Validação do Ensaio de Proliferação Celular

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Revista Cubana de Química
ISSN: 0258-5995
revcubanaquimica@cnt.uo.edu.cu
Universidad de Oriente
Cuba
Ledón Naranjo, N.; García Chaviano, M.; Portillo Vaquer, A.; Ruíz Castro, E.
VALIDACIÓN DEL ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CELULAR COLORIMÉTRICO POR
MTT PARA LA DETERMINACIÓN DE POTENCIA DEL rHu-met-G-CSF
Revista Cubana de Química, vol. XIX, núm. 1, 2007, pp. 18-21
Universidad de Oriente
Santiago de Cuba, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=443543706006
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18 Vol. XIX, Nº 1, 2007
VALIDACIÓN DEL ENSAYO DE
PROLIFERACIÓN CELULAR COLORIMÉTRICO
POR MTT PARA LA DETERMINACIÓN DE
POTENCIA DEL rHu-met-G-CSF
N. Ledón Naranjo, M. García Chaviano, A. Portillo Vaquer, E. Ruíz Castro
Centro de Inmunología Molecular, Ciudad de La Habana
Resumen
Los factores estimuladores de colonias son cuatro glicoproteínas con función reguladora que
intervienen en el control de la proliferación y diferenciación de las diferentes células maduras del tronco
de las células hematopoyéticas pluripotentes. Las notables ventajas que muestran los métodos colorimétricos
(no radioactivos, simples, económicos, menos laboriosos y no tóxicos) con respecto a los que usan tímidina
tritiada, contribuyeron a la elección de este método como alternativa analítica para la determinación de
la actividad del G-CSF.
El ensayo se basa en la medición del efecto proliferativo del rHu-met-G-CSF sobre el crecimiento
de las células G-NFS60. La cuantificación de la proliferación celular, se realiza mediante la medición de
la absorbancia producida luego de la ruptura de la sal de tetrazolium (3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide) por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa y que da lugar a un
producto coloreado (formazán).
La conversión solo se realiza en células vivas y la cantidad de formazán producido es proporcional
al número de células vivas. El método se realiza según se describe en el PNO-5201 “Ensayo de
proliferación celular colorimétrico por MTT para la determinación de potencia del rHu-met-G-CSF”.
La optimización y validación del ensayo demostró que el método es exacto ya que no existen
diferencias significativas entre los valores esperados y los reales según la prueba Chi cuadrado. En el
rango de concentraciones entre 0.012 y 3.12 ng/mL el ensayo es lineal y paralelo para las curvas dosis-
respuesta de curvas y patrones. Este rango es exacto y preciso según los criterios de aceptación
establecidos. El ensayo es preciso, al obtenerse un coeficiente de variación de los ensayos de precisión
por debajo de un 10 %.
Introducción
El Centro de Inmunología Molecular (CIM)
produce el ior LeukoCIM factor estimulador de
colonias granulocíticas (G-CSF, en inglés). Este
producto se emplea en pacientes con cáncer con
tratamiento de quimioterapia mielosupresora y en
pacientes con leucemias mielodes agudas en
tratamiento quimioterapéutico de inducción o
consolidación. También se emplea en pacientes que
reciben trasplante de médula ósea, en pacientes
portadores de cáncer sometidos a procedimientos de
movilización y recolección de células progenitoras
hematopoyéticas y en pacientes con neutropenias
crónicas. En este trabajo nos trazamos el objetivo de
realizar la validación de uno de los métodos utilizados
para la liberación de los lotes de rHu-met-G-CSF
producidos en el CIM.
Materiales y métodos
El ensayo se basa en la medición del efecto
proliferativo del rHu-met-G-CSF sobre el crecimiento
de las células G-NFS60.
19Vol. XIX, Nº 1, 2007
La cuantificación de la proliferación celular, se
realiza mediante la medición de la absorbancia
producida luego de la ruptura de la sal de tetrazolium
(3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide) por la enzima mitocondrial succinato-
deshidrogenasa y que da lugar a un producto coloreado
(formazán). La conversión sólo se realiza en células
vivas y la cantidad de formazán producido es
proporcional al número de células vivas1. Se analizaran
los parámetros de Exactitud, Repetibilidad, Precisión
intermedia, Linealidad y Paralelismo y Rango.
En todos los casos se realizó un análisis estadístico
de los datos obtenidos.
Resultados y discusión
Exactitud
En la tabla 1, se observan los valores de potencia
calculados independientemente y su por ciento con
relación al valor supuesto y los límites fiduciales, para
un 95% de confianza.
Se obtuvo una potencia combinada de 29 MUI no
existiendo diferencias significativas entre los diferentes
valores de potencia según la prueba del Chi-cuadrado.
El valor del por ciento de recuperación de la combinada
(exactitud) calculado ([valor experimental/valor
real]*100) es de 100 %, (la potencia combinada
resultante es igual a 29 con valores individuales de
recuperación en el intervalo de 85 a 112 %). Este
valor cumple con lo mencionado en la Farmacopea
Europea, que establece que el valor de la relación de
la potencia calculada sobre la supuesta, expresada en
%, no debe ser menor de un 80 ni mayor de un 125.
Este mismo documento establece también que los
límites fiduciales de la potencia calculada no deben
ser menores de un 64 ni mayores de un 156 %,
condición con la que cumplen las potencias individuales
(tabla 1) y la combinada.
TABLA 1. VALORES DE POTENCIA Y SUS LÍMITES, DEL MRT 730306 EN
6 EXPERIMENTOS INDEPENDIENTES
 
