y de ingeniería. · Procesos a escala industrial. · Procesos basados en aplicación integrado de microbiología, bioquímica e ingeniería química. · Incluye: uso de fermentadores para la producción de fármacos, combustibles y alimentos y procesamiento de desechos. · También incluye: la técnica de inmovilización de enzimas y técnicas de cultivo de tejidos vegetales y animales. De tercera generación · También llamada: “Nueva biotecnología”. · Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante. · Se basa en la biología molecular. · Dio origen a las empresas biotecnológicas que explotan la ingeniería genética para “cortar” y “confeccionar” genes que son colocados en microorganismos para que “fabriquen por encargo” productos químicos y farmacéuticos de interés. Para la pregunta 3 Los eventos claves que permitieron el desarrollo de la biotecnología vegetal fueron: a. El desarrollo de cultivoin vitro. b. El descubrimiento de DNA recombinante. c. El desarrollo de los marcadores moleculares y el desarrollo de los sistemas de transformación genética de plantas. 138 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Para la pregunta 4 La totipotencia de las células somáticas vegetales fue demostrada por Steward y colaboradores en 1958 quienes describieron el desarrollo de una planta de zanahoria a partir de células somáticas del floema de la raíz de zanahoria. Para la pregunta 5 Para cultivarin vitro células, tejidos y órganos vegetales se deben seguir los siguientes pasos: a. Seleccionar y separar de la planta el explante que se desea cultivar. b. Desinfectar el explante. c. Sembrar el explante en un medio de cultivo apropiado. d. Cultivar el explante en condiciones ambientales controladas. Para la pregunta 6 La aplicación del cultivo de tejidos vegetales se da básicamente en tres áreas: a. La micropropagación. b. La contribución del cultivo in vitro en el mejoramiento vegetal. c. La producción de metabolitos secundarios. Para la pregunta 7 La ingeniería genética, es el térmico más utilizado para referirse al conjunto de técnicas involucradas en la manipulación del material genético (DNA y RNA), y está basada en la tecnología del DNA recombinante. La tecnología del DNA recombinante básicamente consiste en aislar segmentos específicos de DNA (ge- nes) e introducirlos en vectores especiales (plásmidos) para formar moléculas de DNA recombinante. Para la pregunta 8 Las cuatro etapas básicas para la clonación de genes son: a. Generación de fragmentos de DNA. b. Unión de los fragmentos a un vector molecular. c. Introducción del vector a una célula hospedante, para la amplificación. d. Selección de una secuencia específica. Para la pregunta 9 William M. Roca / Hernando Ramírez 139 CEDAF Introducción a la Biotecnología DNA mRNA Transcripción Traducción PRO TEINA Transcripción Reversa Replicación Para la pregunta 10 Un gen es un segmento de DNA que presenta una secuencia específica de pares de bases el cual contiene información para una característica genética del individuo. Para la pregunta 11 Genoma es el contenido genético total de un organismo. En las plantas el genoma está constituido por el contenido genético nuclear y organelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el término genoma casi siempre se utiliza para referirse a la información genética presente sólo en el genoma nuclear. Para la pregunta 12 La variabilidad genética de una especie puede ser detectada de diferentes maneras: a. Usando marcadores morfológicos y marcadores bioquímicos (isoenzimas) que son productos de la expresión de los genes y b. Usando marcadores moleculares, que permiten detectar diferencias entre individuos directamente a nivel de las secuencias del DNA de su genoma. Para la pregunta 13 Para que un marcador molecular sea útil debe reunir las siguientes propiedades: a. Que sea altamente polimórfico, es decir, que permita diferenciar claramente, dos individuos. b. Que sea codominante, para poder discriminar un individuo homocigoto de un heterocigoto. c. Que esté distribuido a través del genoma. d. Que no presente efecto pleiotrópico, es decir, que no afecte más de una característica.e. Que sea de fácil y rápida ejecución. f. Que tenga alta reproducibilidad. Para la pregunta 14 Los usos más importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento genético de plantas son: a. En