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TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS CON IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA Y VETERINARIA 2015 Roger Iván Rodríguez Vivas Editor AMPAVE ~ I ~ TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS CON IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA Y VETERINARIA Roger Iván Rodríguez Vivas MVZ, MSc, PhD. Editor de la edición Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad Autónoma de Yucatán, Laboratorio de Parasitología ~ II ~ Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria Primera edición, Vol. Único. 31 de julio del 2015 ISBN: ___-___-____-__-_ Inscrito en el Registro Público del Derecho de Autor. ©Versión impresa. Certificado: 03-2015-072412191500-01 “Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales” Impreso y hecho en México. Diseño de portada y diseño editoral: Dr. Roger Iván Rodríguez Vivas Editor: Dr. Roger Iván Rodríguez Vivas. Profesor titular de tiempo completo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad Autónoma de Yucatán. Miembro del Sistema Nacional de Investigadores de México, nivel III. Comité Editorial: Dr. Rodrigo Rosario Cruz Dr. Rubén Hernández Ortiz Dr. Alberto Rosado Aguilar M. en C. Melina Ojeda Chi y M. en C. Luis Carlos Pérez Cogollo El contenido de cada capítulo es responsabilidad de sus autores ~ III ~ AUTOR INSTITUCIÓN DE AFILIACIÓN Dr. Armando Aguilar Caballero Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán. Dra. Yazmín Alcalá Canto MV Certificada en Parasitología Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. Dr. Miguel Ángel Alonso Díaz Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. Dr. Jesús Antonio Álvarez Martínez Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Dr. Manuel Emilio Bolio González Departamento de Salud Animal y Medicina Preventiva. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán. M. en C. José Israel Chan Pérez Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán. QFB. María Teresa Corona Souza Laboratorio de Inmunoparasitología, Coordinación de Investigaciones Inmunológicas. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud. Fecha del boletín AUTORES DE LOS CAPÍTULOS ~ IV ~ Dra. Irene Cruz Mendoza MV Certificada en Parasitología Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. Dr. Carlos Cruz Vázquez División de Estudios de Posgrado e Investigación. Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes /DGEST-SEP. Dr. Jorge Luis de la Rosa Arana Laboratorio de Inmunoparasitología, Coordinación de Investigaciones Inmunológicas. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud. M. en C. Lisandro Encalada Mena Escuela Superior de Ciencias Agropecuarias. Universidad Autónoma de Campeche. M. en C. Ismael Escutia Sánchez Dirección General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera SENASICA. SAGARPA. Dr. Juan Antonio Figueroa Castillo MV Certificado en Parasitología Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. Dr. Julio Vicente Figueroa Millán MV Certificado en Parasitología Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. MesSV. Cristina Guerrero Molina MV Certificada en Parasitología Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. M. en C. Carlos Jasso Villazul Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal. SENASICA, SAGARPA. M. en C. Enrique Liébano Hernández† Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Dra. María Eugenia López Arellano Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. ~ V ~ M. en C. Martín López Rojas Corazón del Camino Blanco, A.C. M. en C. Francisco Martínez Ibáñez Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal. SENASICA, SAGARPA. Departamento de Ectoparásitos y Dípteros. Dr. Pablo Martínez Labat Facultad de Estudios Superiores, Cuautitlán. Universidad Nacional Autónoma de México. QFB. Ana Rosa Méndez Cruz Laboratorio de Inmunoparasitología, Coordinación de Investigaciones Inmunológicas. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud. MVZ. Salvador Neri Orantes Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA, SAGARPA. M. en C. Melina Maribel Ojeda Chi Laboratorio de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán. Dra. Nadia Florencia Ojeda Robertos MV Certificada en Parasitología División Académica de Ciencias Agro- pecuarias. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. Biol. Jorge Osorio Miranda Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal. SENASICA, SAGARPA. Dr. Adalberto A. Pérez de León Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory. ARS, USDA. Kerrville, Texas, USA. Dra. María Teresa Quintero Martínez Laboratorio de Entomología del Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Biól. Gabriel Ramírez Vargas Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. ~ VI ~ MVZ. Alberto Ramírez Guadarrama Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Dr. Roger Iván Rodríguez Vivas MV Certificado en Parasitología Laboratorio de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán M. en C. Carmen Rojas Martínez Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Dra. Evangelina Romero Callejas Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. Dr. José Alberto Rosado Aguilar Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán. M. en C. Noé Soberanes Céspedes Lapisa Salud Animal. Dr. Juan Felipe de Jesús Torres Acosta Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónomade Yucatán. Dr. Juan José Vargas Magaña Escuela Superior de Ciencias Agropecuarias. Universidad Autónoma de Campeche. Dr. Carlos A. Vega y Murguía MV Certificado en Parasitología Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Dr. Santiago Vergara Pineda Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro. Dr. Juan José Zárate Ramos MV Certificado en Parasitología Departamento de Parasitología Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nuevo León. ~ VII ~ El Comité de Parasitología y Parasiticidas (CPP) del Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal (CONASA) y la Asociación Mexicana de Parasitólogos Veterinarios A.C. (AMPAVE), han tenido a bien publicar el libro "Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en la salud pública y veterinaria". Este libro incluye los procedimientos y la metodología empleados para la identificación de parásitos: protozoarios, helmintos y artrópodos de importancia en la salud animal y pública. Durante los dos últimos años el CPP del CONASA acordó los temas a incluir e invitó a parasitólogos de todo el país, miembros de la AMPAVE a colaborar. A todos ellos una felicitación por su esfuerzo que ha concluido con la publicación de este libro que estamos seguros será de gran beneficio para la parasitología veterinaria y la salud pública del país. Dra. Consuelo Almazán García, presidenta de la AMPAVE 2010-2014 Dr. Juan Joel Mosqueda, presidente actual de la AMPAVE PREFACIO ~ VIII ~ ~ IX ~ La Parasitología es una rama de la Biología que trata el estudio integral del fenómeno del parasitismo, las relaciones existentes entre el parásito y el hospedero, así como los factores ambientales que influyen sobre esta comunidad. El reconocimiento de los parásitos y las enfermedades parasitarias depende en gran parte de los procedimientos diagnósticos de laboratorio y de campo que sirven para establecer, confirmar o descartar los diagnósticos presuntivos realizados durante el examen clínico. El diagnóstico de las enfermedades parasitarias depende principalmente del examen de las heces, orina, sangre, esputo y tejidos. Este diagnóstico de laboratorio será un elemento para que los profesionistas de la Parasitología, junto con los antecedentes y el estudio clínico-epidemiológico del caso, establezcan el diagnóstico definitivo que orientará al establecimiento de los programas de prevención y control del parasitismo. Existen en la literatura Mexicana y a nivel mundial, muchos