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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Departamento de Ciencias Biológicas Sección de Ciencias de la Salud Humana Licenciatura en Bioquímica Diagnóstica Clave: 105-39 Enero, 2017 Edición 3 Manual de Prácticas de Laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales Clave 1635 Autores QFB René Damián Santos M en C Gloria Leticia Arellano Martínez QFB Ma. De Lourdes Galván Ruiz M en C Beatriz Lucía González Maldonado QFB Verónica Ruiz Solorio QFB Luis Antonio Gordillo Reséndiz M en C Heidi Johanna Amezcua Hempel Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales Contenido Alcance i Presentación i Vinculación de las prácticas de laboratorio con el contenido del temario de la asignatura ii Objetivo general de la asignatura iii Objetivo del manual iii Introducción del manual iv Reglamento de laboratorio vi Práctica 1. Control de calidad en el laboratorio clínico 1 Práctica 2. Obtención de valores de referencia 9 Práctica 3. Espermatobioscopía directa 16 Práctica 4. Evaluación del líquido cefalorraquídeo 30 Práctica 5. Diferenciación de exudados y trasudados 40 Práctica 6. Examen coprológico 47 Práctica 7. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base 59 Práctica 8. Electrolitos del metabolismo mineral 62 Práctica 9. Determinación de hormonas 67 Practica 10. Cuantificación de gonadotropina coriónica humana. 70 Anexo A 74 Anexo B 75 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales i ALCANCE El presente manual debe ser utilizado por los profesores asignados al laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales, como fuente de información básica, debido a que contiene las actividades a realizar en cada una de las prácticas correspondientes a este laboratorio de enseñanza experimental. Asimismo, los alumnos inscritos en este laboratorio deben utilizar y consultar este manual, como parte de las actividades cotidianas que se evaluarán en su desempeño dentro del laboratorio. PRESENTACIÓN El presente manual consta de las prácticas Control de calidad en el laboratorio clínico, Obtención de valores de referencia, Espermatobioscopía directa, Evaluación del líquido cefalorraquídeo, Diferenciación de exudados y trasudados, Examen coprológico, Equilibrio hidroelectrolítico, Electrolitos del metabolismo mineral, Determinación de hormonas y Cuantificación de gonadotropina coriónica humana. Cada una de las prácticas está redactada bajo el siguiente esquema: 1. la introducción que introduce al estudiante a los conocimientos previos de la práctica; a continuación, una serie de preguntas, bajo el rubro información complementaria, que el alumno debe contestar después de haber consultado bibliografía actual, para complementar el marco teórico; 2. el objetivo (u objetivos) indica los conocimientos o habilidades que el estudiante debe adquirir al terminar la práctica; 3. los materiales divididos en biológicos, por equipo, por grupo y reactivos, para que el alumno conozca el material que le será entregado para hacer la práctica; 4. la metodología, donde se describe el fundamento, el significado clínico y la técnica de cada determinación a realizar durante la práctica; 5. la disposición de residuos, basada en la NOM-087-SEMARNAT-2002. Para cumplir con los requisitos que indica el Sistema de Gestión de la Calidad Corporativo de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (SGC-C FESC), el manual debe contener espacios para que el alumno escriba los resultados, la discusión, las conclusiones y las referencias que haya consultado. El grupo académico de profesores ha observado que es adecuado que el documento se divida en un Manual de prácticas, que contiene toda la información indicada en los cinco puntos anteriores y que la información que el alumno obtenga sea registrada en un documento llamado Cuaderno de Prácticas, que complementa al presente documento. Los alumnos de la asignatura reciben la versión electrónica en formato PDF (protegido contra cambios) de este Manual; se les indica que están en libertad de manejarlo en este formato o de imprimirlo, según lo prefieran. El Cuaderno de prácticas debe imprimirse en hojas de papel bond blanco, dos páginas por hoja en negro. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales ii VINCULACIÓN DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO CON EL CONTENIDO DEL TEMARIO DE LA ASIGNATURA En el siguiente cuadro se indica la vinculación de las prácticas que se desarrollan en la enseñanza experimental con el temario correspondiente a esta asignatura. Unidad (número y nombre) Práctica con la que se vincula Contenido que permite la vinculación 1. Control de calidad en el laboratorio clínico 1. Control de calidad en el laboratorio clínico En la teoría se abordan los conceptos básicos del control de calidad interno (CCI) del laboratorio clínico; en la práctica se elaboran cartas control y se conocen los principios para la preparación de sueros control, que son dos elementos que forman parte de la etapa analítica del CCI. Además, se estudia cómo se ejecutan los programas de evaluación externa de la calidad. 1. Control de calidad en el laboratorio clínico 2. Obtención de valores de referencia. Como parte de la calidad que ofrece cada laboratorio, deben obtenerse los valores de referencia considerando la población a la que brinda servicio. 2. Estudio de líquido seminal 3. Espermatobioscopía directa En la unidad se aborda la anatomía y fisiología y patologías relacionadas con el aparato reproductor masculino; en el laboratorio se realiza una espermatobioscopía directa, estudio con el que se inicia la evaluación de la fertilidad del varón. 3. Estudio de líquido cefalorraquídeo 4. Evaluación del líquido cefalorraquídeo En la teoría se estudia el proceso de formación del líquido cefalorraquídeo y se resalta la importancia de su evaluación en patologías relacionadas con el encéfalo; en el laboratorio se realizan las pruebas físicas, químicas y microscópicas de este líquido corporal. 4. Estudio de los líquidos serosos 5. Diferenciación de exudados y trasudados En la teoría se explica la función de los líquidos serosos, se conocen los principales sitios de derrame de estos líquidos corporales; en el laboratorio se realizan las principales pruebas que permiten identificar el origen del derrame. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales iii 5. Estudio de la evaluación gastrointestinal 6. Examen coprológico En la unidad se conocen la anatomía, fisiología y alteraciones relacionadas con el tracto gastrointestinal; en la práctica se realiza el estudio de las heces para detectar indicios de alteración (inflamatoria, de absorción, de digestión) del sistema digestivo. 6. Evaluación del equilibrio hidrolectrolítico 7. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base 8. Electrolitos del metabolismo mineral Tanto en la teoría como en la práctica se describe la función de los electrolitos; en el laboratorio se realiza la cuantificación de iones relacionados con el metabolismo mineral y se explica el fundamento de la determinación de los electrolitos relacionados con la polarización de las membranas biológicas. 7. Las hormonas y el laboratorio 9. Determinación de hormonas 10. Cuantificación de G.C.H. En la teoría se abordan la función de las hormonas de importancia diagnóstica; en el laboratorio se discuten, mediante exposiciones de parte de los alumnos, los fundamentos de los métodos de determinación de las hormonas, complementando con el estudio de casos clínicos de perfiles hormonales, que también dirigen los alumnos. OBJETIVO DE LA ASIGNATURAConocer y seleccionar las pruebas especiales del laboratorio clínico en patologías específicas, a través de diferentes metodologías para desarrollar un criterio en la técnica de mayor especificidad al menor costo, ofreciendo un diagnóstico más exacto y confiable, pero con un alto control de calidad. OBJETIVO DEL MANUAL Describir las pruebas y las determinaciones a realizar en cada sesión correspondiente al laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales, así como también sus fundamentos y utilidad clínica, con la finalidad de que el alumno tenga información precisa y accesible para desempeñarse satisfactoriamente durante el desarrollo de la enseñanza experimental. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales iv INTRODUCCIÓN DEL MANUAL La asignatura de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales forma parte del plan de estudios de la carrera de Licenciado en Bioquímica Diagnóstica, impartida en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, FESC, UNAM. Se trata de una asignatura primordial en el aprendizaje de los estudiantes de esta carrera, debido a que describe en su contenido una serie de pruebas y procedimientos realizados en los laboratorios clínicos como pruebas especiales, es decir, aquellas que no forman parte del trabajo de rutina. El laboratorio de enseñanza experimental correspondiente a esta asignatura permite que el alumno, además de conocer los principios, fundamentos y utilidad clínica de las pruebas especiales de laboratorio clínico en patologías específicas, obtenga las habilidades necesarias para llevarlas a cabo de manera correcta, de tal manera que en su desempeño profesional pueda aplicarlas oportunamente, apoyando al diagnóstico de los pacientes. Asimismo, se adentra al estudiante en el proceso de control de calidad en el laboratorio, para que reconozca la importancia de realizar adecuadamente los procedimientos con la finalidad de ofrecer un diagnóstico más exacto y confiable. Para apoyar a las actividades del laboratorio se cuenta con el presente Manual de prácticas, que cumple adecuadamente con los requisitos que indica el Sistema de Gestión de Calidad Corporativo de la FESC, debido a que la enseñanza experimental en los laboratorios de la FESC está en proceso de certificación bajo la norma ISO-9001-2015. El presente manual consta de las siguientes prácticas: 1. Control de calidad en el laboratorio clínico, donde se describe el procedimiento para realizar y analizar las cartas control, que se utilizan en el control de calidad interno de laboratorio; asimismo se conoce el principio para preparar un suero control, además de los cuidados necesarios en su preparación cuando se trate de un suero comercial. Además, se estudia cómo se ejecuta el control de calidad externo, a través de la obtención del porcentaje de error y de la puntuación del índice de varianza. 2. Obtención de valores de referencia, en esta práctica se describen las características necesarias de la población y dos métodos para la obtención de valores de referencia. 3. Espermatobioscopía directa, en esta práctica se detalla el estudio del líquido seminal, como prueba específica para iniciar la evaluación de la infertilidad masculina; también se da a conocer su importancia en el seguimiento post- vasectomía. 4. Evaluación del líquido cefalorraquídeo, donde se describen los exámenes físico, químico y microscópico de esta muestra, además de resaltar la importancia de su estudio. 5. Diferenciación de exudados y trasudados, que son derrames de líquido seroso, debido a causas mecánicas o inflamatorias; la importancia de diferenciar su origen se basa en la finalidad de apoyar a un adecuado tratamiento. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales v 6. Examen coprológico, se trata de un estudio de las heces con la finalidad de determinar si el paciente presenta alteraciones en el funcionamiento gastrointestinal. 7. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base, que se basa en seminarios impartidos por los estudiantes, quienes muestran el fundamento del flamómetro y del gasómetro, así como el análisis de casos clínicos relacionados con alteraciones electrolíticas. 8. Electrolitos del metabolismo mineral, donde se estudia el fundamento de la determinación de los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral, a través de métodos espectrofotométricos. 9. Determinación de hormonas, la cual se trata de una práctica teórica donde, por medio de exposiciones que los alumnos realizan, se explican los fundamentos de los métodos para determinar hormonas; también se estudian casos clínicos de los perfiles hormonales más importantes. 10. Cuantificación de gonadotropina coriónica humana, en la cual se analiza el método de inhibición de la hemaglutinación, a través del cual se cuantifica a esta hormona, que cobra importancia en el embarazo, aunque también es considerada como marcador tumoral. Por lo anteriormente descrito, este manual no solamente pretende ser una fuente de información que sirva de guía para la realización de la práctica, sino además una herramienta de trabajo durante las sesiones prácticas de este laboratorio. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales vi Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales vii Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 1 PRÁCTICA No 1. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CLÍNICO” Luis A. Gordillo R. 1.1 Introducción El Laboratorio Clínico es el establecimiento público, social y privado, legalmente establecido, independiente o ligado a otro establecimiento para la atención médica de pacientes hospitalarios o ambulatorios, que tenga como finalidad realizar análisis físicos, químicos o biológico de diversos componentes y productos del cuerpo humano, cuyos resultados coadyuvan en el estudio, prevención, diagnóstico, resolución y tratamiento de los problemas de salud (NOM-007-SSA3-2011). El laboratorio clínico debe garantizar que los resultados de estos análisis sean adecuados para el propósito que se aplican, para tal fin, se ejecutan procedimientos que monitorizan la calidad de los resultados y permiten aceptar o rechazar las corridas analíticas, de manera que se pueda afirmar el resultado de un paciente es confiable (Prada, et al, 2016). Debido a lo complejo que resulta mantener la calidad en el laboratorio clínico, los sistemas del control de calidad se han dividido en dos: el Control de Calidad Interno (CCI) y la evaluación externa de la calidad (EEC). En la NOM-007-SSA3-2011 está indicado que el laboratorio clínico debe ejecutar el CCI en todas las áreas de laboratorio, además de participar en al menos un programa de EEC. El CCI se divide en tres etapas: preanalítica, analítica y postanalítica, en cada una de ellas existen variables que pueden afectar el resultado del proceso que se realice (Tetrault, 2010). En la etapa analítica se utilizan las cartas control, también llamadas gráficas de Levey-Jennings, que permiten identificar de manera gráfica y estadística los errores cometidos dentro de esta etapa. Se utiliza una carta control por cada analito o tipo de análisis que se realiza en el laboratorio (Westgard, Barry, Hunt, 1981; Tetrault, 2010; Westgard, 2013). Para elaborar estas cartas se utiliza un suero o material control, que puede ser comercial o preparado en el laboratorio. Este material debe emplearse durante 30 días en las condiciones cotidianas de trabajo, de manera que refleje adecuadamente lo que se realiza en la rutina. Los datos obtenidos se tratan estadísticamente para elaborar la carta control en la que se graficarán los resultados del suero control (Westgard, Barry, Hunt, 1981; Tetrault, 2010). Las cartas controlse evalúan aplicando las multirreglas Westgard, que son criterios que están basados en métodos estadísticos. La violación de estas reglas debe activar una revisión de los procedimientos de la determinación de la prueba, el estado actual de los reactivos y la calibración de los equipos, además del rechazo de los resultados obtenidos con las muestras de los pacientes en la determinación de la prueba realizada. Las causas que llevaron a la aparición del resultado deberán ser Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 2 averiguadas para resolverlas y lograr nuevamente resultados confiables (Westgard, Barry, Hunt, 1981; Westgard, 2013). 1.2 Actividades previas a la práctica - Definir los siguientes conceptos: calidad, control de calidad, sistema de gestión de calidad, control de calidad interno (CCI), programa de evaluación externa de la calidad (PEEC). - Indicar las diferencias que existen entre normatividad, certificación y acreditación. - Identificar las variables que pueden afectar al resultado en cada una de las etapas del CCI. - Investigar cuáles son los PEEC que hay en México. - Explicar, en un cuadro, las diferencias que existen entre una solución control, una solución blanco y una solución patrón. 1.3 Objetivos - Conocer el procedimiento para preparar un suero control que se utilice en el área de Química Clínica. - Elaborar una carta control de algún analito del área de Química Clínica, utilizando un suero control comercial o preparado, según convenga, para poder identificar las variables que afectan al proceso realizado a través de su evaluación mediante el uso de las Multirreglas Westgard. - Evaluar la calidad entre los grupos de la asignatura, a través de las herramientas estadísticas utilizadas en los PEEC. 1.4 Materiales, equipos y reactivos Material por equipo - 1 gradilla - 5 tubos de ensaye - 1 ligadura - papel para limpiar celdas (que no deje residuos) - torundas con alcohol (como mínimo, una por alumno) - 1 sistema al vacío (tubo tapón rojo, aguja) por alumno Material por grupo - espectrofotómetro - celdas para el espectrofotómetro - micropipeta (capacidad mínima 10 μL) - matraz Erlenmeyer de 50 mL - puntas para micropipeta - agitador vórtex - baño maría a 37º C Reactivos Podrá utilizarse cualquier reactivo de Química Clínica que esté disponible y en cantidad suficiente, se prefieren las determinaciones de glucosa, ácido úrico, colesterol y triglicéridos. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 3 1.5 Procedimiento experimental 1.5.1 Obtención de la muestra biológica - Preparar el suero control comercial de acuerdo a las indicaciones del manual de uso (inserto). - Para la obtención de la muestra de sangre y separación del suero ver anexo A (solamente si se requiere preparar el suero control). 1.5.2 Preparación del suero control en el laboratorio Principio. Los sueros control preparados por el propio laboratorio consisten en una mezcla de varios sueros remanentes del trabajo del día, pueden necesitarse diariamente sueros de pacientes sanos (control normal) o con resultados fuera de valores de referencia (control anormal). Los sueros se guardan y almacenan en botellas de plástico en el congelador a <20º C. Deben despreciarse las muestras de los sueros hemolizados, ictéricos, lipémicos y contaminados así como también los sueros de pacientes que se conozca o sospeche que tengan el virus de la hepatitis C (VHC) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Técnica - Realizar una toma de muestra, con sistema al vacío y tubo de tapón rojo de 7 ml, a un integrante de cada equipo del grupo. - Obtener el suero y recolectarlo en un matraz Erlenmeyer de 50 mL y homogenizarlo suavemente en vórtex (sin formar burbujas). - Distribuir a cada integrante de los equipos una porción de la mezcla (aproximadamente 500 μL) para que realicen la determinación del analito elegido y se elabore la carta control. 1.5.3 Elaboración de la carta control experimental (gráfico de Levey-Jennings) Indicaciones previas. Para realizar la carta control puede utilizarse cualquier analito de Química Clínica; para fines de enseñanza experimental, se prefieren aquellos cuya técnica sea colorimétrica de punto final (glucosa, ácido úrico, colesterol, triglicéridos) y que estén disponibles en el laboratorio en cantidad suficiente. Los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las indicaciones del fabricante, siguiendo el manual de uso del reactivo (inserto), donde también se pueden consultar los fundamentos de la determinación y el significado clínico del analito en cuestión. Ver las recomendaciones del Anexo B. Técnica - Determinar al analito elegido, en el control preparado por el laboratorio o en el control comercial, según sea la muestra con la que se cuente, siguiendo las indicaciones del manual de uso de reactivo correspondiente. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 4 - Anotar los resultados en el pizarrón. Los profesores elegirán al menos 20 de estos datos para realizar los cálculos que se requieren para la elaboración de la carta control. Los demás resultados se graficarán en la carta obtenida. - Calcular el promedio de los resultados elegidos, posteriormente la desviación estándar y el coeficiente de variación de acuerdo a las siguientes fórmulas: = X1+X2+X3+X4…Xn N CV= S / Estos datos también pueden obtenerse utilizando una calculadora que cuente con aplicaciones de estadística o en el programa de Excel de Microsoft, según convenga. La forma de ingresar los datos y calcularlos dependerá de la herramienta en cuestión. NOTA: el CV puede expresarse en décimas (tal cual se obtiene con la fórmula indicada) o en porcentaje, para lo cual el resultado obtenido debe multiplicarse por 100. 1.5.3.2.4 Calcular los rangos de la carta control, con el promedio y las desviaciones estándar obtenidas, de acuerdo a lo siguiente: ±1S = ( - S) – ( + S) ±2S = ( - 2S) – ( + 2S) ±3S = ( - 3S) – ( + 3) Donde ( - S) es el límite inferior del rango y ( + S) es el límite superior del rango. Por ejemplo si queremos calcular el ±1S y se tiene un = 89 y una S = 12 ±1S = (89 – 12) – (89 + 12) = 77 – 101 De esta misma manera se calculan los rangos ±2S y ±3S. Nota. El símbolo (–) no indica resta, sino el rango que se obtiene. - Graficar los límites obtenidos como se ilustra en la figura 1.1 (ver página 5). Al momento de graficar es necesario resaltar en color verde el ±1S pues este rango nos indica el límite aceptable, el ±2S se delimita de color amarillo porque es el límite de alerta y por último el ±3S de color rojo pues nos indica que es el límite de acción. - Graficar en la carta control los resultados que no se utilizaron en los cálculos o en su defecto, los que sean indicados por los profesores. