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Aula 1 – Conceito de Gene
Introdução
Objectivos da Biologia Molecular
A Biologia Molecular é o estudo da
Biologia a nível molecular, com especial foco no
estudo da estrutura e função do material
genético e seus produtos de expressão, as
proteínas. Mais concretamente, investiga as
interacções entre os diversos sistemas celulares,
incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese
proteica.
Um dos objectivos da Biologia Molecular é compreender como a
informação é armazenada nos genes (aspectos estruturais) e como essa
informação é usada pelas células (aspectos funcionais).
Evolução do Conceito de Informação Hereditária
Os traços hereditários são definidos pela sua capacidade de passar
duma geração para a outra duma forma previsível.
Cronologia do DNA
Gregor Mendel (1865) – descreve as leis
básicas da hereditariedade a partir de um estudo
sobre sucessivas gerações de ervilhas verdes e
amarelas. Concluiu que existiam elementos
autónomos que controlavam as características
hereditárias.
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Os factores hereditários são transmitidos inalterados de geração em
geração – experiências com ervilheiras-de-cheiro.
Johann Friedrich Miescher (1869) – Extrai o que se tornará
conhecido como DNA do núcleo de glóbulos brancos e esperma.
Francis Galton (1876) – Propõe a "lei da hereditariedade ancestral" –
cada progenitor contribuía com ¼ dos traço herdados e os avós contribuíam
com o resto. Foi o pai da eugenia (Definição: estudo dos agentes sob o
controle social que podem melhorar ou empobrecer as qualidades raciais das
futuras gerações seja física ou mentalmente).
Walther Flemming (1878) – Descobriu no núcleo
das células, a cromatina, e observou durante a mitose a
divisão desta substância em filamentos mais tarde
denominados cromossomas.
Theodor Boveri (1888) – Sugere pela primeira vez que os
cromossomas tenham um papel principal na hereditariedade. Verifica que o
esperma e o óvulo contribuem com o mesmo número de cromossomas durante
a fertilização.
DeVries, Correns, Tschermak (1900) – Confirmam
independentemente as experiências de Mendel, sem terem conhecimento
prévio destas.
Sutton and Boveri (1903) – Propõem independentemente que os
factores hereditários se localizam nos cromossomas.
Bateson (1905) – Propõe o termo "Genética" para descrever o estudo
da hereditariedade.
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Garrod (1908) – Confirma a hereditariedade recessiva na doença alfa-
fenilcetonuria.
Johannsen (1909) – Propõe que os factores hereditários de Mendel
sejam designados “genes”.
Morgan (1910) – Inicia os seus trabalhoscom a mosca da fruta
Drosophila melanogaster. Conclui que um gene está sempre num determinado
local dum dado cromossoma e introduz assim, o conceito de "mapeamento
genético".
1920 – Os cromossomas são constituídos por DNA e proteínas.
Griffith (1928) – Propõe o conceito de princípio transformante, em
experiências com Streptococcus pneumoniae (S e R).
Experiência de Griffith:
Griffith usou duas estirpes que são distinguíveis pela
aparência das suas colónias quando crescidas em culturas laboratoriais. Numa
das estirpes, um tipo virulento normal, as células estão cobertas por uma
cápsula, dando às colónias uma aparência lisa (smooth): daí chamar-se S a
esta estirpe. Na outra estirpe, um tipo mutante, não virulento, que cresce nos
ratos mas não é letal, a cápsula está ausente, dando a estas colónias um
aspecto rugoso (rough), sendo esta estirpe chamada de R.
Griffith matou algumas células virulentas, fervendo-as, e
injectou-as nos ratos. Os ratos sobreviveram, mostrando que as carcaças das
células não causam a morte. No entanto, ratos injectados com uma mistura de
células virulentas mortas pelo calor e células não virulentas vivas morreram.
Mais surpreendente ainda: células vivas podiam ser recuperadas dos ratos
mortos; estas células davam colónias lisas e eram virulentas após injecção
subsequente. De alguma forma, os destroços das células S mortas,
converteram as células R vivas a células S vivas – princípio transformante.
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Caspersson e Schultz (1938) – Supunham que a informação
hereditária (genes) estava contida nas proteínas dos cromossomas.
Avery (1944) – O princípio transformanteé oácido
desoxirribonucleicoou DNA.
Experiência de Avery, MacLeod e McCarty:
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Beadle e Ephrussi (1945) – Propõem que cada gene controla a
actividade dum único enzima.
Chargaff (1949) – Em todos os organismos, é mantida a igualdade:
A/T = G/C, o que implica: (A+G) = (T+C), ou seja: [A]=[T] e [G]=[C].
Chase e Hershey (1952) – Confirmam que o DNA é o material
genético, convencendo finalmente a comunidade científica.
Experiência de Chase e Hershey:
Levaram a cabo experiências com o fago T2:
consiste unicamente numa cápside que contém o material genético, e infecta
uma bactéria quando adere à sua membrana externa, injectando o material
genético. Como consequência, o sistema genético da bactéria reproduz o vírus.
Numa primeira experiência, marcaram o DNA dos
fagos com o isótopo radioactivo fósforo-32 (P-32). Deixaram que os fagos da
cultura bacteriana infectassem as bactérias E.coli e posteriormente retiraram
as coberturas proteicas das células infectadas mediante centrifugação.
Descobriram que o indicador radioactivo era visível somente nas células
bacterianas e não nas coberturas proteicas.
Numa segunda experiência,
marcaram os fagos com o isótopo
enxofre-35 (S-35). O aminoácidos
cisteína e metionina contêm enxofre,
diferentemente do DNA.
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Depois da separação, descobriu-se que
o indicador estava presente nas coberturas
proteicas, mas não nas bactérias infectadas.
Com isto confirmou-se que é o material
genético o que infecta as bactérias.
Rosalind Franklin e Maurice Wilkins (1950s) – Uso da difracção de
raios X na análise de fibras de DNA - as moléculas são helicoidais com dois
tipos de periodicidade.
Watson e Crick (1953) – Propõem a estrutura do DNA em dupla hélice
e um mecanismo para a sua replicação.
1960 – Descoberta do RNA mensageiro (mRNA).
Jacob e Monod (1961) – Teoria da regulação génica.
Nirenberg (1961) – Descobre o 1º tripleto originando a descoberta do
código genético.
Gilbert e Sanger (1977) – Técnica de sequenciação do DNA.
Hood ( 1986) – Construiu o primeiro sequenciador automático.
1986 - Início do projecto de sequenciação Genoma Humano.
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O Gene
Gene
Unidade de informação biológica (de hereditariedade). A informação
genética serve de base para processos bioquímicos.
O gene é a sequência de ácidos nucleicos que transporta a informação
para uma dada proteína ou moléculade RNA com actividade funcional.
Há genes que codificam somente RNA.
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Actividade dos Genes
1. Genes Constitutivos (“housekeeping”) – encontram-se sempre
em actividade, devido às suas proteínas serem
permanentemente necessárias às células.
2. Genes Indutíveis – genes que permanecem silenciados até a
célula ser exposta a determinado estímulo que induz a sua
expressão.
3. Pseudogenes – genes homólogos a outros genes, mas que não
são expressos – não “funcionam”
Organização Genómica
1. Genes Descontínuos (Split genes) – a informação biológica
contida em alguns genes (de Eucariotas) é descontínua,
encontrando-se separada por sequências intervenientes ou
intrões de DNA.
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2. Operão – cluster de genes codificantes para uma série de
proteínas (enzimas) que pertencem à mesma via metabólica.
Cluster: agrupamento de células da mesma família, mesmo
sendo codificados por genes diferentes (ex: família das globulinas – α, β,
γ-globulinas.
3. Famílias multigénicas – clusters de genes relacionados entre
si, sendo as respectivas sequências semelhantes ou iguais.
Organização Genómica em diferentes espécies
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Aula 2 – Natureza do Material Gene tico
Material Genético
Ácidos Nucleicos
1. Contém informação acerca da estrutura das proteínas (DNA);
2. Participam na selecção e ligação dos aminoácidos necessários
para formar as proteínas (RNA);
3. Formam-se através de ligações fosfodiéster entre nucleótidos
sucessivos;
4. Para participar nessas ligações, na posição 3’ tem de haver –
OH. A formação desta ligação dá-se de 5’ para 3’.
Dogma central da Biologia Molecular:
foi descrito em 1958 por Francis Crick na tentativa de relacionar o DNA, o RNA
e as proteínas. Diz que o DNA pode replicar-se e dar origem a novas moléculas
de DNA, pode ainda ser transcrito em RNA, e este por sua vez traduz o código
genético em proteínas. No entanto, algumas descobertas posteriores não
coincidiram com este Dogma:
O RNA pode sofrer replicação em alguns vírus e plantas
O RNA viral, através de uma enzima denominada transcriptase
reversa, pode ser transcrito em DNA
O DNA pode directamente traduzir proteínas específicas sem
passar pelo processo de transcrição, porém o processo ainda
não está bem claro
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Código Genético:
Nucleótido:
Diferentes pentoses:
Ribose – Tem o grupo –OH na extremidade 2’
Desoxirribose – em vez do grupo –OH na extremidade 2’, tem um H
Bases azotadas – dão especificidade às moléculas
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Formação da
dupla hélice
Esqueleto
hidrófilo
Desoxirriboses e
fosfatos virados
para o exterior
Interior
hidrófobo
Bases viradas
para o interior
O emparelhamento
origina um minor groove
e um major groove (este
ideal para a ligação das
proteinas)
Há emparelhamento
específico A-T e C-G
Estrutura das bases azotadas:
DNA
A estrutura tridimensional do DNA – a dupla hélice – surge a partir das
características químicas e estruturais das suas duas cadeias polinucleotídicas.
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As duas cadeias polinucleotídicas são
complementares e anti-paralelas (dá estabilidade).
A estrutura da dupla hélice é estabilizada
por ligações de hidrogénio, forças de Van der Waals
e interacções dipolo-dipolo.
Propriedades do DNA:
Desnaturação e Annealing (Renaturação)
Desnaturação:
Separação reversível das cadeias
Quebra das ligações de hidrogénio
Ligações covalentes não são desfeitas
Renaturação:
Remoção das condições desnaturantes
DNA aquecido – arrefecimento
Restabelecimento de pH ~7,0
Formação de novas ligações de hidrogénio
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Conteúdo em GC
O aumento do conteúdo em GC aumento o valor de Tm
(temperatura à qual metade do DNA se encontra desnaturado).
Superenrolamentos (Supercoiling)
o Ocorre só em DNA “fechado” sem pontas livres/soltas
o O DNA “fechado” pode ser circular ou linear
o As pontas não têm liberdade rotacional
o Corresponde ao sobre enrolamento da dupla hélice de
DNA como resultado de uma tensão estrutural
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DNA torcido
na direcção da
hélice
superenrolamento
positivo
bases mais firmes
na direcção oposta
à da hélice
superenrolamento
negativo
bases mais
"frouxas"
O DNA pode ser torcido num processo denominado superenrolamento.
No estado relaxado do DNA, uma fita normalmente dá uma volta completa ao
eixo da dupla hélice a cada 10,4 pares de base, mas se o DNA está torcido, as
cadeias ficam mais ou menos enroladas.
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Na natureza, o DNA apresenta um ligeiro superenrolamento negativo
que é causado pela acção da enzima topoisomerase. Estes enzimas também
são necessárias para aliviar o stress de torção causado no DNA durante os
processos de transcrição e replicação.
Aula 3 – Empacotamento do Material Gene tico
Eucariotas VS Procariotas
Eucariotas
Nos eucariotas as células têm compartimentos separados por
membranas, como o núcleo e o mitocôndrio. O genoma fica restringido ao
núcleo.
Procariotas
Nos procariotas, não existem compartimentos internos. O genoma não
está num compartimento específico.
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Empacotamento do Material Genético
Empacotamento em Vírus
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Empacotamento em Procariotas
Nos procariotas, o genoma é normalmente constituído por um só
cromossoma circular.
Logo, o DNA enrolado aleatoriamente tem um volume 1000x superior
ao volume da célula. Repulsão entre cargas negativas dos fosfatos.
Nos Procariotas, o DNA acumula-se no nucleóide.
Quando ocorre a lise bacteriana,as fibras de DNA são libertadas sob a
forma de loops agarrados à membrana da célula.
Empacotamento em Eucariotas
O empacotamento do material genético denomina-se cromatina, nos
eucariotas.
Dá-se o nome de cromatina ao complexo de DNA e proteínas (que
juntas denomina-se cromossoma) que se encontra dentro do núcleo celular nas
células eucariotas. As principais proteínas da cromatina são as histonas.
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Numa célula eucariota, quase todo o DNA está compactado na
cromatina. O DNA é "empacotado" na cromatina para diminuir o seu tamanho e
para permitir maior controle por parte da célula de tais genes.
Grande parte da cromatina é localizada na periferia do núcleo,
possivelmente pelo fato de uma das principais proteínas associadas com a
heterocromatina ligar-se a uma proteína da membrana nuclear interna.
Conhecem-se dois tipos de cromatina:
Eucromatina – consiste em DNA activo, ou seja, que pode-se
expressar como proteínas e enzimas. O DNA está menos empacotado.
Heterocromatina – consiste em DNA
inactivo e que parece ter funções estruturais durante o
ciclo celular. O DNA está altamente empacotado, o que
não permite o acesso a enzimas como os RNA e DNA
polimerases, por isso diz-se que a heterocromatina é
inactiva.
Estrutura da cromatina
A fibra de 10 nm
A fibra de 10 nm, num estado parcialmente
"desenrolado", consiste num "rosário" em que as
"contas" são os nucleossomas (baixa concentração
salina).
A fibra de 30 nm
A fibra de 30 nm apresenta uma
estrutura "enrolada" – Condições fisiológicas.
Ampliação a 10 nm.
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A descoberta do Nucleossoma
Nucleossoma
O nucleossoma é o nome dado à unidade fundamental da cromatina
e consiste numa unidade de DNA, dividida em duas espirais, que se enrolam
em torno de um disco proteico, constituído por quatro pares de proteínas
chamadas histonas.
O nuclease de micrococcus hidrolisa, inicialmente
(digestão parcial), entre os nucleossomas: nos mono-
nucleossomas, os fragmentos de DNA têm ~200 pb.
Aumentando o tempo de digestão pelo nuclease de
micrococcus o tamanho das bandas de DNA vai diminuindo
sucessivamente, em passos discretos: 200, 165 e 146 pb.
Estrutura cristalina do nucleossoma
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Sequências de DNA que ficam em voltas diferentes do nucleossoma
podem ficar próximas.
Propriedades das histonas
Robert Kornberg estabeleceu que os nucleossomas são constituídos
por partes equimolares de todas as histonas, à excepção da H1.
