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ADN RECOMBINANTE
(Ingeniería Genética) 
Dra. María Isabel Colombo
Profesora Titular de Biología Celular y Molecular
FCM-U.N. CUYO
ADN Recombinante
“Molécula de ADN obtenida por unión de 
fragmentos de ADN de diferente origen
(especies o individuos diferentes)”
Clonación de ADN:
- producir muchas copias idénticas de una molécula 
de ADN.
- separación de un fragmento concreto de ADN (ej. gen) 
del resto del ADN de la célula.
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Tecnología del ADN Recombinante
“Procedimientos por los cuales una molécula de ADN 
es cortada en un lugar determinado y luego pegada 
con otro fragmento de ADN mediante el uso de ciertas 
enzimas de existencia natural en microorganismos 
(enzimas de restricción, ligasas)”.
* Nucleasas: rompen enlaces covalentes fosfodiésteres
Exonucleasas: sacan nucleótidos desde los 
extremos 5´ o 3´ de una cadena de DNA.
Endonucleasas: cortan en puntos internos de una 
cadena de DNA. Ej: Enzimas de Restricción.
* Ligasas: unión covalente entre el 0H 3´y el P04H 5´
de dos cadenas de ADN . Ej: T4 DNA ligasa.
*Polimerasas: Agregan nucléotidos a una cadena de 
DNA preexistente. Ej: Taq polimerasa
Manipulación del ADN: ENZIMAS
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Enzimas de Restricción
• Son de origen bacteriano
• Restringen la infección
por virus (bacteriófagos)
• Nomenclatura: Eco R I
• Cortan moléculas de ADN internamente (endonucleasas)
y no desde los extremos.
Género y especie
Cepa (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli )
Tipo de enzima (si hay más de una endonucleasa 
aislada de esa misma especie)
Enzimas de Restricción
• Fueron descubiertas por Werner Arber en la década del 1960’s. 
• Existen 3 tipos diferentes Type I, Type II and Type III.
• Hoy se conocen más de 4.000 enzimas de restricción (600 comerciales)
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Sitio de Restricción: PALÍNDROME
5´............ATCTGTT GAATTCTAGGAT........3´
3´............TAGACAACTTAAGATCCTA.......5´
5´..........GAATTC..........3´
3´..........CTTAAG.........5´
EcoRI
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Distintos tipos de corte de las 
enzimas de restricción
Extremos pegajosos Extremos romos
SmaI: Serratia marcescens
Extremos pegajosos
Corte por la enzima
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Extremos romos
Extremos romos
Extremos pegajosos
Extremos pegajosos
Extremos pegajosos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
VECTORES
• Son transportadores de fragmentos de ADN.
• Sirven para incorporar ADNs exógenos en
células procariotas o eucariotas.
• Son autorreplicativos
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Plásmidos: ADN circular de origen bacteriano
VECTORES PLASMÍDICOS
Vector plasmídico
Poliligador
o sitio de 
clonado
ampr ORI 
Promotor
Poliligador
o sitio de 
clonado
ampr ORI 
Promotor
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Poliligador o Sitio de Múltiple clonado
Vector Linearizado
Obtención de un Plásmido Recombinante
• Cortar el vector plasmídico con
enzimas de restricción.
• Aislar y cortar el ADN de interés.
• Unir el ADN de interés al vector 
(ligasas).
• Obtener el plásmido recombinante.
• Incorporar el plásmido recombinan-
te en una bacteria.
• Amplificar y purificar el plásmido.
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Transferencia Génica a Procariotas
TRANSFORMACIÓN: incorporación de un ADN exó-
geno en un organismo procariota (bacteria).
USOS:
• Aislar e identificar genes.
• Producción de grandes cantidades de ADN 
plasmídico.
• Producción de proteínas recombinantes de uso 
médico.
1.- OBTENCIÓN del 
Plásmido Recombinante
2.- TRANSFORMACIÓN
de bacterias con el P.R.
3.- SELECCIÓN
con antibiótico
4.- AMPLIFICACIÓN DEL 
ADN Y PURIFICACIÓN
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Transferencia Génica a Procariotas
TRANSFORMACIÓN: incorporación de un ADN exó-
geno en un organismo procariota (bacteria).
USOS:
• Aislar e identificar genes.
•Producción de grandes cantidades de ADN 
plasmídico.