la evaluación de germoplasma: b. Caracterización y análisis de la variabilidad genética, identificación de acervos genéticos y de parentales para el mejoramiento genético. c. En mapeo de genes cualitativos y cuantitativos (QTLs). d. En estrategias de fitomejoramiento: e. Selección asistida por marcadores moleculares, identificación y transferencia de QTLs de germoplasma silvestre. f. Mejoramiento asistido por marcadores moleculares. g. Clonación de genes con base a mapas genéticos. Para la pregunta 15 Una planta transgénica es una planta a la cual se le ha introducido un gen modificado (un gen quimérico), utilizando un método apropiado de transformación: mediante: ya sea , vía Agrobacterium tumefaciens o 140 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF mediante el bombardeo de partículas o biolística. El gen introducido es integrado en forma estable en el genoma de la planta; es expresado y heredado de una generación a otra. Para la pregunta 16 Las especies dicotiledóneas como tomate son susceptibles a varias cepas de Agrobacterium tumefaciens. Plásmidos Ti modificados de estas cepas pueden ser utilizados como vectores para transformar este culti- vo y en la práctica ésta es la vía elegida para transformar tomate. Para la pregunta 17 Cultivo transgénico Gen introducido Características del cultivo transgénico 1 Soya EPSP Sintasa Resistencia al herbicida glifosato 2 Tomate ACC Sintasa Antisentido Retarda la maduración del fruto 3 Tabaco Proteína de la cubierta o cápsula del virus TMV Resistencia al virus del mosaico del tabaco (TMV) Para la pregunta 18 Bioseguridad: Se refiere a las políticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnología del DNA recombinante y de la transformación genética de plantas en la salud, el medio am- biente y la biodiversidad. Las instituciones oficiales de salud, alimento y ambiental de varios países, han creado regulaciones para evaluar posibles riesgos de las plantas transgénicas, sobre todo al realizar ensa- yos de campo. Para la pregunta 19 Un tomate transgénico al que se le ha introducido el gen Bt de Bacillus thuringiensis expresa una delta- endotoxina que es altamente específica en su efecto tóxico sólo contra insectos lepidópteros. Se ha de- mostrado que estas toxinas no actúan en insectos benéficos y son digeridas en el tracto digestivo de los hu- manos, por lo que no representa ningún riesgo consumir tomate transgénico con Bt. William M. Roca / Hernando Ramírez 141 CEDAF Introducción a la Biotecnología Anexo 3. Evaluación del evento de capacitación Apreciado participante: Deseamos conocer sus opiniones sobre las actividades realizadas el día de hoy. No necesita firmar este formulario; de la sinceridad en sus respuestas depende en gran parte el mejoramiento de esta actividad. La evaluación incluye dos componentes: a) La escala 0 a 3sirve para que usted asigne un valor a cada uno de los aspectos que se evalúan: 0 = Malo, inadecuado 1 = Regular, deficiente 2 = Bueno, aceptable 3 = Muy bueno, altamente satisfactorio b) Debajo de cada pregunta hay un espacio para comentarios de acuerdo con el puntaje asignado. Refiérase a los aspectospositivosy negativosy deje en blanco los aspectos que no aplican en el caso de las actividades realizadas el día de hoy. 1.0 Evalúe el (los) objetivo (s) que se esperaba lograr el día de hoy. 1.1 ¿Correspondió o correspondieron a las necesidades institucionales y personales y las expectativas que usted traía? 0 1 2 3 Comentarios: __________________________________________________________________________________ ¿Cree que se logró o se lograron los objetivos propuestos? 0 1 2 3 Comentarios: __________________________________________________________________________________ 2.0 Evalúel as estrategias metodológicas empleadas: 2.1 Exposiciones de los instructores 0 1 2 3 2.2 Trabajos de grupo 0 1 2 3 2.3 Cantidad y calidad de los materiales entregados 0 1 2 3 2.4 Ejercicios realizados en el sitio del evento 0 1 2 3 2.5 Prácticas de campo 0 1 2 3 2.6 El tiempo dedicado a las diferentes actividades 0 1 2 3 Comentarios: __________________________________________________________________________________ 142 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 3.0 Evalúe la coordinación de las actividades 3.1 Información preliminar recibida por los participantes 0 1 2 3 3.2 Cumplimiento del horario de esta actividad 0 1 2 3 3.3 Manera en que se dirigieron las actividades 0 1 2 3 3.4 Apoyo logístico disponible (espacios, equipos, etc.) 0 1 2 3 3.5 Alojamiento (en caso de que aplique) 0 1 2 3 3.6 Alimentación (en caso de que aplique) 0 1 2 3 Comentarios: __________________________________________________________________________________ 4.0 Evalúe la aplicabilidad (utilidad) de lo aprendido en su trabajo actual o futuro. 