Proteínas não-histónicas (NHPs) – todas e quaisquer proteínas
associadas à cromatina, incluindo as que possuem funções de expressão
genética (topoisomerases, RNA polimerases, etc.) ou condensação
(condensinas, coesinas, etc.).
Proteínas HMG (“high mobility group”) – constituem um grupo bem
definido das NHPs, com elevado número de resíduos polares (função
estrutural).
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Função das histonas
Histona H1 – é necessária para que os complexos histona-DNA (a H1
liga-se externamente ao centro do nucleossoma) formem uma fibra de 30nm de
espessura, enrolando assim o DNA de uma forma ainda mais eficaz.
Histonas H2A, H2B, H3 e H4 – As histonas H3 e H4 apresentam
sequências idênticas em organismos distintos, sugerindo que desempenham
funções idênticas em todos os eucariotas.
Os tipos H2A e H2B possuem
também sequências idênticas, com
algumas variações específicas nas
espécies. Duas histonas de cada
classe (H2A,H2B, H3 e H4) agregam-
se para formar um nucleossoma,
juntamente com DNA, o chamado
octâmero.
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Nucleossomas e Condensação da Cromatina
http://www.youtube.com/watch?v=Pj9cdVeIntY
Aula 4 – A ativaça o da cromatina
Nucleossoma: permite que o DNA se encontre estático. No entanto, a
sua estrutura tem de ser flexível para que possam ocorrer processos de
transcrição (de mRNA) e de replicação (por exemplo na divisão celular).
Até que ponto é mantida a estrutura nucleossómica da cromatina
durante a replicação e a transcrição?
São visíveis nucleossomas em ambas as
fibras de cromatina recém-replicada.
A estrutura nucleossómica da cromatina
deve desfazer-se durante a duplicação do DNA,
mas é rapidamente reformada em ambas as
hélices da cromatina recém-replicada. Como?
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Existem dois modelos para explicar o que acontece aos nucleossomas
pré-existentes:
Modelo dispersivo: cada molécula-filha é formada por porções da
molécula inicial e por regiões sintetizadas de novo, a partir dos nucleótidos
presentes na célula.
Modelo conservativo: a molécula de DNA progenitora mantém-se
íntegra, servindo apenas de molde para a formação da molécula-filha, a qual
seria formada por duas novas cadeias de nucleótidos.
Como se formam os novos nucleossomas?
In vitro o DNA pode interatuar diretamente com
um octâmero de histonas, ou pode interatuar com o
tetrâmero H32-H42, ao que se segue a adição de dois
dímeros H2A E H2B.
In vivo a integridade dos nucleossomas durante
a replicação pode ser testada por experiencias de
cross-linking das histonas, isto faz-se atraves de:
1. Crescer células na presença de
aminoácidos “pesados” (por exemplo, marcados
radioativamente)
2. Posteriormente deixar a replicação do
DNA prosseguir em presença de aminoácidos “normais”;
3. Adicionar agentes de cross-linking e separar os nucleossomas
por gradientes de densidade (os octâmeros iniciais têm aminoácidos pesados e
por isso são mais densos do que os “novos”).
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Se ocorrer conservação dos nucleossomas o que se espera é obter
uma banda numa zona de maior densidade, que corresponde aos octâmeros
originais, e uma banda numa zona de menor densidade, que corresponde aos
nucleossomas “novos”, como é visível na figura correspondente à hipótese A.
No entanto não é o que se obtém, o que se obtém é uma banda de
densidade intermédia entre a densidade dos nucleossomas novos e antigos.
Isto indica que as histonas se separam e voltam depois a ligar-se, sendo o
octâmero formado tanto por histonas novas como pelas histonas “originais”, ou
seja, não há conservação do nucleossoma inteiro. Isto é visível na figura
correspondente à hipótese B.
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Formação in vivo dos novos nucleossomas
Durante a replicação, o garfo replicativo
desloca os octâmeros de histonas que se
dissociam em tetrâmeros – 2(H3+H4) – e em
dímeros – H2A e H2B. Estes tetrâmeros e dímeros
antigos misturam-se que outros tetrâmeros e
dímeros novos. A ligação dashistonas ao DNA
inicia-se por ligação dos tetrâmeros 2(H3+H4) –
ligação assistida por CAF-1, e depois é que ocorre
a ligação dos dímeros H2A e H2B para formar o
octâmero. A montagem dos octâmeros é aleatória quanto ao facto de ser uma
histona antiga ou nova. Quanto à transcrição é possível que ocorra da mesma
forma.
Para ajudar à assemblagem dos nucleossomas são necessárias
proteínas acessórias:
CAF-1 e ASF1 são proteínas de assemblagem de histonas
associadas à maquinaria de replicação;
HIRA e a variante histónica H3.3 são usadas para assemblagem
independente da replicação.
Nucleossomas em fase
Os nucleossomas têm um posicionamento
(ou faseamento) pré-determinado?
O posicionamento dos nucleossomas
colocaria um local de restrição em posição única,
relativamente ao DNA linker, reconhecido pela
nuclease de micrococcus, que hidrolisa os
monómeros de DNA. O fragmento de restrição
tinha sempre o mesmo tamanho, pelo que se
obtém uma única banda no gel de eletroforese.
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Na ausência de posicionamento dos nucleossomas,
um dado local de restrição fica em todas as posições
possíveis em diferentes cópias do genoma. São produzidos
fragmentos de todos os tamanhos quando um enzima de
restrição hidrolisa num local especifico (vermelho) e a
nuclease micrococcal hidrolisa junto das junções entre
nucleossomas (verde).
Transcrição
O que acontece aos nucleossomas?
O RNA polimerase tem um tamanho maior do que o nucleossoma,
o que lhe dificulta seguir o DNA à volta deste.
Quando o DNA está associado aos nucleossomas, o RNA
polimerase e os fatores de transcrição não têm acesso ao DNA.
Quando o RNA polimerase e os fatores de transcrição estão
ligados ao DNA, os octâmeros de histonas (nucleossomas) não têm acesso ao
DNA.
Logo os nucleossomas têm de se dissociar para que os fatores de
transcrição e o RNA polimerase se possam ligar. Depois da transcrição, os
nucleossomas formam-se rapidamente.
A transcrição vai envolver o relaxamento e o desenrolamento do DNA
em certas regiões da cromatina – vai ocorrer portanto, uma alteração
conformacional do DNA.
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Histonas e ativação da cromatina
Experiência 1
Quando o DNA é exposto em simultâneo a
histonas e fatores basais de transcrição, as
histonas formam nucleossomas na TATA box
e bloqueiam o acesso aos fatores basais de
transcrição.
Experiência 2
Quando o DNA é exposto aos fatores basais
antes das histonas (passo 1), os fatores basais
associam-se à TATA box, deixando as
histonas de fora, quando posteriormente
adicionadas.
Experiência 3
Quando o DNA é exposto em
simultâneo a histonas, fatores basais e
ativadores, estes permitem a ligação
dos fatores à TATA box, bloqueando o
acesso das histonas.
Conclusões a retirar destas experiências
o Histonas e fatores basais de transcrição competem para o acesso
à TATA box. Em simultâneo, ‘ganham’ as histonas.
o As histonas podem, portanto, ajudar à repressão de genes.
o Para haver ativação dos genes, as histonas têm de ser removidas
da TATA box.
o As proteínas ativadoras podem desempenhar uma função de
disrupção do nucleossoma e ativação de transcrição dos genes.
o No interior da região codificante, o nucleossoma não inibe a
transcrição, embora possa abrandar a passagem do RNA polimerase.
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o Genes constitutivos (de housekeeping: ou seja, genes sempre
“ligados”) são normalmente desprovidos de nucleossomas na TATA box, ao
contrário dos genes indutíveis (ie, genes que so tem função em determinadas
alturas). Estas zonas sem nucleossomas só ocorrem quando o gene é ativo.
o Locais de hipersensibilidade ao DNase I
Os locais de hipersensibilidade são criados pela estrutura da cromatina
e variam de tecido para tecido (já que depende se o gene se encontra ativo ou
não). Pensa-se que estes locais resultam da ligação de proteínas de regulação
que excluem os nucleossomas. Existem de locais de hipersensibilidade ao
DNase I nas regiões que regulam a transcrição, nas origens de replicação de
genes ativos e nos centrómeros, ou seja, são desprovidos de nucleossomas
todos os locais onde a dupla hélice inicia uma função
Estes locais permitem a associação de proteínas não histónicas. São
zonas muito sensíveis a enzimas de restrição.
As localizações dos locais de hipersensibilidade podem ser
determinados utilizando o enzima DNase I:
1. O DNase I vai hidrolisar num local de
hipersensibilidade, já que é o local mais
exposto;
2. A molécula de DNA encontra-se
agora hidrolisada.
3. Hidrolisando com outro enzima de
restrição (local de hidrólise conhecido)
obtém-se um fragmento que numa ponta foi
hidrolisado pelo DNase I e noutra ponta foi
hidrolisado com o enzima de restrição.
4. Como se sabe onde o enzima de
restrição hidrolisa, através de uma
eletroforese sabe-se o tamanho do
fragmento em causa e, desta forma, onde
se encontrava o local de hipersensibilidade.
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o Os nucleossomas são deslocados e reassemblados durante a
transcrição
A maioria dos genes transcritos retêm uma
estrutura nucleossómica, apesar das alterações na
organização da cromatina durante a transcrição.
Alguns genes altamente transcritos parecem
ser casos excecionais, sendo desprovidos de
nucleossomas.
Experiências mostram que o nucleossoma
continua ligado ao DNA, mas numa posição
diferente. O nucleossoma deve voltar à sua
posição inicial apos o processo de transcrição
estar concluído.
Os promotores ativos estão marcados por locais
de hipersensibilidade ao DNase porque os octâmeros
de histonas foram deslocados do DNA.
Quando o RNA polimerase começa a síntese de
RNA, este encontra-se ligado aos locais onde o DNA
está livre de histonas. Para prosseguir durante a
elongação, as histonas e os octâmeros que se
encontram à frente têm de ser deslocados. No entanto,
para evitar que o DNA fique exposto (a enzimas de
restrição, por exemplo) é necessário que estas
proteínas se voltem a ligar rapidamente.
In vitro, para que ocorra transcrição é
necessário adicionar a proteína FACT (facilitates
chromatin transcription) que funciona como um factor
de elongação na transcrição. Esta proteína vai causar
a dissociação da subunidade H2A-H2B do octâmero,
ou seja, vai produzir “hexassomas”. Esta proteína pode
também estar envolvida na montagem dos octâmeros
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no final do processo de transcrição. Outros fatores são responsáveis pela
libertação dos dímero H3 e H4.
Acetilação de Histonas
A ativação da transcrição está associada com a
acetilação das histonas (adição de um grupo acetil –
COCH3) na região promotora.
As histonas possuem "caudas flexíveis" que podem
sair do nucleossoma e sofrer acetilações nos resíduos de
lisina.
Os enzimas que catalisam a acetilação das
histonas podem ser de dois tipos:
Histona acetiltransferases ou HATs – enzimas que promovem a
acetilação das histonas; que se dividem em:
o Grupo A – envolvidos na transcrição;
o Grupo B – atuam em histonassintetizadas de novo no
citosol, estão também envolvidos na formação dos
nucleossomas;
Histona diacetilase ou HDACs – enzimas que promovem a
desacetilação das histonas, provocam a condensação da cromatina
e a inibição da transcrição. A tricostatina e o ácido butírico são
inibidores dos HDACs, e no laboratório podem ser utilizados como
ativadores de genes normalmente inativos ou pouco expressos.
Os ativadores e os repressores dos genes
atuam via acetilação e desacetilação das caudas das
histonas
Demonstrou-se que fatores coativadores da
transcrição conhecidos possuíam atividade de histona
acetilases (HAT) atuando nas "caudas" das histonas.
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A alteração do promotor envolve alterações na cromatina
A remodelação de complexos pode facilitar a
ligação de complexos de acetiltransferases e vice
versa.
A metilação de histonas também pode
recrutar complexos que modificam cromatina.
Diferentes modificações e complexos
facilitam a elongação da transcrição.
A metilação do DNA e das histonas está
associada à cromatina inativada a longo prazo (e.g.,
genes silenciados)
A formação de heterocromatina é iniciada quando a
proteína RAP1 se liga ao DNA. SIR3/SIR4 ligam-se a
RAP1 e também às histonas H3/H4. O complexo vai
polimerizando ao longo da cromatina e pode ligar os
telómeros à matriz nuclear.
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Aula 5 – Auto perpetuaça o do DNA
Replicação Semi-Conservativa
Experiência de Meselson & Stahl
Meselson e Stahl, em 1958, realizaram experiências que tinham como
objectivo comprovar a hipótese semi-conservativa, trabalhando com a
marcação do DNA por incorporação de 15N.
Os cientistas imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotídicas de
uma molécula de DNA fossem marcadas, seria possível fazer uma previsão
sobre o destino dessas cadeias no decorrer das gerações seguintes.
Células de E.coli crescem em meio contendo apenas 15N (azoto
pesado – isótopo estável com 8 neutrões e 7 protões) durante várias gerações.
O DNA é extraído e centrifugado em gradiente de densidade.
As células são lavadas e passam a crescer em meio com 14N (azoto
normal – 7 neutrões e 7 protões).
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A replicação
O DNA replicado é visualizado sob a forma dum "olho" flanqueado pelo
DNA ainda não replicado.
O "olho replicativo" forma uma estrutura em θ (theta) na replicação
duma molécula de DNA circular.
O replicão
É a unidade de replicação, ou seja, a porção de DNA que é replicado
pela mesma origem de replicação (Ori) e "entra em acção" apenas uma vez por
ciclo celular. Uma vez iniciada a replicação, esta só pára quando todo o
genoma da célula tiver sido replicado.
Nos procariotas existe apenas um replicão, enquanto nos eucariotas
existe grande número de replicões que têm de entrar em acção quase em
simultâneo para todo o genoma ter sido replicado antes da divisão celular.
As regiões Ori são ricas em timina e adenina – a natureza destas
ligações é mais fraca que as de guanina e citosina, o que facilita a abertura da
cadeia dupla, e são reconhecidas por um par de enzimas, os helicases.
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Garfos Replicativos
Os garfos replicativos estão organizados em focino núcleo. A
replicação do DNA a partir dos garfos de replicação é bidireccional.
Em E. coli há um replicão: os términos
da replicação encontram-se no local de
encontro dos dois garfos replicativos.
Em Eucariotas há vários replicões por
cromossoma – há fusão de replicões.
Núcleo onde se vê todo o DNA
corado com iodeto de propídeo.
Núcleo marcado com um anticorpo anti-brometo
de desoxiuridina (BrdU) que identifica o DNA em
replicação
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Replicação em Círculos Rolantes
A origem inicia a replicação apenas numa das cadeias, produzindo
multímeros da sequência original em cadeia simples (replicação unidireccional).
