Purificacao de Produtos Biotecnologicos-1

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Purificação de Produtos Biotecnológicos
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA 
 EEL / USP 
Disciplina: Engenharia Bioquímica II A
Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro
Profº Arnaldo Márcio 
Etapas de um Processo de Purificação
	Etapa do processo	Operações unitárias 	Princípio 
	Clarificação 
 
 
 	Filtração convencional 	Tamanho de partículas 
		Centrifugação 	Tamanho e densidade de partículas 
		Filtração tangencial (membranas) 	Tamanho de partículas 
		Floculação 	Hidrofobicidade de partículas 
	Rompimento de células 	H omegeneização 	Cisalhamento 
		Ultra-som 	Cisalhamento 
		Moagem em moinho de bolas 	Cisalhamento 
		Rompimento químico ou enzimático 	Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular
	Purificação de baixa resolução 	Precipitação 	Solubilidade 
		U Itrafiltração (membranas) 	Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas 
		Extração em sistemas de duas fases líquidas 	Solubilidade, massa molar 
	Purificação de alta resolução 	Cromatografia de troca-iônica 	Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula 
		Cromatografia de afinidade (biológica ou química) 	Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção) 
		Cromatografia de imunoafinidade 	Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo)
		Cromatografia de interação hidrofóbica 	Hidrofobicidade 
			 
		Cromatografia de exclusão molecular 	Massa molar 
		Membranas adsortivas 	Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína 
	Tratamentos finais 	Cristalização 	Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido 
		Liofi I ização	Características de equilíbrio líquido-sólido
		Secagem 	Características de equilíbrio líquido-sólido 
Rompimento Celular
Produtos Intracelulares
Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento
Suspensão Celular
Clarificação
Rompimento Celular
Aplicados após a separação e lavagem das células;
Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento;
Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade
Forma mais adequada de Rompimento?
Tipo de microrganismo
Tamanho da célula;
Tolerância a tensões de cisalhamento;
Necessidade de controle de temperatura;
Gasto de energia;
Parede Celular
Métodos de Rompimento Celular
Lize enzimática
Enzimáticos
Mecânicos
Homogeneizador de alta pressão
Moinho de bolas
Não-mecânicos 
Choque osmótico
Químicos
Álcalis
Ultrassom 
Congelamento-descongelamento
Aquecimento 
Secagem
Solventes
Detergentes
Ácidos
Homogeneizador a alta pressão
Cavitação
Turbulência
Cisalhamento
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração
Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).
Mecânico - Homogeneizador a alta pressão
O desempenho pode ser afetado por:
Pressão de operação;
Velocidade de alimentação;
Temperatura;
Estado fisiológico do microrganismo;
Condições de cultivo;
Tipo de célula e sua concentração.
tamanho das células (maior => rompimento mais fácil)
pressão (maior => maior eficiência)
número de passagens (múltiplas etapas aumenta o ren-dimento) 
Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:
 		log Rm   =    k . N . Pa 
		 (Rm – R)				
onde:
	Rm é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L)
	R é a concentração de proteina liberada (g/L)
	k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célula
	N é o número de passagens
	P é a pressão
 	a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)
Mecânico – Moinho de Bolas
Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro. 
O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células. 
Mecânico – Moinho de Bolas
Mecânico – Ultra-som
O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação.
Escala de laboratório. 
Mecânico - Ultrassom
Rompimentos Mecânicos
Desvantagens:
As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas;
Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.