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 5 Elaboración de la carta control teórica NOTA: esta carta únicamente se elaborará si se cuenta con el suero control comercial - Identificar en el manual de uso del suero control comercial utilizado, el rango aceptable del analito que se determinó, éste es el límite ±2S. Algunos insertos indican el promedio y la desviación estándar. - Calcular el promedio, a partir del límite ±2S; ejemplo: si el límite es 240 – 280, el promedio es 260, es decir el valor medio de este límite. - Calcular la desviación estándar, a partir del límite ±2S; de acuerdo con el ejemplo anterior, se obtiene la diferencia entre el límite superior y el inferior (280 – 240 = 40), este valor se divide entre cuatro (40/4 = 10). El resultado es la desviación estándar (10). Carta control de ___analito___ Mes _______________ nivel del control __________Figura 1.1 Muestra de una carta control (Tomada del archivo del autor) - Calcular, utilizando el promedio y la desviación estándar teóricos, los límites ±1S y ±3S, además del coeficiente de variación. Es recomendable también calcular el límite ±4S. - Elaborar la carta control teórica con los límites teóricos calculados, para compararla con la carta control experimental e identificar el efecto del coeficiente de variación en cada una de ellas. - Analizar las diferencias observadas entre las cartas graficadas. Evaluación de la carta control mediante las Multirreglas Westgard - Evaluar las cartas control teórica y experimental mediante el diagrama lógico de aplicación de las multirreglas Westgard (figura 1.2). X 1DE -1DE 2DE -2DE 3DE 1 2 5 6 -3DE 3 4 Día del mes Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 6 - Cuando una corrida está fuera de control, investigar el proceso y corregir el problema, en el siguiente orden. - Determinar el tipo de error que ocurre con base a la regla violada. Un error aleatorio es detectado usualmente por las reglas 1-3S o R-4S, mientras que un error sistemático es fácilmente indicado por las reglas 2-2S, 4-1S o 10X. - Consultar los manuales de procedimientos para identificar las variables que afectan al proceso para el tipo de error indicado por la regla de control que ha sido violada. - Inspeccionar el proceso de análisis e identificar las causas del problema. Figura 1.2 Diagrama lógico para la aplicación de la técnica de control multirreglas Westgard (Adaptado de Westgard, Barry, Hunt, 1981) Parámetros de la evaluación externa de la calidad - Calcular el promedio de los resultados de cada equipo, denominado “valor del laboratorio” - El valor consenso será el valor promedio del suero control, el cual está indicado por el fabricante. - Calcular el porcentaje de error para cada laboratorio, lo que reflejará la exactitud en su trabajo, para lo cual debe utilizarse la siguiente fórmula % 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑙𝑎𝑏𝑜𝑟𝑎𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑠𝑜 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑠𝑜 ∗ 100 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 7 El “valor del laboratorio” es el promedio de cada equipo, por lo tanto esta fórmula debe aplicarse con cada uno de estos datos, uno a la vez. - Calcular el porcentaje de puntuación del índice de varianza utilizando la siguiente fórmula 𝑃𝐼𝑉 = % 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝐶𝑉𝑆 ∗ 100 Donde el porcentaje de error corresponde a un porcentaje aceptable que es característica del analito que será evaluado, los cuales dependen del método empleado en el análisis. - Analizar el resultado de cada laboratorio ficticio con base en lo indicado en la tabla 1.1 Tabla 1.1 Intervalos de las puntuaciones de los índices de varianza PIV Color Calidad 0 - 100 Verde Calidad satisfactoria 101 – 200 Amarillo Calidad regular, susceptible a mejora 201 – 300 Anaranjado Calidad insatisfactoria 301 – 400 Rojo Mala calidad 1.6 Disposición de residuos - Las agujas deben depositarse en el contenedor rígido de residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI); su empaque se desecha a la basura municipal. - Las torundas, guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del área de trabajo deben desecharse en la basura municipal. - En caso de que algún material esté empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI. - Los tubos que contengan mezclas reactivas sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse en los botes ubicados fuera del laboratorio. 1.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas debe elaborarse la carta control experimental y teórica; en cada una de estas se graficarán algunos de los resultados (al finalizar la sesión experimental el profesor responsable de la práctica indicará los datos a graficar). Para analizar las cartas control debe calcularse el coeficiente de variación, para conocer el efecto de la de la variabilidad de los datos; posteriormente, los puntos graficados deben evaluarse de acuerdo a las reglas Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 8 Westgard; en caso de que se presente violaciones, indicar si se trató de un error personal o instrumental, aleatorio o sistemático; además de seguir el procedimiento para conocer las variables que ocasionaron el error. Es importante que se plantee una posible acción correctiva y una preventiva para evitar que vuelva a suceder la violación. Debe resaltarse la importancia de esta herramienta para el control de calidad interno del laboratorio clínico. 1.8 Referencias - NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos. - Prada, E., Blazquez, R., Gutiérrez-Bassini, G., Morancho, J., Jou, J.M., Ramón, F., Ricós, C., Salas, A. (2016) Control interno de la calidad vs control externo de la calidad. Laboratorio clínico, 9:54-9 doi 10.1016/j.labcli.2016.04.0003 - Westgard, J, Barry, P, Hunt, M (1981) A multi-rule Shewart chart for quality control in clinical chemistry. Clin Chem 27(3):493-501 - Westgard, J. (2013) Prácticas básicas de control de la calidad. Westgard QC Inc, USA Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 9 PRÁCTICA No. 2 OBTENCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA Beatriz L. González M. Luis A. Gordillo R. 2.1 Introducción Los valores de referencia son una herramienta esencial para la interpretación de los resultados de laboratorio; la NOM-007-SSA3-2011, en su numeral 4.8, indica que deben estar impresos en los informes de resultados, conforme a los métodos utilizados, el género y el grupo de edad al que corresponden. Actualmente, se define a los valores de referencia como el resultado analítico obtenido en un individuo de referencia, es decir, aquel rango que se obtiene por una observación o medición de un tipo particular de magnitud o de un individuo perteneciente a un grupo muestra de referencia; estos valores son dependientes de la genética, la raza, los estilos de vida y ambientales, y en ocasiones, hasta la edad; además, el método analítico utilizado y el equipo también pueden afectar (Boyd, 2010). Los valores de referencia son una guía de los que se podrían considerar pacientes normales, pero el hecho de encontrarse fuera de ellos no indica una enfermedad, simplemente que el valor obtenido no está dentro del 95% de la población con la que se calcularon. Debido a lo anterior, se dice que no es válido utilizar los valores de referencia reportados en los insertos de las casas comerciales, ya que fueron obtenidos, la mayoría de las veces, de poblaciones muy diferentes a las usuarias del laboratorio (Ozarda, 2016)). El panel de expertos de la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC, por sus siglas en inglés) desarrolló en 1986, la llamada “teoría de los valores de referencia”, que describe los lineamientos para establecerlos, pero hasta la fecha el concepto no es bien comprendido, pues se manejan en forma indistinta los conceptos valores de referencia, límites de referencia y límites de decisión clínica (Boyd, 2010). Para la obtención de estos valores es necesario buscar una población lo más homogénea posible, respecto a las variables que los afectan, y clínicamente sana, establecer los criterios de inclusión y exclusión de los individuos, el procedimiento de recolección idóneo de la muestra, el sitio de punción más recomendable, las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras y el método de análisis óptimo de acuerdoa los parámetros del control de calidad (Sikaris, 2014). La determinación de valores de referencia implica: obtener datos, ordenarlos, procesarlos estadísticamente y obtener conclusiones. Cuando la distribución es simétrica (el 95% de los pacientes es aparentemente sana), se emplea estadística paramétrica; si se trata de distribución asimétrica se usa la descriptiva, abarcando el percentil 2.5 al 97.5 (Boyd, 2010; Theodorsson, 2015). La importancia de la obtención de los valores de referencia no solo radica en hacer una comparación adecuada de los resultados del paciente con respecto a la población en la que se ubica, sino que además se cumple con la normatividad oficial en México (NOM-007-SSA3-2011) que indica que el informe de resultados debe incluir los valores de referencia de cada analito que se determine en el laboratorio. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 10 2.2 Actividades previas a la práctica - Definir los siguientes conceptos: límites de referencia, límites de decisión clínica, límites de corte; métodos estadísticos paramétricos y no paramétricos; normalidad estadística. - Explicar cómo afectan las diversas variables (relacionadas con el paciente, el equipo y método a utilizar) en la obtención de valores de referencia. 2.3 Objetivos - Conocer el procedimiento correspondiente para realizar la obtención de valores de referencia en una población homogénea. - Obtener los valores de referencia en una población de estudiantes (grupo de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales) de algún analito de Química Clínica, según convenga, mediante el método ±2S y el método de percentiles, para comparar los resultados obtenidos y determinar cuál es el más adecuado de acuerdo a la población estudiada. 2.4 Materiales, equipos y reactivos Material por equipo - 1 gradilla - 5 tubos de ensaye - 1 ligadura - papel para limpiar celdas (que no deje residuos) - torundas con alcohol (como mínimo una por alumno) - 1 sistema al vacío (tubo tapón rojo de 4 ml, aguja) por alumno Material por grupo - espectrofotómetro - celdas para el espectrofotómetro - micropipeta (capacidad mínima 10 μL) - puntas para micropipeta - agitador vórtex - baño maría a 37º C Reactivos Podrá utilizarse cualquier reactivo de Química Clínica que esté disponible y en cantidad suficiente, se prefieren las determinaciones de glucosa, ácido úrico, colesterol y triglicéridos. 2.5 Procedimiento experimental 2.5.1 Obtención del material biológico Para la obtención de la muestra y separación del suero ver Anexo A. Nota. Cada alumno procesará la muestra que obtuvo. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 11 2.5.2 Indicaciones previas. Para calcular los valores de referencia en la población estudiada y para fines de enseñanza experimental, se prefieren determinar aquellos analitos cuya técnica sea colorimétrica de punto final (glucosa, ácido úrico, colesterol, triglicéridos) y que estén disponibles en el laboratorio en cantidad suficiente. Por lo tanto, deben verificarse las condiciones de ayuno e interferencia con fármacos, de modo que los pacientes cumplan con estas condiciones, así como identificar si es conveniente considerar criterios de partición. Los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las indicaciones del fabricante, siguiendo el manual de uso del reactivo (inserto), donde también se pueden consultar los fundamentos de la determinación y el significado clínico del analito en cuestión. Ver las recomendaciones del Anexo B. Los datos que se obtengan deben compartirse con todos los integrantes del grupo; en ocasiones es conveniente considerar los resultados de los demás grupos con la finalidad de que la n sea más grande. 2.5.3 Selección de la población de referencia - La población de referencia se define como el conjunto de individuos seleccionados con la finalidad de obtener valores de referencia, para seleccionarlos es necesario definir adecuadamente los criterios de inclusión y exclusión con la finalidad de que se reduzca la variabilidad biológica. Asimismo es importante definir la necesidad de establecer los criterios de participación, en caso de que sea necesario establecer subgrupos (ver tabla 1). Criterios de inclusión Criterios de exclusión Criterios de partición Ser clínicamente sanos Vivir en una zona geográfica delimitada Pertenecer a la misma raza o etnia Seguir las indicaciones de ayuno Condiciones patológicas o intervención médica reciente Uso de drogas o fármacos Factores de riesgo Edad Género Estado fisiológico - Además de lo anterior, deben considerarse las características de la muestra; es necesario darle a la población de referencia las indicaciones previas de ayuno o dieta, restricción de fármacos, entre otras. Una vez obtenida la muestra debe manipularse de manera que no se hemolice. Lo anterior con la finalidad de obtener una muestra de calidad analítica. - Por otro lado, el procedimiento a realizar debe ser ejecutarse correctamente, de modo que cumpla con el control de calidad previamente establecido. 2.5.4 Tratamiento de valores aberrantes Con el fin de eliminar valores que no pertenezcan a la serie de datos obtenidos es conveniente evaluar a los valores de los extremos, para lo cual se utiliza la prueba de Dixon-Reed. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 12 Procedimiento - Ordenar los resultados del analito determinado en forma ascendente. - Evaluar el primero y el último valor por la fórmula de Dixon-Reed, para determinar estadísticamente que pertenecen a la serie de datos: D ≤ R/3, donde D es la diferencia del valor evaluado menos el valor inmediato (considerándose el valor absoluto) y R es la diferencia entre el último y el primer valor. - Eliminar el valor evaluado en caso de que no se cumpla la fórmula de Dixon. 2.5.5 Descripción de la muestra de referencia La muestra de referencia es un subconjunto de la población de referencia. Es importante verificar que la distribución de los datos obtenidos en esta población sea gaussiana, pues el cálculo de valores de referencia paramétricos exige este tipo de distribución, en caso contrario deberá optarse por transformar los datos para obligarlos a cumplir con la distribución de Gauss o proceder a calcular intervalos de referencia no paramétricos. Procedimiento - Una forma sencilla de identificar si la muestra de referencia tiene una distribución gaussiana es demostrar que el promedio, la mediana y la moda corresponden al mismo dato. - También es posible graficar los datos mediante un histograma, para lo cual se recomienda utilizar la siguiente fórmula, con la finalidad de definir el tamaño del intervalo 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑 = 𝑥 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑜 − 𝑥 𝑚í𝑛𝑖𝑚𝑜 1 + (3.321 ∗ 𝑙𝑜𝑔 𝑛) Donde x máximo es el límite superior de los datos, x mínimo es el límite inferior y n es el número de datos. Considerando este dato es posible graficar el histograma de frecuencias y determinar gráficamente si los datos tienen una distribución gaussiana. - Existen pruebas estadísticas que permiten definir la gaussianidad de los datos, la IFCC recomienda determinar los coeficientes de sesgo y de curtosis (test de coeficientes). Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 13 Coeficiente de sesgo basado en el coeficiente de Person donde X es el promedio, Md es la mediana y S es la desviación estándar. El coeficiente de Pearson varía entre -3 y 3, de modo que: o Si As < 0 la distribución será simétrica negativa o Si As = 0 la distribución será simétrica (gaussiana) o Si As > 0 la distribución será simétrica positiva Coeficiente de curtosis basado en la medida de Fischer Donde Xi escada uno de los valores, X es la media aritmética, n es el número de datos y 4 es el cúadruplo de la desviación estándar poblacional. La medida de Fischer se interpreta de acuerdo con lo siguiente. o Si α < 3 la distribución es platicúrtica o Si α = 3 la distribución es normal o mesocúrtica o Si α > 3 la distribución es leptocúrtica NOTA: El resultado del coeficiente de curtosis que da Excel es una medida semejante a α, a este valor debe sumarse 3 para que se obtenga la medida de Fischer. 2.5.6 Cálculo de valores de referencia: método 2S El método 2S está basado en estadística paramétrica, de modo que la población debe cumplir la condición de que tenga una distribución gaussiana. Procedimiento - Una vez que se ha demostrado que los datos cumplen con una distribución gaussiana, obtener el promedio y la desviación estándar. - Calcular el rango ±2S, como se obtiene para las cartas control. Este intervalo es el valor de referencia. - Es conveniente calcular el coeficiente de variación, que junto con las pruebas de gaussianidad permitirán fundamentar si el método es adecuado o no para calcular los valores de referencia en la población. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 14 2.5.7 Cálculo de valores de referencia: método de percentiles 2.5 y 97.5 El método de percentiles 2.5 y 97.5 está basado en estadística no paramétrica, de modo que es el método de elección cuando la distribución no es gaussiana. Procedimiento - Calcular ((n+1) x 0.025), donde n es el número total de datos. Expresar el resultado sin décimas. - Eliminar, al principio y final de la serie, el número obtenido de datos. - Los resultados de los extremos son los valores de referencia para esa población. NOTA: con fines de enseñanza experimental, los valores de referencia deben calcular por ambos métodos, sin embargo deben considerarse los resultados de los test de coeficientes en el análisis de los resultados. 2.6 Disposición de residuos - Las agujas deben depositarse en el contenedor rígido de residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI); su empaque se desecha a la basura municipal. - Las torundas, los guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del área de trabajo deben desecharse en la basura municipal. - En caso de que algún material esté empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI. - Los tubos que contengan mezclas reactivas, sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse en los botes ubicados fuera del laboratorio. 2.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas se realizarán los cálculos pertinentes para obtener los valores de referencia con los métodos ±2S y percentiles. Considerar cuál de los dos métodos es el más apropiado para obtener los valores de referencia en la población utilizada, explicando si se presentaron variables preanalíticas, analíticas y postanalíticas que pudieran afectar el proceso. Comparar los valores obtenidos con algunos teóricos, indicando la referencia consultada, verificando si existe alguna diferencia significativa entre ellos, apoyándose en alguna prueba estadística. 2.8 Referencias - NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos. - Boyd, J. (2010) Defining laboratory reference values and decision limits: populations, intervals, and interpretations. Asian J Androl 12:83 – 90 - Ozarda, Y. (2016) Reference intervals: current status, recent developments and future considerations. Biochemia Medica 26(1):5 -16 doi: 10.11613/BM.2016.001 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 15 - Sikaris, K. (2014) Physiology and its importance for reference intervals. Clin Biochem Rev 35(1):3 – 14 - Thedorsson, E. (2015) Resampling methods in Microsoft Excel for estimating reference intervals. Biochemia Medica 25(3):311 – 319 doi: 10.11613/BM.2015.031 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 16 PRÁCTICA No 3. “ESPERMATOBIOSCOPÍA DIRECTA” Beatriz L. González M. 3.1 Introducción El semen es una combinación de espermatozoides suspendidos en las secreciones del testículo y epidídimo, y las secreciones de la próstata, vesículas seminales y las glándulas bulbouretrales que se mezclan con aquella en el momento de la eyaculación. El producto final es un líquido viscoso denominado eyaculado (WHO, 2010). El estudio del líquido seminal, conocido como espermatobioscopía, espermiograma o espermatograma, es el examen diagnóstico más importante y sencillo para iniciar el estudio de la fertilidad masculina, es de bajo costo y permite realizar una primera impresión diagnóstica y evaluar los logros de los tratamientos médicos y quirúrgicos que se llevan a cabo durante el tratamiento. La espermatobioscopía también tiene aplicaciones en problemas legales, como en los casos de violación, y para verificar la eficacia de la vasectomía (Omu, 2013; Wang, et al, 2014). Existen dos tipos de espermatobioscopía: la directa para la cual se obtiene la muestra por masturbación evitando el uso de condón o lubricantes, y la indirecta, también llamada prueba de Sims- Huhner, cuya muestra es el fluido que se obtiene después de que la pareja mantuvo coito a término. Esta última prueba permite evaluar la compatibilidad del líquido seminal con el moco cervical, debido a que solamente se evalúa la capacidad del espermatozoide para moverse en la secreción vaginal (WHO, 2010). La espermatobioscopía directa se realiza dividiéndola en dos tipos de examen: macroscópico, en el que se evalúan el volumen, el pH, licuefacción, viscosidad, olor, color y el examen microscópico, donde se determina el número de espermatozoides, motilidad, morfología y vitalidad (WHO, 2010; Omu, 2013; Auger, et al 2015; Agarwal, et al, 2016). Debe considerarse que las muestras fluctúan en un rango que varía en función de diferencias individuales, del tiempo de abstinencia y de detalles finos en la recolección, así como del intervalo transcurrido entre la obtención y el procesamiento de la muestra; por lo tanto, estos factores pueden hacer variar los resultados. En consecuencia, nunca se deberá establecer un diagnóstico con la evaluación de una sola muestra, por lo que se recomienda analizar dos muestras de semen en un lapso no menor y no mayor a tres meses para establecer un diagnóstico certero, (WHO, 2010). Para que una espermatobioscopia sea interpretada correctamente por el médico es necesario indicarle al paciente una información clara y completa acerca de la recolección y manipulación de la muestra hasta su entrega al laboratorio; también es fundamental que la muestra sea analizada garantizando un procesamiento correcto, por lo cual se recomienda realizar estos exámenes en un laboratorio de andrología (WHO, 2010; Esteves, 2016). Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 17 3.2 Actividades previas a la práctica - Definir los siguientes conceptos: astenozoospermia, poliespermia, oligospermia, teratozoospermia, hiperespermia, aneyaculación, eyaculación retrógrada, hematospermia. - Explicar cómo se obtiene el factor para calcular el número de espermatozoides/mL - Investigar los fundamentos del análisis apoyado por computadora para la evaluación de la motilidad, la estimación de la concentración y de la morfometría del semen. - Indicar en un cuadro comparativo las diferencias entre la cámara Makler y la de Neubauer. - Investigar el fundamento de las tinciones de Shorr y Diff-Quick. - Investigar en que consiste la técnica deevaluación de la morfología de los organelos de los espermatozoides mótiles (MSOME). 3.3 Objetivos - Conocer la importancia que tienen las indicaciones que se le dan al paciente para realizar la recolección y el manejo de la muestra para observar el efecto que tienen en los resultados de espermatobioscopía. - Conocer las pruebas que se realizan al semen mediante la realización de una espermatobioscopía directa para poder apoyar a un diagnóstico adecuado. 3.4 Materiales, equipos y reactivos Material por equipo -1 gradilla -1 aplicador de madera -1 hemocitómetro con pipeta de leucocitos -1 microscopio -1 tiras de papel pH -2 tubos de ensaye 12x75 -1 pipeta graduada Reactivos - Tren de tinción de Papanicolau -Reactivo de Dacie (formol 1%, citrato de sodio 3%) - Colorante de Wright y buffer de fosfatos (en caso de que no se cuente con el tren de tinción de Papanicolau 3.5 Procedimiento experimental Instrucciones para la recolección de la muestra de semen - Abstenerse de tener relaciones sexuales y masturbación por un periodo de entre 2 a 7 días. - Obtener la muestra vía masturbación sin usar lubricante ni condones de látex ya que pueden contener espermicidas. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 18 - Recolectar la muestra en un contenedor de plástico limpio, estéril y de boca ancha. Es importante que se recoja la totalidad del eyaculado. En caso contrario, la muestra debe marcarse “recolección incompleta” e indicar cuál fue la fracción no recolectada. - A la brevedad o dentro de la primera media hora de recolección de la muestra, llevar el recipiente al laboratorio manteniéndolo en un bolsillo que esté cerca del cuerpo, para mantener la temperatura de la muestra. - Etiquetar el espécimen con: nombre, fecha y hora de recolección. 3.5.2 Aspecto y color Significado clínico. El aspecto del líquido seminal es opalescente, el color es grisáceo. La muestra de semen debe ser examinada inmediatamente después de su licuefacción o dentro de los 60 minutos, por simple observación a temperatura ambiente. Un aumento o disminución de la turbidez en el aspecto del semen carecen de importancia clínica excepto cuando es causado por una leucocitosis en procesos inflamatorios. Puede parecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy baja, marrón cuando contiene eritrocitos, o amarillenta en el caso de un paciente con ictericia o que consume algunas vitaminas. Técnica - Observar la muestra después de la licuefacción, mezclándola suavemente. 3.5.3 Licuefacción Significado clínico. La licuefacción total de la muestra a temperatura ambiente se realiza de 15-60 minutos. El semen se eyacula líquido, pero al poco tiempo se forma un coágulo, que se rompe entre 10 y 20 minutos debido a la acción de enzimas proteolíticas, como la fibrinolisina, posteriormente vuelve a transformarse en un líquido viscoso. En algunos casos, la licuefacción no es completa a los 60 minutos, lo que puede provocar una inmovilización completa o parcial de los espermatozoides, inhibiendo su movimiento a través del cérvix del útero. El retraso de la licuefacción por más de 2 horas sugiere una inflamación de glándulas sexuales accesorias o defectos de enzimas de los productos de secreción de las glándulas. El semen con licuefacción normal puede contener pequeños gránulos que no licúan, lo que parece no tener significancia clínica. La presencia de cadenas de moco puede interferir con el análisis. Técnica - Mezclar cuidadosamente la muestra en el recipiente original, evitando agitarla vigorosamente. - Observar que la muestra se licúe dentro del periodo de tiempo mencionado. Es posible que se observen grumos e hilos. No debe mezclarse continuamente pues se puede acelerar la licuefacción. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 19 3.5.4 Volumen Significado clínico. El volumen normal del eyaculado es de 1.2 a 7.6 mL; el cual se genera principalmente por las vesículas seminales y la glándula prostática, con una pequeña cantidad de las glándulas bulbouretrales y el epidídimo. Los aumentos de volumen se relacionan a procesos infecciosos-inflamatorios de los órganos accesorios; la disminución es característica de obstrucción del conducto eyaculatorio o ausencia congénita del conducto deferente. Asimismo, debe considerarse la pérdida de eyaculado durante la recolección, la eyaculación parcial retrógrada o la deficiencia de andrógenos. Los volúmenes reducidos pueden ocasionar una escasa penetración en el moco cervical por parte de los espermatozoides. Técnica - Medir el volumen del eyaculado usando una pipeta de vidrio después de que la muestra esté totalmente licuada. 3.5.5 Viscosidad Significado clínico. Se dice que una muestra tiene una buena viscosidad cuando la licuefacción es adecuada. La viscosidad (a menudo denominada “consistencia”) puede interferir con la determinación de la motilidad y la concentración de espermatozoides y con las pruebas para la detección de anticuerpos unidos a la superficie de los espermatozoides. También una viscosidad elevada ha demostrado una invasión excesiva del moco cervical en estudios realizados después del coito. Técnica. - Aspirar la muestra en una pipeta de 5 mL y permitir la libre caída de las gotas. Observar la longitud del filamento formado. En una muestra normal se observan gotas pequeñas y bien definidas. - Como método alternativo, la muestra puede ser evaluada introduciendo una varilla de vidrio o un aplicador de madera. La longitud del filamento que se forma no debe exceder los 2 cm de longitud. 3.5.6 pH Significado clínico. El pH del líquido seminal es de 7.2 - 8.0. El pH es un reflejo del balance entre el pH de las diferentes glándulas accesorias, principalmente de la secreción de vesículas seminales (alcalinas) y prostática (ácida). Debe determinarse entre 30 minutos y 1 hora después de la eyaculación, pues la pérdida de CO2 puede afectar el pH. Cuando el pH de una muestra es <7.0 y además presenta azoospermia e hipospermia, se debe sospechar de una obstrucción de las vías eyaculatorias o ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes. A valores de pH ácido se produce mortalidad de los espermatozoides (el pH de la vagina actúa como espermaticida biológico). Cuando existe un pH ácido y un volumen menor a 2 mL se debe sospechar de una agenesia de vesículas seminales y esta se debe comprobar con una titulación de fructuosa de semen. Los valores de pH en ciertas regiones geográficas son generalmente iguales o Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 20 superiores a 8.0 comparados con valores de 7.2 a 8.0 de otras regiones. Procesos inflamatorios e infecciones crónicas pueden estar relacionados con alteraciones en el pH. Técnica - El pH debe medirse dentro de la primera hora posterior a la eyaculación. - Distribuir una gota de semen sobre la tira de papel pH. - Al cabo de 30 segundos el color de la zona impregnada debe ser uniforme; comparar con la escala de colores de la caja para determinar el pH de la muestra. 3.5.7 Agregación y aglutinación NOTA: Esta prueba y la de motilidad son subjetivas, por lo que deben realizarse por duplicado por dos analistas diferentes y comparar sus resultados. En caso de discordancia es necesaria la participación de un tercer analista. Fundamento. La observación en fresco, bajo el microscopio óptico, de una muestra de semen permite evaluar la agregación o aglutinación, la presencia de células redondas (diferentes a los espermatozoides, tales como células epiteliales, leucocitos, células germinales inmaduras), la evaluación de la motilidad; asimismo permitirá determinar la dilución requerida para el recuento. Es recomendable realizar la observación en dospreparaciones diferentes. Significado clínico. La adherencia de espermatozoides inmóviles a otros o de espermatozoides móviles a cadenas de moco, células no espermáticas o detritos celulares es considerada como agregación inespecífica y debe ser reportada. La aglutinación específica se refiere a espermatozoides con movilidad limitada pegados a otros, cabeza a cabeza, cola a cola o cabeza a cola. No obstante la aglutinación es evidencia insuficiente para deducir causas inmunológicas de la infertilidad, aunque sugiere determinar la presencia de anticuerpos anti-espermatozoides. La aglutinación severa puede afectar la evaluación de la motilidad y de la concentración. Técnica - Colocar una gota de semen licuado sobre un portaobjetos limpio y seco. - Cubrir con un cubreobjetos y montar en el microscopio. - Enfocar la preparación a 10X y observarla a 40X por lo menos 10 campos. - Evaluar el grado de aglutinación con base en los grados indicados a continuación Grado 1, aislado: < 10 espermatozoides por aglutinado, la mayoría están libres Grado 2, moderado: 10 a 50 espermatozoides por aglutinado, se observan espermatozoides libres Grado 3, grande: aglutinados de más de 50 espermatozoides, pocos permanecen libres Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 21 Grado 4, grueso: todos los espermatozoides están aglutinados, y estos están interconectados. Figura 3.1 Grados de aglutinación 3.5.8 Motilidad Significado clínico. La motilidad progresiva debe ser mayor al 32% de los espermatozoides con motilidad; la motilidad progresiva y no progresiva (anteriormente conocida como movilidad) debe ser mayor al 40%. Si no se cumplen estos criterios la muestra seminal se califica con diagnóstico de astenozoospermia. El espermatozoide tiene una estructura flagelar que permite su desplazamiento en el líquido seminal, en la cavidad vaginal, útero y trompas uterinas. En la evaluación de la capacidad reproductiva o fértil del espermatozoide, la motilidad es un criterio determinante para su normalidad. La motilidad está disminuida por infecciones de transmisión sexual, por el varicocele testicular, el frío, muchos días de abstinencia, afectaciones mitocondriales de origen congénito o adquirido, sustancias adictivas como el cigarrillo y el alcohol. Es una alteración frecuente en varones con infertilidad. Su tratamiento depende de la causa. En caso de infecciones (especialmente por Chlamydia) se utilizan antibióticos, cuando hay aumento de la Grados 1 2 3 4 Cabeza – cabeza Flagelo – flagelo Mezclado Cabeza - flagelo Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 22 viscosidad del semen se utilizan los mucolíticos, y si hay sospechas de la deficiencia en la cadena respiratoria mitocondrial se utilizan vitaminas, aminoácidos, antioxidantes. Técnica - Utilizar la preparación en fresco indicada en el procedimiento de aglutinación y agregación. - Evaluar el porcentaje aproximado de la motilidad de acuerdo a las categorías de la OMS: Motilidad progresiva (PR, progressive motility): los espermatozoides se mueven activamente, sea en forma lineal o en círculos Motilidad no progresiva (NP, non-progressive motility): cualquier patrón de movimientos con ausencia de progresión Inmóvil (IM, immotility): ningún tipo de movimiento 3.5.9 Vitalidad Fundamento. El porcentaje de espermatozoides vivos se puede evaluar identificando aquellas células con la membrana intacta, mediante exclusión de colorante o por choque hipoosmótico, este último se basa en el hecho de que solamente las membranas intactas se hincharán en soluciones hipotónicas. La vitalidad debe evaluarse lo más pronto posible, preferiblemente a los 30 minutos después de la emisión, de manera que se eviten cambios en la vitalidad por efecto de la disminución de la temperatura. Significado clínico. El porcentaje de células viables normalmente debe exceder el número de células mótiles, siendo el valor de referencia mayor a 58%. La vitalidad se estima para evaluar la integridad de la membrana celular, su evaluación es muy importante cuando los espermatozoides presentan una motilidad progresiva menor al 40%. Técnica del choque hipoosmótico - Colocar 1 ml de solución hipoosmótica (citrato de sodio + fructosa) a 37º C durante 5 minutos. - Agregar 100 μl de la muestra de semen a la solución y mezclar por pipeteo suave. - Incubar a 37º C durante 30 minutos. Entonces transferir una alícuota a un portaobjetos y cubrirla con un cubreobjetos. - Contar 200 espermatozoides, indicando el número de células hinchadas (vivas) y el número de células no hinchadas (muertas). Las células hinchadas se identifican por cambios en la forma de las células (ver figura 3.2). - Calcular el porcentaje de células vivas. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 23 Figura 3.2 Representación esquemática de cambios morfológicos en espermatozoides sujetos a estrés hipo- osmótico. (a) representa a un espermatozoide muerto, (b-g) indica cualquier tipo de hinchazón que puedan observarse en los espermatozoides. Técnica de la exclusión del colorante eosina-nigrosina - Colocar en un portaobjetos 15 μl de colorante eosina-nigrosina. - Agregar al colorante 15 μl de la muestra de semen y mezclar por pipeteo suave. - Esperar 30 segundos e inmediatamente extender con ayuda de un portaobjetos. - Realizar un conteo de 200 espermatozoides, señalando el número de células teñidas (muertas) y de células no teñidas (vivas) (ver figura 3.3). - Calcular el porcentaje de células vivas. Figura 3.3 Tinción de nigrosina-eosina. Los espermatozoides vivos no están teñidos, los espermatozoides muertos se ven de color rojo Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 24 3.5.10 Recuento de espermatozoides: método de la cámara de Neubauer Fundamento. El líquido de Dacie está compuesto por formol al 1%, que es un espermicida y citrato de sodio al 3%, que funciona como anticoagulante, este líquido se utiliza para mantener inmóviles a los espermatozoides y evitar la coagulación de la muestra dentro de la cámara de Neubauer, lo que facilita su conteo. Significado clínico. El valor de referencia es > 15 millones/mL o > 39 millones como número total de espermatozoides en la muestra. Cuando la cantidad de espermatozoides es inferior a estos valores se denomina oligozoospermia; cuando no hay ningún espermatozoide se denomina azoospermia. En estos casos, el problema puede ser secretor, es decir, no hay o hay pocos espermatozoides por daño en el testículo causado por inflamaciones, infecciones, varicocele y otras causas, o excretor, es decir, se producen espermatozoides pero existe una obstrucción de la vía de transporte de espermatozoides desde los testículos a la uretra prostática. Las oligozoospermias o azoospermias pueden ser de origen congénito o adquirido. Es importante determinar en suero el valor de FSH, la cual está relacionada con el número de espermatogonias. Cuando FSH está alta, el daño de la espermatogénesis es importante y su pronóstico es reservado; cuando FSH es baja es posible estimular la espermatogénesis y se espera un resultado favorable. Si FSH está en valores normales y hay azoospermia, hay que sospechar de un proceso obstructivo. Técnica NOTA: En la evaluación de la muestra en fresco debe observarse la densidad espermática; en caso de que se observe una gran cantidad de espermatozoides por campo, es recomendable aumentar la dilución recomendada en esta técnica o contar una quinta parte de la cuadrícula central. - Después de la licuefacción delsemen, se realiza una dilución 1:20 con líquido de Dacie, sea con ayuda de micropipetas o con la pipeta de Thoma para leucocitos. - Homogenizar la dilución y proceder al llenado de la cámara de Neubauer. - Se cuentan 2 cuadros primarios opuestos (aquellos que se utilizan para el conteo de leucocitos, ver en la figura 3.4 los cuadros marcados con la letra “L”). El conteo se hace por duplicado y se obtiene el promedio de los conteos. - Reportar el número de espermatozoides/mL y el número total de espermatozoides en el eyaculado de acuedo a las siguientes fórmulas: Número (no) de espermatozoides (esp)/mL = no de esp X 100000 no total de esp en el eyaculado = no de esp/mL X volumen total de la muestra Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 25 Figura 3.4 Posición de los cuadros primarios para el conteo de espermatozoides en la cámara de Neubauer (Adaptado de OMS, 2001) 3.5.11 Morfología La morfología de los espermatozoides puede observarse en una extensión (frotis) sobre un portaobjetos si se tiñen con alguna técnica apropiada. En los laboratorios de andrología se utiliza la tinción de Papanicolau para realizar esta observación, además de que es la técnica que la OMS recomienda. Existen otros métodos de tinción, tales como la tinción de Shorr, la de Diff-Quick y otros derivados de la tinción de Romanowsky, sin embargo pueden presentar una tinción de fondo y no tener la misma calidad que la tinción de Papanicolau. 3.5.11.1 Fundamentos Fundamento de la tinción de Papanicolau. La tinción de Papanicolau es un método de tinción policrómico; está compuesto por hematoxilina de Harris (que tiene afinidad por la cromatina, tiñendo el núcleo), EA-50 (colorante integrado por eosina Y, café Bismarck, verde luz; tiñe el citoplasma de células metabólicamente activas y al flagelo) y el naranja G (OG-6, el 6 indica la concentración de ácido fosfotúngstico utilizado para acidificar durante su disolución; tiene afinidad por la queratina, penetra rápidamente al citoplasma). Los pasos de tinción están entremezclados con soluciones que hidratan, deshidratan y enjuagan las células con la finalidad de asegurar la tinción; finalizando con un paso de aclaramiento con xilol que produce transparencia celular. El paso final de montaje permite proteger la muestra contra el secado y la oxidación (puede omitirse si la muestra no se guardará para observaciones posteriores). Significado clínico. El porcentaje de formas normales va de 3 a 48%. Las infecciones de transmisión sexual, el estrés, las altas temperaturas, el varicocele, los tóxicos ambientales, las drogas de adicción (marihuana, ácidos, cocaína etc.), el alcohol, el cigarrillo, antibióticos, agropesticidas, radiaciones han sido asociadas con la teratozoospermia. También existen factores genéticos, como los casos de la agenesia del acrosoma y la ausencia de brazos de dineína en el flagelo (síndrome del cilio inmóvil), donde hay inmovilidad de los espermatozoides. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 26 Técnica de la tinción de Papanicolau - Colocar hacia la orilla un portaobjetos limpio y seco una gota pequeña de la muestra del líquido seminal. - Extender la gota hacia el centro del portaobjetos con un aplicador de madera y secar al aire libre. - Fijar el frotis sumergiéndolo durante cinco minutos en etanol al 95%. - Las extensiones fijadas se deben teñir de acuerdo al siguiente procedimiento, en cada paso se retira el excedente de solución Etanol al 80% 30 segundos Etanol al 50% 30 segundos Agua destilada 30 segundos Hematoxilina de Harris 4 minutos exactos Agua destilada 30 segundos Etanol acidulado 6 inmersiones Agua corriente fría 5 minutos Etanol al 50% 30 segundos Etanol al 80% 30 segundos Etanol al 95% Al menos 15 minutos Naranja G6 1 minuto Etanol al 95% 30 segundos Etanol al 95% 30 segundos Etanol al 95% 30 segundos EA-50 1 minutos Etanol al 95% 30 segundos Etanol al 95% 30 segundos Etanol al 99.5% Etanol al 99.5% 15 segundos 15 segundos NOTA: en caso de que se desee conservar la tinción, es necesario colocarla en una solución de xilol:etanol 95% durante un minuto y posteriormente en xilol 100% un minuto. Posteriormente montar en resina sintética, cubriendo la preparación con un cubreobjetos. - Observar al microscopio con objetivo de inmersión. - Realizar dos conteos de 200 espermatozoides, clasificándolos en espermatozoides normales, anormales de cabeza, anormales de pieza intermedia y anormalidad de flagelo; es importante considerar que un mismo espermatozoide puede tener una, dos o tres anormalidades. Los resultados se reportan en porcentaje. La figura 3.5 muestra algunas formas anormales de espermatozoides humanos. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 27 Figura 3.5 Formas anormales del espermatozoide; a, normal, b, cabeza puntiaguda, c, remanente citoplasmático, d, cabeza de alfiler, e, macrocefálico, f, microcefálico, g, cabeza estrellada, h, bicefálico, j, doble flagelo, k, defecto de pieza intermedia (Tomado de Cannon y Henry, 1991). Con la tinción de Papanicolau, la cabeza aparece teñida de azul claro en la región acrosomal y azul oscuro en la zona postacrosomal. La pieza media puede mostrarse rojiza, mientras que el flagelo puede ser azul o rojizo. Las gotas citoplasmáticas, usualmente ubicadas detrás de la cabeza en la pieza media, se tiñen de verde. 3.5.12 Índices de defectos múltiples Fundamento de la determinación. Morfológicamente, los espermatozoides anormales pueden tener múltiples defectos (de cabeza, de pieza intermedia, del flagelo o una combinación de estos). Una detallada observación de la incidencia del porcentaje de anormalidades morfológicas puede ser de gran utilidad en la evaluación del grado de daño de la espermatogénesis. Los índices de defectos múltiples son: índice de anomalías múltiples (MAI), índice de teratozoospermia (TZI) e índice de deformidad del esperma (SDI) se derivan de los porcentajes de las anormalidades de cabeza, pieza intermedia y flagelo. Significado clínico. Estos índices han sido correlacionados con fertilidad in vivo (MAI y TZI) e in vitro (SDI) y pueden ser de utilidad en la evaluación de ciertas condiciones patológicas. Algunos informes sugieren que un TZI mayor a 1.6 está asociado con menores tasas de embarazo en parejas infértiles sin tratamiento y que un SDI de 1.6 predice el fracaso de la fertilización in vitro. Técnica. - Cada anormalidad del espermatozoide se registra, incluyendo la presencia de citoplasma residual. Para calcularlos considere que A = número de espermatozoides con anormalidades de cabeza B = número de espermatozoides con anormalidades de pieza intermedia Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 28 C = número de espermatozoides con anormalidades de flagelo D = número de espermatozoides con residuos citoplasmáticos E = número total de espermatozoides contados (siempre será 200, pues son los espermatozoides que se cuentan en cada recuento) F = número de espermatozoides con defectos (este número será igual a la resta de formas normales respecto a 200) - MAI es el promedio de anomalías por espermatozoide anormal. Se incluyen todas las anomalías observadas. MAI = (A+B+C) / F - TZI es parecido a MAI, pero un máximo de cuatro defectos por espermatozoides anormal son considerados. TZI = (A+B+C+D) / F - SDI es el número de defectos dividido por el número total de espermatozoides (normales mas anormales) SDI = (A+B+C+D) / E 3.6 Disposición de residuos - El material utilizado que contenga muestra biológica (pipeta de leucocitos, portaobjetosy cubreobjetos) se depositará en los contenedores con cloro dispuestos para cada fin. - El sobrante de la muestra biológica contenida en el recipiente recolección, se depositará en la taza del baño y se accionará la palanca; el recipiente se puede tirar en el bote de la basura del baño. - Los guantes, torundas, papel y demás material desechable contaminados con muestra se depositarán en el bote de la basura municipal. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse fuera del laboratorio. 3.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas se indicarán los cálculos pertinentes y los resultados de cada determinación realizada; la discusión debe centrarse en la importancia que tiene la realización de la espematobioscopía en el diagnóstico de infertilidad, en la donación de esperma en bancos especializados y como seguimiento a la Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 29 realización de una vasectomía. Además de considerar la importancia de cada una de las fases del control de calidad interno en la emisión de resultados confiables. Los resultados obtenidos deben analizarse integralmente; en caso de que orienten a problemas de fertilidad dar recomendaciones tales como la pertinencia de una nueva evaluación, el uso de otras pruebas para corroborar los resultados, entre otras. Para las conclusiones haga referencia si los objetivos planteados fueron alcanzados o no, así como sus consideraciones sobre el aprendizaje adquirido en su formación profesional. 3.8 Referencias - Agarwal, A., Gupta, S., Du Plessis, S., Sharma, R., Esteves, S., Cirenza, C., Eliwa, J., Al-Najjar, W., Kumaresan, D., Haroun, N., Philby, S., Sabanegh, E. (2016) Abstinence time and its impacto n basic and advanced semen parameters. Urology 94: 102 – 110 - Auger, J., Jouannet, P., Eustache, F. (2015) Another look at human sperm morphology. Hum Reprod 31(1):10 - 23 doi: 10.1093/humrep/dev251 - Esteves, S. (2016) Novel concepts in male factor infertility: clinical and laboratory perspectives J. Assist Reprod Genet 33:1319 – 1335 doi: 10.1007/s10815-016-0763-8 - Omu, A. (2013) Sperm parameters: paradigmatic index of good health and longevity. Med Princ Pract 22(suppl 1): 30 – 42 doi: 10.1159/000354208 - WHO (2010) WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO Press. Switzerland. - Wang, Y., Yang, J., Jia, Y., Xiong, C., Meng, T., Guan, H., Xia, W., Ding, M., Yuchi, M. (2014) Variability in the morphologic assessment of human sperm: use of the strict criteria recommended by the World Health Organization in 2010. Fertility and Sterility 101 (4) doi j.fertnstert.2013.12.047 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 30 PRÁCTICA No 4. “EVALUACIÓN DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO” Heidi J. Amezcua Hempel 4.1 Introducción El líquido cefalorraquídeo (LCR) se forma principalmente en los plexos coroideos ventriculares mediante una combinación de transporte activo y ultrafiltración del plasma. Una vez formado circula en sentido ascendente sobre los hemisferios cerebrales, así como en sentido descendente por encima de la columna vertebral y las raíces nerviosas (Tortora, Derrickson, 2007). Una característica importante de este líquido es el incremento de sodio, cloruro, magnesio y glutamina en comparación con el plasma, así mismo se encuentran en menor proporción la glucosa, potasio, calcio, colesterol, ácido úrico, hierro, tiroxina y zinc (Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, 2003). El volumen de LCR en un adulto sano es 90 a 150 ml y de 10 a 60 ml en neonatos, este se forma a un ritmo aproximado de 500 ml al día, lo que equivale de cinco a seis veces el volumen total del líquido de todo este sistema (Cabrera, 2003). Las funciones vitales del LCR son: • Amortiguar el encéfalo dentro de la bóveda craneal. Por lo tanto, un golpe en la cabeza moviliza en forma simultánea todo el encéfalo, lo que hace que ninguna porción de éste sea contorsionada momentáneamente por el golpe. • Sirve de transporte para los nutrientes que llegan al cerebro y eliminar los desechos. • Fluir entre el cráneo y la médula espinal para compensar los cambios en el volumen de sangre intracraneal (la cantidad de sangre dentro del cerebro), manteniendo una presión constante (Tortora, Derrickson, 2007). La muestra biológica puede obtenerse por medio de punciones realizadas en tres sitios diferentes: lumbar, cisternal o ventricular (Smith, Kjeldsverg, 2010). Cabe aclarar que su composición varía dependiendo el sitio de punción, en la zona ventricular hay una mayor cantidad de proteínas respecto a la zona lumbar (Cabrera, 2003). La punción lumbar es la primera elección en adultos, debe ser realizada por personal capacitado debido a los riesgos que corre el paciente, los pasos para realizar esta punción son: • Se coloca al paciente acostado lateralmente con la cabeza y las rodillas flexionadas hacia el abdomen, con lo que se obtiene una mayor separación de las apófisis espinosas vertebrales (son prominencias óseas o proyecciones que surgen de la parte posterior de las láminas de las vértebras). • Se traza una línea entre ambas crestas ilíacas que pasa, generalmente, entre la tercera y cuarta apófisis Se elige el espacio más favorable palpando las apófisis espinosas ya sea por encima o por debajo de la línea trazada. Algunos autores refieren que la punción se puede llevar a cabo entre la 2 y 3 vértebra lumbar sin que existan complicaciones, aunque se prefiere Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 31 entre la 3 y 4 debido a que esta zona tiene una mayor zona de trabajo. Se desinfecta la piel de la región lumbosacra con una solución antiséptica (yodo o alcohol). • Inyectar 1-2 ml anestésico local (lidocaína 2 %) en el espacio seleccionado. • La aguja se introduce entre ambas apófisis espinosas atravesando el ligamento ínterespinoso perpendicularmente a la piel de la línea media. El bisel del trocar se debe disponer en el sentido de las fibras musculares. En ese momento se desvía la aguja hacia la cabeza y se introduce hasta 5- 6 cm alcanzándose el espacio subaracnoideo. Se nota una ligera resistencia cuando se perforan los ligamentos y el saco dural. Se retira el mandril fluyendo espontáneamente la muestra. Cuando el ligamento ínterespinoso está fibrosado o es muy resistente es necesario practicar la punción a 1 cm de la línea media moviendo a la aguja en sentido cefálico y hacia la línea media. La punción lumbar se indica ante la sospecha de meningitis, aunque también puede aportar información relevante en enfermedades malignas, hemorragias cerebrales, convulsiones, enfermedades metabólicas (Smith, Kjeldsverg, 2010). Este tipo de punción está contraindicada en aquellos pacientes que presentan síntomas o signos de incremento de la presión intracraneal. En estos casos, existe el riesgo de herniación cerebral, al realizar la extracción. También está contraindicada en los niños con inestabilidad hemodinámica, coagulopatía o que presenten infección de los tejidos del lugar donde se va a realizar la extracción (Cabrera, 2003). El estudio del LCR se divide en el examen físico, evaluándose aspecto, color densidad y pH, el examen microscópico, donde se determina el número de leucocitos y su cuenta diferencial y el examen químico, realizándose la determinación de glucosa, cloro y proteínas de forma cuantitativa y cualitativa (Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, 2003). 4.2 Actividades previas a la práctica - ¿Cuándo se utilizan las diferentes zonas de punción para la obtención de LCR? - En una tabla indique la composición bioquímica del LCR, comparándola con la del plasma. - ¿Cómo se distingueuna punción traumática de un derrame cerebral cuando el aspecto de la muestra es sanguinolento? - ¿Qué es la xantocromía? ¿En qué casos se presenta? - ¿Porque es importante el cuidado de la presión durante la obtención del LCR? - Explicar la utilidad de los índices los índices de IgG, de albúmina y de Tourtelotte. - Investigar cómo se utiliza la técnica multiplex PCR el estudio del LCR. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 32 4.3 Objetivos - Conocer los métodos de obtención del LCR y los cuidados al paciente antes, durante y después de la obtención del mismo. - Analizar una muestra de LCR, a través de las diferentes pruebas que se realizan para su estudio (físicas, químicas, conteo celular y diferencial), y establecer una posible alteración en su composición que apoye al diagnóstico médico. 4.4 Materiales, equipos y reactivos Material por equipo - 15 Tubos de ensaye 12x75 mm - 1Propipeta - 1 Gradilla - 1 Microscopio - 1 pipeta graduada de 1 ml (1/100) - 2 Portaobjetos - 1 Aplicador de madera - 1 Cuadro de papel seda - 1 Hemocitómetro Material por grupo - 3 Gradilla - 1 Centrífuga con balanza - 1 Agitador vortex - 1 Baño de incubación a 37º C - 2 Espectrofotómetro con gradilla - 10 celdas para espectrofotómetro - 2 piseta con agua destilada - 1 bolsa roja para RPBI - 1 Pipetas graduadas de 1 ml (1/100) - 3 Pipetas graduadas de 5 ml - 1 Pipetas graduadas de 2 ml (1/100) - 2 Vaso de precipitado de 500 ml - 1 Micropipeta (5 – 50 ul) - 1 Micropipeta (40 – 200 ul) - 1 Micropipeta (200 – 100 ul) - Refractómetro Reactivos - Reactivo para la determinación Glucosa - Reactivo para la determinación Proteínas rojo de pirogalol - Reactivo para la determinación cloruros - Hipoclorito de sodio - Reactivo de Pandy - Reactivo de None-Apelt - Colorante de Wright - Buffer de fosfatos 4.5 Procedimiento experimental 4.5.1. Obtención de la muestra biológica La muestra de LCR será proporcionada por los profesores del laboratorio. NOTA. La evaluación de los resultados de las pruebas del examen físico (aspecto, color, densidad y pH) puede ser subjetiva, por lo que se requerirá de atención de parte de los integrantes del equipo. En caso de alguna duda se podrá solicitar apoyo a los profesores. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 33 4.5.2 Aspecto y color Significado clínico. El LCR es transparente e incoloro en condiciones normales. Su estudio es importante y es útil en el estudio de enfermedades desmielinizantes tanto del sistema nervioso central (SNC) como periférico. Si tiene apariencia turbia o lechosa, indica un aumento de la concentración de lípidos y proteínas o infección bacteriana. Una apariencia brumosa nos indica la presencia de leucocitos. Un aspecto sanguinolento nos habla de una posible hemorragia. La apariencia coagulada nos indica la elevación de proteínas o factores de coagulación. La formación de una película en la superficie de la muestra es un indicio de meningitis bacteriana. El color en una muestra de LCR se denomina xantocromía, generalmente obedece a la presencia de productos derivados de la ruptura de los eritrocitos (oxihemoglobina o bilirrubina), por el incremento de la concentración de proteínas o por la presencia de mieloperoxidasa. La xantocromía debe distinguirse de la punción traumática, en la cual se presenta al inicio de la punción un color rojizo, el cual generalmente va disminuyendo conforme sale el líquido (prueba de los tres tubos) y la centrifugación lo elimina por completo al decantarse los eritrocitos. Cabe mencionar que la hemorragia subaracnoidea no siempre da un color rojo; para distinguirla de una punción traumática puede realizarse la cuantificación de LDH y compararse con la determinación en suero. Técnica - Homogenizar la muestra por inversión suave. - Observar la muestra para determinar su aspecto y color 4.5.3 Densidad Significado clínico. La densidad del LCR oscila entre 1.005 y 1.009, debido a que su componente principal es el agua. La densidad se ve alterada por la presencia de sangre (debido a una punción incorrecta o hemorragia), elevación de proteínas, lípidos, o por alguna infección microbiana. Técnica - Calibrar el refractómetro a 1.000 agregando una gota de agua a la cámara y moviendo la perilla que se encuentra en la parte superior, (si se tienen problemas para visualizar la escala puede calibrarse con el ocular). - Limpiar con papel absorbente y agregar gotas de la muestra homogenizada a la cámara y observar por el ocular. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 34 Figura 4.1 Vista del refractrómetro. Izquierda, refractrómetro vacío; Derecha, refractrómetro calibrado a 1.000 - Leer la densidad en la escala respectiva, de acuerdo con la línea de separación entre el campo claro y el oscuro. 4.5.4 pH Significado clínico. El pH del LCR es de 7.3 a 7.4, es ligeramente más alcalino cuando permanece en reposo, como resultado del desprendimiento de dióxido de carbono. Técnica - Introducir una tira de papel pH a la muestra homogenizada. - Al cabo de 30 segundos comparar con la escala de colores de la caja para determinar el pH de la muestra. 4.5.5 Conteo celular de leucocitos Significado clínico. En adultos el número debe ser inferior a 5/mm3 con predominio linfocitario (linfocitos: 93-97%; polimorfonucleares: 1-3%; monocitos 0.5-1%). El significado de un recuento entre 5 y 10 células es dudoso, pero por encima de 10 células es inequívocamente patológico. En niños la cifra de leucocito aumenta hasta 20-30/mm3, sobre todo en los menores de un año. Técnica - Homogenizar la muestra por inversión suave. - 4.5.5.2.2 Llenar la cámara de Neubauer con una pipeta de Thoma o tubo capilar y permitir reposar durante 2 minutos. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 35 - 4.5.5.2.3 Montar en el microscopio, enfocar con el objetivo de 10X y contar los cuadrantes de leucocitos en 40X. - 4.5.5.2.4 En caso de que se dificulte el conteo por el número de células, hacer una dilución con la pipeta de Thoma y líquido de Turck. El factor por el que se multiplica el número de células se calcula considerando la dilución, el volumen de la cámara y los cuadrantes contados. 4.5.6 Cuenta diferencial de leucocitos Fundamento. Se utiliza la tinción de Wright, su fundamento está descrito en el numeral 3.5.9. de la práctica no. 3. Significado clínico. En condiciones normales encontramos en el LCR menos de 5 linfocitos/µl, cuando existe una meningitis purulenta los valores de neutrófilos van de 10-10.000/μl, en el caso de meningitis viral y tuberculosa los valores son mayores a 100/μl, con un predominio mononuclear. Técnica - Centrifugar el LCR a 2000 rpm por 5 min, recolectar el sobrenadante en otro tubo y guardarlo para realizar las pruebas químicas. - Colocar una gota del sedimento en un portaobjetos y secar a temperatura ambiente. - Realizar la tinción de Wright. - Montar la preparación en el microscopio, enfocarla a 10X y observarla a 100X. - Contar 100 leucocitos diferenciando cada población presente. 4.5.7 Determinación de glucosa por el método de glucosa oxidasa-POD (enzimático colorimétrico) Fundamento. La glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando ácido glucónico y H2O2, este reacciona con un cromógeno (4-aminoantipirina) por la reacción de Trinder, para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente proporcional a la concentración de glucosa. Significado clínico. Los valores normales corresponden a 2/3 partes del valor de glucosa en el paciente por loque se recomienda que se determine la glucemia dos horas antes de realizar la extracción del LCR. Al realizar este examen se debe tomar en cuenta si el paciente cursa una hiperglucemia, de ser así pueden registrarse valores mayores a 60 mg/dL y el valor máximo que se puede observar es de 300 mg/dL por esta causa. Se puede observar Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 36 un aumento de glucosa en encefalitis epidémica (aumento discreto), poliomielitis, meningitis serosas y urémicas e hipertensión endocraneana. Se observa una disminución de glucosa en estados de hipoglucemia, meningitis purulentas (acompañando la pleocitosis y la turbidez), meningitis tuberculosa (el descenso es lento), en casos graves de sífilis meningovascular, carcinomatosis meníngea, síndrome de Reye (hepatoencefalopatía aguda metavírica), cisticercosis con meningoencefalitis, meningitis reumatoide, granulomatosa por sarcoidosis y hemorragia aracnoidea. Técnica - Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda es 505 nm. 4.5.8 Determinación cualitativa de proteínas por los métodos de Nonne-Apelt y Ross Jones Fundamento. La prueba de Nonne Apelt es específica de las globulinas, puesto que precipitan por el sulfato de amonio a media saturación; no sucede lo mismo con la de Ross Jones pues en el punto de contacto la concentración del sulfato de amonio es del 85 %, o sea una solución saturada, que precipita no sólo las globulinas sino también la albúmina. Significado clínico. La presencia de un color claro indica cantidad normal de globulinas. La presencia de precipitado turbio es indicativo del exceso de globulinas. La formación de un anillo turbio entre los 2 líquidos se observa en casos patológicos. Técnica para la realización de la prueba de Nonne Apelt. - Colocar en un tubo de ensaye 0.5 ml de la solución de sulfato de amonio saturado y 0.5 ml de LCR, agitar suavemente. - Reposar 3 min y leer los resultados de acuerdo a lo siguiente: La mezcla no cambia de aspecto, reacción negativa (-). Opalinidad, reacción positiva (+). Enturbiamiento, reacción positiva (++). Enturbiamiento fuerte, reacción positiva (+++). Enturbiamiento lechoso, reacción positiva (++++). Técnica para la realización de la prueba de Ross Jones. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 37 Proteína Complejo Rojo de pirogalol molibdeno Complejo proteína - Rojo de pirogalol- molibdeno - Colocar en un tubo de ensaye 1.0 ml de solución saturada de sulfato de amonio y 0.5 ml de LCR éste último deslizándolo por las paredes del tubo, evitando romper la interfase que se forma. - Observa sobre fondo oscuro el anillo blanquecino que aparece en el punto de contacto. Si él anillo no aparece a los 2 minutos la reacción se considera negativa. - Reportar la intensidad del anillo con cruces (+ a ++++) 4.5.9 Determinación cualitativa de proteínas por el método de Pandy Fundamento. La albúmina y las globulinas precipitan en una solución de fenol. Significado clínico. Se considera normal si no se observa turbidez alguna. Al igual que las otras pruebas permite reconocer una inflamación crónica o incipiente. La presencia de una ligera turbidez indica una presencia anormal de globulina. La reacción es un índice de la fracción globulínica del LCR. Sin embargo Pandy dice que es una prueba para albúmina y globulinas. En la inmensa mayoría de los casos un Pandy negativo corresponde a albuminorraquias normales. Técnica - Agregar una gota de LCR a 0.5 ml de la solución saturada de fenol, agitar y leer después de haber pasado 3 minutos. - Observar sobre fondo oscuro para apreciar la opalescencia o la turbidez producidas. Es aconsejado por algunos autores, la comparación con un LCR normal, lo que facilita la apreciación de las pequeñas opalescencias. - La forma de reportar los resultado es igual que en las pruebas anteriores. 4.5.10 Determinación cuantitativa de proteínas por el método de rojo de pirogalol (colorimétrico) Fundamento. Las proteínas presentes en la muestra reaccionan en medio ácido con el rojo de pirogalol y el molibdato, formando un complejo colorido. La absorbancia a 600 nm debido a la formación del complejo colorido es directamente proporcional a la concentración de proteína en la reacción. + Significado clínico. Se consideran normales resultados de 15-40 mg/dl por punción lumbar, para el caso de punción cisternal es de 10-25 mg/dl, y ventricularmente es de 5-15 mg/dl. Debe considerarse que la presencia de sangre en LCR Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 38 da lugar a un incremento la concentración. Las proteínas pueden observarse elevadas cuando existe variación en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica: en procesos inflamatorios y degenerativos del neuroeje y meninges, daños vasculares del sistema nervioso, meningitis supuradas, hemorragia cerebral, procesos obstructivos del espacio subaracnoideo y síndrome de Guillain-Barré. Técnica - Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda en que se lee es 600 nm. 4.5.11 Determinación de cloro por el método de tiocianato de mercurio (colorimétrico) Fundamento. Los iones cloruro de la muestra reaccionan con tiocianato de mercurio desplazando el ion tiocianato. El tiocianato libre en presencia de iones férricos forma un complejo colorido medible espectrofotométricamente. La intensidad del color, leída entre 440 y 500 nm, es proporcional a la concentración de iones cloruro presente en la muestra ensayada. Significado clínico. La cifra normal es de 700 a 750 mg/dl. (120-130 mEq/L) expresados en NaCl. Se observa un aumento en los procesos en que existe una retención de cloruros en sangre, en las nefritis con insuficiencia renal, deshidrataciones “puras” sin pérdida de electrolitos. Se observa una disminución en hipocloremias (ocasionado en la neumonía por neumococos), meningitis tuberculosas y purulentas y en la enfermedad de Heine-Medin y sífilis nerviosa. Técnica. - Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda es 540 nm. 4.6 Disposición de residuos - Los tubos con muestra biológica y los portaobjetos se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos para este fin. - Los guantes, papel y demás materiales desechables empapados con la muestra se depositarán en la bolsa roja de residuos peligrosos biológicos infecciosos. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse fuera del laboratorio. 2 Cl- + Hg (SCN)2 HgCl2 + 2 SCN- SCN- + Fe3+ FeSCN2+ Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 39 4.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas realizar los cálculos necesarios para obtener los resultados de cada prueba realizada y compararlos con los valores de referencia correspondiente. Dado que la muestra es proporcionada por los profesores, debe considerarse si la toma de muestra puede afectar a las determinaciones realizadas explicando cómo sucedería. Integrar los resultados para verificar si orientan hacia algún diagnóstico; indicar si existen otras pruebas que puedan complementarlos. Realizar las recomendaciones necesarias al paciente y al médico, de acuerdo al probable diagnóstico. Resaltar la importancia del estudio de esta muestra en patologías específicas relacionadas con el sistema nervioso central. 4.8 Referencias - Anatomía para estudiantes, Gray, 2° edición, 2010. - Strasinger SK, Schaub Di Lorenzo M. Análisis de orina y de loslíquidos corporales. 5 ed. Madrid : Editorial Médica Panamericana; 2010. - Guillén Campuzano E, Buño Soto A, Díaz García R, Galán Ortega A,Guevara Ramírez P, Malumbres S, et. al. Recomendaciones para el estudiodel líquido cefalorraquídeo. Sociedad Española de Bioquímica Clínica yPatología Molecular (SEQC). Comité Científico. Comisión MagnitudesBiológicas relacionadas con la Urgencia Médica. Documento K. Fase 3.Versión 2. 2010. - Cisternografía con radionucléidos [Internet]. Biblioteca Nacional de Medicina de los EE.UU.; [citado 10 oct 2016]. [1 pantalla]. Disponible en: https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003823.htm - Definición, Indicaciones, Contra-indicaciones, Técnicas, Equipos, Preparación y Fotos de Punción lumbar. [Internet] Disponible en: http://apuntes-medicina.blogspot.com/2016/10/definicion-indicaciones- contra.html - Smith, G., Kjeldsverg, C. (2010). Líquido cefalorraquídeo, sinovial y líquidos serosos del organismo. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marbán: Madrid. - Tortora, G. Derrickson, B. (2007). El encéfalo y los nervios craneales. En autor Principios de anatomía y fisiología. Médica Panamericana: México, D.F - https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2011/09/analisis-de-liquidos-biolc3b3gicos.pdf - Cabrera, C. (2003) Líquido cefalorraquídeo y la punción lumbar en el siglo XXI. Rev Posg VIa Cáted Medicina 128. Recuperado de http://med.unne.edu.ar/revista/indice.html#128 - Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, D. (2003) Cerebrospinal fluid analysis. American Family Physician. 68 (6): 1103 – 1108 http://www.monografias.com/trabajos901/historia-madrid/historia-madrid.shtml https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003823.htm http://apuntes-medicina.blogspot.com/2016/10/definicion-indicaciones-contra.html http://apuntes-medicina.blogspot.com/2016/10/definicion-indicaciones-contra.html https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2011/09/analisis-de-liquidos-biolc3b3gicos.pdf Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 40 PRÁCTICA No 5. “DIFERENCIACIÓN DE EXUDADOS Y TRASUDADOS” Verónica Ruiz Solorio 5.1 Introducción Los líquidos serosos corporales se derivan del plasma y se encuentran en la cavidad pleural, pericárdica, peritoneal y articular, en estas cavidades corporales están delimitadas por una membrana serosa parietal y una visceral que están constituidas por una capa de tejido conjuntivo con abundantes capilares y vasos linfáticos y una capa superficial de células mesoteliales (Tortora y Derrickson, 2007). Estos líquidos son un ultrafiltrado del plasma que se derivan de una abundante red capilar de la membrana serosa. Su formación es similar a la del líquido extravascular y aquí intervienen la presión hidrostática, la presión coloidosmótica y la permeabilidad capilar (Tortora y Derrickson, 2007). En condiciones fisiológicas hay una pequeña cantidad de líquido en cada una de estas cavidades que permite el movimiento de las vísceras en cada uno de estos espacios. Un sistema complejo regula el volumen de estos líquidos. Cuando se alteran estos mecanismos responsables de la formación o absorción del líquido se produce un aumento excesivo de estos líquidos, de este modo el líquido se acumula cuando se aumenta la permeabilidad capilar y la presión hidrostática o cuando disminuye la presión coloidosmotica o se obstruye el drenaje linfático. La presión hidrostática impulsa la salida del líquido de los capilares hacia el interior de las cavidades (Strasinger y DiLorenzo, 2008). Las proteínas plasmáticas son las que producen la presión osmótica y contrarrestan la presión hidrostática manteniendo el líquido en los capilares, la diferencia de presión osmótica entre el plasma y el líquido intersticial es proporcional a la concentración de proteínas, principalmente la albumina. Los vasos linfáticos también desempeñan un papel importante en la absorción de agua, proteínas y otros solutos desde el espacio extravascular (Strasinger y DiLorenzo, 2008). Los exudados son líquidos inflamatorios cuya formación depende de un aumento de la permeabilidad capilar debido a alteraciones que implican directamente a estructuras de la superficie de determinadas cavidades (mesotelio, vasos linfáticos, capilares y articulaciones). Por ejemplo: tuberculosis, infecciones bacterianas, tumores, entre otras (Smith, Kjeldsverg, 2010). Los trasudados son derrames provocados por factores mecánicos que influyen en la formación o resorción de líquido plasmático, por ejemplo, a causa de la reducción de la albúmina del plasma o incremento de la presión venosa (presión hidrostática o coloidosmótica). La diferencia entre un trasudado y exudado se basa en niveles arbitrarios de decisión clínica que han sido determinados empíricamente (Smith, Kjeldsverg, 2010). El estudio habitual del derrame pleural y sinovial de etiología desconocida incluye en general la determinación de su aspecto general, nivel total de proteínas, recuento de eritrocitos recuento de leucocitos, Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 41 recuento diferencial y estudio microscópico con Wright y Gram, cultivo y estudio citológico (Smith, Kjeldsverg, 2010; Strasinger y DiLorenzo, 2008). Otros estudios que resultan de gran utilidad son: la determinación de glucosa, LDH, pH, fosfatasa alcalina y biopsia (Smith, Kjeldsverg, 2010). También es importante señalar que existen técnicas de imagen, que son importantes para el diagnóstico de las diversas patologías relacionadas. La radiografía de tórax permite detectar derrames muy pequeños de hasta 100 ml adoptando diferentes posiciones como el decúbito lateral. En ocasiones es necesario recurrir a la ecografía para localizar un derrame (Strasinger y DiLorenzo, 2008). El estudio de estos líquidos serosos proporcionan información importante sobre la fisiopatología de los órganos y tejidos donde se generan y es función del laboratorio la selección de magnitud diagnostica apropiada y con buena capacidad discriminatoria, para que este estudio aporte información decisiva en la práctica clínica. 5.2 Actividades previas a la práctica - Describa en un cuadro las características distintivas de los exudados y trasudados. - ¿Qué otras pruebas complementarían la práctica y en qué situaciones se usarían? - ¿Qué enzimas son cuantificadas en el estudio de los exudados y trasudados? - Definir los siguientes conceptos: paracentesis, toracocentesis, artrocentesis, pericardiocentesis. - En un cuadro, indique la composición, la cantidad, las situaciones en las que aumenta y sus hallazgos de laboratorio de los líquidos peritoneal, sinovial, pericárdico y pleural. 5.3 Objetivos - Determinar si el líquido seroso proporcionado en la práctica es un exudado o un trasudado mediante la realización de pruebas físicas, químicas y microscópicas para conocer la importancia de su diferenciación. 5.4 Materiales, equipos y reactivos Material biológico Muestra de líquido seroso proporcionada por los profesores del laboratorio Material por equipo - 3 Cubreobjetos - 1 Pipeta graduada de 1ml - 1 Cuadros de papel seda - 6 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm - 1 Propipeta - 1 Gradilla - 3 Portaobjetos - 1 Microscopio Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 42 Material por grupo - 1 Baño de incubación a 37º C - 1 Centrifuga con balanza - 1 Micropipeta (5 – 50 ul) - 1 Micropipeta (40 – 200 ul) - 1 Micropipeta (200 – 1000 ml) - 1 Espectrofotómetro con gradilla - 5 Frasco gotero con aceite de inmersión - 10 celdas para espectrofotómetro - Recipientes para desechos (RPBI) - 1 Pinzas para portaobjetos - 3 pipetas graduadas de 5 ml - 3 gradillas - 2 Vaso de precipitado de 500 ml - 1 Dispensador de puntas azules - 1Dispensador de puntas amarillas Reactivos - Reactivo para la determinación Glucosa - Hipoclorito de sodio - Reactivo para la determinación Proteínas totales (Biuret) - Benzal - Ácido acético glacial - Buffer de fosfatos - Reactivos para la tinción Wright - Aceite de inmersión 5.5 Procedimiento experimental 5.5.1 Obtención de la muestra La muestra será proporcionada por los profesores. 5.5.2 Aspecto y color Significado clínico. Los líquidos amarillentos claros, parecidos al suero o a la orina normal, pueden corresponder a trasudados de congestión. El líquido puede ser de color amarillento transparente, turbio por su contenido elevado de células, hemático por la presencia de hematíes o quiloso por aumento de grasas en forma de triglicéridos. Una apariencia lechosa o fibrinosa puede ser debida a un aumento de la concentración celular o lipídica. El examen del sobrenadante tras la centrifugación permite su diferenciación. Técnica - Homogenizar la muestra por inversión suave y observarla - En caso de que la muestra presente turbidez se observa después de la centrifugación a 2000 rpm por 5 minutos. 5.5.3 Densidad Significado clínico. El exudado generalmente tiene una densidad superior 1.018 y un trasudado con una densidad menor a 1.018 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 43 Técnica - Seguir la técnica descrita en 4.5.3.2. 5.5.4 pH Significado clínico. En los exudados el pH es inferior a 7.30 en trasudados el pH es mayor a 7.30. El pH es inferior a 7.2 en muchos derrames exudativos de diversa etiología especialmente en empiema pleural y derrames neoplásicos. Sin embargo en los derrames quilosos y los secundarios a embolismo pulmonar no desciende por debajo de este límite. Técnica - Seguir la técnica descrita en 4.5.4.2. 5.5.5 Prueba de Rivalta Fundamento. Se usa para distinguir exudados de trasudados. Los exudados contienen una proteína que es la “seromusina” esta precipita con ácido acético, la presencia de dicha proteína en una muestra de líquido filtrado, se revela por una muestra de precipitado o floculación cuando se le adiciona ácido acético. Técnica - Colocar en un tubo de ensaye 2 ml de ácido acético diluido. - Agregar una o dos gotas del líquido de punción analizado. - Si las gotas se hunden dejando un rastro claramente visible de precipitado blanco se puede afirmar que es un exudado. Si se disuelven inmediatamente se trata de un trasudado. 5.5.6 Determinación de proteínas por el método de Biuret (colorimétrico) Fundamento. En medio alcalino, los grupos amino terminales de los enlaces peptídicos de las proteínas se unen al cobre, formando un tetracomplejo (4 amino terminales y un cobre) generando un intenso color violeta azulado. La intensidad del color formado, leída entre 540 y 560 nm es proporcional a la concentración de proteína total en la muestra ensayada. Significado clínico. Una cifra mayor a 3 g/dl es significativa de un exudado, por debajo de 3 g/dl es indicativo de un trasudado. Una ascitis rápida muy rica en proteínas es sospechosa de trombosis suprahepática. La fibronectina aumenta en la ascitis maligna por carcinomatosis peritoneal. También en derrames pleurales tuberculosos o en conectivopatías (son un grupo de enfermedades que se caracterizan por ser generalmente procesos Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 44 multisistémicos. Los órganos diana varían en cada proceso lo que les da una entidad propia a cada una de ellas. En todas ellas se presume una etiopatogenia común, la aparición de autoanticuerpos específicos). La beta-2 microglobulina está presente en los derrames debidos a procesos hematológicos. Técnica - Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda es 540 nm. 5.5.7 Determinación de glucosa en la muestra control por el método de glucosa oxidasa-POD (enzimático colorimétrico). Fundamento. El fundamento está descrito en el numeral 4.5.7. Significado clínico. La determinación de la glucosa sirve para el diagnóstico diferencial de los exudados. Cuando la glucosa es menor de 60 mg/dl sugiere derrame pleural paraneumónico, tuberculosis, neoplasia o artritis reumatoide. Los valores bajos de glucosa se deben al consumo excesivo por parte del metabolismo celular o bacteriano. En los derrames paraneumónicos complicados valores de glucopleura inferiores a 40 mg/dl son indicación de drenaje. En neoplasias, la glucosa baja indica gran número de células neoplásicas y mayor probabilidad de obtener citología positiva. En la artritis reumatoide la glucopleura baja se debe a un bloqueo del paso de la misma desde la sangre al espacio pleural. 5.5.8 Examen microscópico Fundamento. Se realiza una observación del sedimento sin realizar tinción, bajo el microscopio a 40X, buscando la presencia de células mesoteliales y de la inflamación, además de cristales. En aquellos casos en que se identifique una cantidad considerable de leucocitos, el sedimento se observará tiñéndolo con Wright (para el fundamento ver 3.4.9.2 y la técnica ver 3.4.9.4). Significado clínico. El sedimento de los derrames trasudados puede presentar algunas células mesoteliales de descamación, cuyo único interés estriba en la posible confusión con células atópicas, por su alteración y degeneración en los derrames crónicos. El conteo celular aumenta en las infecciones bacterianas. La presencia de cristales de urato en fagocitosis se observa con gota artrítica. En lupus eritematoso sistemático se observan células LE. Los linfocitos predominan en derrames tuberculosos pero también los podemos encontrar en neoplásicos. Polinucleares en exudados de origen bacteriano no tuberculosos por cocos generalmente. Eosinófilos son elevados en enfermedades como periartritis nodosa; Churg Straus, etc. que también se le Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 45 llama enfermedad del colágeno, pero también abundan en derrames parasitarios o alérgicos, incluso en la tuberculosis o cáncer. Técnica - Centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 5 min. - Decantar el sobrenadante en otro tubo. - Resuspender la pastilla, colectar una gota del líquido con una pipeta Pasteur y colocarla sobre un portaobjetos, cubrir con cubreobjetos. - Montar la preparación en el microscopio, enfocar en 10X y observar a 40X. - Buscar y registrar la presencia de células mesoteliales, leucocitos, bacterias y cristales. - Reportar la presencia de estas células como negativo, escasos, moderados, abundantes e incontables. - En caso que los leucocitos se encuentren de moderados a incontables, realizar un frotis colocando una gota del sedimento homogenizado, extendiendo suavemente sobre un portaobjetos. Secar al aire y teñir con Wright (ver 3.5.9.4). 5.6 Disposición de residuos - Los tubos y portaobjetos con muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos para este fin. - Los guantes, papel y demás material desechable contaminado con muestra se depositarán en la bolsa roja de RPBI. - Los guantes y su envoltura se desecharán en el bote de la basura si no están contaminados. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse fuera del laboratorio. 5.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas que entregarán después de haber terminado la parte experimental y con base a los resultados de las pruebas realizadas al líquido en estudio, se analizará si se trata de un exudado o trasudado; también es pertinente sugerir pruebas complementarias para la clasificación y para conocer el origende la posible patología del líquido seroso. Debe resaltarse la importancia de diferenciar el origen del líquido, para iniciar un tratamiento, dar un seguimiento y valorar posibles patologías relacionadas con el derrame. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 46 5.8 Referencias - Smith, G., Kjeldsverg, C. (2010). Líquido cefalorraquídeo, sinovial y líquidos serosos del organismo. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marbán: Madrid. - Strasinger, S. DiLorenzo, M. (2008). Líquidos serosos. En autor Análisis de orina y de los líquidos corporales. Médica Panamericana: Buenos Aires - Tortora, G. Derrickson, B. (2007). Principios de anatomía y fisiología. Médica Panamericana: México, D.F - “Diferenciación entre nuevos marcadores” L. Hernández Blasco. Revista de Patología Respiratoria Vol. 11 Nov. 2008. http://www.revistadepatologiarespiratoria.org/descargas/pr_11-2s_104-108.pdf. http://www.revistadepatologiarespiratoria.org/descargas/pr_11-2s_104-108.pdf Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 47 PRÁCTICA NO. 6 EXÁMEN COPROLÓGICO Ma. de Lourdes Galván Ruiz 6.1 Introducción Aunque la digestión de las proteínas, los hidratos de carbono y las grasas ingeridas tienen lugar a lo largo del tubo digestivo, el intestino delgado es el sitio principal para la degradación final y reabsorción de estos compuestos. Las enzimas digestivas secretadas en el intestino delgado por el páncreas son la tripsina, quimiotripsina, aminopeptidasa y lipasa. Las sales biliares proporcionadas por el hígado ayudan a la digestión de las grasas. Una deficiencia en cualquiera de estas sustancias causa incapacidad de digerir y, por lo tanto reabsorber ciertos alimentos. El exceso de material sin digerir o sin reabsorber aparece después en las heces y el paciente presenta síntomas de dispepsia y malabsorción (Strasinger y Di Lorenzo, 2010). La muestra normal de heces contiene bacterias, celulosa y otros alimentos sin digerir, secreciones gastrointestinales, pigmentos biliares, células de las paredes intestinales, electrólitos y agua. Muchas especies de bacterias componen la flora intestinal normal. El metabolismo bacteriano produce el olor fuerte asociado con las heces y el gas intestinal (flato). Los hidratos de carbono, en especial los oligosacáridos, que son resistentes al paso de la digestión, atraviesan la porción superior del intestino sin cambios, pero son metabolizados por las bacterias en la porción inferior del intestino y producen cantidades grandes de flatos. La producción excesiva de gas también aparece en los individuos con intolerancia a la lactosa cuando las bacterias intestinales metabolizan la lactosa de la leche o de las sustancias que la contienen (Strasinger y Di Lorenzo, 2010). Un adulto excreta entre 100 a 300 gr de materia fecal por día, la excreción depende de una serie compleja de procesos de absorción, secreción y fermentación. El examen de estas se realiza con frecuencia en la evaluación de trastornos gastrointestinales y sus resultados ayudan a descubrir un sinfín de enfermedades como pueden ser, sangrado y obstrucción gastrointestinal, ictericia obstructiva, enfermedades parasitarias, disentería, colitis ulcerosa y en los síndromes de mala absorción y mala asimilación. El contenido del intestino delgado (quimo) principia su paso hacia el recto en tan solo 2 a 3 horas después de haber comido, pero el proceso no es completo sino hasta 6 a 9 h después de la comida (Tortora y Derrickson, 2007). El intestino grueso es capaz de absorber alrededor de 3 000 ml de agua. Cuando la cantidad de agua que alcanza el intestino grueso excede esta cantidad, se excreta con la materia fecal sólida y produce diarrea. Por otra parte, el estreñimiento provee el tiempo necesario para que más agua se reabsorba de la materia fecal y produce heces pequeñas y duras (Strasinger y Di Lorenzo, 2010).. El colon proximal o recto absorbe la mayor parte del agua restante. La absorción colónica del agua y electrolitos es un proceso pasivo. Después de comer hay movimientos de mayor actividad propulsiva (peristaltismo). Estas ondas peristálticas tienen su origen en reflejos gastrocólicos y duodenocólicos, los Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 48 cuales se inician después de la comida, se producen al llenarse el duodeno con el alimento proveniente del estómago. Los músculos del colon están inervados por el sistema nervioso autónomo. El sistema nervioso parasimpático estimula el movimiento, y el simpático inhibe este movimiento. Varias veces al día se presenta peristaltismo masivo, lo cual hay distención del recto y se inicia la urgencia de la defecación. En personas con motilidad normal y con ingestión de una dieta mixta, el tiempo de tránsito o de paso (desde la ingesta del alimento hasta de defecación) es de 24 a 48 h. De esta forma, la función normal del colon encierra 3 procesos fisiológicos: 1) absorción de líquidos y electrolitos; 2) contracción que mezclan el contenido, lo exponen a la mucosa y lo transportan al recto, y 3) defecación (Tortora y Derrickson, 2007; García y López, 2007). El examen coprológico es un examen habitual de las heces, incluye los análisis macroscópico, microscópicos y químicos para la detección temprana de hemorragia gastrointestinal, trastornos hepáticos y de los conductos biliares, síndromes de dispepsia y malabsorción, inflamación y causas de diarrea y esteatorrea (Strasinger y Di Lorenzo, 2010). También existen otros exámenes como son el coproparasitoscópico y el coprocultivo, el primero se realiza para la observación de parásitos en sus diferentes fases del ciclo de vida en una muestra fresca; en el segundo, la muestra se siembra en medios de cultivos selectivos para el desarrollo e identificación de las bacterias entéricas patógenas (Heising, Threatte, Henry, 2010) Las muestras al azar convienen para la comprobación cualitativa de sangre y el examen microscópico de leucocitos, fibras musculares y grasas en heces suelen recolectarse en envases de plástico o vidrio con tapa de rosca. Para la comprobación cuantitativa, por ejemplo para las grasas en heces, se requieren muestras en tiempo establecido, debido a la variabilidad de los hábitos intestinales y el tiempo de tránsito requerido para que el alimento atraviese el tubo digestivo, la muestra más representativa es una recolección de 3 días. Estas muestras se recolectan en envases grandes para albergar la cantidad y facilitar la emulsificación antes de la prueba (Strasinger y Di Lorenzo, 2010). Cuando se recolecte la muestra debe evitarse mezclarla con orina, sangre menstrual o agua de colonia; debe llevarse lo más pronto posible al laboratorio, registrarla y realizar el examen. 6.2 Actividades previas a la práctica: - Definir creatorrea, esteatorrea, melena, esprúe, acolia, aquilia, amilorrea y meconio. - Investigar cómo se realizan y cuál es la utilidad diagnóstica de las siguientes pruebas: i) urobilinógeno y pigmentos biliares en heces; ii) van de Kamer; iii) esteatocrito; iii) D-xilosa - Describir el fundamento de la determinación inmunológica de sangre en heces. - Buscar imágenes para consultar durante la práctica, describiendo con las diferentes tinciones a emplear; así como los artefactos y de restos de alimentos que se observan en el examen microscópico de heces. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 49 6.3 Objetivos - Conocer la importancia de recolectar correctamente de una muestra de heces al azar y para estudios cuantitativos, así como las interferencias que se deben evitar para la obtención de resultados confiables. - Resaltar la importancia de las pruebas que integran al examencoprológico, mediante su correcta ejecución e interpretación, para orientar al diagnóstico de alteraciones específicas de los procesos digestivos y los órganos involucrados. 6.4 Materiales, equipos y reactivos Material por equipo 3 Tubos de ensaye 13x100 1 Gradilla 2 Pipetas Pasteur con bulbo 1 Abatelenguas 1 Microscopio 1 Tubo de ensaye 15x150 mm 5 Portaobjetos 5 Cubreobjetos 1 Cuadro de papel seda 1 Aplicador de madera 1 Tira indicadora de pH Material por grupo 1 Gradilla 5 Tubos de ensaye 15X100 mm 5 Bulbos para Pipeta Pasteur 5 Pipetas Pasteur con punta corta 6.5 Procedimiento experimental 6.5.1 Obtención y procesamiento de la muestra biológica - Como se mencionó anteriormente debe seguirse el régimen de prueba indicado, evitando el consumo excesivo de carne pues puede afectarse el resultado de la detección de sangre oculta. - Debe evitarse el consumo de suplementos con hierro o sales de bismuto, al menos tres días antes de la recolección. - El paciente debe orinar en la taza del baño. - La defecación se realiza en un cómodo o recipiente escrupulosamente limpio, evitando la contaminación con sangre (proveniente menstruación) u orina. - Existen tubos de plástico con tapas que tienen adaptadas unas cucharillas con las que se pueden recolectar aproximadamente de 5 a 10 g de heces. En caso de no contar con estos tubos, puede utilizarse un abatelenguas estéril para realizar la recolección. - En caso de que el paciente sea un bebé, la muestra se recoge del pañal, pero debe evitarse el uso de talco o pomadas en la piel del bebé. Reactivos por grupo Azul de metileno al 0.1% Ácido acético al 36% Sudán III Lugol SSF Tarjetas Hema screen Tabletas reactivas Clinitest Benzal Hipoclorito de sodio Reactivo de Benedict Eosina al 10% Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 50 - Las muestras pueden ser examinadas una hora después de la evacuación, aunque puede ser posible refrigerarlas el tiempo que sea indispensable hasta su evaluación. 6.5.2 Examen macroscópico Principio La observación de la muestra nos permite definir el color y el aspecto. Para observar la forma de las heces es recomendable observar la deposición completa. Para evaluar la consistencia de las heces se pueden tocar con ayuda de un abatelenguas. Al abrir el contenedor de la muestra se percibe el olor de la muestra. Técnica - Destapar con cuidado el recipiente que contiene la muestra. - Realizar las observaciones inmediatamente, reportando color, forma, consistencia y olor. - Verificar la presencia de anormalidades, tales como sangre, moco, restos de alimentos o presencia de parásitos. Significado Clínico El color marrón de las heces es el resultado de la oxidación intestinal del estercobilinógeno a estercobilina, una molécula que proviene del metabolismo de la bilirrubina. Normalmente el aspecto las heces presenta forma cilíndrica y consistencia sólida, que debe mantenerse después de excretada. El olor fecal característico (reportado como sui géneris), varía de acuerdo con la ingesta de alimentos y el tiempo que permanece dentro del intestino. Es frecuente que los trastornos gastrointestinales originen cambios en el color y consistencia de las heces, se debe tomar en cuenta que pueden existir situaciones (debidas a la dieta o consumo de medicamentos) que afecten el aspecto de las heces y que deben diferenciarse de una posible patología. Según el área del tracto intestinal en el que se produzca la hemorragia el color puede ser de rojo brillante a rojo oscuro o inclusive negro. La sangre que se origina en esófago, estómago o duodeno tarda aproximadamente 3 días para aparecer en las heces, observándose negras alquitranadas; mientras que la sangre que proviene de la porción inferior del tubo digestivo requiere menos tiempo para aparecer y conserva el color rojo. En caso de encontrar heces rojas o negras es necesario realizar pruebas químicas para determinar la presencia de sangre; ya que la ingesta de sangre, moras, mosto de uva, vino tinto, carbón vegetal, hierro, bismuto, sales de plata, hierro, carbón vegetal o bismuto producen heces negras; mientras que el betabel produce heces rojas, por lo tanto, deben evitarse 3 a 5 días antes de la recolección de la muestra. Las heces verdes las producen los antibióticos orales por oxidación de bilirrubina fecal a biliverdina o también por la ingestión de grandes cantidades de verduras de hojas o alimentos ricos en colorantes verdes. La insuficiencia pancreática provoca heces amarillentas, con diferentes matices; la dieta láctea y en los lactantes es amarillo canario. Con dieta cárnica se hace marrón oscuro, mientras que si son abundantes las papas y el pan, las heces se aclaran hacia un marrón amarillento. El ruibarbo, el sen, la santonina y otras Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 51 plantas tiñen de amarillo las deposiciones. En la acolia de las ictericias obstructivas y en la fase aguda de las hepáticas son blanco-grisáceas. La sangre en forma de estrías en la superficie indica hemorroides o anormalidades anales. El régimen de prueba sin celulosa puede dar lugar a unas heces algo más blandas, pero normales. La consistencia acuosa sugiere diarrea. Cuando las heces son pequeñas y duras indican estreñimiento, mientras que las heces delgadas como cintas sugieren una obstrucción intestinal. Las falsas diarreas de los constipados se caracterizan por la deposición mixta, compacta la primera parte y pastosa al final. En el cólera se han comparado con la "sopa de arroz", y en la tifoidea con el "puré de guisantes", pero esta última es inconstante en su presentación. La deposición de los enfermos con insuficiencia gástrica descompensada parece una "papilla". En las esteatorreas de origen biliar, pancreático o entérico (esprúe y diarreas esprueiformes, celiaquía) es cremosa y pegajosa, como "mantequilla", también se observan voluminosas y espumosas, con apariencia grasosa y flotan. En la dispepsia de fermentación son generalmente pastosas, esponjadas y espumosas. Las heces revestidas de moco indican inflamación o irritación intestinal, se observan en colitis patológica o presión excesiva durante la evacuación. El moco con filamento de sangre sugiere daño en las paredes intestinales, causada tal vez por disentería bacteriana o amebiana o por procesos maligno. La presencia de moco debe informarse. Aunque el olor se hace fétido en todos los procesos que cursan con putrefacción de las proteínas ingeridas o endógenas (lo cual puede ocurrir en pacientes con insuficiencia gástrica, biliar o pancreática, colitis, cáncer, entre otras), y sobre todo en las melenas, en el cáncer de colon y en el absceso abierto en el intestino grueso. En las "diarreas de fermentación" con tránsito rápido a partir del ciego son de olor rancio, agrio. Durante el tratamiento con antibióticos no emiten olor. Las diarreas urémicas y en las fístulas rectovesicales provocan un olor amoniacal. 6.5.3 pH Fundamento La tira indicadora de pH contiene como indicadores: azul de bromotimol, rojo de metileno y fenolftaleína, produciendo un cambio de coloración de acuerdo con la concentración de iones H+. Técnica - Humedecer una tira de papel pH, con agua destilada. - Poner el papel en contacto con las heces en varios puntos de la superficie y también el interior, usando solo un lado de la tira de papel. - Comparar el vire que presenta tira de papel pH con la escala de colores de la caja, evitando el contacto directo con la carta de colores, para evitar contaminación de contenedor de tiras. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 52 Significado clínicoLos valores normales van de 7.0 – 8.0 . El pH de las heces depende de múltiples factores, dietéticos y endógenos, pero nos orienta para identificar que si es <7.0 puede tratarse de una dispepsia fermentativa, mientras que en procesos diarreicos e insuficiencia gástrica es >8.0 6.5.4 Sangre oculta por el método del guayaco (HemaScreen) Fundamento La reacción utiliza la actividad de la pseudoperoxidasa de la hemoglobina que reacciona con el peróxido de hidrógeno para oxidar los compuestos fenólicos presentes en el guayaco (inicialmente incoloro) con la producción de quinonas de color azul. Hemoglobina + H2O2 Técnica - Escribir la información requerida en la parte frontal de la tapa de la tarjeta Hema-Screen y abrir la tapa. - Con un aplicador de madera tomar con un extremo un poco de muestra superficial y con el otro de la parte interna. - Distribuir las muestras en cada una de las ventanas y cerrar la tapa con ayuda de la pestaña. Secar a temperatura ambiente. - Abrir la parte trasera de la ventana perforada y agregar 2 gotas de revelador en la parte trasera de las ventanas. La presencia de sangre provoca la formación de un halo verde-azulado en torno a las heces. Significado clínico En condiciones normales este parámetro es negativo. La prueba positiva es indicativa de sangre oculta y sangrado masivo del tracto gastrointestinal. Como todo sangrado mayor a 2.5 mL/150g de heces se considera importante desde el punto de vista patológico y pueden estar ausentes los signos visibles de sangrado. En la actualidad su uso está muy difundido como procedimiento elección para identificación de sangre oculta, la prueba anual tiene un alto valor predictivo positivo para la detección temprana de cáncer colorrectal y es recomendada por la American Cancer Society, en particular para las personas mayores de 50 años. 6.5.5 Determinación de azúcares reductores en heces Fundamento de las tabletas Clinitest El sulfato de cobre, que puede proveerse como reactivo de Benedict o en las tabletas de Clinitest, reacciona con el grupo aldehído libre de los llamados “azúcares reductores” (glucosa, maltosa, lactosa, galactosa y azul incoloro pseudoperoxidasa 2H2O + O2 + Guayaco Guayaco oxidado Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 53 pentosa) presentes en la muestra, reduciéndolo a óxido cuproso. El color resultante va de azul verdoso a naranja, dependiendo de la cantidad de azúcar presente. Tanto el reactivo de Benedict como las tabletas Clinitest contienen a) hidróxido de sodio, que proporciona el medio alcalino necesario para que el carbohidrato no forme el anillo piranósico o furanósico y asegura que la reacción se lleve a cabo; b) carbonato de sodio que asegura mantener el pH alrededor de 10; c) citrato de sodio que secuestra el cobre presente en el reactivo, para prevenir la remoción por precipitación (si no se agrega el citrato de sodio, el cobre precipita como Cu(OH)2). La fructosa puede dar positiva esta reacción debido a que en el medio alcalino y por la temperatura de la reacción, se tautomeriza a glucosa. La sacarosa y la trehalosa no dan positivo a la reacción, pues sus grupos aldehído están siendo utilizados para el enlace glucosídico. Técnica del reactivo de Benedict - Realizar en un tubo de ensaye 13 x 100 mm una emulsión, colocando una parte de las heces en dos partes de agua. Reservar el sobrante de la emulsión para la evaluación microscópica. - Colocar 5 gotas de la emulsión de heces en 1.0 ml de reactivo de Benedict. - Colocar durante dos minutos, el tubo de reacción en baño de agua a punto de ebullición, teniendo la precaución de retirarlo cada vez que la reacción se torne violenta, asegurándose de dirigir el tubo en dirección contraria a cualquier persona, pues la reacción es exotérmica. - Dejar enfriar el tubo y leer la reacción. Cualquier indicio de color azul verdoso a naranja indica prueba positiva. Técnica con la tableta Clinitest - Transferir 15 gotas de la emulsión a un tubo 15x150 mm y adicionar una tableta de Clinitest. - Esperar 15 segundos y agitar suavemente para asegurar la disolución de la tableta, asegurándose que el tubo se dirija en dirección opuesta a los estudiantes. - La lectura se realiza comparando el color del líquido contenido en el tubo con la carta de colores del manual de uso de las tabletas. Significado clínico En condiciones normales no deben existir azúcares reductores en la muestra, pues son digeridos y absorbidos en su totalidad en el intestino. Esta determinación debe utilizarse en caso de que la muestra sea de paciente pediátrico y lo más pronto posible después de emitida, pues la glucosa y otros azúcares son consumidos por bacterias. Pueden presentarse en intolerancia a la lactosa, mala digestión por falta de actividad enzimática, mala absorción o distrofia de la mucosa intestinal. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 54 6.5.6 Examen microscópico directo Principio La evaluación microscópica de las preparaciones de heces se realiza para detectar presencia de leucocitos asociados con diarrea microbiana, almidones, fibras musculares sin digerir que se asocian con creatorrea y grasas asociadas con esteatorrea. Técnica - En un portaobjetos, colocar una gota de emulsión y cubrirla con un cubreobjetos, para después montar la preparación en el microscopio. - Enfocar a 10X y realizar la observación a 40X revisando 15 campos evitando la lectura en las orilla del cubreobjetos. - Identificar leucocitos, fibras musculares estriadas y parásitos reportando: cantidad /campo. - Evaluar la cantidad de bacterias como escasas, moderadas o abundantes. Significado clínico Si la muestra es observada dentro de la primera hora de emisión, puede evidenciarse la presencia leucocitos, fibras musculares estríadas, parásitos vivos o bacterias. Los primeros deben ser negativos, mientras que las bacterias son escasas. En caso de observarse una presencia abundante de bacterias es recomendable indicar al paciente la realización de un coprocultivo. 6.5.7 Fibras musculares en heces Fundamento. La eosina en alcohol al 10% es un colorante ácido que se enlaza a constituyentes celulares de carácter básico, por lo que tiñe componentes y organelos citoplasmáticos de modo que realza las estriaciones de las fibras musculares. Técnica - Colocar en un portaobjetos una pequeña cantidad de heces y adicionar 2 gotas de eosina en alcohol al 10% y emulsionar empleando un aplicador de plástico. - Colocar un cubreobjetos y dejar reposar durante 3 minutos - Enfocar la preparación a 10X y observar a 40X, se revisa la totalidad del cubreobjetos durante exactamente 5 minutos. - Contar el número de fibras bien conservadas, teñidas de rojo con estriaciones tanto en sentido horizontal como vertical, éstas son características de las fibras sin digerir. Las fibras parcialmente digeridas muestran estriación en una sola dirección y las totalmente digeridas no tienen estriaciones. - Reportar la cantidad total observada. Sólo deben contarse y reportarse la presencia de fibras musculares estriadas sin digerir Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 55 Significado clínico La prueba debe ser negativa o escasa., siendo útil para el diagnóstico y monitorización de pacientes con insuficiencia pancreática, debida a pancreatitis crónica, fibrosis quística o neoplasias; también pueden observarse en caso de obstrucción biliar y fístulas gastrocólicas. Existe creatorrea en la insuficiencia gástrica con aquilia. 6.5.8 Leucocitos fecales Fundamento Las muestras se pueden examinar como preparaciones en fresco o en frotis teñidos con azul de metilenoque presenta afinidad por los núcleos leucocitarios y hará evidente la presencia de neutrófilos, presentes como parte de la respuesta inflamatoria. Esta tinción también identificar a las sales de ácidos grasos, llamadas comúnmente jabones. Todas las preparaciones deben realizarse con muestras recién emitidas y preferentemente de la porción que contenga moco. Técnica - Colocar 3 gotas de emulsión de heces ó 1 gota de heces líquidas con moco y agregar 2 gotas de azul de metileno - Mezclar con un palillo de madera - Dejar reposar 2 a 3 minutos - Enfocar a 10X y realizar la observación a 40X revisando 20 campos evitando la lectura en las orilla del cubreobjetos. - Identificar los neutrófilos reportando: cantidad /campo Significado clínico Los neutrófilos se observan en las heces en enfermedades que afectan la mucosa intestinal, como colitis ulcerosa y disentería bacteriana. La presencia de 3 o más neutrófilos por campo (visto a 40x) puede ser indicativo de una enfermedad bacteriana invasiva. El hallazgo de algún neutrófilo observado en frotis de heces a 100x tiene una sensibilidad de alrededor del 70% para detectar la presencia de bacterias invasivas. 