0 1 2 3 Comentarios: __________________________________________________________________________________ 5.0 ¿Qué actividades realizará en el corto plazo en su institución para aplicar o transferir lo aprendido en este día? __________________________________________________________________________________ 6.0 ¿Estaría interesado en que esta capacitación se llevara a cabo en su institución? ¿En qué forma? __________________________________________________________________________________ ¡Gracias por sus respuestas y comentarios! William M. Roca / Hernando Ramírez 143 CEDAF Introducción a la Biotecnología Anexo 4. Evaluación del desempeño del instructor Fecha:______________________________ Nombre del Instructor:_________________________________________________ Temas desarrollados:___________________________________________________ Instrucciones Marque con una (X) el número que corresponda según lo que haya apreciado del instructor en el desarrollo de los temas. La escala evaluativa es la siguiente:4= Muy bien 3= Bien 2= Regular 1= Mal Exprese con sinceridad sus opiniones, no requiere firmar, los resultados serán utilizados para el mejoramiento en próximos eventos. 1.Organización y claridad del instructor a. Presentó los objetivos de la actividad 4 3 2 1 b. Explicó la metodología a seguir 4 3 2 1 c. Tuvo claridad en las explicaciones 4 3 2 1 d. Presentó ayudas didácticas que permitieran la comprensión 4 3 2 1 e. Los contenidos facilitaron el aprendizaje 4 3 2 1 2. Dominio del tema a. Mostró seguridad en su exposición 4 3 2 1 b. Respondió las preguntas a satisfacción 4 3 2 1 c. Relacionó la teoría con la práctica 4 3 2 1 d. Presentó ejemplos para ilustrar temas 4 3 2 1 3. Interacción del grupo a.Inspiró confianza al grupo 4 3 2 1 b. Demostró interés en el aprendizaje de los alumnos 4 3 2 1 c. Formuló preguntas a los participantes 4 3 2 1 d. Escuchó con atención a los participantes 4 3 2 1 e. Proporcionó información de retorno 4 3 2 1 4. Dirección de las prácticas a. Las prácticas estuvieron orientadas hacia los objetivos propuestos 4 3 2 1 b. Eligió los sitios adecuados para su realización 4 3 2 1 c. Evaluó la sesión práctica 4 3 2 1 d.Proporcionó información de retorno 4 3 2 1 144 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Anexo 5. Evaluación de los materiales de capacitación La evaluación del material puede hacerse con la participación de: • Expertos en el contenido (científicos, investigadores) • Expertos en comunicación • Técnicos, facilitadores de procesos, profesores, etc. • Productores, agricultores, miembros de organizaciones comunitarias, etc. • Para este efecto, los evaluadores pueden usar un formato como el siguiente: Calidad del Contenido Si No La información que se presenta es técnicamente válida en el contexto en que se utiliza El contenido está dividido en segmentos que siguen un proceso claro y ordenadoEl contenido se presenta objetivamente, es decir respetando principios y métodos válidos El contenido es adecuado para el nivel de la audiencia (ver usuarios de la Guía) El contenido está actualizado desde el punto de vista científico-técnico Calidad de la Producción Si No La calidad de la impresión es excelente Las imágenes (dibujos, gráficas, cuadros) son claras Las ilustraciones apoyan el mensaje escrito Los iconos están bien seleccionados (de acuerdo con el significado del texto) La distribución de la información (diagramación) en cada página es adecuada Los dibujos y fotografías reflejan bien situaciones reales Hay una buena correspondencia entre imágenes y textos Calidad instruccional Si No Los objetivos están claramente establecidos El material favorece la participación de la audiencia en la capacitación La relación objetivos-contenidos es excelente: el contenido refleja lo que se propone en los objetivos El material facilita los procesos de enseñanza y aprendizaje Los ejercicios y prácticas son novedosos