textos sobre técnicas Parasitológicas para el diagnóstico de enfermedades en los animales y en el ser humano; sin embargo, muchos de ellos carecen de información actualizada, diagramas, ilustraciones, taxonomía, nomenclatura, etc. Por estas razones, en el seno de la Comisión de Parasitología y Parasiticidas del Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal (CONASA), así como de la Asociación Mexicana de Parasitólogos Veterinarios, A.C., se gestó la idea de elaborar el presente libro denominado " TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS CON IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA Y VETERINARIA". Este libro tiene como propósito proveer al lector una guía estandarizada sobre las técnicas de laboratorio y de campo para el diagnóstico de los parásitos internos y externos que afectan a los animales domésticos y silvestres. En esta edición se cuenta con la aportación de 39 expertos mexicanos de 12 reconocidas Instituciones. Los autores colaboradores de este libro cuentan con una amplia experiencia en el campo de la Parasitología Veterinaria y tienen un destacado reconocimiento a nivel nacional e internacional por sus investigaciones y en la formación de recursos humanos de alto nivel. Muchas de las técnicas diagnósticas presentadas en este libro están basadas en los protocolos establecidos de las campañas de control de enfermedades parasitarias en México. Mérida, Yucatán, México a Julio de 2014 Atentamente Dr. Roger Iván Rodríguez Vivas Coordinador de la edición Nombre del trabajo Fecha del boletín Volumen 1, nº 1 ÑLKÑL PRÓLOGO PRÓLOGO PRÓLOGO PRÓLOGO ~ X ~ ~ XI ~ Un profundo agradecimiento a los autores de los capítulos de este libro, quienes vertieron su gran experiencia en cada una de las técnicas diagnósticas presentadas. Quisera también agradecer a las Instituciones, revistas científicas y personas que proporcionaron esquemas, imágenes y cuadros. Extiendo mi agradecimiento a los integrantes de la Comisión de Parasitología y Parasiticidas del Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal (CONASA), así como a la Asociación Mexicana de Parasitólogos Veterinarios, A.C., por ser el grupo que gestó la idea de este libro y por darme la oportunidad y confianza para ser el coordinador general de esta edición. De igual modo a los colegas, Dr. Rodrigo Rosario Cruz, Dr. Rubén Hernández Ortiz, Dr. Alberto Rosado Aguilar, M. en C. Melina Ojeda Chi y M. en C. Luis Carlos Pérez Cogollo, quienes me apoyaron en la revisión exhaustiva de los capítulos y en la edición final del libro. Al M. en C. Franklin Quiñones Avila por el diseño de los animales en la portada. Quisiera manifestar mi profundo agradecimiento a mi esposa Rossana y a mis hijos Lizette e Iván, por el amor y cariño que les tengo, así como por tener la suficiente paciencia y comprensión a mi persona y a mi profesión, especialmente cuando me ven trabajando en la casa, rebándoles tiempo a la convivencia familiar. Por último, al Campus de Ciencias Biológica y Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Yucatán por darme la oportunidad de trabajar en esta prestigiada Institución y proporcionarme las facilidades para la edición de este libro. Nombre del trabajo Fecha del boletín Volumen 1, nº 1 ÑLKÑL TESTIMONIO DE GRATITUD ~ XII ~ ~ XIII ~ CAPÍTULO 1. MICROSCOPÍA 1 1.1. Introducción 3 1.2. Breve reseña histórica 3 1.3. Consideraciones especiales 5 1.3.1. Enfoque interpupilar 5 1.3.2. Enfoque ocular 6 1.4. Partes del microscopio compuesto moderno 6 1.4.1. Sistema mecánico del microscopio 6 1.4.2. Sistema óptico del microscopio 9 1.4.3. Óptica finita y óptica infinita 11 1.4.3.1. Estructura de los objetivos 12 1.4.3.2. Nomenclatura de los objetivos 12 1.4.4. El ocular 14 1.4.5. Sistema de iluminación 18 1.4.5.1. Fuentes de luz 19 1.4.6. Condensador 20 1.4.7. Diafragma o iris 22 1.5. Normas básicas para el cuidado del microscopio 22 1.5.1. Frecuencias en el cuidado del microscopio 24 1.5.1.1. Cuidados de frecuencia diaria 24 1.5.1.2. Cuidados de frecuencia mensual 24 1.5.1.3. Cuidados de frecuencia semestral 24 1.5.2. Procedimientos de limpieza. 