• Producción de proteínas recombinantes de uso 
médico.
Producción de Proteínas Recombinantes 
de uso médico
• Insulina: para diabéticos
• Factor VIII: para pacientes con hemofilia A
• Factor IX: para hemofilia B
• Hormona del crecimiento humana: enanismo
• Eritropoyetina: para el tratamiento de anemias
• Interferón: defensa contra infecciones
• Antígeno de superficie de hepatitis B: vacunas
• Activador del plasminógeno tisular: disolución 
de coágulos
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TRANSFERENCIA GÉNICA 
A CÉLULAS DE MAMÍFEROS
TRANSFECCIÓN: Introducción de un ADN 
desnudo o unido a un plásmido 
en células eucariotas.
INFECCIÓN: Introducción de un ADN 
por medio de un virus.
Métodos de Transfección
• Con FOSFATO DE CALCIO: el ADN es incorporado 
por la célula por un mecanismo no bien definido
• ELECTROPORACIÓN: descargas eléctricas de alto 
voltaje que abren poros transientes en la membranas
• LIPOSOMAS: vesículas artificiales de membrana
cargadas positivamente.
•MICROINYECCIÓN: permite introducir ADN en el 
núcleo celular (Ej. microinyección de DNA en óvulos 
fecundados para obtención de animales transgénicos)
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Métodos de Transfección
• Con FOSFATO DE CALCIO: el ADN es incorporado 
por la célula por un mecanismo no bien definido
• ELECTROPORACIÓN: descargas eléctricas de alto 
voltaje que abren poros transientes en la membranas
• LIPOSOMAS: vesículas artificiales de membrana
cargadas positivamente.
•MICROINYECCIÓN: permite introducir ADN en el 
núcleo celular (Ej. microinyección de DNA en óvulos 
fecundados para obtención de animales transgénicos)
ELECTROPORACIÓN
Cubetas para electroporar
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TRANSFECCION DE CÉLULAS: USO DE LIPOSOMAS
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
• Con FOSFATO DE CALCIO: el ADN es incorporado 
por la célula por un mecanismo no bien definido.
• ELECTROPORACIÓN: descargas eléctricas de alto 
voltaje que abren poros transientes en la membranas
• LIPOSOMAS: vesículas artificiales de membrana
cargadas positivamente.
•MICROINYECCIÓN: permite introducir ADN en el 
núcleo celular (Ej. microinyección de DNA en óvulos 
fecundados para obtención de animales transgénicos).
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MICROINYECCIÓN
1. Investigación básica: estudio de la 
funcionalidad de genes y proteínas.
2. Producción de proteínas recombinantes.
3. Terapia génica. 
4. Modelo de enfermedades.
USOS:
Transferencia génica a células de 
mamíferos
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Vectores para expresar proteínas 
fusionadas a la GFP
Autofagosomas marcados con la proteína GFP-LC3
Células CHO
GFP-LC3
+ aminoácidos - aminoácidos
Célula de mamífero transfectada con 
plásmido recombinante
pGFP-LC3 (Green Fluorescent Protein-LC3)
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TRANSFERENCIA GÉNICA 
a
ORGANISMOS ENTEROS
Transferencia génica 
a organismos enteros
1.- Obtención de Animales Transgénicos
2.- Producción de proteínas recombinantes
3.- Terapia Génica
4.- Clonación de individuos
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ANIMALES TRANSGÉNICOS
Animales a los cuales se les ha transferido un gen foráneo
Por Ej. GFP-actina
Células tumo-
rales marcadas 
con RFP
Transferencia génica 
a organismos enteros
1.- Obtención de Animales Transgénicos
2.- Producción de proteínas recombinantes
3.- Terapia Génica
4.- Clonación de individuos
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Producción de 
Proteínas Recombinantes
en Animales Transgénicos
“Pampita", la vaca argentina transgénica del 
laboratorio Sidus, genéticamente preparada 
para producir hormona de crecimiento
en su leche 
“Pampita"
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“Patagonia", la ternera argentina transgénica 
del laboratorio Sidus, genéticamente 
preparada para producir insulina en su leche
Con apenas 25 vacas como Patagonia se obtendrían los
200 kilos de insulina humana que se necesitan por año 
en la Argentina, que hoy son importados
Transferencia génica 
a organismos enteros
1.- Obtención de Animales Transgénicos
2.- Producción de proteínas recombinantes
3.- Terapia Génica
4.- Clonación de individuos
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Enfermedad Gen afectado Producto Célula a Estado 
y vector alterado modificar actual
Talasemia B-hemoglobina
cósmidos
Hemoglobina Células de
médula
ósea
Modelo en
animales
Hipercoleste-
rolemia
r-LDL
retrovirus
Receptor de
LDL
Células 
hepáticas
Clínica con
éxito parcial
Fibrosis 
Quística
En clínica,
problemas
de rechazo
Proteína Reg. 