Los ejercicios y prácticas ayudan en la comprensión de los temas. William M. Roca / Hernando Ramírez 145 CEDAF Introducción a la Biotecnología Anexo 6. La Biotecnología Vegetal en la República Dominicana Por: Bienvenido Cabral E., Ph.D. Para: Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal (CEDAF) Un análisis del programa agropecuario de la República Dominicana muestra que las oportunidades ofre- cidas por la Biotecnología Vegetal al país son obviamente prometedoras. Según datos del Plan Nacional de Alimentación y Nutrición (PLANAN), publicado en Santo Domingo, D. N., por la Secretaría de Estado de Agricultura (SEA), en enero de 1998, la agropecuaria dominicana te- nía el potencial de proveer más de una tercera parte de divisas por concepto de exportación y bienes, y más del 60% de los alimentos del consumo interno. Los principales cultivos de exportación continúan siendo la caña de azúcar, el café, el cacao y el tabaco, los que ocupan más del 50% del volumen de las explotaciones; por otro lado, las pequeñas y medianas fin- cas proporcionan al país su seguridad alimentaria, siendo los principales cultivos café, cacao, arroz, taba- co, musáceas, habichuelas, así como también en algunas áreas de hortalizas, papas, raíces. Los problemas fitosanitarios afectan considerablemente la producción de los cultivos en la República Dominicana. El ataque de plagas, enfermedades fungosas, bacterianas y las causadas por virus, reducen sustancialmente la producción siendo esto un peligro para la seguridad alimentaria de los dominicanos. Además, hay que destacar que en la mayoría de los casos se emplean variedades tradicionales con muy bajos niveles de productividad y resistencia a los factores antes mencionados. Tal es el caso de la Broca y la Roya en el café, las Sigatokas amarilla y negras en las musáceas, el ácaro y la Pyricularia en el arroz y las virosis en los cultivos de tabaco, habichuelas y raíces comestibles Por otra parte, es oportuno recono- cer que la baja productividad de la agricultura dominicana está asociada en gran medida con problemas climáticos y de suelos, siendo particularmente importantes las sequías, las cuales ocasionan daños consi- derables en los cultivos. En la solución de estos problemas debe jugar un papel la política que se adopte de generación y transfe- rencia de tecnología, la cual debe considerar la reorganización del sistema de investigación, validación y transferencia de tecnología, enfatizando la investigación en rubros que integran la canasta familiar en el mercado local, tales como plátano, arroz, habichuela y otros cultivos competitivos en el mercado interna- cional. El rol y el aporte de la Biotecnología Vegetal al desarrollo de este proceso son prioritarios, sobre todo en los actuales tiempos cuando se demanda una mayor productividad y competitividad de la agricultura do- minicana, ante los procesos de apertura y las nuevas reglas del mercado internacional. Dado que en el mejoramiento genético convencional los ciclos de cultivo son amplios y se requieren de grandes extensiones de terreno para su evaluación, es necesario incorporar técnicas como las de cultivo in 146 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF vitro e ingeniería genética, para reducir el tiempo y el espacio necesarios para la obtención de mejores va- riedades. Como sabemos, la Biotecnología Vegetal ofrece la posibilidad de producir variedades más tolerantes a condiciones desfavorables que teóricamente permitirían ampliar la superficie cultivable, elevar los rendi- mientos y disminuir las pérdidas producidas por enfermedades, plagas y estrés. Sin embargo, de la teoría a la práctica existe un camino muy largo y con muchos obstáculos. El desarrollo de la Biotecnología Ve- getal en la República Dominicana requiere de un mayor apoyo que permita incrementar la infraestructura material y humana; y disponer de financiamiento seguro y adecuado. En términos generales, podemos considerar que el país tiene en la actualidad un potencial para desarrollar y explotar la Biotecnología Vegetal. En el país existen cinco laboratorios que trabajan con técnicas de biotecnológicas. En la mayoría de éstos sus actividades se restringen al cultivo de tejidos con énfasis en la micropropagación vegetativa comercial y, prácticamente, no se han dado los pasos para aprovechar otras