25 1.6. Identificación y solución de los problemas más comunes 25 1.6.1. Sistema de iluminación 26 1.6.2. Sistema mecánico 27 1.6.3. Sistema óptico 28 1.6.4. Sistema operativo 30 1.7. Técnicas de microscopia. 31 1.7.1. Iluminación de Köhler 31 1.7.2. Iluminación de campo oscuro 33 1.7.3. Iluminación parcial de Rheinberg 34 1.7.4. Observación con luz polarizada 35 1.7.5. Observación con fluorescencia 36 1.7.6. Observación mediante contraste de fases 37 1.7.7. Fotomicrografía 38 1.7.8. Micrometría 38 Nombre del trabajo Fecha del boletín Volumen 1, nº 1 ÑLKÑL CONTENIDO Página~ XIV ~ CAPÍTULO 2. MUESTRAS BIOLÓGICAS Y MUESTREOS 44 2.1. Introducción 45 2.2. Técnica de colección de pasto 46 2.3. Colecta de muestras de heces compuestas en rumiantes y equinos 48 2.4. Colecta de muestras para Tritrichomonas foetus y Trichomonas gallinae 50 2.5. Colecta de ectoparásitos: ácaros, garrapatas, moscas, piojos y pulgas 57 CAPÍTULO 3. EXAMEN COPROPARASITOSCÓPICO 78 3.1. Introducción 79 3.2. Examen macroscópico 80 3.3. Examen microscópico 81 3.3.1. Técnica directa 81 3.3.2. Técnica de flotación 83 3.3.3. Técnica de Faust 90 3.3.4. Técnica de sedimentación (sedimentación múltiple, cualitativa) 95 3.3.5. Técnica de Graham 99 3.3.6. Técnica de McMaster 101 3.3.7. Técnica coproparasitoscópica en cama de pollo 106 3.3.8. Técnica de Kinyoun 109 3.3.9. Técnica de migración larvaria o Baermann 112 3.3.10. Técnica de cultivo larvario 115 3.4. Técnicas para el diagnóstico de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales 117 3.4.1. Técnica para la limpieza de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales por gradientes de densidad con sacarosa 117 3.4.2. Identificación de larvas infectantes de estrongilidos de rumiantes 118 3.4.3. Características morfológicas de las larvas infectantes de rumiantes 120 CAPÍTULO 4. EXAMEN DE LABORATORIO PARA PARÁSITOS DE LA SANGRE 129 4.1. Introducción 130 4.2. Diagnóstico de hemoparásitos: microfilarias y amastigotes del género Leishmania 130 4.3. Diagnóstico de microfilarias 131 4.3.1. Examen en fresco 131 4.3.2. Capa leucoplaquetaria o capa flogística (“Buffy coat”) 132 4.3.3. Técnica modificada de Knott (método de sedimentación) 132 4.3.4. Técnica de filtración sanguínea 134 4.3.5. Identificación e interpretación de microfilarias 135 4.4. Diagnóstico del género Leishmania 135 4.4.1. Diagnóstico de amastigotes de Leishmania spp. 135 4.4.1.1. Improntas de tejido 136 ~ XV ~ 4.4.1.2. Punción de ganglios y médula 136 4.4.1.3. Biopsias de piel 137 4.4.1.4. Frotis de material subyacente de úlceras 137 4.4.1.5. Frotis de líquido abdominal 138 4.4.1.6. Identificación e interpretación de amastigotes de Leishmania spp. 138 4.5. Diagnóstico de hemoparásitos: protozoarios y rickettsias 139 4.6. Interpretación del examen microscópico de frotis sanguíneo 140 CAPÍTULO 5. RECUPERACIÓN DE HELMINTOS A LA NECROPSIA 158 5.1. Introducción 160 5.2. Técnica para la recuperación de helmintos a la necropsia 161 5.2.1. Técnica para recuperar helmintos adultos (nematodos gastrointestinales, nematodos pulmonares y trematodos) a la necropsia 161 5.2.2. Obtención de nematodos del tracto gastrointestinal 162 5.2.3. Obtención de nematodos adultos del sistema respiratorio 163 5.2.4. Obtención de trematodos del hígado 165 5.2.5. Recuperación de nematodos inmaduros del tracto digestivo 166 5.3. Técnica para contar nematodos del tracto digestivo, del sistema pulmonar y complejo hepático 167 5.3.1. Técnica para contar nematodos del lumen del tracto gastrointestinal 168 5.3.2. Conteo de larvas de nematodos tisulares en el tracto gastrointestinal 169 5.3.3 Conteo de nematodos del sistema pulmonar y el complejo hepático 170 5.4. Identificación de nematodos adultos de los rumiantes 170 5.4.1. Aspectos generales en la identificación 