Como exemplo pode ser a replicação do genoma de certos fagos
(como o fago M13).
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Replicação em D-loops
Há uma origem de replicação diferente em cada uma das duas cadeias
(L e H):
1. Replicação da cadeia H inicia-se num "D loop" (com primer de
RNA).
2. Replicação da cadeia L inicia-se quando origem L fica exposta
pela passagem do garfo replicativo do D-loop.
Exemplo: a replicação do DNA mitocondrial e no DNA dos
cloroplastos.
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O problema dos replicões lineares
PROBLEMAS:
Tem de ser usada uma estratégia especial para poder replicar a cadeia
de DNA com uma extremidade 5’ num replicão linear.
O DNA polimerase só funciona na direcção 5'-3' e precisa de uma
extremidade 3'-OH como "primer“.
SOLUÇÕES:
Conversão da molécula linear em circular (fagos T4 e λ)
Formação duma estrutura especial, e.g., hairpin (Paramecia)
Extremidades de comprimento variável (eucariotas)
Presença duma proteína que permite a iniciação da síntese na própria
extremidade (adenovírus, vírus de RNA da poliomielite)
Deslocação da cadeia: Um modo
de replicação do DNA de alguns
vírus que é iniciada separadamente
nas duas extremidades da molécula
e em que a nova cadeia de DNA
cresce por deslocação da cadeia
mãe (homóloga).
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Telómeros e Telomerase
Os extremos dos
cromossomas normais são constituídos
por estruturas denominadas telómeros
que impedem a união de cromossomas.
São estruturas constituídas por fileiras
repetitivas de proteínas e DNA não
codificante.
Os telómeros estão presentes principalmente em células eucarióticas,
visto que o DNA das células procarióticas forma cadeias circulares, logo não
tem locais de terminação, embora existam excepções como: bactérias com
DNA linear e que possuem telómeros.
Telomerase: enzima que tem como função adicionar sequências
específicas e repetitivas de DNA à extremidade 3' dos cromossomas, onde se
encontra o telómero. Este enzima é um transcriptase reversa, tendo na sua
estrutura um modelo em RNA que utiliza para sintetizar o DNA telomérico, em
eucariotas.
A proteína terminal de adenovírus liga-se à
extremidade 5’ do DNA, proporcionando um
grupo C-OH (citidina com 3’-OH) que o
polimerase usa para iniciar a síntese da
nova cadeia de DNA.
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Replicação e Ciclo Celular
O telomerase posiciona-se na cadeia
de DNA protuberante por emparelhamento de
bases com a sua molécula de RNA –
ribozima. Vai adicionando as bases de acordo
com o "molde". O ciclo recomeçade novo
após a adição duma unidade completa
(GGGTTG). O telomerase está activo nas
células germinais e estaminais onde é muito
importante manter as sequências
cromossómicas intactas.
Nas células somáticas, o
encurtamento do telómero dá um limite ao
número de divisões celulares possíveis e
conduz à senescência.
A senescência celular é importante na
supressão do cancro.
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Em E. coli, a replicação do cromossoma bacteriano demora 40
minutoa, seguido de divisão celular 20 minutos depois.
Quando a bactéria esta a crescer rapidamente, a replicação pode
decorrer mais rapidamente do que a divisão celular. O resultado podem ser
cromossomas bacterianos com múltiplos garfos replicativos.
Replicação em Eucariotas
Em bactérias, a segregação
cromossómica pode necessitar de
recombinação em locais específicos.
Um cromossoma circular replica-se
produzindo duas moléculas-filhas
monoméricas que segregam com as
células-filhas
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Aula 6 – Mecanismos de Replicaça o do DNA
DNA polimerase – enzima que catalisa a
síntese da nova cadeia polinucleotídica de DNA
O DNA é sintetizado pela adição de
nucleótidos à extremidade 3’-OH da cadeia
nascente, de forma que a nova cadeia cresce na
direção 5’ 3’. Os DNA polimerase necessitam de:
Uma cadeia molde;
Uma extremidade 3’-OH livre;
Nucleótidos
A separação das duas cadeias na extremidade livre (ou seja, no garfo
replicativo) cria forças de torsão crescentes e faz com que o DNA ainda não
separado fique mais enrolado. Para corrigir estas forças de torção existe um
família de enzimas, os topoisomerases:
Topoisomerase tipo I: enzimas que hidrolisam uma cadeia de DNA
(dando origem aos nicks)
Topoisomerase tipo II: enzimas que hidrolisam duas cadeias de DNA.
Mecanismo de ação do DNA topoisomerase I
A topoisomerase I introduz
um nick no DNA, permitindo a
rotação duma cadeia em torno da
outra, aliviando a força de torsão
que se acumula à frente do garfo
replicativo. O nick é transitório,
sendo religado imediatamente após
o topoisomerase I ter libertado a
outra cadeia.
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Algumas topoisomerases só reconhecem
superenrolamentos negativos e outras só reconhecem
superenrolamentos positivos. As topoisomerases dos
eucariotas são semelhantes, mas reconhecem
enrolamentos positivos ou negativos e ligam-se
covalentemente à cadeia de DNA que hidrolisam.
As topoisomerases são
responsáveis por separar os
cromossomas no final da replicação
em E. coli, através do processo de
decatenação (processo em que se
desligam duas moléculas de DNA que
se encontram interligadas, é o oposto
de catenação)
Replicação do DNA
1. Abertura da dupla hélice
A replicação requer uma helicase para separar as cadeias da dupla
hélice de DNA usando energia à custa da hidrólise de ATP.
As SSBPs ("single-stranded binding proteins") são necessárias
para manter separadas as duas cadeias simples
2. O Priming é necessário para o início da síntese de DNA
Todos os DNA polimerases requerem uma extremidade 3’-OH livre
para iniciar a síntese de DNA.
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3. Elongação e Topoisomerases
A estrutura antiparalela das duas cadeias de DNA constitui um
problema para a replicação. Enquanto o garfo de replicação avança, ambas as
cadeias filhas devem ser sintetizadas enquanto as cadeias mãe se encontram
expostas. No entanto o garfo replicativo avança no sentido 5’-3’ numa cadeia e
no sentido 3’-5’ noutra, e os ácidos nucleicos são sintetizados apenas na
direção 5’-3’. Este problema é resolvido sintetizando a cadeia 3’-5’ numa série
de pequenos fragmentos que são formados no sentido 5’-3’.
Na cadeia líder, a síntese de DNA procede de forma continua na
direção 5’-3’, enquanto molécula de DNA é “desenrolada”. Na cadeia atrasada,
(uma parte do DNA original tem de estar exposto) formam-se segmentos na
direção oposta à do garfo replicativo. Estes fragmentos, denominados,
fragmentos de Okazaki vão se juntando, formando uma cadeia atrasada
completa.
Síntese das cadeias líder e atrasada em E. coli:
a) Intervenção de DNA helicases (que separam as duas cadeias),
SSBPs ("single stranded binding proteins") que impedem o re-emparelhamento
do DNA e de topoisomerases
b) Síntese de primer de RNA (10-60 nt) pela primase
c) A síntese das duas cadeias é catalisada por um dímero assimétrico
da DNA polimerase III.
Replicação da cadeia atrasada
a) O primer de RNA (10-60 bases) é
sintetizado pela primase, baseado na cadeia-mãe de
DNA
b) A DNA polimerase sintetiza a nova cadeia
DNA a partir do 3’-OH do primer de RNA
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c) A polimerase remove o RNA a 5’ no final do fragmento de Okazaki
seguinte e preenche o espaço com DNA
d) A DNA ligase une dois fragmentos de Okazaki adjacentes e
terminados
4. Terminação
Em E.coli, a replicação termina numa zona de repetições de 20 bp
(zonas de terminação de replicação = "ter")
As duas moléculas de DNA resultantes estão interligadas – catenanos
A separação (decatenação) é feita pela topoisomerase IV.
Enzimas incluídos no modelo de síntese de DNA (E. coli)
Helicase: abre as cadeias da dupla hélice original
Single stranded BPs (SSB): impedem o reemparelhamento das
cadeias
Topoisomerase II: reduz a tensão na dupla hélice à frente do RF
Primase (RNA polimerase): inicia as novas cadeias de DNA
DNA polimerase III: é o principal enzima replicativo
DNA polimerase I: remove os primers de RNA
DNA ligase: liga os fragmentos de Okazaki na cadeia atrasada
Topoisomerase IV: faz a descatenação dos dois novos
cromossomas (circulares)
Assemblagem in vivo do DNA Polimerase III
O DNA polimerase é constituído por 10 proteínas:
Existem 2 copias do centro ativo. Cada centro ativo contém uma
subunidade α (que confere atividade ao DNA polimerase), uma subunidade ɛ
(que confere atividade de proofreading 3’-5’).
Existem 2 cópias da subunidade de dimerização, Ƭ, que ligam os
dois centros catalíticos
Existem 2 cópias de subunidade de processividade, β, que são
responsáveis por ligar os centros catalíticos às respetivas cadeias;
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O complexo γ é um grupo de 5 proteínas, “clamp loader”, que
posiciona as subunidades de processividade no DNA, formando um clamp à
sua volta. É responsável por adicionar um par de dímeros β a cada cadeia de
DNA.
Mecanismo de assemblagem:
1. O dímero β e o complexo γ
reconhecem o primer e formam um complexo
inicial. Nesta reação, o complexo γ hidrolisa o ATP
e transfere as subunidades β para o primer. O par
de subunidades β forma um clamp que se liga à
volta do DNA e assegura a processividade. A
hidrolise do ATP permite a ligação da subunidade β
ao DNA.
2. A ligação ao DNA altera a
conformação da subunidade β na ligação ao
complexo γ,aumentando a afinidade da subunidade
β para o centro ativo do polimerase. Esta alteração conformacional é o que vai
permitir que o centro ativo se ligue ao DNA.
3. O dímero τ liga-se ao centro ativo do polimerase promovendo a
dimerização através da ligação de dois centros ativos. O holoenzima é
assimétrico porque apenas tem um complexo γ.
Modelo dimérico do DNA polimerase
Enquanto uma subunidade
sintetiza a cadeia líder de forma contínua,
a outra subunidade vai sintetizando de
forma descontínua a cadeia atrasada,
iniciando e terminando os fragmentos de
Okazaki. O “clamp” associado à cadeia
atrasada dissocia-se e reassocia-se para
cada fragmento de Okazaki.
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Enzimas e fatores de replicação
DNA polimerases
DNA polimerase I: reparação de DNA; remove os primers de
RNA nos fragmentos de Okazaki e substitui-os por DNA
DNA polimerase II: reparação de DNA; função não muito bem
esclarecida
DNA polimerase III: sintetiza cadeias de DNA. Faz parte dum
grande complexo, o holoenzima do DNA polimerase III. Uma das
subunidades deste holoenzima é a subunidade β, que mantém
a polimerase III associada ao DNA.
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Aula 7 – A Transcriça o em Procariotas
O Ácido Ribonucleico (RNA)
O RNA desempenha as suas funções em cadeia simples
e a sua diversidade estrutural é muito superior à do DNA. As
principais funções do RNA são o armazenamento e
transmissão da informação genética e a catálise enzimática
(ribozimas).
O processo de síntese de RNA a partir da informação
armazenada de forma permanente no DNA chama-se
transcrição.
Na transcrição, um sistema enzimático complexo
converte a informação contida num segmento de DNA em
cadeia dupla numa cadeia de RNA cuja sequência de bases é
complementar a uma das cadeias de DNA.
O processo é semelhante para os três tipos de RNA: mRNA, tRNA e
rRNA.
Transcrição e Replicação
Semelhanças:
O mecanismo fundamental da reacção é semelhante;
A transcrição dá-se de 5’ → 3’;
Ambas necessitam dum molde para a síntese do DNA/RNA;
Os processos dividem-se em três fases: iniciação, elongação e
terminação.
Diferenças:
A transcrição é selectiva – apenas um gene ou um grupo
específico de genes é transcrito de cada vez;
Na transcrição, apenas uma das cadeias é transcrita;
A transcrição não necessita de um iniciador (primer);
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A iniciação da transcrição é complexa, dividindo-se em ligação
dos factores ao DNA e iniciação da síntese de RNA.
Unidade Transcricional
Uma unidade transcricional é uma porção de DNA transcrita numa
única molécula de RNA (transcrito primário), começando no promotor e
acabando no terminador.
A transcrição pelo RNA polimerase
A função do RNA polimerase é copiar uma das cadeias de DNA em
RNA.
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Cadeia Codificante e Cadeia Molde
As duas cadeias de DNA têm funções distintas na transcrição, só uma
serve de molde à síntese do RNA: cadeia molde.
A cadeia de DNA complementar à cadeia molde designa-se por cadeia
não molde ou cadeia codificante (má designação que traduz o facto de ser
idêntica à molécula de RNA sintetizada, excepto devido à presença de ribose e
uracilo).
A cadeia codificante de um dado gene pode estarem qualquer uma das
cadeias de DNA num cromossoma.
As sequências que regulam a transcrição são por convenção descritas
pela sequência na cadeia não-molde (por isso chamada "codificante").
A “bolha” Transcricional
Durante a transcrição, a
"bolha" transcricional é
mantida no interior do
RNA polimerase.
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As fases da transcrição:
1. Pré-iniciação – reconhecimento do DNA molde.
2. Iniciação – início da síntese da cadeia de RNA pela adição dos
primeiros 2-9 ribonucleótidos.
A síntese de RNA ocorre
na "Bolha" Transcricional.
O RNA polimerase não
necessita de primer. O primeiro
nucleótido fica intacto (sem
perda de pirofosfato).
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3. Elongação – aumento da cadeia de RNA na direcção 5’ → 3’
pela adição de ribonucleótido.
4. Terminação – libertação do polimerase e da cadeia de RNA
completa.
A transcrição em Procariotas
O alinhamento de múltiplos promotores evidencia a conservação de
nucleótidos em determinadas posições a montante do local de início da
transcrição.
O promotor é uma sequência específica no DNA à qual os RNA
polimerases se ligam.
O Promotor
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Mutações no promotor do operão Lac podem resultar quer no
aumento ou na diminuição da actividade de transcrição, consoante a
mutação se aproxima ou afasta da sequência canónica de consensus.
Promotores em Procariotas
Um promotor típico possui 3 componentes:
1. a sequência a –35;
2. a sequência a –10;
3. o início da transcrição (“startpoint”).
Uma das cadeias de DNA no promotor possui os pontos de contacto
para o RNA polimerase.
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O RNA polimerase de E.coli
Os RNA polimerases de bactérias, especialmente de Escherichia coli,
são os melhores caracterizados genética e bioquimicamente.