aplicaciones y técnicas para al mejoramiento genético vegetal. Tampoco se han explorado a profundidad otras oportunidades como son la producción de metabolitos secundarios muy demandados por la industria farmacéutica y la perfumería, entre otros. Por otro lado, ninguno de los laboratorios existentes cuentan con la infraestructura y equipos necesarios para la implementación de la tecnología del DNA recombinante, las técnicas de los marcadores molecula- res y la transformación genética de plantas. Sin embargo hay que reconocer que en el área de cultivo de tejidos ya contamos con algunos avances. En el Laboratorio Nacional de Biotecnología Vegetal de la SEA, se han desarrollado técnicas avanzadas de reproducción mediante el sistema de vitro, que han contribuido a la producción de plantas de mayor sani- dad y a disminuir los costos en la producción. Este laboratorio aporta al país cerca de algunos 600,000 plantas/año, principalmente de plátanos y papas, que son cultivos en los cuales se concentra la demanda de los productores. Las necesidades de material de siembra para estos cultivos no son abastecidas, ya que ésta se sitúa por los dos millones de plantas por año. Otras especies multiplicadas son: yuca, ñame, piña, algunos vegetales y café. El laboratorio desarro- lla varios trabajos de interés como son los de multiplicación de variedades de café tolerantes a Roya, nue- vas variedades de ajo adaptadas a zonas bajas, rescate de germoplasma de piña, producción de material de propagación de fresas, entre otros. En el cultivo de café se ensayan técnicas de embriogénesis somáti- ca, lo que representa una gran perspectiva. El país dispone de uno de los laboratorios de Biotecnología Vegetal más grandes del área del Caribe (Luo- ma Vitrolab), el cual, según el nivel de demanda, ha logrado producir cerca de 5 millones de plántulas de musáceas por año. En este laboratorio privado se han aplicado las técnicas de cultivos de tejidos para la multiplicación de un gran número de cultivos alimenticios así como especies forestales, frutales y ornamentales y, más aún, han logrado realizar la regeneración de las plantas no sólo mediante el cultivo de meristemos, sino tam- William M. Roca / Hernando Ramírez 147 CEDAF Introducción a la Biotecnología bién vía organogénesis y embriogénesis somática. Además, han practicado el cultivo de sus suspensiones celulares. Este laboratorio cuenta con un alto potencial investigativo y productivo, pero en la actualidad sólo se de- dica exclusivamente a la micropropagación clonal de plantas de especies ornamentales, como orquídeas, crisantemos, éster, gladiolos,anthurium, lilium, claveles, rosas y otros. Según sus directivos le resulta im- posible competir con los costos de producción del laboratorio estatal en la multiplicación de otros rubros. Existe otro laboratorio privado en el país que se dedica exclusivamente a la producción en gran escala de orquídeas para la exportación. Los que pertenecen al Instituto Superior de Agricultura (ISA) y a la Uni- versidad Autónoma de Santo Domingo (UASD) realizan tareas de micropropagación de plantas en menor escala y no son empleados a plenitud en las funciones de investigación y enseñanza como es de esperar. Esto quizá ocurre porque todavía en el país no existe ningún pregrado o postgrado en el área de agrobio- tecnología. Tan solo ahora una universidad del país, el Instituto Superior de Agricultura (ISA), ha tomado la iniciativa de incluir en el pensum de las carreras de Ingeniería Agronómica e Ingeniería en Manejo de Recursos Naturales la asignatura biotecnología vegetal. Por otra parte, el Comité Interinstitucional del Programa de Postgrados Tecnológicos de las Américas, en coordinación con el INDOTEC y el CEDAF, ha discutido la posibilidad de un proyecto de postgrado en biotecnología. Uno de los problemas que en- frentará este proyecto podría ser el de la insuficiencia de recursos humanos locales en esta área. En la ac- tualidad existen en el país solamente tres especialistas en Biotecnología Vegetal que poseen grado científico de Ph.D., dos con el grado de M.Sc. y un número muy reducido de técnicos con cursos realiza- dos en esta área. No obstante esto último, debemos insistir que las investigaciones en esta importante área científico-técni- ca sólo se manifestarán cuando tengan la prioridad y el apoyo de los sectores vinculados a la administra- ción del desarrollo agropecuario nacional, tanto privado como estatal; de lo contrario, el potencial de la biotecnología vegetal permanecerá latente en la República Dominicana. 