171 5.4.2. Preparación de especímenes 174 5.4.3. Claves para determinar el género de los principales nematodos gastrointestinales 175 5.4.4. Claves para identificar géneros importantes de la familia Trichostrongylidae 175 5.4.5. Claves para identificar géneros importantes de la familia Strongylididae 184 5.4.6. Claves para identificar géneros importantes de la familia Trichuridae 185 5.4.7. Claves para identificar géneros importantes de la familia Chabertiidae 186 5.4.8. Claves para identificar géneros importantes de la familia Oxyuridae 190 5.4.9. Claves para identificar géneros importantes de la familia Ascarididae 190 ~ XVI ~ 5.4.10. Claves para identificar géneros importantes de la familia Ancylostomatidae 191 5.4.11. Claves para identificar géneros importantes de la familia Dictyocaulidae 193 5.4.12. Claves para identificar géneros importantes de la familia Protostrongylidae 194 5.5. Técnica para medir la longitud y contabilizar el número de huevos in utero de hembras de nematodos gastrointestinales 197 CAPÍTULO 6. TÉCNICAS PARA LA FIJACIÓN, PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE PARÁSITOS 200 6.1. Introducción 201 6.2. Recolección de parásitos al examen post mortem 201 6.3. Fijación y conservación de parásitos 202 6.3.1. Fijación de trematodos y cestodos para montaje 202 6.3.2. Conservación de parásitos 204 6.3.3. Aclarantes 205 6.3.4. Montaje de parásitos 206 6.3.5. Tinciones de parásitos 208 CAPÍTULO 7. PIOJOS DE IMPORTANCIA VETERINARIA 213 7.1. Introducción 214 7.2. Clasificación taxonómica de piojos 214 7.3. Morfología y ciclo biológico de piojos 214 7.4. Claves para subórdenes de piojos 217 7.5. Morfología de las diferentes familias de cada suborden 217 7.6. Esquemas de piojos de importancia médica veterinaria 218 7.7. Imágenes fotográficas de algunos piojos 226 7.8. Clave para la determinación de piojos de interés médico y veterinario 231 7.9. Recomendaciones finales 234 CAPÍTULO 8. PULGAS DE IMPORTANCIA VETERINARIA 237 8.1. Introducción 238 8.2. Clasificación taxonómica de las pulgas 238 8.3. Morfología general de las pulgas 239 8.4. Descripción de las principales pulgas que afectan a los animales domésticos 241 8.4.1. Familia Pulicidae 242 8.4.1.1. Género Ctenocephalides 243 8.4.1.2. Género Spilopsyllus 245 8.4.1.3. Género Echidnophaga 246 8.4.1.4. Género Pulex 247 8.4.1.5. Género Xenopsylla 248 8.4.1.6. Género Tunga 250 ~ XVII ~ 8.4.2. Familia Ceratophyllidae 251 8.4.2.1. Género Ceratophyllus 251 8.4.2.2. Género Nosopsyllus 252 CAPÍTULO 9. GARRAPATAS DE IMPORTANCIA VETERINARIA 258 9.1. Introducción 259 9.2. Metodología para la identificación de garrapatas 260 9.3. Definiciones taxonómicas 261 9.4. Clave para la identificación de la familia Ixodidae 265 9.4.1. Taxonomía del género Boophilus spp. 273 9.4.2. Taxonomía del género Amblyomma spp. 279 9.4.3. Taxonomía del género Dermacentor spp. 287 9.4.4. Taxonomía del género Anocentor nitens 292 9.4.5. Taxonomía del género Haemaphysalis leporispalustris 295 9.4.6. Taxonomía del género Ixodes scapularis 296 9.4.7. Taxonomía del género Rhipicephalus sanguineus 298 9.5. Clave para la identificación de la familia Argasidae 300 9.5.1. Taxonomía del género Argas 301 9.5.2. Taxonomía del género Ornithodoros 302 9.5.3. Taxonomía del género Otobius 303 CAPÍTULO 10. ÁCAROS DE IMPORTANCIA VETERINARIA 306 10.1. Introducción 307 10.2. Clasificación taxonómica de los ácaros 307 10.3. Morfología general de los ácaros 309 10.3.1. Orden Mesostigmata 309 10.3.2. Orden Trombidiformes 309 10.3.3. Orden Sarcoptiformes 310 10.4. Descripción de los principales ácaros que afectan a los animales 311 10.4.1. Orden Mesostigmata 311 10.4.1.1. Familia Macronyssidae 311 10.4.1.2. Familia Dermanyssidae 312 10.4.2.3. Familia Halarachnidae 313 10.4.2. Orden Trombidiformes 313 10.4.2.1. Familia Demodicidae 313 10.3.2.2. Familia Cheyletidae 316 10.4.2.3. Familia Trombiculidae 317 10.4.3. Orden Sarcoptiformes 318 10.4.3.1. Familia Sarcoptidae 