6.5.9. Determinación cualitativa de grasas neutras y grasas fraccionadas en heces Fundamento Los lípidos incluidos en el examen microscópico de las heces son grasas neutras (triglicéridos), sales de ácidos grasos, ácidos grasos y colesterol; las grasas neutras se tiñen con facilidad utilizando la tinción con Sudán III, colorante que tiene afinidad por la cadena hidrocarbonada, generando una reacción hidrofóbica, donde los grupos no polares se agrupan y son rodeados por moléculas del reactivo, situadas a menudo cerca del borde del cubreobjetos. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 56 Como los jabones y los ácidos grasos no se tiñen directamente con Sudán III se debe examinar un segundo portaobjetos después de realizar una hidrólisis de éstos, mezclando la muestra de heces con ácido acético al 36% y aplicando calor, para posteriormente teñirlas con Sudán III. Técnica de tinción de grasas neutras - Mezclar 3 gotas de heces emulsificadas con una gota de alcohol etílico al 95% sobre un portaobjetos - Mezclar con aplicador de plástico - Adicionar 2 gotas de Sudán III saturado en etanol al 95% - Mezclar con aplicador y colocar cubreobjetos - Revisar con objetivo 40x toda la preparación incluyendo las orillas del cubreobjetos. - Contar las gotas anaranjadas presentes / campo, e indicar el tamaño de las gotas. Técnica de tinción de grasas fraccionadas - Mezclar 3 gotas de heces emulsificadas con una gota de ácido acético al 36% sobre un portaobjetos - Mezclar con aplicador de plástico - Adicionar 2 gotas de Sudán III saturado en etanol al 95% - Mezclar con aplicador y colocar cubreobjetos - Calentar suavemente hasta el punto de ebullición - Revisar con objetivo 40x toda la preparación incluyendo las orillas del cubreobjetos - Contar las gotas anaranjadas presentes / campo, e indicar el tamaño de las gotas. Interpretación de resultados Significado clínico. La grasa en las heces debe ser negativa o escasa; su presencia abundante (sin importar el tipo de grasa) recibe el nombre de esteatorrea, la cual puede deberse a uno o varios mecanismos como lo son: tránsito acelerado, déficit enzimático de su digestión, déficit de absorción o hipersecreción endógena. Unas veces predomina la grasa neutra, sin desdoblar, y en otros casos los ácidos grasos y jabones. La grasa puede reconocerse macroscópicamente siempre y cuando la excreción de grasa sea considerable. Número de gotitas/campo Reporte 100 gotas menores de 4 m Escasa 100 gotas de 1 a 8 m Moderada 100 gotas de 6 a 75 m Abundante Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 57 6.5.11 Presencia de quistes parasitarios y almidón Fundamento. El yodo tiñe de amarillo los núcleos de quistes, de café las vacuolas que contienen glucógeno y de azul los grumos de almidón en presencia de lugol, debido a una adsorción o fijación del yoduro sobre las unidades de glucosa de la amilasa. Técnica - En un portaobjetos colocar una gota de emulsión de realizada de heces. - Agregarle una gota de lugol mezclándolas con un aplicador de madera. - Enfocar la preparación a 10X y observar a 40X, buscando quistes, vacuolas con glucógeno y almidón. - Para el caso de las vacuolas de glucógeno y almidón debe considerarse que si el promedio de 20 campos observados con objetivo 40x es de 1 - 4 se reportan como escasos, mientras que si es de 5 – 9 se indica moderados y si son más de 10 serán abundantes Significado clínico La búsqueda de amilorrea tiene menos interés clínico que el de los demás pero sirve principalmente para evidenciar un tránsito acelerado a través del colon. Aparece cuando hay una ingestión excesiva de féculas con o sin defectos de insalivación y masticación. Cuando existe una Insuficiencia pancreática la coexistencia de esteatorrea y creatorrea en este síndrome global confirma el diagnóstico. La amilorrea puede faltar en pancreopatías evidentes. La evidencia de quistes o restos parasitarios debe reportarse para recomendar al paciente realizarse un coproparasitoscópico para identificar al parásito en cuestión. 6.6 Disposición de residuos - La emulsión y todos los residuos de heces deben regresarse al contenedor original de la muestra, enjuagando con un poco de agua; junto con el resto de la muestra biológica depositará en la taza del baño y se accionará la palanca. - El contenedor vacío puede tirarse en el bote de la basura del baño. - Los guantes, papel y demás material desechable contaminado se depositarán en la bolsa de la basura municipal. - Las cajas petri y portaobjetos con muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos para este fin. 6.7 Orientaciones para la elaboración del reporte Al iniciar el análisis de los resultados debe comentarse si la muestra fue de calidad analítica, es decir, si no existieron interferencias en su obtención (alimentación, uso de medicamentos) o manipulación (tiempo de almacenamiento) que afectaran los resultados. Posteriormente, para cada una de las pruebas debe indicarse hacia qué probable diagnóstico orienta su resultado, integrando el análisis, es decir, si se observan Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 58 alteraciones en el examen macroscópico es posible que también se presenten resultados inadecuados en el análisis microscópico, por lo que será necesario interrelacionar resultados para orientar a una probable alteración en la función gastrointestinal. 6.8 Referencias - García, P.,López, G. (2007). Evaluación de la absorción y metabolismo intestinal. Nutrición Hospitalaria 22(Suppl 2): 5-13 - Heisig, D., Threatte, G., Henry, J.B. (2010). Diagnóstico de laboratorio de las alteraciones gastrointestinales y pancreáticas. En Henry , J.B. Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marban: Madrid, Espala - Strasinger, S. , Di Lorenzo, M. (2008). Análisis de heces. En autor Análisis de orina y de los líquidos corporales. Médica Panamericana: Buenos Aires, Argentina - Tórtora, G., Derrickson, B. (2007). El aparato digestivo. En autor Principios de anatomía y fisiología. Médica Panamericana: México, D.F. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 59 PRÁCTICA No 7. “EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO Y ÁCIDO BASE” René Damián Santos. 7.1 Introducción Los electrolitos son iones que existen en los líquidos corporales; el metabolismo resulta afectado por las concentraciones absolutas y relativas de estos electrolitos constituyendo importantes factores de la osmolalidad, los potenciales de membrana elestado de hidratación y del pH de los líquidos intracelular (LIC) y extracelular (LEC) (Singer y Brenner, 2008). Los electrolitos de importancia clínica son: sodio (principal catión extracelular), potasio (principal catión intracelular), cloro (principal anión extracelular), fósforo, magnesio y calcio (iones inorgánicos relacionados con el metabolismo mineral). Los análisis para la evaluación del equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base son los procedimientos más comúnmente realizados en los laboratorios de química clínica; en conjunto, estos análisis se agrupan frecuentemente en un perfil metabólico básico. De manera que es importante conocer la fisiología de los órganos relacionados con el equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base, riñón y pulmón, para poder interpretar adecuadamente los resultados de los electrolitos séricos, término bajo el cual se han conjuntado al sodio, cloro y potasio. Estos se relacionan con el equilibrio hidroelectrolítico, debido a que mantienen la distribución del agua entre los líquidos extracelulares e intracelulares. Los desórdenes de electrolitos son comunes en pacientes adultos hospitalizados en terapia intensiva, con frecuencia, secundarios al tratamiento de diferentes alteraciones comunes, pues los medicamentos utilizados en estos pacientes pueden alterar su absorción, han sido asociados con incremento de la morbilidad y mortalidad, la alteración más común es la mielosis pontina, que degenera en edema cerebral. Estas alteraciones pueden prevenirse si se usa una adecuada administración intravenosa de fluidos y nutrientes, por ejemplo, si se observa hiponatremia se contraindica el uso de fluidos intravenosos hipotónicos, mientras que si hay hipernatremia se administra agua (Singer y Brenner, 2008). Las alteraciones crónicas de los electrolitos, sumadas a la presencia de otras patologías pueden ocasionar arritmias atriales. Además, los electrolitos cumplen una función primordial en la hidratación, de tal manera que también deben monitorearse en aquellos pacientes que se someten a ejercicio extenuante, dado que debido a su pérdida a través del sudor pueden generar alteraciones. La determinación de sodio, cloro y bicarbonato como electrolitos, además de la evaluación del CO2 y del pH, permiten evaluar al equilibrio ácido-base, con la finalidad de definir el origen, metabólico o respiratorio, de las alteraciones relacionadas (Heitz y Horne, 2005). El método más utilizado para determinar al sodio, potasio y cloro es el de ion selectivo (automatizado), que se fundamenta en un método potenciométrico que emplea electrodos "ion-selectivo". Estos electrodos consisten en membranas permeables a una determinada especie iónica. La diferencia de potencial que se establece en la interfase de la membrana y la muestra en solución, es directamente proporcional al logaritmo de la actividad o concentración iónica según lo establecido por la ecuación de Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 60 Nernst. Además de este método, se ha utilizado la flamometría, aunque la necesidad de gas propano ha disminuido su uso (Heitz y Horne, 2005). La gasometría es el método de elección para evaluar al equilibrio ácido-base, a través de la medición de bicarbonato, CO2 y del pH. No obstante, su ejecución no forma parte de las pruebas de rutina, como lo puede ser la determinación de electrolitos séricos; sin embargo, se reconoce su importancia clínica como apoyo al diagnóstico (Heitz y Horne, 2005). 7.2 Actividades previas a la práctica - Explicar qué muestras se utilizan para la determinación de sodio, cloro y potasio. - Investigar el fundamento de la determinación de sodio, cloro y potasio por flamometría. - Investigar ¿qué es la gasometría? ¿para qué se utiliza? ¿cuál es la muestra idónea para realizarla? 7.3 Objetivo Estudiar el papel de la determinación de electrolitos en las patologías relacionadas con el equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base a través del estudio de los fundamentos de su determinación y de casos clínicos que permitan valorar la importancia. 7.4 Materiales, equipos y reactivos Cuaderno de prácticas Casos clínicos relacionados con alteraciones ácido-base y del equilibrio hidroelectrolítico. 7.5 Procedimiento experimental - Asignar a los equipos uno de los siguientes temas: Métodos de cuantificación de electrolitos - Ion selectivo - Flamometría - Gasometría Casos clínicos - Deshidratación - Acidosis tubular renal - Hiper e hiponatremia - Hipovolemia - Cetoacidosis (alcohólica y diabética) Puede considerarse la opción de asignar un tema por mesa en caso de que el número de equipos y de sesiones calendarizadas así lo requieran. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 61 - Los puntos que deberá contener la presentación son los que se indican en la siguiente tabla: - Al término de cada exposición, los alumnos deben responder las dudas que se hayan generado de parte de los alumnos y de los profesores del grupo, a fin de complementar y resaltar los puntos importantes de la exposición. 7.6 Disposición de residuos Debido a que se trata de una práctica teórica no habrá generación de residuos. 7.7 Orientaciones para la elaboración del reporte Este punto no aplica debido a que la práctica se cumple con presentaciones orales que los alumnos preparan con antelación. 7.8 Referencias - Buckley, MS, Leblanc, JM, Cawley, MJ. (2010) Electrolyte disturbances associated with commonly prescribed medications in the intensive care unit. Crit Care Med 38(6 Suppl):S253-64 - Heitz, U., Horne, M. (2005). Fluidos, electrolitos y equilibrio ácido-base. Elsevier Mosby: Madrid - Sedlacek, M, Schoolwertj, AC, Remillard, BD. (2006) Electrolyte disturbances in the intensive care unit. 19(6):496-501 - Singer, G., Brenner, B. (2008) Alteraciones de líquidos y electrolitos. En Fauci, A., Braunwald, E., Kasper, D., Hauser, S., Longo, D., Jameson, L., Loscalzo, J. Principios de Medicina Interna. Mc Graw Hill: México. Método de cuantificación Caso clínico - Titulo - Fundamento: anotar reacciones químicas necesarias. - Ejemplo de metodología: describir pasos, hacer diagrama de flujo utilizar los esquemas necesarios. - Muestra(s) biológica(s) que se puede(n) emplear. - Sensibilidad y especificidad. - Unidades de reporte - Ejemplos de electrolitos que se cuantifiquen por ese método - Costos - Titulo - Introducción - Características del (los) paciente(s) - Metodología: describir pasos, hacer diagrama de flujo, utilizar los esquemas necesarios - Resultados - Discusión (considerando la importancia de la evaluación de los electrolitos para estos casos) - Conclusiones Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 62 PRÁCTICA NO. 8 “ELECTROLITOS DEL METABOLISMO MINERAL” René Damián Santos. 8.1 Introducción Como la piel, el hueso se forma antes del nacimiento, pero después se renueva en forma continua (Tortora, 2007), lo que provoca que el esqueleto sea un órgano metabólicamente activo que sufre remodelación a lo largo de la vida (Hristova, 2010). Para que se produzca el crecimiento del hueso son necesarias grandes cantidades de calcio (Ca) y fosforo (P) y pequeñas cantidades de flúor (F), magnesio (Mg), hierro (Fe) y manganeso (Mn) (Tortora, 2007). La remodelación esquelética puede ser estimulada por la respuesta hormonal a los cambios de Ca y P. El Ca es el catión de mayor concentración en el cuerpo humano, tiene gran importancia en la mineralización del hueso, además de ser un componente importante en diversos procesos fisiológicos como la coagulación sanguínea, la transmisión neuronal, la excitabilidad muscular, por lo cual la concentración séricade calcio debe mantenerse entre los 8 mg/dL y los 11 mg/dL. Entre las metodologías que se emplean para su cuantificación se encuentra el análisis colorimétrico con indicadores metalocrómicos, el marcado fluorescente en unión con EDTA o EGTA y la espectrometría de absorción atómica (Hristova, 2010). El P es el mayor anión intracelular, es esencial en diferentes funciones celulares y fisiológicas, además de participar en vías metabólicas de carbohidratos, lípidos y proteínas, también es responsable de la producción y almacenamiento de energía mediante los compuesto fosforilados de alta energía y no olvidemos que es importante en la estructura ósea, la síntesis de colágena y la homeostasis del Ca (Viana, 2012), cerca del 85% de fosfato en adultos se encuentra como sales de fosfato de calcio, el 15% restante se encuentra ionizado (Tortora, 2007). Los métodos más empleados en la determinación de fosfato inorgánico son reacciones de esté con molibdato de amonio para dar un complejo de fosfomolibadato (Hristova, 2010). El catión intracelular más abundante, pero el segundo en importancia es el Mg, está involucrado en aproximadamente 300 reacciones enzimáticas como cofactor metálico (Viana, 2012). Casi el 54% del Mg forma parte de la matriz ósea como sales de magnesio y el 46% restante se encuentra en forma de iones Mg2+ en el LEC y el LIC. Es esencial para la actividad neuromuscular, la transmisión sináptica y la función del miocardio, además de participar en la secreción de PTH (Tortora, 2007). El método de referencia para la determinación de Mg es la espectrometría de absorción atómica, sin embargo se han utilizado varias técnicas analíticas (Hristova, 2010). Los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral (fósforo, magnesio y calcio total) pueden determinarse mediante métodos espectrofotométricos usando el rango UV-visible del espectro electromagnético. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 63 8.2 Actividades previas a la práctica - Explique la diferencia entre el calcio total y el calcio ionizado. - Investigar las interferencias relacionadas con las determinaciones de calcio, fósforo y magnesio. 8.3 Objetivos - Realizar la determinación de los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral mediante métodos espectrofotométricos para conocer los cuidados en el procedimiento, así como su importancia en el apoyo al diagnóstico. 8.4 Materiales, equipos y reactivos - Material biológico *1 ml de suero obtenido por sistema al vacío, uno por equipo. - Material por equipo - 1 gradilla - 6 tubos de ensaye - 1 ligadura - papel para limpiar celdas (que no deje residuos) - torundas con alcohol (como mínimo, una por alumno) - 1 sistema al vacío (tubo tapón rojo, aguja, adaptador) - Material por grupo - 2 espectrofotómetro - 10 celdas para el espectrofotómetro - 1 micropipeta (capacidad mínima 10 μL) - 1 agitador vórtex - 1 baño maría a 37º C - 1 dispensador de puntas azules para micropipeta - 1 dispensador de puntas amarillas para micropipeta - Reactivos Equipo para la determinación de: - Fósforo inorgánico - Magnesio - Calcio total NOTA: El método a utilizar dependerá de los reactivos disponibles en el laboratorio. 8.5 Procedimiento experimental - Obtención del material biológico Para la obtención de la muestra y separación del suero ver Anexo A. NOTA: Para conocer la técnica, el valor de referencia y las precauciones durante la determinación de cada electrolito que se realizará, es necesario consultar el manual de uso de los reactivos disponibles en el laboratorio en el momento de la práctica. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 64 - Determinación de fósforo inorgánico - Fundamento. Existen dos métodos para la determinación de fósforo inorgánico: - Método colorimétrico: determina fósforo inorgánico. El fosfato inorgánico reacciona en medio ácido con el molibdato para dar fosfomolibdato, que es reducido por el ácido ascórbico a azul de molibdeno, desarrollándose el color en medio arsenito/citrato. El arsenito/citrato se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con el fosfato liberado de los ésteres lábiles. El color obtenido se mide entre 620 y 650 nm. - Método UV: El fósforo inorgánico (Pi) reacciona en medio ácido con el molibdato para dar un complejo fosfomolíbdico que se mide espectrofotométricamente a 340 nm. - Significado clínico. El fósforo se encuentra en el organismo formando parte de compuestos orgánicos (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos) o como fosfatos inorgánicos, cumpliendo diversas funciones (transporte de energía, estructura de los tejidos, mantenimiento del pH de los líquidos corporales). Los tejidos óseo y muscular lo contienen como constituyente esencial y es notable su participación en la composición del tejido nervioso. Su concentración en circulación está regulada entre otros factores por los niveles de vitamina D y las glándulas endocrinas, observándose variaciones fisiológicas de acuerdo a la edad, ingesta, actividad física, embarazo, etc. Existen situaciones patológicas en las que se altera este equilibrio, produciéndose anormalidades en la concentración de fósforo circulante. Niveles elevados de fósforo sérico son atribuidos a la dieta, metástasis de huesos, alteraciones en el hígado, alcoholismo, diarreas y vómitos, en el hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo conduce a la situación contraria. También puede encontrarse hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y diversos trastornos renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con deficiencias de vitamina D y defectos en la reabsorción de fósforo a nivel renal. - Determinación de magnesio (Mg): método colorimétrico - Fundamento. El Mg, en medio alcalino, reacciona con un cromógeno (xylidyl blue o calmagita) formando un complejo de color púrpura cuya intensidad es proporcional a la concentración de Mg presente en la muestra. La incorporación del complejante EGTA al reactivo elimina la interferencia de los iones calcio. - Significado clínico. El Mg es el segundo catión intracelular más abundante en el organismo humano después del potasio, siendo esencial en gran número de procesos enzimáticos y metabólicos. El 60% del Mg del organismo se encuentra en los huesos y el resto está repartido entre músculos y otros tejidos blandos. El Mg cumple un rol muy importante en la fisiología humana. Participa en el metabolismo energético a través de la activación del ATP, en la transferencia de fosfatos de alta energía y es el ion activador de muchas enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos, carbohidratos y proteínas. El Mg es un mediador en Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 65 mecanismos de conducción y transporte a través de membranas. Es esencial en la preservación de estructuras macromoleculares de DNA, RNA y ribosomas y en la formación del hueso y el mantenimiento de la presión osmótica. La hipomagnesemia está muy asociada a la deficiencia de otros iones como el P, K y Ca. Las causas de hipomagnesemia son múltiples: diarreas crónicas y agudas, síndromes de mala absorción, succión nasogástrica prolongada y vómitos, fístulas intestinales y biliares, deterioro de la conservación renal, diabetes mellitus (acidosis diabética), hipertiroidismo, hiperaldosteronismo primario, alcoholismo crónico, administración de diuréticos o aminoglucósidos, hiperparatiroidismo. El exceso de Mg puede darse por incorporación o administración excesiva de sales de Mg y en general se asocia a falla renal. Otras patologías asociadas a hipermagnesemia son: hipercalcemia hipocalciúrica, hipotiroidismo, deficiencia de mineralocorticoides, enfermedad de Addison o terapia intensivacon antiácidos. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio. - Determinación de calcio total - Fundamento. Existen dos métodos colorimétricos para la determinación de calcio: - Método del arsenazo III: El calcio reacciona con arsenazo III (ácido 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7- naftalenen-bis(azo)-dibenzenarsónico) dando un complejo de color azul que se mide fotocolorimétricamente a 650 nm. - Método de o-cresolftaleína. El calcio reacciona con la cresolftaleín complexona (o-CPC) a pH 11, dando un complejo de adición color magenta que se mide fotocolorimétricamente a 570 nm. - Significado clínico. El calcio es el mineral más abundante e importante del cuerpo humano, el 99 % se halla en los huesos. Es esencial en la mayoría de las reacciones de la coagulación sanguínea y en la regulación de la excitabilidad de las fibras musculares. Su concentración en suero y orina está regulada por la acción de factores tales como niveles de parathormona, vitamina D y fósforo, observándose fluctuaciones fisiológicas debidas a edad, sexo, embarazo, actividad física, cambios estacionales (por acción de la luz solar). La hipercalcemia está relacionada con distintas patologías: hiperparatiroidismo, neoplasias óseas, intoxicaciones con vitamina D, aumento de la retención renal, osteoporosis, sarcoidosis, tirotoxicosis. La hipocalcemia se asocia con desórdenes tales como hipoparatiroidismo, deficiencia de vitamina D, malnutrición o malabsorción. Una disminución de los niveles de albúmina causa una disminución del calcio en suero. 8.6 Disposición de residuos - Las agujas deben depositarse en el contenedor rígido de residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI); su empaque se desecha a la basura municipal. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 66 - Las torundas, los guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del área de trabajo deben desecharse en la basura municipal. En caso de que estos materiales estén empapados de sangre, depositarlos en la bolsa roja de RPBI. - Los tubos que contengan mezclas reactivas, sangre y muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse en los botes ubicados fuera del laboratorio. 8.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas se harán los cálculos necesarios para obtener el resultado de cada analito determinado; la discusión se basará en el análisis de la influencia que tienen los electrolitos determinados en el impacto del estudio del tejido óseo principalmente, sin dejar de considerar que cada uno de ellos también tienen otras funciones que pueden verse alteradas en caso de su aumento o disminución. Analizar las ventajas y desventajas de los métodos de determinación empleados, haciendo comentarios de cómo afectarían la calidad en los resultados así como sugerencias para corregir los posibles errores en lo que se incurrió. En las conclusiones debe considerarse si los objetivos planteados fueron alcanzados, si la práctica otorgó aprendizaje significativo y valor agregado a la formación del estudiante. 8.8 Referencias - Hristova, L.N, Henry, J.B. (2010).Intermediarios metabólicos, iones inorgánicos y marcadores bioquímicos del metabolismo del hueso. En Henry, J.B, Davey, F. Herman, C. McPherson, R. Pincus, M. Threatte, G. Woods, G. Laboratorio en el diagnostico clínico. Marbán: Madrid - Tortora, G. Derrickson, B. (2007). Homeostasis hidroelectrolítica y acido-base. En Tortora, G. Derrickson, B. Principios de anatomía y fisiología. Médica Panamericana: México, D.F - Viana, L. Burgos, M.G.P, Silva, R. (2012). Refeeding síndrome: clinical and nutritional relevance. ABCD. Arquivos Brasileiros de Cirugia Digestiva. 25(1), 56 – 59. - Gattineni, J. Baum, M. (2012). Genetic disorders of phosphate regulation. Pediatric Nephrology. 27(9): 1477 – 1487. DOI: 10.1007/s00467-012-2103-2 Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 67 PRÁCTICA No 9 “DETERMINACION DE HORMONAS” G. Leticia Arellano M. 9.1 Introducción El sistema endocrino comprende parte del sistema de comunicación intra y extracelular encargado de controlar la reproducción, diferenciación sexual, crecimiento, desarrollo, regulación del metabolismo y aporte de nutrimentos en un individuo. Este sistema funciona a base de una serie de glándulas encargadas de elaborar un grupo de mensajeros químicos llamados hormonas, que interactúan con receptores específicos en sus células blanco. Aunque no existe relación anatómica entre las diversas glándulas endocrinas, existen ciertas relaciones hormonales de interdependencia, por lo que se habla de ejes hormonales (Kaplan, 2003). En general la secreción de una hormona depende de su concentración o de la concentración de algún producto de su acción, en plasma o en el líquido extracelular, es decir, son reguladas por retroalimentación. La secreción hormonal no tiene lugar de forma continua y uniforme, sino pulsátil, con períodos de secreción (pulsos) y otros de reposo. Las características de los pulsos pueden variar a lo largo del día o en diversas circunstancias fisiológicas o patológicas. Cuando la secreción varía ostensiblemente a lo largo del día se habla del ritmo circadiano (Henry, 2001). Las anormalidades en la secreción hormonal son generalmente definidas en términos de los niveles séricos de las mismas (aumento o disminución), o en la demostración de alteración directamente en la glándula en la que se producen. Excesiva cantidad de hormona pude ser secretada por tumores, que la retroalimentación no funcione, ingestión deliberada o por indicación terapéutica. En tanto que la disminución puede resultar de la carencia en su síntesis o daño en la glándula que la produce (Kaplan, 2003). Una complicación en el estudio de la secreción hormonal es que no se debe exclusivamente al daño de la glándula productora, sino que como existen ejes de regulación, el daño en alguna parte del eje tendrá como consecuencia que se dañen los de otra. Es por ello generalmente se evalúan en perfiles o conjunto de hormonas que regulan una determinada función (Henry, 2001). El progreso de la endocrinología ha ido ligado al desarrollo de ensayos que permiten medir las hormonas. La endocrinología clínica está limitada a la medición de la concentración de las hormonas en suero u otros fluidos tales como la orina o saliva. En los laboratorios clínicos se tiene acceso a una amplia variedad de ensayos con diferentes grados de sensibilidad y especificidad que ayudan a interpretar la severidad del daño, la mayoría de estos son inmunoensayos, entre los que se encuentran: el radioinmunoanálisis (RIA), el análisis inmunorradiométrico (IRMA), el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), la quimioluminiscencia (QL) y el fluoroinmunoanálisis incrementado por la disociación de lantánidos (DELFIA) (Kaplan, 2003). Para la interpretación de los ensayos deben ser considerados los siguientes factores: el estado clínico del paciente, la concentración de la variable regulada por la hormona, la concentración de otras hormonas Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 68 que participen en el mecanismo de retroalimentación, la naturaleza pulsátil de la secreción hormonal (anotar la hora del día a la cual se toma la muestra), el estado de estrés del paciente, así como la naturaleza química de la hormona y su vida media, ya que todos estos factores pueden afectar los niveles de hormonas (Henry, 2001). 9.2 Actividades complementarias a la práctica − Esquematizarlas glándulas que forman parte del sistema endocrino, indicando las hormonas producidas por cada una de ellas. − Investigar cuál es la naturaleza química de las hormonas, mencionando un ejemplo de cada una. − Describir un ejemplo de la respuesta que una hormona puede desencadenar cuando se une a su receptor en la célula blanco. 9.3 Objetivos − Conocer la importancia clínica de la determinación de hormonas a través de la exposición de los métodos empleados en la cuantificación de las mismas, así como describir sus fundamentos para poder aplicarlos en el diagnóstico de patologías que involucren alteraciones en la secreción hormonal. − Comprender la importancia de la determinación de hormonas, por medio de la exposición y discusión de algunos casos clínicos, en los que se apliquen las metodologías expuestas, para resaltar su importancia en el diagnóstico, seguimiento y tratamiento de alteraciones hormonales. 9.4 Materiales, equipos y reactivos − Video proyector 9.5 Metodología 9.5.1 Exposiciones por parte de los alumnos − Asignar a cada equipo de trabajo, un tema para exposición. Este puede ser un método para cuantificación de hormonas o un caso clínico. − El equipo realizará una búsqueda en medios impresos o electrónicos. − En base a la información obtenida y con la asesoría del profesor, realizara una presentación, para exponerla ante el grupo. − Los puntos que deberá contener la presentación se indican en la siguiente tabla: Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 69 − Al término de cada exposición, los alumnos deben responder las dudas que se hayan generado de parte de los alumnos y de los profesores del grupo, a fin de complementar y resaltar los puntos importantes de la exposición. 9.6 Disposición de residuos Por tratarse de exposiciones orales, no se generan residuos peligrosos. Los residuos que se pudieran generar, se depositaran en la basura municipal. 9.7 Orientaciones para la elaboración del reporte No se entregará reporte para esta práctica. 9.8 Referencias - Henry, J. B. (2001) Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 20th. W.B. Saunders Co: U.S.A. - Kaplan, Lawrence A., Pesce, Amadeo J., Kazmierczak, Steven C. (2003). Clinical Chemistry. 4th Mosby: USA. Método de cuantificación Caso clínico • Nombre de la Técnica. • Fundamento: indicar reacciones químicas necesarias. • Muestra(s) biológica(s) que se puede(n) emplear. • Indicaciones al paciente. • Ejemplo de metodología: describir pasos, hacer diagrama de flujo, utilizar los esquemas necesarios. • Sensibilidad y especificidad. • Unidades de reporte. • Ejemplos de hormonas que se cuantifiquen por ese método. • Costos. • Referencias. • Título del caso. • Introducción. • Cuadro clínico del (los) paciente(s). • Metodología: describir pasos, hacer diagrama de flujo, utilizar los esquemas necesarios. Resaltar técnicas de cuantificación. • Resultados. • Discusión. • Conclusiones. • Referecias. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 70 PRÁCTICA No 10. “CUANTIFICACIÓN DE GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA” G. Leticia Arellano M. 10.1 Introducción La gonadotrofina coriónica humana (GCH), es sintetizada principalmente por el trofoblasto placentario, por ello ha sido considerada “la hormona del embarazo”, sin embargo es también producida por la hipófisis de hombres y mujeres sanos, así como por algunos tumores (carcinoma testicular u ovárico). Su función en el embarazo normal es mantener la esteroideogenésis del cuerpo lúteo hasta el momento en que la placenta alcance el desarrollo adecuado para realizar esta función (Saavedra, MS. et al. 2004). La GCH es una glicoproteína con un peso molecular de 36.7 kDa y está formada por dos subunidades, una cadena y una cadena , unidas por un puente disulfuro. La cadena es codificada por un solo gen y es similar a la cadena de otras hormonas como la hormona luteinizante (LH), la hormona estimulante del folículo (FSH) y la tirotrofina hipofisaria (TSH); en tanto que, la cadena β, se codifica por seis genes y es diferente a la cadena de las otras hormonas, lo que le confiere la especificidad. Una vez sintetizada la hormona, esta sufre una serie de transformaciones, entre las que se encuentran, rearreglos moleculares, cortes y diferentes grados de glicosilación, que dan lugar a variantes de la misma, por lo que se puede localizar a la molécula completa, o bien fragmentos de ella. También se puede encontrar variación en el porcentaje de glicosilación, lo que modifica su actividad biológica, vida media y aclaramiento (Saavedra, MS. et al. 2004). Es importante considerar esta variabilidad en la hormona, cuando se desea cuantificar con fines diagnósticos. La cuantificación de GCH se emplea para el diagnóstico de embarazos intra y extrauterinos, predicción de aborto espontáneo, diagnóstico y seguimiento de tumores y búsqueda de algunas alteraciones cromosómicas como el síndrome de Down. La medición de GCH se realiza cualitativa o cuantitativamente por métodos inmunológicos. Entre las técnicas que se emplean en su determinación se encuentran inhibición de la hemaglutinación, RIA, inmunoenzayo cromatográfico, quimioluminiscente o fluorimétrico. La especificidad de estos ensayos, es dada por el tipo de anticuerpos que se empleen en su determinación. Debido a la variabilidad en las formas de GCH, se recomienda el uso de anticuerpos monoclonales. 10.2 Actividades previas a la práctica - Describir las diferentes moléculas de GCH que se pueden encontrar en sangre y orina. - Realizar una tabla indicando los niveles de GCH durante las diferentes etapas del embarazo. 10.3 Objetivos - Realizar la cuantificación de GCH empleando un reactivo comercial, con el fin de aplicar una de las técnicas para cuantificación de hormonas y comprender la importancia de la toma de muestra, los cuidados en la determinación e interpretación de resultados. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 71 10.4 Materiales, equipos y reactivos 10.4.1 Material biológico. Orina de 24 horas. Nota: Las muestras de orina deberán enfriarse y centrifugarse para eliminar material insoluble. 10.4.2 Material por equipo - 1 gradilla para tubos de ensaye 12x75 mm - 20 tubos de ensaye 12x75 mm - 1 pipeta Pasteur con bulbo 10.4.3 Material por grupo - 1 Micropipeta (10 - 200 μL) - 1 Micropipeta (200 - 1000 μL) - Puntas azules para micropipeta. - Puntas amarillas para micropipeta 10.4.4 Reactivos - Kit para cuantificación de hCG - 250 mL de NaCl al 0.85% (SSF) 10.5 Procedimiento experimental 10.5.1 Fundamento Cuando los eritrocitos sensibilizados con GCH (adsorbida en la membrana del eritrocito) se ponen en contacto con anticuerpos monoclonales anti-fracción beta de GCH, reaccionan formando un patrón de aglutinación, que se manifiesta como un botón en el fondo del tubo (reacción negativa). La presencia simultánea de GCH libre, en la muestra de suero u orina, boquea la unión de los anticuerpos anti-GCH con los eritrocitos sensibilizados (inhibe la hemaglutinación), permitiendo la sedimentación de los eritrocitos en forma anular (reacción positiva). 10.5.2 Preparación de la muestra biológica - En el caso de la muestra de orina, enfriar la muestra (4-8°C) durante 2 horas, para precipitar material insoluble y centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos. Trabajar con el sobrenadante. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 72 10.5.2 Técnica Numerar del 1- 8, 16 tubos de ensaye 12x75mm (por duplicado). - Preparar 8 diluciones dobles de la muestra de orina, como se indica enla siguiente tabla: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Dilución 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 SSF - Mezclar perfectamente cada uno de los tubos. - Colocar en la otra serie de tubos numerados, 0.1 mL de la dilución correspondiente. - Adicionar a cada uno de los tubos, 0.1 mL de la solución de anticuerpos anti-hCG y mezclar perfectamente. - Agregar 0.05 mL de eritrocitos sensibilizados con hCG (eritrocitos-hCG). - Mezclar perfectamente para homogenizar. - Colocar la gradilla en un lugar exento de vibraciones calor excesivo. - Esperar 6 minutos y registrar los resultados positivos. - Los resultados negativos deberán verificarse al cabo de 90-120 minutos. 10.5.3 Interpretación de resultados Considerar como dilución final aquella que se encuentra entre la que inhibe la aglutinación formando un anillo y la que no inhibe, dando un patrón homogéneo en el fondo del tubo. Dilución final 1:48. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 73 En este caso, considerar como dilución final al tubo en el que se formó el anillo con mayor diámetro, ya que se encuentra entre la que inhibe totalmente la aglutinación y la que no inhibe, dando un patrón homogéneo en el fondo del tubo. Dilución final 1:64. 10.5.4 Cálculos hCG = Inverso de la dilución final x sensibilidad del reactivo (U/mL) x volumen orina/ 24 hrs. = UI/24 horas. 10.6 Disposición de residuos. - Las muestras de orina deben depositarse en el sanitario. - Las torundas, guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del área de trabajo deben desecharse en la basura municipal. - Los tubos que contengan mezclas reactivas: muestra biológica + reactivos, así como las puntas de la micropipeta, se depositarán en los contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin. - Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse en los botes ubicados fuera del laboratorio. 10.7 Orientaciones para la elaboración del reporte En el cuaderno de prácticas deberán anotarse los datos para calcular la concentración de hCG en la muestra. Analizar: cuidados en la determinación, dificultades en la lectura y especificidad en relación a otras técnicas de cuantificación. 10.8 Referencias − Saavedra, M.S.; Filguerira, E.E.; Pessacq, M.T. et al. (2004). Formas moleculares de gonadotrofina coriónica humana (hCG). Impacto en su medición. RAEM. 41(1):27-45. − Instructivo para cuantificación de hCG por inhibición de la hemoaglutinación. Lafon. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 74 Anexo A Método para la obtención de sangre venosa por sistema de tubo al vacío A.1 Lavarse correctamente las manos con jabón líquido (preferentemente) y agua. A.2 Seleccionar e identificar la vena para realizar la punción: A.2.1 Vena media basílica A.2.2 Vena cefálica A.3 Enroscar la aguja al adaptador del sistema al vacío. A.4 Preparar el tubo indicado para cada caso: A.4.1 Tubo con tapón rojo o tapón dorado: Sangre coagulada para obtención de suero A.4.2 Tubo con tapón lila: Sangre entera anticoagulada con EDTA A.5 Ligar el brazo a 5 cm aproximadamente del lugar de punción. A.6 Realizar asepsia con una torunda impregnada con alcohol. A.7 Introducir la aguja de punción en la vena con una inclinación de 30º C aproximadamente. A.8 Colocar el tubo, verificar que la sangre comienza a salir y retirar la ligadura. A.9 Dejar llenar el tubo y retirarlo, sosteniendo con firmeza el adaptador. A.10 Retirar la aguja y presionar con una torunda impregnada con alcohol el sitio de la punción. A.11 En caso de que el tubo sea para la obtención de sangre anticoagulada (tapón lila), invertirlo suavemente 15 veces, para homogenizarla con el anticoagulante. A.12 Si se trata del tubo de tapón rojo o dorado, debe colocarse durante 10 minutos en baño de agua a 37º C para coagular la muestra; posteriormente se le quita el tapón cubriéndose con papel parafilm y se centrifuga a 2500 rpm/10 min para separar el suero. A.13 Disponer los residuos generados de la siguiente forma A.13.1 Depositar la aguja de punción en el contenedor rojo rígido A.13.2 Depositar las torundas con alcohol y los tapones de la aguja en el bote de basura municipal. Manual de prácticas de laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales 75 Anexo B Indicaciones básicas para realizar las determinaciones colorimétricas B.1 Rotular tres tubos de ensayo, cada uno como blanco, estándar y muestra con un marcador de tinta indeleble, no se recomienda utilizar cinta adhesiva tipo masking tape ya que en el momento de la incubación puede desprenderse del tubo y ocasionar confusión. B.2 El tubo marcado como “blanco” lo realizará el primer equipo que lea en el espectrofotómetro y el tubo marcado como “estándar” será preparado por tres personas del grupo. B.3 Los tubos se preparan e incuban de acuerdo a la tabla que viene en el manual de uso (inserto) del reactivo con que se cuente en el momento de la práctica, siguiendo el orden y las cantidades que se indiquen. Esto se debe a que la forma de preparar los tubos puede cambiar de acuerdo a la marca del reactivo. B.4 Ajustar el espectrofotómetro a la longitud de onda indicada en el fundamento y llevar a cero de absorbancia con el tubo blanco. B.5 Leer la absorbancia de los 2 tubos restantes (estándar y problema) y realizar el cálculo correspondiente, de acuerdo a la siguiente fórmula. 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 𝒑𝒓𝒐𝒃𝒍𝒆𝒎𝒂 = (𝑨𝒃𝒔. 𝒕𝒖𝒃𝒐 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂)(𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒔𝒕𝒂𝒏𝒅𝒂𝒓) 𝑨𝒃𝒔. 𝑻𝒖𝒃𝒐 𝒆𝒔𝒕𝒂𝒏𝒅𝒂𝒓 La concentración del estándar se proporcionará en el momento de la realización de la práctica pues depende de la determinación a realizar y la marca del reactivo que se vaya a utilizar.
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