Em todas as bactérias, um único tipo de RNA polimerase é responsável
pela síntese de rRNA, mRNA e tRNA ao contrário dos eucariotas, onde o
rRNA, mRNA e tRNA são descritos, tipicamente, por diferentes RNA
polimerases: Pol I, II e III.
Holoenzima (“Enzima completo”) – forma do RNA polimerase que é
competente para iniciar a transcrição. Consiste nas cinco subunidades do
enzima core e no factor σ. A composição das suas subunidades está na figura
seguinte.
O "core" dos RNA polimerases bacterianas são complexos de ~400
kDa com múltiplas subunidades e com a estrutura geral α2ββ′ω.
As subunidades β e β′são as principais subunidades catalíticas.
O domínio CTD ("C-terminal domain") – é o domínio do RNA
polimerase que está envolvido na estimulação da transcrição por contacto com
as proteínas reguladoras.
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O Papel da Subunidade σ
A subunidade σ é primeiramente responsável pelo
reconhecimento do promotor.
Subunidades sigma distintas reconhecem diferentes
sequências de consensus.
Factor anti-sigma – Uma proteína que se liga a um factorsigma inibindo a sua capacidade de se ligar a promotores específicos.
Aminoácidos da subunidade σ contactam bases específicas na
cadeia não transcrita da sequência –10 do promotor.
A hélice da subunidade sigma determina a sua especificidade.
A subunidade α também contribui para o reconhecimento do
promotor.
A subunidade σ mais comum é a σ70.
A subunidade σ não possui centro activo para proofreading.
Os erros na transcrição são de 1 em 104-105 nucleótidos
incorporados. A correcção de um erro faz-se por reversão da actividade de
polimerase.
A subunidade σ dissocia-se do enzima logo após o
reconhecimento, ficando apenas o enzima core durante o resto da transcrição.
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O modelo para o movimento do enzima é sugerido pela sua estrutura
cristalográfica:
O DNA move-se através dum
canal no RNA polimerase e faz uma
curva acentuada no centro activo.
Alterações de conformação em
certos módulos flexíveis do enzima
controlam a entrada nucleótidos no
centro activo.
Complexos de Iniciação do RNA polimerase
O RNA polimerase liga-se ao
promotor, formando um complexo fechado
(o DNA está intacto).
O DNA desemparelha parcialmente
junto à região -10, formando um complexo
aberto.
A transcrição inicia-se levando a
uma alteração conformacional no
complexo.
Na presença do complexo ternário, a
iniciação é abortiva.
Passa-se à fase da elongação, com
a libertação da subunidade σ.
O reconhecimento de diferentes
promotores é feito mediante o uso de
diferentes subunidades σ.
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Posicionamento do RNA polimerase
Inicialmente, o RNA
polimerase contacta com
a região entre -55 e +20.
Quando a subunidade sigma se
dissocia, o enzima core contrai-se
até -30.
Quando o enzima se move alguns
pares de bases, torna-se mais
compactamente organizado no
complexo de elongação.
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Reconhecimento do Alvo pelo RNA polimerase
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Reciclagem da subunidade σ e do Enzima core
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Acção dos Enhancers
São sequências estimuladoras da
transcrição que podem acelerar a
conversão do complexo binário fechado
em complexo aberto.
Elongação da Transcrição
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Reinício da Transcrição
Um RNA polimerase parada pode reiniciar a transcrição por uma
reacção de hidrólise na extremidade 3’.
Terminação por Palindromas
Palindroma – tem a propriedade de poder ser lida tanto da direita para
a esquerda como da esquerda para a direita.
Exemplo:
5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5'
Este tipo de segmento é um palíndroma de DNA, que significa que
ambos os segmentos têm a mesma sequência de nucleótidos, mas com ordem
inversa.
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Os terminadores intrínsecos incluem
regiões palindromas de 7 a 20 pb.
A estrutura em "stem-and-loop" inclui
uma região rica em GC’s ("stem") e
outra com uma série de U’s.
Terminação Independente de Rho (ρ)
Os sinais independentes de ρ formam uma pequena região em "hairpin" e
possuem uma sequência de 3 A’s na cadeia molde junto da extremidade 3’ do
"hairpin".
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Terminação Dependente de Rho
(ρ)
1. O factor Rho, liga-se a um local rut ("rho utilization site");
2. O factor Rho persegue o RNA polimerase, ligado a este;
3. Quando o polimerase abranda (ou pára) num stem-and-loop, o factor
Rho, consegue "apanhá-lo”;
4. Rho induz a terminação desfazendo o híbrido DNA-RNA e todos os
componentes são libertados.
Transcrição e Tradução
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Anti-Terminação
Pode ser usado um mecanismo de anti-terminação para controlar a
transcrição. Os factores de anti-terminação atuam como subunidades do RNA
polimerase que ignoram (fazem o readthrough) os sinais de terminação.
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Aula 8 – A transcriça o em Eucariotas
Principais diferenças em relação à transcrição de procariotas
O processo é mais complexo, devido à estrutura nucleossómica do
DNA.
Existem 3 RNA polimerases diferentes no núcleo das células
eucarióticas: RNA polimerases I, II e III (para além da RNA polimerase
mitocondrial e, nas plantas, da RNA polimerase dos cloroplastos); nos
procariotas apenas existe um RNA polimerase com capacidade de
reconhecimento do promotor (subunidade α).
Cada um dos RNA polimerases nucleares não se liga diretamente ao
seu promotor respetivo mas sim a proteínas designadas fatores de transcrição
que, por sua vez, se ligam a sequências de DNA específicas que constituem
cada promotor.
Os mRNAs são mais estáveis e os processos de transcrição e
tradução são espacialmente e temporalmente separados (ou seja, a transcrição
ocorre no núcleo e a tradução ocorre no citoplasma).
Fatores auxiliares
Fatores Basais - são necessários ao início da transcrição em todos os
promotores. Formam um complexo com a RNA polimerase em torno do início
da transcrição (IT).
Fatores a Montante (“Upstream Factors”) – são proteínas que se ligam
ao DNA a montante do IT. São ubiquitários e a sua atividade não é regulada.
Fatores Indutíveis - atuam como os fatores a montante, mas possuem
atividade reguladora. Ligam-se a elementos de resposta.
Fator de Transcrição Qualquer proteína necessária para o início da
transcrição, mas que não seja parte integrante da RNA polimerase.
Enhancers Sequências que estimulam a transcrição, mas que se
situam a uma distância considerável do IT (a montante ou a jusante) e em
qualquer orientação.
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RNA polimerases
Transcrição pelo RNA polimerase I
A RNA Polimerase I usa um promotor bipartido:
Spacer não-transcrito – Uma região entre a unidade transcricional
num "cluster" de genes em tandem.
O promotor da RNA polimerase I consiste num promotor core e num
elemento a montante do promotor (UPE, "upstream promoter element").
O fator UBF1 enrola o DNA em torno duma estruturaproteica para
trazer o core e o UPE em proximidade.
Transcrição pelo RNA polimerase III
A RNA Polimerase III usa três tipos de promotores:
Promotores internos (tipo I e II) que têm curtas sequências de
consensus localizadas dentro da unidade transcricional e que induzem a
iniciação a ocorrer a uma distância fixa "upstream".
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Promotores upstream Contêm três curtas sequências de
consensos "upstream" do início da transcrição e às quais se ligam fatores de
transcrição.
Transcrição pelo tRNAs em levedura
A eficiência da transcrição depende do correto posicionamento de dois
nucleossomas a montante do gene do tRNA e da maquinaria de transcrição no
gene.
Transcrição pelo RNA polimerase II: complexo de iniciação
A RNA pol II requere sete fatores gerais de transcrição, ou GTFs
("general transcription factors") e ATP para iniciar a transcrição.
A ligação do TFIID à TATA box (ou Inr) é o primeiro passo da iniciação:
a TBP posiciona a RNA Pol II na TATA box.
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Iniciação de transcrição
Elementos "upstream" e os fatores que a eles se ligam aumentam a
frequência da iniciação
Papel do TFIIH
O TFIIH funciona como local de ancoragem de um complexo de
enzimas envolvidos na reparação do DNA
Mutações no "domínio XPD" do TFIIH são causadoras de
doenças
Fatores de iniciação do RNA polimerase II
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A TBP é um Fator Universal de Posicionamento
A TBP é a componente do fator de posicionamento
que é requerida para os três tipos de RNA polimerases se
ligarem ao seu promotor.
Para o RNA polimerase II é o fator TFIID, que
consiste na TBP mais aproximadamente 14 TAFs.
As três polimerases ligam-se via fatores de
compromisso.
Promotor do RNA polimerase II
Um promotor típico do RNA polimerase II consiste em dois tipos de
regiões:
1. Promotor core – que inclui a
TATA box, onde se ligam os fatores basais, e
situado perto do início da transcrição (IT).
2. Sequências a Montante – onde
se ligam os fatores a montante. Estas podem
incluir os elementos de resposta, onde se ligam os fatores indutíveis
(elementos reguladores), no caso dos genes indutíveis.
Função de Diferentes Regiões no Promotor
TATA box (TATAAAA) – situa-se a cerca de -30 nucleótidos do
início da transcrição. Quando mutada, altera-se o local de início da
transcrição.
CAAT box (GGCCAATCT) - a cerca de -75/-80 do IT; mutações
sugerem um papel na determinação da eficiência da transcrição, e não
na especificidade do promotor. Funciona em qualquer orientação.
GC box (GGGCGG) - a cerca de -90 do IT ocorre frequentemente
em múltiplas cópias e em qualquer orientação. Atua sobre os fatores
basais, determinando a frequência da transcrição.
Octâmero (ATTTTGCAT) - responsável por interações proteína-
proteína que determinam a eficiência da transcrição.
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Promotores vs. Enhancers
Enhancers
São sequências de DNA que atuam:
A distâncias geralmente grandes do início da transcrição. Esta
distância ao promotor é variável.
Em qualquer orientação.
Podem-se localizar a jusante do início da transcrição.
Promotores
Sequências de DNA que se encontram a uma distância (relativamente)
fixa e curta do início da transcrição.
O Aparelho Transcricional em Eucariotas
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Aula 9 – Regulaça o da Transcriça o em Procariotas
Porquê regular a Expressão dos Genes?
Procariotas
O gene 1 é um gene constitutivo (ou de “housekeeping”).
Os genes 2 e 3 são genes indutíveis, sendo activados consoante o tipo
de glícido presente no meio.
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Eucariotas
1. Genes de plantas que respondem à luz;
2. Hormonas que regulam a expressão génica;
3. Células especializadas expressam genes diferentes.
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Regulação Transcricional
Regulação Negativa
Na regulação negativa, um repressor liga-se ao operador evitando que
um gene seja expresso.
Exemplo: operões repressíveis que são controlados negativamente
pelo produto final da via biossintética a que pertencem.
Regulação Positiva
Na regulação positiva, é necessário um factor de transcrição ligar-se ao
promotor a fim de permitir que o RNA polimerase inicie a transcrição.
Exemplo: operões indutíveis que são controlados positivamente pelo
substrato da respectiva via metabólica.
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Um repressor pode evitar a iniciação pelo
RNA polimerase.
Factores de transcrição permitem que o
RNA polimerase se ligue ao promotor.
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Operão da Lactose
Operão indutível em procariotas, requerido para o transporte e o
metabolismo da lactose em Escherichia coli e outras bactérias.
O operão lac é regulado por diversos factores, em particular a
disponibilidade de glicose e lactose no meio extracelular.
A regulação genética do operão lac foi o primeiro mecanismo complexo
de regulação génica a ser elucidado e é um dos principais exemplos de
regulação genética em procariotas.
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Organização do Operão Lac
Regulação Alostérea do Operão Lac
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Regulação do operão Lac
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Repressão do Operão Lac pela Glucose
Quando existe glicose, que é preferencialmente usada, os genes
que codificam os enzimas envolvidos no catabolismo de outros glúcidos não
são expressos, ou seja, a glicose reprime o operão lac na presença do seu
indutor lactose.
A repressão pela glicose é mediada por um sistema positivo de
controlo, que está dependente dos níveis de cAMP. O enzima que converte em
ATP em cAMP é activado quando os níveis de glicose estão baixos, o cAMP
liga-se a uma proteína reguladora da transcrição, a CAP, que por sua vez se
liga à sua sequencia alvo (localizado antes do inicio do operão) e faz com que
a subunidade σ do RNA polimerase se ligue mais facilmente ao promotor.Apontamentos de Biologia Molecular, Licenciatura em Bioquímica
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CAP e RNA polimerase
CAP – “catabolite activator protein” é um activador
transcricional.
Duas moléculas de cAMP (AMP cíclico) ligam-se à CAP
com cooperatividade negativa e funcionam como efectores alostérios
aumentando a afinidade da proteína para o DNA.
CAP tem uma estrutura em hélice que lhe permite ligar-se
a sucessivas “major grooves” de DNA. Isto abre a molécula de DNA,
permitindo que o RNA polimerase se ligue e transcreva os genes
envolvidos no catabolismo da lactose. Assim, CAP aumenta a
expressão do operão lac, quando a lactose está presente, mas a
glicose não.
Repressão do Operão Lac
O repressor Lac é controlado
por uma pequena molécula indutora. Um
indutor pode funcionar convertendo uma
proteína repressora numa forma com baixa
afinidade para o operador.
O repressor tem 2 locais de
ligação: um para o operador do DNA e
outro para o indutor.
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Indutor gratuito – indutores que se assemelham a autênticos
indutores da transcrição, mas não são substratos para os enzimas induzidos.
Operão do Triptofano
A regulação da transcrição do operão do triptofano pode ser
generalizada para os restantes aminoácidos e é uma regulação por
repressão do produto final pois, ao contrário do operão da lactose que está
sempre silenciado na ausência do substrato, o operão do triptofano está
sempre activo, sendo reprimido apenas quando este aminoácido abunda na
célula.
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Mecanismo de Atenuação
A regulação por atenuação é exclusiva dos procariotas pois implica
que a transcrição e a tradução ocorram em simultâneo, o que não se verifica
em organismos eucariotas.
A atenuação da transcrição age impedindo o alongamento a partir de
determinados sítios, que não são mais do que sequências específicas.
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Aula 10 – Regulaça o da transcriça o em Eucariotas
A expressão dos genes em eucariotas é,
principalmente, controlada no início da
transcrição. Este controlo envolve mudanças
estruturais da cromatina na região do promotor,
acompanhado com a ligação do aparelho
transcricional basal ao promotor.
Os intrões são depois removidos do
mRNA transcrito. O RNA maduro migra depois do
núcleo para o citoplasma. Esta transição pode ser
especificamente controlada em células
embrionárias. A regulação dos fatores de
transcrição permite controlar um elevado número
de genes alvo.
Um gene é regulado por uma sequência promotora (e, por vezes um
ou mais enhancers) que compreende vários elementos em cis.