318 10.4.3.2. Familia Psoroptidae 322 10.4.3.3. FamiliaEpidermoptidae 326 CAPÍTULO 11. MOSCAS DE IMPORTANCIA VETERINARIA 333 11.1. Introducción 334 11.2. Clasificación taxonómica de las moscas 334 ~ XVIII ~ 11.3. Morfología general de las moscas 334 11.4. Descripción de las principales moscas que afectan a los animales 335 11.4.1. Moscas del suborden Nematocera 335 11.4.1.1. Familia Psychodidae 335 11.4.1.2. Familia Ceratopogonidae 336 11.4.1.3. Familia Culicidae 337 11.4.1.4. Familia Simuliidae 339 11.4.2. Moscas del suborden Brachicera 340 11.4.2.1. Familia Tabanidae 340 11.4.2.2. Familia Calliphoridae 342 11.4.2.3. Familia Hippoboscidae 344 11.4.2.4. Familia Muscidae 345 11.4.2.5. Familia Oestridae 347 11.4.2.6. Familia Sarcophagidae 350 CAPÍTULO 12. DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA A LOS ANTIPARASITARIOS EN RUMIANTES 355 12.1. Introducción 356 12.2. Pruebas para determinar la resistencia antihelmíntica 358 12.2.1. Diagnóstico de campo para determinar la resistencia de los nematodos gastrointestinales a los antihelmínticos (prueba de reducción en el conteo de huevos en heces) 358 12.2.2. Pruebas in vitro para el diagnóstico de la resistencia hacia los antihelmínticos 364 12.2.2.1. Prueba de inhibición de la eclosión de huevos 364 12.2.2.2. Prueba de inhibición de la migración larval 371 12.3. Diagnóstico de laboratorio para determinar la resistencia de las garrapatas a los ixodicidas 379 12.3.1. Prueba de paquete de larvas 380 12.3.2. Prueba de inmersión de larvas 384 12.3.3. Prueba de inmersión de larvas modificada (ivermectina) 387 12.3.4. Prueba de inmersión de adultas 390 12.4. Diagnóstico de resistencia a los insecticidas en las moscas Haematobia irritans 392 CAPÍTULO 13. CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE PARÁSITOS VIVOS 404 13.1. Introducción 405 13.2. Protozoarios 405 13.2.1. Cultivo de Eimeria ninakohlyakimovae en células epiteliales intestinales caprinas 405 13.2.2. Cultivo de Babesia spp 410 13.2.3. Cultivo del Trypanosoma theileri 416 13.2.4. Cultivo y mantenimiento de Tritrichomonas foetus 421 ~ XIX ~ 13.3. Helmintos 428 13.3.1. Cultivos de nematodos gastrointestinales v.gr. Haemonchus 428 13.3.2. Coprocultivos del nematodo pulmonar Dictyocaulus viviparus 438 13.4. Artrópodos 440 13.4.1. Colonias de garrapatas 440 13.4.2. Colonias de dípteros (moscas) 446 CAPÍTULO 14. TRIQUINOSCOPÍA Y DIGESTIÓN ARTIFICIAL EN TEJIDO PARA EL DIAGNÓSTICO DE TRICHINELLA 461 14.1. Introducción 462 14.2. Triquinoscopía 462 14.2.1. Fundamento de la triquinoscopía 463 14.2.2. Materiales y equipo 463 14.2.3. Procedimiento 464 14.2.4. Interpretación de los resultados 465 14.2.5. Consideraciones 465 14.3. Digestión artificial 466 14.3.1. Fundamento de la digestión artificial 466 14.3.2. Materiales y equipo 467 14.3.3. Procedimiento 468 14.3.4. Interpretación de los resultados 470 14.3.5. Consideraciones 470 APÉNDICE - PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ESTUDIOS PARASITOLÓGICOS 473 15.1. Introducción 475 15.2. Conservadores y fijadores 475 15.2.1. Alcohol etílico al 70% 475 15.2.2. Alcohol etílico glicerinado 476 15.2.3. Dicromato de potasio al 2% 476 15.2.4. Alcohol metílico absoluto 476 15.2.5. Bouin 476 15.2.6. Bouin alcohólico 477 15.2.7. Formol o formalina 477 15.2.8. Formol-aceto-alcohol (F.A.A.) 477 15.2.9. Formol amortiguado al 10% 477 15.2.10. Formol neutro al 4% 478 15.2.11. Schaudinn 478 15.2.12. Solución de mentol 479 15.3. Aclarantes 479 15.3.1. Cloral lactofenol de Amann 479 15.3.2. Lactofenol 479 15.3.3. Xilol fenicado 480 15.3.4. Xilol fenicado creosotado 480 ~ XX ~ 15.4. Colorantes 480 15.4.1. Azul de lactofenol 480 15.4.2. Azul de metileno 481 15.4.3. Carmín acético 481 15.4.4. Carmín acético según Rausch 481 15.4.5. Carmín–bórax 482 15.4.6. Carmín de Semichon 482 15.4.7. Carmín propiónico 483 15.4.8. Fucsina ácida de Gag 483 15.4.9. Fucsina básica 483 15.4.10. Giemsa 484 15.4.11. Hematoxilina de Delafield 484 