Tecnologia do DNA recombinante biotec (1)

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TECNOLOGIA DO DNA 
RECOMBINANTE 
Profa Dra. Charlotte Cesty Borda de Saenz 
É possível fazer 
uma 
transferência 
genética para 
fazer alguma 
manipulação 
genética? 
SIM!!!! 
TECNOLOGIA 
DO DNA 
RECOMBINANTE 
O procedimento que envolve o isolamento de 
um gene com potencial terapêutico (por ex. 
insulina) ou biotecnológico (por ex. gene do bt) 
e a introdução desse gene numa célula animal, 
bacteriana ou de leveduras. 
 
 Esta tecnologia do DNA recombinante, 
também conhecida como clonagem gênica ou 
clonagem molecular, compreende processos de 
transferência da informação genética (DNA) de 
um organismo a outro. 
 
Tecnologia de DNA Recombinante 
 
CLONAGEM DE DNA 
 CLONAGEM: É o método utilizado para produzir 
cópias idênticas de uma molécula de DNA 
 Para a produção dessas cópias são empregados 
VETORES que proliferam dentro de bactérias ou 
fungos. 
 Estas bactérias de fácil manipulação, crescimento 
rápido e constituição genética conhecida são 
chamadas de CÉLULA HOSPEDEIRA. 
- Isolamento e propagação de moléculas idênticas 
+ recombinanteDNA = 
INSERTO 
VETOR 
+ 
CÉLULA HOSPEDEIRA 
TRANSFORMAÇÃO 
CLONAGEM DE DNA 
recombinanteDNA 
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= Inserto 
DNA RECOMBINANTE 
PREPARANDO O INSERTO 
Clonagem Molecular 
+ recombinanteDNA = 
INSERTO 
VETOR 
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A descoberta de 2 tipos de enzimas forneceu o ímpeto 
essencial para os grandes avanços na área da Biologia 
Molecular e permitiu o desenvolvimento da técnica, hoje 
comum, de clonagem de DNA: 
 
- Enzimas de restrição 
•1962 - Arber forneceu as primeiras evidências para 
 a existência de ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
 
- DNA ligases 
•1967 - Gellert descobriu a DNA LIGASE 
 
Enzimas de Restrição 
- Sítio de reconhecimento – geralmente palindrômico 
ARARA 
ARARA 
OMO 
OMO 
ANA 
ANA 
- Reconhecem de 4 a 8 pb 
- Cortes com extremidades abruptas / coesivas 
- Nomenclatura: 1ª letra – Gênero / 2ª3ª - Espécie 
- Clonagem molecular - ~ 1.073 enzimas diferentes 
- Isolamento DNA – separado por Eletroforese 
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www2.uol.com.br/princesasdomar/images/polvina_espelho.gif&imgrefurl=http://www2.uol.com.br/princesasdomar/conto_maes.htm&h=345&w=290&sz=18&hl=pt-BR&start=5&tbnid=yCq6vD0wqnLk1M:&tbnh=120&tbnw=101&prev=/images%3Fq%3Despelho%26gbv%3D2%26hl%3Dpt-BR
Enzimas de Restrição 
- Clivagens 
 Eco RI 
Enzima Organismo Seqüência 
Alu I Arthrobacter luteus 5’ AG CT 
Bam HI Bacillus amyloliquefasciens H 5’ G GATCC 
Hae III Haemophilus aegyptius 5’ GG CC 
Hind III Haemophilus influenzae Rd 5’ A AGCTT 
Eco RI Escherichia coli RY13 5’ G AATTC 
Gênero 
Espécie Linhagem 
Ordem de descoberta 
Sítios de reconhecimento para enzimas de restrição são curtas 
sequências reconhecidas e clivadas por várias endonucleases 
Bactérias com endonucleases de restrição também têm as 
enzimas correspondentes que metilam as bases específicas no 
sítio de reconhecimento. 
Que tipo de fragmento de DNA podemos 
inserir em um vetor? 
 
 
- O DNA a ser inserido tem que ser dupla-fita. 
 Enzimas de restrição só cortam DNA dupla-fita. 
 