Cada um destes elementos é reconhecido por uma proteína
específica: elementos em trans (ou fatores de transcrição). O conjunto destes
elementos é indispensável para a RNA polimerase iniciar a sua atividade, em
conjunto com os fatores basais.
Os fatores de transcrição só se encontram presentes na sua forma
ativa sob condições em que o gene deve ser expresso. Na sua ausência, o
gene não é ativado por via desse fator.
Gene Humano da Metalotioneína
Um elemento que causa que um gene responda a um dado fator é
denominado elemento de resposta. Exemplos de elementos de resposta:
GRE – Glucocorticoid response element
MRE – Metal response element
TRE – TPA (tumour promoting agent) response element
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A região à qual os fatores se ligam não fica muito longe da região que
vão ativar. Podem localizar-se tanto nos promotores como nos enhancers. A
ligação do ativador ao elemento de resposta é necessária para que o RNA
polimerase inicie a transcrição. Um ativador pode apenas estar ativo em
determinadas condições e são essas condições que vão determinar quando o
gene vai ser expresso.
O gene da metalotioneína é um exemplo de como um gene pode ser
regulado por vários fatores. Este gene está ativo, mas é induzido por elevadas
concentrações de metais pesados (como o cádmio) ou por glucocorticoides.
A TATA e a GC box estão localizadas perto da região de
iniciação. Para a expressão basal são também necessários dois elementos
basais, BLE – basal level elements, que se encaixam na categoria de
enhancers. Estes elementos, embora perto do local de iniciação, podem ser
movidos para outro sitio sem perder a sua atividade.
Ativação da transcrição
Ativadores: determinam a frequência da transcrição.
Repressores: proteínas que inibem a expressão dum gene.
o Podem atuar evitando que ocorra a transcrição ligando-se
a um operador no DNA ou prevenindo a tradução ligando-
se ao RNA.
Epigenética: inclui alterações que influenciam o fenótipo sem
alteração do genótipo.
o Estas consistem em alterações nas propriedades da
célula que são herdadas, mas que não representam uma
alteração da informação genética.
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Vários Elementos – Um Gene
Cada acontecimento
regulador depende apenas da ligação
de um fator em trans no elemento em
cis correspondente.
Cada elemento regulador
(promotor ou enhancer) pode por si só
ativar o gene, independentemente dos
restantes.
Para um dado fator de
transcrição, o respetivo elemento em cis e a região ativada (promotor) situam-
se em locais diferentes, o que explica como diferentes regiões reguladoras, a
distâncias variáveis do promotor, possam funcionar independentemente.
Domínios Zinc Finger
Alguns aminoácidos ligam o ião zinco e formam um domínio
independente na proteína.
O ião zinco é ligado por aminoácidos
conservados de histidina e cisteína.
Os zinc finger são domínios comuns no DNA
que liga proteínas; os zinc fingers organizam-se
numa série de repetições tandem.
O C-terminal de cada finger forma hélices α enquanto o N-terminal
forma folhas β.
O Finger pode estar envolvido na ligação do
RNA e não do DNA ou pode não estar relacionado
com a ligação de nenhum ácido nucleico.
Os aminoácidos antes do primeiro zinc
finger determinam a sequência do DNA alvo; os que
se encontram antes do segundo controlam o
espaçamento entre os locais em que são reconhecidos por cada subunidade
de um dímero.
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A evidência de que o primeiro zinc
finger é que ligava o DNA veio da
experiência de trocar a especificidade da
sequência antes desse finger. O finger do
recetor de estrogénio (localizado antes do
primeiro finger) foi eliminado e substituído
pela sequencia do recetor de
glucocorticoide. A nova proteína passou a
apresentar especificidade para o GRE (o alvo do recetor do glucocorticoide) em
vez de apresentar para o ERE (o alvo do recetor de estrogénio).
Ativação da transcrição por hormonas esteróides
Uma hormona esteroide pode atravessar a membrana celular por
difusão simples. Dentro da célula, o
glucocorticoide liga-se ao seu recetor (alocalização destes recetores ainda não está
esclarecida, pensa-se que existem em equilíbrio
entre o núcleo e o citoplasma), o que converte a
proteína para a sua forma ativa que tem uma
elevada afinidade para o DNA, pelo que o
complexo hormona-recetor se encontra sempre
localizado no núcleo.
O recetor ativado reconhece uma sequência específica que identifica o
GRE. O GRE, normalmente, encontra-se localizado no enhancer, que se
encontra a alguns pares de bases do promotor. Quando o complexo hormona-
recetor se liga ao enhancer, o promotor mais perto é ativado e dando início à
transcrição.
A ativação do enhancer corresponde ao mecanismo geral pelo qual os
esteroides regulam alguns genes.
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Aula 11 – Processamento de RNAs: mRNAs de Eucariotas
Processamento do mRNA em Eucariotas
Nos procariotas, o mRNA está pronto a ser traduzido logo após a
transcrição. Já nos organismos eucariotas, o transcrito de pré-mRNA
sintetizado no núcleo ainda vai sofrer extensas modificações até poder ser
utilizado no processo de tradução.
O processamento de mRNA de eucariotas ocorre no núcleo e inclui:
Capping em 5’ – adição ao terminal 5’ de um nucleótido com
uma base modificada, 7-metil guanilato. É neste terminal que se vão ligar os
ribossomas para que se dê a tradução completa do mRNA;
Poliadenilação – adição de nucleótidos de adenina ao terminal 3’
e formação de uma cauda poli-A de comprimento variável (pode atingir 200-300
bases). Para além de regular mecanismos de tradução e estabilidade, esta
cauda tem ainda um papel protector na medida em que atrasa a digestão do
RNA pelo RNase, permitindo assim que a sua sequência codificante se
mantenha íntegra durante um período de tempo maior.
A poliadenilação não é um processo exclusivo dos
eucariotas, tendo-se vindo a verificar que também ocorre em
alguns mRNA’s de procariotas;
Splicing – remoção de intrões e colagem de exões – intrões são
sequências que não codificam para o mRNA final, em oposição ao exões, que
codificam informação para o mRNA maduro. Ocorre em grandes complexos, os
spliceossomas, formados por proteínas e pequenos RNA’s nucleares
(snRNA). Os snRNA’s reconhecem sequências nos locais de splicing do pré-
mRNA e catalisam a reacção de splicing. A maioria dos genes de eucariotas
contém múltiplos intrões pelo que é possível juntar exões em diferentes
combinações através de mecanismos de splicing alternativo.
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Estes mecanismos, muito importantes na regulação da expressão
genética, permitem ainda que intrões passem a ser considerados exões, não
sendo removidos e permitindo novas combinações.
Capping
O cap bloqueia a extremidade 5’ do mRNA e pode ser metilado em
várias posições.
1. Presente em todos os "caps" (posição 7 da guanina terminal).
Enzima: guanina 7-metiltransferase
2. Posição 2-O da base primeiro (da cadeia original). Enzima: 2’-O-
metiltransferase.
3. Em 10% dos casos, também há metilação na posição 2-O da
segunda base original: "CAP 2".
CAP 1
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O cap tem influência na eficiência da tradução.
Cap0 → uma só metilação na posição 7da guanina (pelo guanina-
7-metil-transferase).
Cap1 → a 1ª base transcrita (geralmente A ou G) pode também
estar metilada (pelo 2’-O-metil-transferase) no oxigénio 2’. Esta metilação
predomina nos mRNAs de eucariotas, à excepção dos unicelulares.
A adição dum grupo metilo no azoto N6do cap1pode ocorrer nos
Eucariotas superiores, se a base deste 2º nucleótido fôr a adenina.
Cap2 → a 2ª base transcritapode também apresentar metilação
no oxigénio 2’ → (10-15% dos mensageiros).
Podem ainda ocorrermetilações internasno mRNA (nas adeninas)
Poliadenilação
A sequência AAUAAA é
necessária para a clivagem e
poliadenilação da extremidade 3’.
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1. A poliadenilação inicia-se quando o complexo da RNA polimerase II
sintetiza o sinal AAUAAA na extremidade 3’ da molécula do mRNA precursor.
2. O CPSF liga-se ao sinal de consensos (AAUAAA) e forma um complexo
contendo os endonucleases CFI e CFII que clivam o transcrito a juzante do
sinal de poliadenilação, formando nova extremidade 3’. A PAP liga-se agora a
esta extremidade.
3. Os endonucleases dissociam-se e a nova extremidade 3’ é poliadenilada
pela actividade da PAP.
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A poliadenilação do mRNA:
Ocorre em 2/3 dos mRNAs de Eucariotas ausente nas histonas);
É um acontecimento precoce na biossíntese do mRNA: ~1 min
após a polimerase passar AAUAAA;
O tamanho da cauda é ~200 A;
A adição da cauda é catalisada pelo enzima poli(A) polimerase
(PAP). A sua actividade é distributiva (liga-se e dissocia-se para cada base
ligada), para a síntese dos primeiros ~20 A;
A actividade da PAP torna-se processiva (uma cadeia
polimerizada durante uma associação), para a síntese dos restantes ~200 A,
quando mediada pelo CPSF (cleavage poliadenylation specificity factor) e do
seu cofactor CstF, e em presença da PABP (poly(A) binding protein);
Para cada espécie de mRNA, apenas 70% possui cauda;
A presença da cauda poli(A) está relacionada com estabilidade e
com o transporte núcleo-citoplasma;
Principal consequência prática: isolamento de mRNA.
Alguns mensageiros (de Eucariotas) não possuem cauda poli(A).
Exemplo: mensageiros das histonas: a formação da sua extremidade
3’depende da estrutura secundária e do snRNA U7.
A formação da extremidade 3’ nos mRNAs das histonas depende dum
hairpin conservado e duma sequência que emparelha com o RNA U7.
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Os mRNAs eucariotas são modificados, processados e transportados
Splicing
O splicing depende apenas do reconhecimento de pares de junções de
splicing – as junções de splicing são lidas aos pares.
Todos os locais de splicing 5′ são funcionalmente equivalentes, assim
como todos os locais de splicing 3′.
Outras sequências adicionais conservadas, quer a 5′ quer a 3′ dos
locais de splicing, definem estes últimos como funcionais entre os numerosos
potenciais locais presentes no pré-mRNA.
Na figura seguinte mostra-se a remoção de 3 intrões por splicing
correto através do reconhecimento de pares de junções de splicing.
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O splicing nuclear decorre por duas reacções de esterificação.
O intrão é libertado como um "lariat" quando é clivado no seu local de
splice 3′ e os exões à esquerda e à direita são então ligados entre si.Apontamentos de Biologia Molecular, Licenciatura em Bioquímica
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O splicing do pré-mRNA decorre através da formação dum "Lariat".
A estrutura do Spliceossoma e as snRNPs
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O splicing ocorre no Núcleo com a participação das snRNPs
Splicing – consiste na remoção dos intrões do transcrito primário e
junção dos exões formando a sequência do RNA maduro.
snRNPS: small nuclear ribonucleoproteins (complexos de RNA e
proteína, constituintes do spliceossoma).
snRNP’s e snRNAs
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Composição do Spliceossoma
Comprometimento do pré-mRNA para a via de Splicing
A U1-snRNP inicia o splicing ligando-se ao local de splice 5′ por uma
interacção RNA – RNA.
Em organismos eucarióticos multicelulares, as proteínas SR
desempenham um papel essencial na formação do complexo E.
O complexo E (de "comprometimento") contém a U1-snRNP ligada ao
local de splice 5′ e a proteína U2AF (e outras) ligada à cauda de polipirimidinas
entre o "branch site" e o local de splice 3′.
Cinco snRNPs estão envolvidas
no splicing: U1, U2, U5, U4, e U6.
Conjuntamente com algumas
proteinas adicionais, as snRNPs
formam o spliceossoma.
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O emparelhamento dos splice sites 5’ e 3’ segue duas vias possíveis:
1. Definição do intrão, ou
2. Definição do exão
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Via de Assemblagem do Spliceossoma
Consensus em locais de Splicing
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Aula 12 – Processamento de RNAs de Eucariotas –II
Intrões e Mecanismos de Splicing
Existem quatro mecanismos principais de splicing:
Intrões "nucleares" GU-AG: genes nucleares de mRNA.
Intrões do Grupo I (GI): intrões de Protozoários. Ex.: genes
mitocondriais de fungos e levedura.
Intrões do Grupo II (GII): situam-se entre os intrões "GU-AG"
(formam lariats) e os GI (self-splicing). Ex.: genes mitocondriais.
Intrões de tRNAs de levedura: presentes no respetivo loop do
anticodão.
E ainda dois mecanismos adicionais:
Intrões do Grupo III (GIII): mecanismo diferente para genes de
organitos.
Intrões de arquibactérias: intrões presentes em Procariotas.
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Intrões do grupo I
Os intrões do grupo I levam a cabo "self-splicing" por
transesterificação.
Os únicos fatores necessários para o auto-splicing (ou "selfsplicing") in
vitro pelos intrões do grupo I são dois iões metálicos e um nucleótido de
guanosina.
Os genes para dois rRNAs têm uma
organização normal, sendo que são expressos
da mesma unidade de transcrição. O produto é
um RNA 35S que é precursor do small rRNA na
extremidade 5’, e um RNA 26S que é
precursor do large rRNA na extremidade 3’.
Nalgumas espécies a sequencia que
codifica para o 26S pode estar interrompida por
um pequeno intrão. Quando o precursor do 35S
é incubado in vitro, o splicing ocorre como uma
reação autónoma. O intrão é removido do precursor e acumula-se na forma
linear, que é depois transformado numa forma circular. O splicing do rRNA
percursor 35S de pode ser seguido por eletroforese em gel de agarose.
O splicing ocorre por duas
transesterificações, sem ser necessário qualquer
input de energia (ATP), mas só com um nucleótido
de guanina como cofator (equivalente ao A do
branch point nos intrões nucleares)
1. A extremidade 3′–OH do cofator de
guanosina ataca a extremidade 5′ do intrão na 1ª
transesterificação.
2. A extremidade 3′–OH gerada no fim do
primeiro exão ataca a junção entre o intrão e o 2º
exão na 2ª transesterificação.
3. O intrão é libertado como molécula linear
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que circulariza quando a sua extremidade 3′–OH ataca a ligação numa das
duas posições internas. Este intrão excisado tem atividade catalítica.
Os intrões do grupo I formam uma
estrutura secundária característica constituída por
9 regiões emparelhadas (duplexes): P1-P9.
As regiões "core" de P3, P4, P6, e P7
possuem atividade catalítica.
As regiões P4 e P7 são ambas formadas
por emparelhamento entre sequências de
consensus conservadas.
Uma sequência adjacente a P7 emparelha
com a sequência que contém o G reativo.
A estrutura do intrão do grupo I é conservada.
Semelhanças entre Splicing de Intrões de mRNAs Nucleares e
Intrões de Grupo II
1. O splicing de intrões de mRNAs nucleares e o splicing de intrões GII
involve a formação de estruturas secundárias em lariat.