Repetibilidad
En la tabla 2, se observan los valores de potencia,
los límites inferior y superior para cada experimento
y la media, desviación estándar y coeficiente de
variación de los tres en conjunto. Los valores del
coeficiente de variación de la media de los tres
experimentos realizados es de 2.52 %, el cual es
reconocido como válido por la OMS2.
 
 
TABLA 2. MEDIAS, DESVIACIONES ESTÁNDAR Y COEFICIENTES DE VARIACIÓN
DE LAS POTENCIAS OBTENIDAS EN LOS EXPERIMENTOS REALIZADOS
Precisión intermedia: Se evaluó el MRT 730306 en
cuatro experimentos independientes realizados en
días diferentes, con diferentes analistas. El valor del
coeficiente de variación de la media de los cuatro
experimentos realizados es de 6.52, el cual es
reconocido como válido por la OMS (tabla 3)
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Linealidad y paralelismo
Se evaluaron diversas muestras contra el MRT
730306, y en todos los experimentos se cumplió con la
hipótesis de linealidad y paralelismo según un diseño
al azar de líneas paralelas de un patrón contra una
muestra de actividad desconocida. Se muestran los
resultados de comprobación de linealidad y paralelismo
de 4 muestras evaluadas en experimentos
independientes. Se observa en todos los casos un
comportamiento dependiente de la dosis y el valor F
calculado es menor que el valor F teórico, por lo que
la hipótesis nula de linealidad y paralelismo no puede
ser rechazada con un nivel de confianza de 95 %
(tabla 4).
TABLA 3. MEDIAS, DESVIACIONES ESTÁNDAR Y COEFICIENTES DE VARIACIÓN
DE LAS POTENCIAS OBTENIDAS EN LOS EXPERIMENTOS REALIZADOS
TABLA 4. VALORES DEL ESTADÍGRAFO F DE FISHER (F CALCULADA) Y DE
LA F TABULADA (F TEÓRICA)
Rango
Para la determinación del rango y mejor ajuste se realizaron experimentos donde se incluyó el MRT 730306
a las concentraciones de 3,12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.195, 0.0975, 0.048, 0.024, 0.012 ng/mL.
Fig. 1 Curva Dosis-Respuesta para el rango de concentraciones entre 0.012 – 3.12 ng/mL del MRT 730306.
 Conclusiones
El método es exacto ya que no existen
diferenciassignificativas entre los valores
esperados y los reales según la prueba Chi
cuadrado. El ensayo es preciso, al obtenerse un
coeficiente de variación de repetibilidad de 2.52
entre determinaciones independientes realizadas
con las mismas condiciones de operación y por
obtenerse un coeficiente de variación de 6.29 bajo
las condiciones de reproducción intermedia. En el
rango de concentraciones entre 0.012 y 3.12 ng/
mL, el ensayo es lineal y paralelo para las curvas
dosis-respuesta de curvas y patrones.
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 Bibliografía
1. Mosmann T rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation citotoxicity assays J. Immunol
Methods 1983 16: 55-63.
2. A WHO guide to good manufacture practice (GMP) requeriments. Part 2: Validation. World Health Organization, Geneva, 1997:
74-78.