148 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Anexo 7. Glosario Ácido nucleico: Polímero de nucleotidos (ver DNA y RNA). Aminoácido Unidades estructurales que forman las proteínas. Se encuentran unidos en una secuencia ordenada, lo que determina la estructura primaria, secundaria, y terciaria de la proteína. Anteras Parte masculina de una flor, en la cual se produce el polen. Porción del estambre que contiene el polen or- dinariamente bilocular. Antibiótico Sustancia producido por un organismo viviente que es tóxica para otros organismos. Anticodón Triplete de nucleótidos en la molécula del RNA de transferencia (tRNA) que es complementario con el codón en el RNA mensajero. (mRNA), durante la síntesis de proteínas. Autorradiografía Técnica que permite la detección de moléculas marcadas radioactivamente, al superponer la muestra con una película fotográfica. Bacterias Grupo de microorganismos unicelulares procariontes, es decir, sin membrana nuclear ni organelos defini- dos. Bacteriófago También llamado fago. Son virus que infectan células bacterianas provocando normalmente su lisis y ob- teniéndose una nueva progenie de virus. Algunos, como el fago lambda son muy utilizados en experimen- tos de DNA recombinante. Base nitrogenada Molécula orgánica de naturaleza purínica o pirimidínica que forma parte de los ácidos nucleicos. Princi- palmente son cinco: adenina, guanina, timina, citosina y uracilo. Esta última se encuentra sólo en el RNA. Beta-Galactosidasa Enzima que cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa. William M. Roca / Hernando Ramírez 149 CEDAF Introducción a la Biotecnología Biotecnología Conjunto de procesos industriales y de tecnologías, que implican el uso de sistemas biológicos. Algunos de estos procesos utilizan microorganismos manipulados genéticamente (ingeniería genética). Callo Conjunto de células vegetales provenientes de una sola célula vegetal inicial. Cápside Cubierta proteica externa de un virus. Posee una estructura altamente regular, que encierra el ácido nu- cleico del virus. Célula Unidad fundamental de la vida; el organismo más pequeño capaz de reproducción independiente. Clon En general, grupo de organismos genéticamente idénticos debido a que han sido producidos por algún tipo de reproducción asexual. Población de células que desciende de una sola célula madre. Clonaje Originalmente se refería al proceso por el cual se obtiene un grupo de células idénticas de una sola célula (clón). El término se ha extendido al proceso de obtener muchas copias de un gen a partir de una sola co- pia. Cloroplasto Organelo presente en las células vegetales, donde se produce la fotosíntesis. Código genético Relación entre la secuencia de nucleótidos en el DNA o el RNA y la secuencia de aminoácidos de una pro- teína. Cada triplete o conjunto de tres nucleótidos en el ácido nucleico determina un aminoácido específi- co. Por tanto, según la composición y frecuencia de nucleótidos, se obtendrán diferentes composiciones y frecuencias de aminoácidos, es decir, diferentes proteínas. Codón Secuencia de tres nucleótidos en el mRNA, que codifica un aminoácido o la terminación de una cadena polipeptídica. Colonia Grupo de células contiguas, normalmente derivadas de una misma célula original, que crecen en una su- perficie sólida. 150 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Crecimiento Incremento en la masa (peso seco y/o tamaño) de un organismo que acompaña los procesos de desarrollo, diferenciación y morfogénesis. El crecimiento usualmente involucra división y expansión celular. Cromosoma Estructura compuesta por ácidos nucleicos, en la que se encuentran los genes dispuestos en orden lineal. Su número es variable según la especie de que se trate, pero siempre es constante en una especie dada. Cultivo celular Crecimiento in vitro de células aisladas de organismos pluricélulares, animales o vegetales. Cultivo en suspensión Cultivo de células, tejidos u órganos sumergidos en un medio nutritivo líquido que requiere agitación. Delección Pérdida de un segmento de DNA. Puede variar desde solamente un nucleótido hasta