2. As sequências de consensus são mais específicas nos intrões
nucleares (o splicing de grupo II involve sequências de consensus que, em
várias posições podem ser ocupadas por qualquer purina, R, ou por qualquer
pirimidina, Y)
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Splicing de Intrões grupo I e grupo II
Tal como o splicing de intrões nucleares, o splicing de intrões GI e GII
decorre por duas reações de trans-esterificação:
1. Um grupo –OH livre ataca a junção exão1-intrão.
2. O grupo –OH criado em 1. na extremidade do exão 1 ataca junção
intrãoexão
Splicing de Intrões de tRNAs (levedura)
Implica:
1. Atividade nucleásica que origina um intrão linear.
2. Atividade de ligação que junta covalentemente as duas metades da
molécula.
Não ocorre nenhuma sequência de consensus que possa ser
reconhecida pelos enzimas de splicing.
Todos os intrões possuem uma sequência complementar ao anticodão
do tRNA.
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Resumo das várias reações de splicing in vitro
Cis e Trans Splicing
Dois Tipos Básicos de Reações de Spicing:
1. Cis-Splicing: Reações intramoleculares (regra geral)
2. Trans-Splicing: Reações intermoleculares (raro, mas possível)
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Splicings alternativos
Diferentes modos de splicing alternativo podem originar diferentes
produtos proteicos a partir dum mesmo gene:
Editing de mRNAs
RNA Editing - altera a sequência dum RNA (mRNA), pela inserção de
novos nucleótidos, ou pela remoção dos já existentes.
Este processo foi descoberto em 1986 em estudos dos genes
mitocondriais de Trypanosoma brucei.
Este mecanismo,juntamente com o splicing contraria o dogma central
da Biologia Molecular, segundo o qual uma sequência de mRNA pode apenas
representar o que está codificado no DNA
Mecanismo
O RNA guia proporciona o molde (template) para a adição (mais
raramente, a deleção) de uridinas.
O RNA editing é catalizado no editossoma, em complexo que contém
atividades de:
Endonuclease
Exonuclease
Terminal uridiltransferase
RNA ligase.
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Aula 13 – O RNA mensageiro: mRNA
RNA mensageiro - Introdução
Apesar de ser o DNA que determina a sequencia de aminoácidos, não
o faz directamente, o que se prova pelo facto do DNA se localizar no núcleo e
síntese proteica se realizar no citoplasma, logo é preciso uma molécula que
transporte a informação para os ribossomas – mRNA.
O RNA mensageiro é originado tendo como molde o DNA num
processo denominado transcrição.
RNA mensageiro de Eucariotas e Procariotas
RNA de Eucariotas
mRNA de Eucariotas e Procariotas
Características dos mRNA de procariotas e Eucariotas:
3′ UTR (3′"untranslated region") – a sequência não traduzida a
juzante da região codificante dum mRNA.
5′ UTR (5′"untranslated region") – a sequência não traduzida a
montante da região codificante dum mRNA.
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Diferentes tipos de mRNA
1. mRNAs policistrónicos – típicos em procariotas e têm cerca de
3000 a 8000 nucleótidos.
2. mRNAs monocistrónicos – típicos em eucariotas e têm cerca
de 150 a 14000 nucleótidos.
Cistrão – unidade genética que preenche uma função única, que
consiste em servir de modelo para a síntese de uma só cadeia polipeptídica.
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3. mRNAs multicistrónicos – tem-se como exemplo os genes de
ubiquitina em Eucariotas.
As regiões codificantes (geralmente iguais) nos mRNAs multicistrónicos
sucedem-se sem interrupção por codões STOP e com um único início de
iniciação (pode ter 7 ou mais unidades). O resultado é uma poliproteína que
depois é processada por uma protease específica (modificação pós
traducional), originando cadeias individuais.
Tradução de mRNAs policistrónicos
1. Região intercistrónica longa (30-40 nucleótidos) – Se a região
intercistrónica for maior do que a área coberta pelo ribossoma, este dissocia-se
e reinicia a tradução independentemente no próximo cistrão.
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2. Região intercistrónica curta (mín: -1, 1 ou 2 nucleótidos) – Se
a região intercistrónica for menor do que a área coberta pelo ribossoma, este
pode fazer leitura das sequências de iniciação e terminação simultaneamente.
Assim, a tradução de cistrões adjacentes pode ocorrer continuamente, isto é,
sem a dissociação do ribossoma.
Os mRNA são instáveis
A instabilidade dos mRNA é devida à acção dos ribonucleases. Os
ribonucleases diferem na sua preferência de substratos e modo de ataque:
Endoribonuclease – é um ribonuclease que cliva um RNA num (ou
mais) local interno.
Exoribonuclease – é um ribonuclease que remove os
ribonucleótidos terminais dum RNA.
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Degradação do mRNA
Em Procariotas
Em Levedura
A degradação de mRNAs em levedura requer:
1. Desadenilação: remoção da cauda poli-A 3’ (a PABP
protege contra o decapping 5’: com a desadenilação este efeito é
abolido);
2. "Decapping" (remoção do "cap" a 5’)
3. Clivagem por um endonuclease.
A degradação de mRNAs em
Procariotas ocorre durante a tradução e:
Envolve vários enzimas;
Inicia-se pela remoção de
pirofosfato da extremidade 5′;
Os mRNAs monofosforilados são
depois degradados em ciclos de 2 passos:
1. Clivagem endonucleolítica
2. Digestão 3′ → 5′ dos
fragmentos resultantes
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4. Actividade exonucleolítica que degrada o mRNA:
a) exonuclease 5’→ 3’ XRN1,
b) ou 3’→ 5’ pelo "exosoma"– um complexo de exo- e
endonucleases
RNA mensageiro em Eucariotas
Os mRNAs eucarióticos existem sob a forma de mRNPs desde que
nascem até que morrem (desde a transcrição até a tradução) que confere aos
mRNAs uma maior estabilidade do que nos Procariotas.
Os mRNAs associam-se com uma população de proteínas que se
altera durante a sua maturação nuclear e vida no citoplasma.
Algumas proteínas das mRNP adquiridas no núcleo desempenham
funções no citoplasma.
Existe um elevado número de "RNA-binding proteins" (RBPs), a
maioria das quais permanece por caracterizar.
Diferentes mRNAs associam-se com conjuntos de distintos (mas com
alguma sobreposição) de proteínas reguladoras, originando os regulões de
RNA.
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Degradação do mRNA em Eucariotas
Muitos mRNAs instáveis têm uma sequência com várias repetições do
motivo AUUUA na região 3’UTR antes da cauda poli-A. Esta sequência chama-
se ARE – (AUUUA)n Rich Element.
A degradação de mRNAs em Eucariotas pode ser desencadeada por
um motivo ARE na região 3’UTR. Segue-se:
1) Remoção da cauda poli-A;
2) Degradação por endonucleases.
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A maioria dos mRNA eucarióticos é degradada por duas vias
dependentes da desadenilação.
As duas principais vias de decaimento do mRNA iniciam-se por
desadenilação catalisada por poli(A)-nucleases.
À desadenilação pode seguir-se:
1) O "decapping" (remoção do "cap") e digestão exonucleolítica 5′→3′;
2) Apenas digestão exonucleolítica 3′→5′.
Outras vias de degradação de mRNA Eucarióticos visam mRNAs específicos:
A degradação do mRNAs das histonas, sem cauda poli(A), inicia-se
pela adição duma cauda poli(U) na extremidade 3′;
A degradação de alguns mRNAs pode iniciar-se por clivagem
endonucleolítica específica de sequência ou de estrutura;
Um número desconhecido de mRNAs são marcados para
degradação ou repressão traducional por micro RNAs (miRNAs).
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Exemplos:
Degradação do mRNA da Ferritina
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Degradação de mRNAs Nucleares
Nonsense-Mediated Decay (NMD)
Mutações que dão origem a um codão STOP prematuro (= UAA, UAG
ou UGA: mutações nonsense) podem activar um sistema citoplasmático de
degradação de mRNAs não-funcionais: o NMD.
O NMD é dependente de:
1)Codão de terminação prematuro (PTC);
2) Elementos a juzante da mutação nonsense ("DSE -distal sequence
elements") que promovem a associação de nucleases.
RNAs nucleares aberrantes são identificados e destruídos por sistema
de vigilânciado RNA chamado Nonsense-Mediated Decay (NMD).
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O reconhecimento dum codão de terminação como prematuro (PTC)
envolve uma 3′UTR com estrutura ou comprimento pouco usuais (em muitos
organismos) ou a presença de complexos junção de exão (EJC) no mRNA
citoplasmático (em mamíferos).
O primeiro acontecimento de tradução que ocorre para um mRNA
recém-sintetizado e exportado designa-se por ciclo pioneiro de tradução
("pioneer round of translation").
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Sistemas de Vigilância de mRNAs citoplasmáticos
1. Nonsense-mediated decay(NMD) – visa degradar mRNAs com
um codão STOP prematuro;
2. Nonstop decay (NSD) – visa degradar mRNAs sem um STOP
in-frame e requer um conjunto de proteínas SKI conservadas;
3. No-go decay (NGD) – visa degradar mRNAs com ribossomas
estacionados ("stalled") nas suas regiões codificantes.
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Transporte do mRNA do núcleo para o citoplasma
O splicing é essencial para o transporte do mRNA do núcleo (onde é
sintetizado) para o citoplasma (onde dirige a síntese proteica): o spliceossoma
é reconhecido pelo complexo EJC, e o RNA não pode sair do núcleo antes
do splicing.
Uma das proteinas EJC é REF, que recruta uma proteína de
Transporte (TAP/Mex). Este interage directamente com proteínas do poro
nuclear → Exportação.
O transporte é muito mais lento se o mRNA não possuir intrões.
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mRNA: Procariotas vs. Eucariotas
Aula 14 – Ribossomas e RNA ribossomal
O Ribossoma
As duas subunidades em Procariotas tem coeficientes de
sedimentação 30S e 50S (combinado 70S), sendo S a unidade Svedberg, ou
seja, o coeficiente de sedimentação
Onde é a velocidade terminal e é a aceleração no centrífugo)
Maior valor S, maior massa molecular, ou seja, partículas com maior
densidade sedimentam mais rapidamente.
Subunidades: 50S & 30S (Procariotas)
O core da subunidade 50S é formado pelos rRNA 5S e 23S, e da
subunidade 30S pelo rRNA 16S.
As proteínas são elementos secundários (estruturais).
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Não há proteínas na proximidade do centro ativo da síntese
proteica.
Subunidade 50S – atividade de peptidiltransferase (a função
enzimática primária do ribossoma que
forma ligações peptídicas entre
aminoácidos adjacentes usando os tRNAs
durante a biossíntese proteica)
As duas subunidades associam-
se, constituindo um túnel por onde passa o
mRNA durante o processo de síntese.
O Ribossoma 70S
Ribossomas de Procariotas e de Eucariotas
Ribossoma bacteriano
57 Proteínas de grande diversidade;
3 rRNAs
Massa molecular 6 – 75 KDa
Domínios globulares aninhados no ribossoma ou "em serpente"
para contactar com rRNA
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Ribossoma eucariota
Maiores e mais complexos: 82 proteínas; 4 rRNAs
Diâmetro 23 nm e coeficiente de sedimentação 80S
Síntese de rRNA
Os RNA ribossomais em Eucariotas são sintetizados no nucléolo sob a
forma de um único precursor (45S em eucariotas superiores, 35S em
leveduras) que é depois clivado.
Além da ação das endonucleases e exonucleases, o processamento
dos rRNAs envolve pequenas moléculas de RNA – snoRNAs (small nucleolar
RNAs).
Os snoRNAs conduzem uma série de pequenas alterações que
constituem a maturação dos rRNAs.
1. Síntese do rRNA
2. O rRNA tem estrutura secundária determinada por
emparelhamento de bases ao longo da molécula de rRNA
3. O rRNA associa-se com proteínas para formar as subunidades
ribossomais
4. As duas subunidades formam o ribossoma; Os contactos entre as
subunidades ribossomais são principalmente entre moléculas de RNA, no
entanto, também há contactos entre proteínas ribossomais.
Centros Ativos do Ribossoma
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rRNA e Atividade do Ribossoma
Muitas bases individuais no rRNA têm funções específicas identificadas
por estudos estruturais e funcionais:
Interação com mRNA
Interação com tRNA
Relevância na síntese proteica
Interação com fatores proteicos envolvidos na tradução
Polissomas
Múltiplos ribossomas progridem ao longo duma molécula de mRNA,
formando um "poli-ribossoma" ou polissoma.
Quanto maior a molécula de RNA mensageiro a ser traduzida, mais
ribossomas se ligam à molécula.
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Aula 15 – O RNA de transfere ncia: tRNA
RNA de transferência
O tRNA é uma molécula de RNA de pequenas dimensões, responsável
pela formação de um complexo activado com cada aminoácido e pelo
transporte deste até ao tripleto que lhe corresponde na cadeia de RNA
mensageiro (mRNA)
Cada tRNA é específico de um
aminoácido (exemplo: a designação tRNAAla
corresponde a um tRNA específico de
alanina), existindo vários tRNAs para cada um
dos aminoácidos (tRNA isoaceitadores).
Os vários tRNA são caracterizados por:
1. Comportarem nucleótidos raros;
2. Assumirem uma estrutura secundária em folha de trevo, com 4 zonas de
emparelhamento entre bases complementares e 3 dobras;
3. Possuírem uma sequência trinucleotídica terminal pCpCpA, na
extremidade 3’, indispensável à ligação do aminoácido;
4. Possuírem numa das dobras um tripleto nucleotídico, designado por
anticodão e que constitui um determinante na incorporação do
aminoácido na proteína.
Estrutura em forma de trevo do tRNA.
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Estrutura em forma de trevo e respectivos “braços”
Exemplos de tRNAs
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As variações podem ser:
1. No tamanho do braço extra;
2. Na sequência do braço aceitador de aminoácidos;
3. Na presença de bases modificadas que dá reconhecimento
específico ao enzima aminoacil-tRNA-sintetase;
4. Na sequência do anticodão.
Estrutura tridimensional do tRNA
Estrutura tridimensional do tRNA
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tRNA como molécula adaptadora
O RNA de transferência é uma molécula adaptadora de ácidos
nucleicos para proteínas (reconhece o aminoácido e o codão).
As moléculas de tRNA possuemalgumas características comuns entre
si, mas também apresentam a possibilidade de distinção por parte de outras
moléculas (nomeadamente, pelos aminoacil-tRNA-sintetases).
Actividade dos aminoacil-tRNA-sintetases
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Activação dos aminoácidos
Cada aminoacil-tRNA sintetase é específico para um aminoácido e um
ou mais tRNA correspondentes.