del transporte 
de cloruros
Rtfc
adenovirus
Células 
Pulmona-
res
Distrofia
Muscular
Dis
adenovirusDistrofina
Muscular
Células 
musculares
Estudios
Preliminares
• Herramienta para cambiar o "editar" piezas del ADN de una célula.
• CRISPR-Cas9 utiliza una molécula de ARN con un diseño especial que
guía a la enzima Cas9 hacia una secuencia particular del ADN.
• Cas9 corta las hebras de ADN en ese lugar y quita una pieza pequeña.
• El origen de CRISPR/Cas9 es en el sistema de defensa inmunitario 
de las bacterias ante los virus.
CRISPR: edición genómica
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente 
interespaciadas .
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NHDJ
HR
CRISPR-Cas9
CRISPR: edición genómica
• La tecnología CRISPR-Cas9 ofrece la capacidad de modificar
o corregir directamente los cambios asociados a una enfermedad 
subyacente en el genoma.
CRISPR/Cas9 se aplica en diversos campos de la ciencia como 
la agricultura y la medicina.
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Transferencia génica 
a organismos enteros
1.- Obtención de Animales Transgénicos
2.- Producción de proteínas recombinantes
3.- Terapia Génica
4.- Clonación de individuos
1. Obtención de un oocito desnucleado (individuo 
aceptor)
2. Microinyección del núcleo de una célula somática 
(individuo donador)
3. Fecundación in vitro.
4. Implantación del embrión en el individuo aceptor
5. Nacimiento de un individuo con material génico
idéntico al individuo donador.
* Ian Wilmut et al. 1997 (Oveja Dolly)
Clonación de individuos
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La clonación de la oveja Dolly
La clonación de la oveja Dolly
Extraer una célula
del animal que se 
va a clonar Conservar sólo
el núcleo Introducir el núcleo 
en el óvulo
Implantar el óvulo en
una madre portadora
Oveja A
Oveja B
Extraer un óvulo 
no fecundado
Extraer
el núcleo
Oveja C
Dolly, clon de la oveja A
CLONACIÓN TERAPEÚTICA
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CELULAS MADRE: células madres embrionarias 
y no embrionarias (adultas)
Fuentes de células madre adultas
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CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL
La Células Madre del Cordón Umbilical son Células Madre adultas y en 
su extracción tanto el bebé como la madre no sufren ningún tipo de daño, 
por lo que su conservación no entraña ningún tipo de dilema ético. 
CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL
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Inquietudes...............................
A Nivel Biológico:
-Reprodución asexual
-Especies híbridas
-¿Expectativa de vida y envejecimiento precoz?
-.¿Fertilidad? Otras alteraciones
Clonación de Individuos
¿Hay justificaciones científicas, médicas o éticas
para generalizar la clonación de la especie humana?
¿Hasta dónde pueden influir los factores no genéticos
(ambientales o herencia mitocondrial) para crear
variabilidad y diversidad en la especie humana?
La sociedad en que vivimos ha condenado la clona-
ción en seres humanos; ya que existe un miedo ge-
nuino y probablemente justificado a que estas tecno-
logías se nos “vayan de las manos”.
....................Para Reflexionar
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Bibliografía
• INGENIERÍA GENÉTICA Y TRANSFERENCIA GÉNICA. 
Marta Izquierdo Rojo. Ed.Pirámides. 2001
• BIOLOGÍA MOLECULAR EN MEDICINA. Timothy M. Cox and
John Sinclair. Ed. Panamericana.1998.
• RECOMBINANT DNA. James D. Watson. Michael Gilman.
Jan Witkowski. Mark Zoller. Ed. Schientific American BOOKS. 1997
• GENÉTICA HUMANA. A. J. Solari. Ed. Panamericana. 2000
• BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. Lodish et al. 
Ed. Panamericana. 2002