- O fragmento de DNA pode ser : 
 
 - Produto de digestão de DNA genômico 
 com endonucleases de restrição 
 - Produto de PCR 
 
PREPARANDO O VETOR 
+ recombinanteDNA = 
INSERTO 
VETOR 
CLONAGEM DE DNA 
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PLASMÍDEOS 
Pequenas moléculas circulares (raramente 
lineares) de DNA dupla fita, não incorporadas 
ao genoma das bactérias 
São formas autoreplicativas de DNA 
Codificam proteínas importantes para a 
sobrevida/resistência das bactérias 
Não conficam genes essenciais 
Tem um tamanho de 1-5% do cromosomico 
= Polylinker 
QUANDO USAR PLASMÍDEOS: 
 
- SÃO UTILIZADOS PARA CLONAGEM DE FRAGMENTOS 
RELATIVAMENTE PEQUENOS (NO MÁXIMO 20 KB) 
- SÃO DE FÁCIL MANUSEIO 
- EXISTEM VÁRIOS TIPOS DE PLASMÍDEOS COMERCIALMENTE 
DISPONÍVEIS, CADA UM COM VANTAGENS E APLICAÇÕES 
ESPECÍFICAS 
 - VETORES PARA SÍNTESE DE RNA E PROTEÍNAS 
 (VETORES DE EXPRESSÃO) 
 -VETORES PARA MODIFICAÇÕES DE INSERÇÃO: 
 CLONAGEM (VETOR DE CLONAGEM), ETC. 
 
Vetores Hospedeiros Utilização 
Plasmídeos 
Cosmídeos 
Virus 
 
Bactérias / leveduras 
clonagem 
Terapia gênica Células eucarióticas 
Bacteriófagos 
Plasmídeo 
pUC 18 
TRANSFORMAÇÃO 
PREPARANDO AS CÉLULAS 
HOSPEDEIRAS 
(CÉLULAS COMPETENTES) 
+ 
CÉLULA HOSPEDEIRA 
TRANSFORMAÇÃO 
recombinanteDNA 
CLONAGEM DE DNA 
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 Células Hospedeiras 
DH10B / DH5α 
Transformação por Choque térmico 
Transformação 
bacteriana 
 
Transformação por Eletroporação 
Transformação por Biobalística 
Plaqueamento 
Transformação: 
Inserção do plasmídeo em bactérias: 
a) Choque térmico em bactérias tornadas 
“competentes” 
b) b) Eletroporação 
 
 
 
Seleção das bactérias transformantes 
(marcador de seletividade): 
a) resistência a antibiótico 
 
 
Seleção das bactérias transformados com 
plasmídeos recombinantes: 
a) alfa complementação do gene da 
betagalactosidase 
 (colônias azuis ou brancas) 
APLICAÇÕES 
DNA RECOMBINANTE - TRANSGENIA 
OUTROS EXEMPLOS DE TRANSGÊNICOS 
Golden Rice. 
Arroz geneticamente modificado 
que contém um gene que codifica a 
produção de β-caroteno. Foi 
produzido para evitar que as 
populações pobres da Ásia 
adoecessem por avitaminoses. 
Planta de algodão resistentes às lagartas. 
Reduz a necessidade de utilização de pesticidas. 
Os gastos de produção diminuem e a poluição 
ambiental também é reduzida. 
PRODUÇÃO DE 
INSULINA HUMANA 
EM BACTÉRIAS: 
-Isola-se o gene da insulina 
humana utilizando-se 
enzimas de restrição para 
cortar o DNA humano; 
 
- Insere-se o gene em um 
plasmídeo bacteriano; 
 
- Ativa-se o plasmídeo, para 
a transcrição do gene e 
produção da proteína 
(insulina); 
 
- Retira-se a insulina da 
bactéria. 
 
Como fazer uma vacina comestível 
Batatas transgênicas que 
podematuar como “vacina” 
Suspensão de bactérias 
Agrobacterium tumefaciens 
Calo 
Células 
mortas 
Meio com 
antibiótico 
Célula da planta 
Transferência de genes 
DNA 
Plasmídeo 
Gene para o antígeno 
Célula bacteriana 
Gene que 
confere resistência 
a certo antibiótico 
CÓMO É 
REALIZADO O 
DNA 
RECOMBINANTE? 
LABORATÓRIO VIRTUAL 
http://www.bch.cuhk.edu.hk/vlab/hpv/vl_detail.html 
 
http://www.bch.cuhk.edu.hk/vlab/hpv/vl_detail.html