un conjunto de ge- nes. DNA (ácido desoxirribonucleico) Es la forma molecular en la que se guarda y transmite la información biológica hereditaria. Desoxirribonucleótido Se obtiene al unirse un grupo fosfato a la pentosa de un desoxirribunucleósido. Diferenciación Fase de crecimiento durante la cual las células no especializadas se especializan en funciones particulares (por ejemplo, el meristemo). Dogma central La relación entre DNA, RNA y proteína. El DNA sirve como molde tanto para su autorreplicación como para la síntesis del RNA. El RNA, a su vez es el molde de la síntesis de proteína. Endonucleasa Enzima que produce cortes internos en el DNA. Enzima Proteína funcional que cataliza una reacción química específica, pero sin intervenir en ella. Es un catali- zador biológico. Es específico, es decir, es un catalizador solo de una reacción o de un tipo de reacciones. William M. Roca / Hernando Ramírez 151 CEDAF Introducción a la Biotecnología Enzimas de restricción Son endonucleasas capaces de reconocer y cortar móleculas de DNA de doble cadena en sitios específicos y que intervienen en el sistema de restricción-modificación del DNA de algunas bacterias. Embriogénesis Capacidad de las plantas con flores para producir embriones. No se reduce el desarrollo del huevo fertili- zado, sino que también puede ser inducido en cultivo de tejidos vegetales. (Embriogénesis somática). Escherichia coli Bacteria del intestino humano. Durante muchos años fue el único hospedero utilizado en los experimen- tos de ingeniería genética. Exón Secuencia de bases del DNA eucarióptico que se transcribe a mRNA y que codifica una proteína. Expresión genética Síntesis de proteína a partir de un gen determinado (gen expresado), mediante transcripción y traducción. Extremos cohesivos Cortes "escalanados" en el DNA de doble cadena, dando lugara terminales de cadena sencilla comple- mentarios entre sí. Permiten la circularización de la molécula de DNA de doble cadena. Fenotipo Conjunto de características visibles de un organismo como consecuencia de la interacción del genotipo y del medio ambiente. Fermentación Proceso de transformación, mediante enzimas o microorganismos. Se utiliza a escala industrial para la obtención de productos como alcoholes, ácidos orgánicos, etc. Gen 1. Unidad básica de la herencia. 2. Secuencia de DNA que codifica una proteína específica. Genoma Conjunto cromosómico básico de un organismo. La suma total de sus genes. Genotipo Dotación genética de un organismo. 152 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF Haploide Designa a cualquier núcleo célula u organismo que posee un juego simple de cromosomas impares. Nú- mero n o número reducido de cromosomas típico de la mayoría de los gametofitos. Heterocigoto Designa a un núcleo, célula u organismo diploide que contiene dos alelos diferentes por cada gen. Híbrido Producto de dos padres genéticamente diferentes. Primera generación de la descendencia de una cruza en- tre dos individuos que difieren en uno o más genes. Progenie de una cruza entre especies del mismo géne- ro o de géneros distintos. In vitro Designa a los procesos biológicos o a las investigaciones que se realizan fuera de los organismos vivos, tradicionalmente en tubos de ensayo. Información genética La información contenida en la secuencia de nucleótidos del DNA o RNA. Ingeniería genética Tecnología usada a nivel de laboratorio para alterar el aparato heriditario de una célula viva, de forma que pueda producir más o diferentes productos o desarrollar funciones diferentes. Estas células, manipuladas genéticamente, pueden utilizarse en la producción industrial. Inserción Mutación producida al intercalar una o varias bases nitrogenadas en la secuencia de una cadena de DNA. Intrón Secuencia de bases presentes en el DNA que aunque se transcribe no aparece en el mRNA final. Nucleótido Unidad fundamental de los ácidos nucleicos. Consta de una de las bases nitrogenadas unida a un grupo pentosa-fosfato. mRNA (RNA mensajero) RNA formado a partir del DNA y que sirve como molde para la síntesis de proteínas. Marcador genético Mutación genética con un efecto observable sobre el organismo, lo que permite localizar su posición den- tro del cromosoma y seguir su transmisión. William M. Roca / Hernando Ramírez 153 CEDAF Introducción a la Biotecnología Mapa