O processo de activação dos aminoácidos ocorre no citoplasma.
Classes dos aminoacil-tRNA-sintetases
Os aminoacil-tRNA sintetases dividem-se em dois grupos, de acordo
com a sua própria estrutura e mecanismo de acção:
Aminoacil-tRNA-sintetases: Proofreading
Os enzimas fazem proofreading para corrigir erros na selecção dos 2
substratos – tRNA e aminoácidos.
Há mais erros na selecção de aminoácidos (1/10-4) do que na selecção
dos tRNAs (1/10-6).
Os tRNAs são moléculas maiores, com mais características únicas.
Existem 2 mecanismos de proofreading:
1. Cinético: O enzima possui maior afinidade para o "seu" tRNA
correcto, sendo que a reacção de aminoacilação dum tRNA incorrecto é muito
lenta;
2. Especifico: O enzima pode reconhecer erros ou quando um
aminoácido errado entra ou já depois da ligação do aminoácido errado ao
tRNA.
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O tRNA é reconhecido pelo seu Anticodão
Cada tRNA é reconhecido pelo seu anticodão e não pelo aminoácido
que transporta.
Uma vez carregado o tRNA, o aminoácido deixa de ter qualquer
influencia na especificidade que passa a depender apenas do anticodão.
Todas as ligações entre tRNA e aminoácidos são quimicamente
idênticas.
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Um segundo Código Genético?
Modificações pós-transcricionais no RNA
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Aula 16 – Sí ntese proteica: iniciaça o
A síntese proteica divide-se em 3 fases:
Iniciação – as fases da tradução até à síntese da primeira
ligação peptídica do polipéptido;
Elongação – a fase da tradução na qual o polipéptido é
elongado pela adição de novas subunidades individuais (aminoácidos);
Terminação – uma reação distinta que acaba a tradução pela
paragem da adição.
Subunidade 30 S e Fator IF-3
Apesar de a subunidade 30S
estar envolvida no processo de
iniciação, por si só não liga o mRNA e
o tRNA. São necessárias proteínas
adicionais denominadas fatores de
iniciação (IF). Estes fatores são
encontrados apenas na subunidade
30S e soltam-se quando as
subunidades 30S e 50S se associam.
Se não ocorrer desassociação dos
fatores de iniciação, a subunidade
50S não se associa à subunidade
30S.
Fatores de Iniciação em E. coli
Estão apenas envolvidos na formação do complexo de iniciação,
não estando presentes nos ribossomas 70S, e não desempenham qualquer
função nos passos da elongação.
Este comportamento distingue os fatores de iniciação das
proteínas estruturais do ribossoma.
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A Reação de Formilação
Em bactérias e em organelos eucariotas, o tRNA iniciador contém um
resíduo de metionina que foi formilado no seu grupo amina, formando a
molécula N-formil-metionil-tRNA. Este tRNA é conhecido como tRNAf
Met e o
nome deste aminoaceil-tRNA é abreviado para fMet-tRNAf.
O tRNA iniciador fica com o seu aminoácido alterado numa reação de
dois passos:
1. É carregado com o
aminoácido formando Met-tRNAf;
2. Formilação do NH2
livre, bloqueando o aminoácido.
Este aminácido bloqueado embora
impeça que o iniciador participe na
elongação da cadeia, não interfere
na sua habilidade para iniciar a
proteína.
Este tRNA só é utilizado na
iniciação. Apenas reconhece os
codões AUG e GUG (e por vezes o UUG).
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Apenas o fMet-tRNAi entra no site P:
Apenas o fMet-tRNAi pode ser utilizado na iniciação pelas
subunidades 30S.
Apenas os restantes aminoacil-tRNAs (aatRNAs) podem ser
utilizados na elongação pelo ribossoma 70S.
Processamento do 1º aminoácido
As proteínas recém-sintetizadas em bactérias possuem formil-
metionina (fMet) como primeiro aminoácido, mas o grupo formilo, e por vezes
também a metionina, são removidos durante a síntese proteica.
A Iniciação da Tradução em Eucariotas
Vários fatores de iniciação eucarióticos são necessários para as várias
fases da tradução, incluindo:
Desenrolamento do mRNA e sua ligação do tRNA iniciador;
Associação da subunidade 40S ao mRNA
Movimento ao longo do mRNA;
Associação da subunidade 60S.
O tRNA iniciador eucariótico é um Met-tRNA que é diferente do Met-
tRNA usado na elongação, mas a metionina não é formilada.
Fatores de iniciação em eucariotas:
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O codão de iniciação em Eucariotas
Modelo de scanning de M.Kozak é
válido para a maior parte dos mRNAs:
a subunidade ribossomal 40S
eucariótica liga-se à extremidade 5’ do
mRNA cap) e migram a partir daí,
escrutinando o mRNA até encontrarem o
local de iniciação, ou seja, o codão
iniciador AUG
O local de inicição eucariótico
consiste numa sequência de 10
nucleótidos que inclui um codão AUG.
A subunidade ribossomal 40S
eucariótica associa-se ao complexo no
local de iniciação (codão AUG).
Iniciação Alternativa da Tradução
Um AUG interno pode ser o iniciador.
1. O 1º AUG nem sempre é o local de iniciação (Ex.:mRNAs
codificantes para factor de crescimento de fibroblastos(FGF-1 e FGF-2),
mRNAs virais, etc.)
2. A iniciação da tradução inicia-se em mais do que um AUG, na
mesma ORF ou em ORFs diferentes.
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Iniciação em Procariotas vs. Eucariotas
Aula 17 – Sí ntese Proteica: Elongaça o e Terminaça o
A Elongação da Tradução em Procariotas
O EF-Tu-GTP (um fator de elongação) é uma proteína G monomérica
cuja forma ativa (ligada a GTP) que se liga aos aminoacilo-tRNAs.
O complexo EF-Tu-GTP-aminoacil-tRNA liga-se ao sítio A do
ribossoma.
O EF-Tu-GTP coloca o aminoacil-tRNA no ribossoma, sendo depois
libertado como EF-Tu-GDP.
O EF-Ts é necessário para reciclar o EF-Tu-GDP a EF-Tu-GTP. A
reacção de elongação consome assim GTP, libertando GDP.
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O único amino-acil-tRNA que não é reconhecido pelo EF-Tu-GTP é o
fMet-tRNAi, o que faz com que este não seja incorporado emcodões metionina
internos (AUG).
Formação da Ligação Peptídica no Ribossoma
A formação da ligação peptídica ocorre
por reacção entre o polipéptido do peptidil-tRNA
(no site P) e o resíduo de aminoácidodo
aminoacil-tRNA (site A).
A subunidade 50S tem atividade de
peptidil transferase que é proporcionada por um
ribozima de rRNA.
A cadeia polipeptídica nascente é
transferida do peptidil-tRNA no site P para o
aminoacilo-tRNA no site A.
A formação da ligação peptídica gera um
tRNA desacilado no site P e um peptidil-tRNAno
site A.
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A Translocação Move o Ribossoma
A translocação do ribosoma move o mRNA
através do ribossoma avançando três bases (um
codão) em direcção à extremidade 3’ do mRNA.
A translocação move o tRNA desacilado
para o site E, onde é libertado, passando o
peptidil-tRNA para o site P.
Esvazia o sitio A, ficando exposto o terceiro
codão que pode receber um novo aminoacil-tRNA.
O movimento do ribossoma depende do
factor EF-G.
O ribossoma eucariota não tem local
E. A saída do tRNA descarregado faz-se
directamente a partir do local P.
O ciclo da Elongação da Tradução
Os factores EF-Tu e EF-G alternam na
sua ligação ao ribossoma durante o ciclo de
elongação em Procariotas.
O GMP-PCP é um análogo do GTP que
não pode ser hidrolisado e que é usado para
testar em que fase duma reação é necessário
ocorrer a hidrólise de GTP.
A kirromicina é um antibiótico que inibe
a síntese proteica atuando no EF-Tu.
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Translocação e Ribossoma
Modelo do estado híbrido – A translocação ocorre em duas etapas:
1. A subunidade 50S desloca-se relativamente à subunidade 30S
2. A subunidade 30S move-se posteriormente ao longo do mRNA,
restaurando a conformação original do ribossoma.
Aula 18 – O Co digo Gene tico
Um codão é um tripleto de nucleótidos que codifica para um
aminoácido específico
A tradução decorre com a leitura sequencial dos codões e sem
sobreposição destes.
O primeiro codão da sequência inicia uma grelha de leitura.
Não há pontuação, i.e. os codões são contínuos.
Grelhas de Leitura Aberta
Cada sequência numa cadeia
simples de DNA possui três grelhas de
leitura aberta ou ORFs (Open Reading
Frames)
Um segmento de DNA em cadeia
dupla possui assim seis grelhas de
leitura aberta possíveis.
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O Código Genético Universal
61 dos 64 tripletos possíveis codificam para 20 aminoácidos.
3 codões (codões stop) não representam aminoácidos mas levam à
terminação.
Codão de iniciação AUG: para além de sinal de iniciação (metionina)
também codifica para metionina no interior da cadeia polipeptídica
Codões de terminação: UAA, UAG, UGA (1 em 20).
O número de codões para cada aminoácido não se correlaciona a
respectiva frequência de utilização nas proteínas.
A Não-Universalidade do Código Genético
Nos genomas nucleares, as alterações normalmente afetam apenas os
codões de terminação. Em algumas espécies ocorreram alterações ao código
genético universal. Estas alterações são mais comuns nos genomas
mitocondriais, nos quais se pode reconstruir as alterações por uma árvore
filogenética.
A Degenerescência do Código
Vários aminoácidos são representados por mais do que um codão.
Codões com o mesmo significado designam-se por codões sinónimos.
Codões sinónimos diferem frequentemente apenas na 3ª base.
Tal facto, conjuntamente com uma tendência para aminoácidos
semelhantes serem codificados por codões também semelhantes, minimiza o
efeito das mutações silenciosas.
O Conceito de Wobble
Cada codão necessita dum tRNA específico ou pode o mesmo tRNA
emparelhar com 2 ou mais codões duma mesma família?
Frequentemente, cada tRNA reconhece mais do que um codão,
pois a 1ª base do anticodão consegue emparelhar com
diferentes bases na correspondente 3ª posição do codão.
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Múltiplos codões representam o mesmo aminoácido que
frequentemente apenas diferem na base da 3ª posição (a
"hipótese do wobble").
Hipótese de Wobble: O emparelhamento entre codão e anticodão para
as duas primeiras bases (do codão) segue as regras usuais (G-C e A-U), mas
na 3ª posição podem ocorrer wobbles (vacilações/ baloiços), devido à
flexibilidade da conformação do loop do anticodão dos tRNAs.
Existem apenas três casos em que um significado único é conferido
pela presença de uma base única na terceira posição:
AUG - metionina
UGG - triptofano
UGA – stop
C e U nunca têm significado único na 3ª posição e A (na 3ª posição)
nunca codifica um aminoácido único.
Wobbles
Emparelhamentos G-U (U e G podem reconhecer 2 bases: A/G e C/U)
O Wobble no emparelhamento de bases permite que algumas bases
na 1ª posição do anticodão reconheçam mais do que uma base na 3ª posição
do codão, o que é devido duma monitorização mais frouxa no emparelhamento
pelo rRNA no local A do ribossoma.
tRNAs Supressores
As mutações "nonsense" podem ser suprimidas por um tRNA com um
anti-codão mutante. Que também suprimem os codões STOP "naturais",
sintetizando assim proteínas mais longas do que as wild-type.
Os tRNAs supressores também suprimem codões "missense". A
supressão de mutações "missense" ocorre quando o tRNA reconhece um
codão diferente do usual, de tal forma que um aminoácido é substituído por
outro.
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Factores de Elongação: Procariotas e Eucariotas
Terminação da Tradução em Procariotas
1) Hidrólise da ligação no peptidil-tRNA presente no local P
2) Libertaçãoda proteína livre e do tRNA descarregado
3) Dissociação do ribossoma nas subunidades 30S e 50S
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Factores de Terminação
Os Codões de Terminação São Reconhecidos por Factores
Proteicos
Por analogia de estruturas moleculares, o complexo EF-Tu-tRNA, o
factor de translocação EF-Ge os factores de libertação RF1/2-RF3 ligam-se ao
mesmo site ribossomal.
Os codões de terminação são reconhecidos por factores de libertação
proteicos, e não por aminoacil-tRNAs.
RF1 – Factor de libertação bacteriano que
reconhece UAA e UAG como sinais de
terminação da tradução polipeptídica.
RF2 – Factor de libertação bacteriano que
reconhece UAA e UGA como sinais de
terminação.
RF3 – factor de libertação proteico
relacionado com o factor de elongação EF-G. O
RF3 funciona para libertar os factores RF1 ou
RF2 do ribossoma quando actuam como
terminadores da tradução.
As estruturas tridimensionais dos factores de terminação de classe 1
assemelham-se ao aminoacil-tRNA-EF-Tu e EF-G. O factor EF-G é essencial
no passo de translocação e a sua estrutura é semelhante à do complexo
aminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP.
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Inibição da Síntese Proteica
A selecção natural permitiu obter compostos que afectam a síntese
proteica bacteriana e não a do hospedeiro.
A especificidade de alguns antibióticos deve-se precisamente a tal
selectividade.
A inibição da síntese proteica é o alvo primáriode muitos
antibióticos e toxinas naturais.
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Inibição da Síntese Proteica pela Puromicina
Puromicina – um antibiótico que termina a síntese mimetizando um
tRNA e ficando ligado à cadeia polipeptídica nascente.
Esta tem estrutura semelhante à
extremidade 3’ do tRNA e a translocação
do ribossoma é bloqueada.
Síntese Peptídica não ribossomal
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Exemplo: Biossíntese da Gramicidina
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Aula 19 – Folding e Degradaça o de Proteí nas
Proteínas: Diversidade de conformação
As proteínas funcionam conforme a sua conformação.
Folding de Proteínas
O folding de proteínas é o processe pelo qual as proteínas adquirem a
estrutura terciária que lhes é termodinamicamente mais favorável.
Consiste num processo por etapas em que as ligações mais
adequadas vão sendo estabelecidas e a proteína adquire a sua estrutura
(conformação) funcional.
Essas ligações que se estabelecem são de natureza covalente.
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Ligações intra-moleculares em Proteínas
Passos na via de Folding de uma proteína globular
1) Formação rápida e reversível de estrutura secundária localizada
(folding);
2) Formação dos domínios por interacção cooperativa de regiões já
folded;
a. Domínio – parte da proteína com um fold próprio e funcional,
que é independente do resto da proteína
3) Formação do “glóbulo fundido” (molten globule) dos domínios;
4) Ajuste na conformação dos domínios;
5) Estrutura final monomérica.