genético Colocación ordenada de los genes en un cromosoma, según se deduce de los experimentos de recombina- ción genética. Medio nutritivo Medio de cultivo empleado para iniciar, desarrollar o enraizar diferentes inóculos; está formulado con macro y micronutrientes azúcar y reguladores de crecimiento. Meristemo apical Meristemo que se encuentra en el ápice de un brote o raíz. Mutación Cambio en la cantidad o estructura del DNA en los cromosomas, pudiendo ser génica o cromosómica. Una mutación génica consiste en el cambio de un gen de una forma alélica a otra; los cambios cromosómi- cos consisten en duplicaciones, inversiones, intercambios, etc. Organogénesis Formación de órganos (la caulogénesis es la iniciación de brotes y la rizogénesis es la iniciación de raí- ces). Plásmido Material heridatario extracromosómico. Es una molécula de DNA circular con replicación independiente. Gracias a su pequeño tamaño y simplicidad se usan frecuentemente en experimentos con DNA recombi- nante, sectores de DNA extraños y como vectores para la inserción de estos DNAs extraños en otros orga- nismos. Polinucleótido Secuencia lineal de nucleótidos. Promotor Región del DNA a la que se une la enzima RNA polimerasa para iniciar la transcripción. Primordio Grupo de células destinado a transformarse en una estructura particular, como lo es el primordio foliar, que va a dar origen a las hojas. Proliferación Crecimiento por multiplicación rápida de nuevas células. Proteína Polímero lineal de aminoácidos. Las proteínas son el producto de la expresión genética. 154 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF rRNA (RNA ribosómico) RNA componente de los ribozomas. Distinto del mRNA y tRNA. Su función es la de mantener la unión entre el mRNA y el tRNA durante la síntesis de proteínas. Recombinación Proceso de intercambio de material genético. Recombinante Célula o clón de células resultante de una recombinación. Replicación del DNA Mecanismo por el cual se producen copias exactas de un DNA que se toma como molde. Este mecanismo implica la separación de las dos cadenas de DNA y la construcción a partir de cada una de ellas, de una nueva cadena complementaria, mediante el apareamiento de bases. RNA (ácido ribonucleíco) Polímero de ribonucleótidos. En sus tres formas de mRNA, tRNA y rRNA, transforma el mensaje conte- nido en el DNA en una secuencia de aminoácidos, es decir, en proteínas. Subcultivo Transferencia del inóculo a medio fresco. tRNA (RNA de transferencia) RNA capaz de combinarse con un aminoácido específico. Cada especie de tRNA tiene un triplete de nu- cleótidos (anticodón) que interacciona con un triplete complementario (codón) en el mRNA. Totipotencialidad Es el fenómeno por el cual las células somáticas provenientes de diferentes partes de la planta, dadas las condiciones apropiadas, pueden desarrollarse en una planta completa. Traducción Síntesis de una proteína, cuya secuencia de aminoácidos esta especificada por los tripletes de nucleótidos del mRNA. Transcripción Síntesis del RNA a partir de un DNA molde, basándose en la complementariedad de bases. Transcriptasa inversa Enzima capaz de catalizar la síntesis de DNA a partir de RNA. Sólo se ha encontrado en los retrovirus. William M. Roca / Hernando Ramírez 155 CEDAF Introducción a la Biotecnología Transformación genética Mecanismo por el que se introduce un fragmento de DNA en el interior de una célula. Gracias a este nue- vo fragmento la célula receptora puede adquirir nuevas funciones. Vector genético Vehículo para la transmisión de un fragmento de DNA de una célula a otra. En genética molecular, los vectores más utilizados son plásmidos y virus, que pueden llevar un DNA extraño a una célula receptora u hospedante. Virus Agente, de menor tamaño que una bacteria, que causa enfermedades infecciosas y que necesita una célula intacta para su replicación. Contiene DNA o RNA como material hereditario, rodeado por una cubierta proteica. Yema (botón) Pequeño abultamiento en el tallo de una planta; da origen a una rama, a una flor o a varias hojas. 156 William M. Roca / Hernando Ramírez Introducción a la Biotecnología CEDAF 00 Inicio Biotecnologia 01A Seccione1 Biotecnologia 02 A Seccione2 Biotecnologia 03 A Seccione3 Biotecnologia 04A Seccione4 Biotecnologia 05A Seccione5 Biotecnologia 06A Seccione6 Biotecnologia 07 Anexos