Ligações intra-moleculares:
Ligações de hidrogénio
Ligações hidrófobas
Ligações de van der Waals
Ligações iónicas
Ligações perssulfureto
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Folding e energia
As proteínas adquirem a conformação que lhes é mais favorável do
ponto de vista energético – existem as hipóteses cinética e termodinâmica
do folding de proteínas.
Existem várias vias possíveis
para o folding duma proteína até à sua
conformação nativa. A imagem ao
lado é uma representação do folding –
diagrama de energia (funil de folding)
– sendo que o pico do funil corresponde
ao mínimo de energia, ou seja, à
conformação nativa.
Chaperones moleculares
Os chaperones moleculares assistem
ao folding correcto das proteínas in vivo.
Estes não são componentes das
proteínas funcionais e não possuem qualquer
informação espacial para o folding.
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A Hsp70 Liga-se Co-Traducionalmenteàs Cadeias Nascentes
As hsp70 são proteínas menores, que se ligam em sequências
hidrófobas expostas e mantêm a cadeia peptídica unfolded até que ela possa
assumir a conformação tridimensional correta.
Este chaperone tem duas tarefas importantes: ajudar o folding e
impedir que várias proteínas malformadas, com sequências hidrófobas
expostas, formem agregados, que podem ser nocivos. Ela ajuda proteínas que
estão a ser sintetizadas em ribossomas livres no citoplasma ou proteínas que
foram transferidas através para o retículo endoplasmático.
O Sistema GroEL-GroES
Este sistema entra em “acção”, uma vez que há proteínas que não
cabem dentro das chaperoninas – por terem grandes dimensões. O mecanismo
em detalhe é explicado mais à frente. De seguida mostra-se apenas um
resumo.
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Enzimas envolvidos no Folding
a) Perssulfureto Isomerase (PDI);
b) Peptidil Prolil Isomerase (PPI);
c) Colagénio – Alguns resíduos trans de prolina do colagénio são
modificados pelos 3- e 4-prolilhidroxilases
Principais Famílias de Chaperones
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Chaperones e Translocação de Proteínas
Translocação para o Mitocôndrio
Doenças Associadas ao Folding
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Folding e Doença Humana
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Alzheimer
As moléculas de APP na membrana celular e em vesículas
intracelulares (endossomas) são clivadas pela β-secretase (BACE) e pelo
complexo presenilina–γ-secretase (PS–γ) libertando a região Aβ.
Uma porção dos péptidos Aβ pode oligomerizar, inicialmente
intravesicularmente, sendo depois libertados para o fluido intersticial do
cérebro, onde os oligómeros solúveis se difundem para as fendas sinápticas
interferindo com a sua função por mecanismos desconhecidos.
Os oligómerosde Aβ podem polimerizar mais em fibras amilóides
que se agregam em placas esféricas, resultando na distorção e mau
funcionamento dos axónios e dendritos adjacentes.
Em paralelo, ocorre a activação de cinases no citoplasma do neurónio,
levando à híper-fosforilação da proteína Tau, associada aos microtúbulos e
sua polimerização em filamentos insolúveis que se agregam como "tangles"
neurofibrilhares.
Os microglia activados e os astrócitos reactivos perto das placas
participam numa resposta inflamatória local contribuindo para a
neurotoxicidade.
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Vias de Degradação das Proteínas
Aula 20 – Sorting de Proteí nas
Localização Intracelular de Proteínas
As proteínas podem ir para a sua devida localização após terem sido
completamente sintetizadas no citoplasma, em ribossomas ‘livres’ , ou seja,
póstraducionalmente. Para tal, possuem sinais de localização.
Alternativamente, podem ser inseridas nos organitos
cotraducionalmente como p.ex, as proteínas destinadas à via secretora (RE,
Golgi, membrana, meio extracelular ou ainda endossomas ou lisossomas).
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Ribossomas e destinos das proteínas
As proteínas sintetizadas nos ribossomas livres seguem a via pós-
traducional enquanto as proteínas sintetizadas nos ribossomas ligados ao
reticulo endoplasmático seguem a via secretora. As proteínas da via secretoranunca são libertadas diretamente no citosol.
Sinais de Sorting: O Código Postal das Proteínas
As proteínas sintetizadas nos ribossomas livres do citoplasma são
dirigidas para os seus destinos específicos através de sinais (sequências de
aminoácidos) que funcionam como ‘códigos postais’.
A sequência de sinal é comum a todas as proteínas com o mesmo
destino. Se se alterar essa sequência a proteína é enviada para outro local da
célula.
A Via Secretora em Eucariotas
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Translocação de proteínas da via secretora
Topografia de Proteínas de Membrana
A topografia das proteínas de membrana depende do número e
orientação das regiões transmembranares:
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As Proteínas são Transportadas em Vesículas com Revestimentos
A formação das vesículas é desencadeada pela associação das
proteínas de revestimento à membrana. Estas proteínas de revestimento vão
provocar o dobramento da membrana até à formação da vesícula
A Hipótese das SNAREs
A especificidade para ‘atracar’ é dada
pelas SNARES.
A v-SNARE transportada pela vesícula é
reconhecida pela t-SNARE na membrana,
formando um SNARE-pin.
O NSF e a SNAP permanecem ligados à
outra extremidade do SNARE-pin durante a
fusão.
Após a
fusão, dá-se a
hidrólise de ATP e o
NSF e a SNAP
dissociam-se para
libertar a SNARE.
Proteínas Rab
Rab’s: são proteínas que se ligam ao GTP,
"small GTPase"s (activas na forma ligada) e que
influenciam determinados passos do transporte de
proteínas na via secretora.
Vias de tráfego para o lisossoma
Os endossomas distribuem as proteínas
endocitadas e proporcionam uma via para o lisossoma.
As proteínas são transportadas pelas vesículas revestidas de clatrina
da membrana para os endossomas precoces.
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Podem depois regressar à membrana ou continuar para os
endossomas tardios e lisossomas.
As proteínas recém-sintetizadas podem ser encaminhadas para os
endossomas tardios (e, de seguida, para os lisossomas) a partir do Golgi.
O sinal no targeting para o lisossoma é o reconhecimento do fosfato de
6- manose por um recetor específico.
Aula 21 – A Base Molecular e Funcional da Fibrose Quí stica
Fibrose Quística
É a doença autossómica
recessiva letal mais comum em
Caucasianos, ou seja, afecta os
autossomas e só tem a doença
quem possui a mutação nos dois
alelos.
A causa de morte pode
ser a falta de ar.
Diagnóstico
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Fisiopatologia
Doença Respiratória
A presença dum espesso muco impede a ‘limpeza’ (clearance) das vias
respiratórias e atrai bactérias patogénicas e células do sistema imunitário.
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A Cascata da Patogénese da CF
1,900 Mutações CFTR: 5 Classes Funcionais
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Corrigir as ~1,900 Mutações CFTR por Classe Funcional
Controlo de Qualidade do Retículo Endoplasmático (RE)
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Resgatar Mutações de Classe II
1. Corrigir o folding e inibir a degradação
2. Aumentar o número (e a função) de canais CFTR na superfície
3. Fase secundária de ensaio clínico para o VX-809 mostrou
diminuição da concentração salina no suor mas não teve efeito na
função respiratória
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Resgatando Mutações de Classe III/IV
Classe III – Defeito de Regulação: O canal não responde
Classe IV – Defeito de Condutância: Menos iões passam pelo canal
Resgatando Mutações de Classe V
Novas Terapias
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Aula 22 e 23 – Me todos para o Estudo da Regulaça o da Expressa o
dos Genes
Gel-Mobility Shift Assay
Permite identificar interações proteína – DNA ou proteína – RNA. A
técnica baseia-se no facto de que complexos proteína – DNA migram mais
lentamente que DNA livre quando sujeitos a uma eletroforese em gel de
agarose ou em gel de poliacrilamida (não desnaturante)
Complexos proteina – DNA formados de DNA circular podem migrar
mais rápido que o DNA livre.
Esta técnica permite estudar alterações da conformação do DNA
induzidas pela ligação de proteínas.
DNA footprinting
Esta técnica tem ser aplicada num gel de alta resolução, como o gel de
acrilamida que apresenta resolução de 1 nucleótido.
Após a amplificação do DNA em estudo, adiciona-se uma proteína de
interesse que se vai ligar a uma zona especifica deste DNA, impedindo a sua
clivagem por um enzima de restrição. Comparando o gel de eletroforese obtido
ao adicionar esta proteína e o gel sem a adicionar verifica-se que no caso da
adição há uma zona que não foi clivada por não aparecer no gel. É assim
possível determinar a zona a que a proteína se liga no DNA em estudo.
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Determinação da Atividade de Promotores
O promotor é clonado com um gene repórter a jusante. Coloca-se
numa célula em que o gene repórter seja normalmente expresso. Os níveis de
enzima na célula são proporcionais à “força” do promotor.
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Sistema “Tet-off”
Permite desativar irreversivelmente o promotor. A presença de
tetraciclina impede a transcrição.
Sistema “Tet-on”
O promotor é ativado na presença de tetraciclina.
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Pulse-chase com radioisótopos
Permite analisar processos celulares ao longo do tempo
O sistema do duplo hibrido em levedura
Neste sistema, um par de
factores de transcrição responsáveis
pela expressão de um gene de
levedura é substituído por proteínas
híbridas, cada uma feita, em parte,
pelo factor de transcrição pela
proteína de teste. Assim é testada a
capacidade deste par de híbridos de
dirigir a expressão do gene alvo de
levedura.
Para utilizar o sistema,
devem ser realizadas duas
experiênciasde clonagem de
levedura.
A primeira experiência de clonagem envolve o gene cujo produto da
proteína que ele codifica está a ser estudado. Este gene é ligado ao gene que
codifica para um factor de transcrição (do par) e essa conjugação é inserida
num vector de levedura. As leveduras recombinantes, que são produzidas não
são capazes de expressar o gene-alvo, uma vez que este factor de transcrição
modificado não pode interagir com o seu parceiro (b).
Na segunda experiência de clonagem, é feita uma versão híbrida do
parceiro e este é clonado em células de levedura. A restauração da expressão
do gene alvo indica que os dois factores de transcrição podem interagir. As
fusões são concebidas de tal modo que só podem acontecer se as interacções
ocorrerem entre os componentes da proteína teste dos híbridos, não entre os
segmentos de factor de transcrição (c).
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Pares de interacção de proteínas de teste são então identificados. A
segunda experiência de clonagem pode envolver uma biblioteca de
recombinantes que representam proteínas diferentes, de modo a que uma
proteína pode ser testada contra muitas outras.
FRET-Fluorescence Resonance Energy Transfer
É um processo físico onde há transferência de energia entre o dador e
o aceitador. A diminuição da fluorescência do dador e o aumento da
fluorescência do aceitador pode ser medida por microscopia. Este processo
permite estudar a interação direta entre proteínas numa célula viva.
Para poder ocorrer FRET:
Os espetros de emissão e absorção tem de se sobrepor, ou seja, os
fluoróforos têm de ser complementares (o comprimento de onda de excitação
de um deve corresponder ao comprimento de onda de emissão do outro);
O raio da distância entre os fluoróforos tem de ser inferior a 100 Å.
Neste exemplo, a proteína e o seu aceitador são marcados por
fluorescência. Como apenas se deteta fluorescência quando as moléculas se
encontram suficientemente perto, apenas se deteta fluorescência quando a
proteína e o seu aceitador se ligam, provocando a proximidade necessária
entre o dador e o aceitador.
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Nesta estratégia, a excitação do CFP resulta na emissão a partir duma
proteína vizinha, tal como a proteína com YFP (fluorescência azul) se esta
estiver suficientemente perto.
FRET: "Photobleaching" do Aceitador
No modo "photobleaching" do aceitador, a molécula aceitadora é
sujeita a "bleaching", resultando um aumento de brilho ("unquenching") no
dador de fluorescência. Como o aceitador deixa de absorver energia, a energia
emitida pelo dador é detetada com maior intensidade, observando-se uma
maior fluorescência.
Ao aplicar esta técnica, se não se observar nenhuma alteração nos
fluoróforos, significa que não existia FRET e portanto o fluoróforos ou estavam
muito afastados ou não eram complementares.
FRET: Emissão Sensibilizada
Esta técnica (modo emissão sensibilizada), permite:
Analisar interações proteína:proteína in vivo;
Investigar alterações conformacionais das proteínas.
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FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching
Mede a dinâmica da mobilidade molecular em membranas ou células
vivas. Especialmente a capacidade de uma molécula se mover entre os
diferentes organitos da célula.
Por exemplo, (A) a bicamada fosfolipidica é
marcada com um fluoróforo depois (B) realiza-se um
"photobleaching" direcionado a uma zona especifica
da membrana. (C) Ao observar a intensidade de
fluorescência ao longo do tempo, o marcador
“antigo” é substituído por um “novo” e,
eventualmente, (D) volta-se ao estado inicial.
FLIP - Fluorescence Loss In Photobleaching
É uma variante da técnica de FRAP, tem o mesmo objetivo: analisar o
movimento de partículas na célula.
RNA interference (RNAi) – Mecanismo Natural
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Mecanismo:
A. Passo precursor. Longos precursores de
dsRNA e miRNA são processados em
siRNA/miRNA duplexes pelo enzima DICER
(uma RNase-III-like). Provavelmente ocorre um
passo de amplificação.
B. Passo efetor. Estes dsRNAs são depois
desenrolados e incorporados em complexo
nucleásicos efetores, designados RISCs (RNA-
induced silencing complexes) que atuam
induzindo a clivagem dos mRNAs, a repressão
da tradução ou a modificação da cromatina.
Small interfering RNAs (siRNAs)
dsRNAs curtos (19-22 bp) com extremidades protuberantes com 2
nucleótidos.
Produzidos por síntese química, por transcrição in vitro, ou cassette de
expressão (introduzida nas células por transfeção).
Permitem a perturbação da função dos genes.
Pode ser aplicado em high-throughput à escala da célula/sistema.
Microscopia de High-Throughput
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A variante termosensível da proteína G do vírus VSV (ts-O45-G) fica
retida no retículo endoplasmático (RE) à temperatura de 39.5ºC. Após a
transfeção com esta proteína fundida com YFP (A), as células são inicialmente
incubadas a este temperatura e a ts-O45-G acumula-se no RE (B). Após 16h,
as células passam para 32ºC (temperatura permissiva) e a ts-O45-G vai para a
membrana plasmática (C). Num siRNA screen, são avaliados os efeitos de
siRNAs neste tráfego membranar da ts-O45-G.
Os ensaios para imagiologia de fluorescência de high-throughput têm de
ser concebidos de forma que:
A preparação de amostra em larga escala possa ser efetuada
automaticamente;
A aquisição das imagens seja rápida e quantitativa;
As imagens sejam armazenadas de modo a poderem ser analisadas
automaticamente.Mais conteúdos dessa disciplina
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