15.4.12. Hemalumbre de Mayer 485 15.4.13. Horen 485 15.4.14. Paracarmín de Mayer 486 15.4.15. Rojo neutro 486 15.4.16. Tricrómica de Gomori 486 15.4.17. Verde brillante 487 15.4.18. Wright 487 15.4.19. Ziehl-Neelsen modificada 487 15.5. Medios de montaje 488 15.5.1. Bálsamo de Canadá 488 15.5.2. Gelatina glicerinada 488 15.5.3. Líquido de Hoyer 489 15.6. Otras soluciones 489 15.6.1. Alcohol etílico ácido 489 15.6.2. Alcohol etílico alcalino 489 15.6.3. Dilución de bilis con solución salina fisiológica 489 15.6.4. Jugo gástrico artificial 490 15.6.5. Solución de ácido sulfúrico al 0.1 normal 490 15.6.6. Solución de ácido sulfúrico al 10% 490 15.6.7. Solución de flotación con sacarosa 491 15.6.8. Solución de flotación con cloruro de sodio saturado 491 15.6.9. Solución de flotación con nitrato de sodio 491 15.6.10. Solución de flotación con sulfato de magnesio 491 15.6.11. Solución de flotación con sulfato de zinc 492 15.6.12. Solución de hidróxido de potasio al 10% 492 15.6.13. Solución de hidróxido de sodio al 5% 492 15.6.14. Solución de lugol (solución madre) 493 15.6.15. Solución salina fisiológica al 0.85% 493 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 1 ~ CONTENIDO 1.1. Introducción 1.2. Breve reseña histórica 1.3. Consideraciones especiales 1.3.1. Enfoque interpupilar 1.3.2. Enfoque ocular 1.4. Partes del microscopio compuesto moderno 1.4.1. Sistema mecánico del microscopio 1.4.2. Sistema óptico del microscopio 1.4.3. Óptica finita y óptica infinita 1.4.3.1. Estructura de los objetivos 1.4.3.2. Nomenclatura de los objetivos 1.4.4. El ocular 1.4.5. Sistema de iluminación 1.4.5.1. Fuente de luz 1.4.6. Condensador 1.4.7. Diafragma o iris 1.5. Normas básicas para el cuidado del microscopio 1.5.1. Frecuencias en el cuidado del microscopio 1.5.1.1. Cuidados de frecuencia diaria 1.5.1.2. Cuidados de frecuencia mensual 1.5.1.3. Cuidados de frecuencia semestral 1.5.2. Procedimientos de limpieza. 1.6. Identificación y solución de los problemas más comunes 1.6.1. Sistema de iluminación 1.6.2. Sistema mecánico 1.6.3. Sistema óptico Dr. Juan José Zárate Ramos1 Dra. Yazmín Alcalá Canto2 1Departamento de Parasitología FMVZ-UANL. Monterrey, Nuevo León. 2Departamento de Parasitología FMVZ-UNAM, México, D.F. MICROSCOPÍA Capítulo 1 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 2 ~ 1.6.4. Sistema operativo 1.7. Técnicas de microscopia. 1.7.1. Iluminación de Köhler 1.7.2. Iluminación de campo oscuro 1.7.3. Iluminación parcial de Rheinberg 1.7.4. Observación con luz polarizada 1.7.5. Observación con fluorescencia 1.7.6. Observación mediante contraste de fases 1.7.7. Fotomicrografía 1.7.8. Micrometría Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 3 ~ 1.1. INTRODUCCIÓN El microscopio es un instrumento muy valioso que permite aumentar la imagen de los objetos para hacerlos visibles al ojo humano. Los Microscopios se utilizan para observar la forma de las bacterias, hongos, parásitos y células del hospedero en diversas preparaciones que son observadas de forma directa o teñidas con distintos colorantes. Los microscopios que más se utilizan en la prácticaclínica son los microscopios de luz. Se les llama microscopios de luz, ya que utilizan un haz de luz para ver las muestras. El microscopio compuesto es el instrumento más utilizado para observar estructuras en microbiología. Se compone de dos sistemas de lentes (combinación de lentes) para ampliar la imagen. Cada lente tiene un poder de aumento diferente. Los microscopios compuestos de luz con un ocular sencillo se llaman monoculares o con dos oculares se les denomina binoculares. En el presente capítulo se abordará una breve historia de los orígenes del microscopio, sus pastes, sus sistemas, los cuidados básicos, así como la detección y en su caso la alternativa de corrección de los problemas más frecuentes finalmente se aborda algunas de las técnicas más usadas en el área de la microscopia de luz. 1.2. BREVE RESEÑA HISTÓRICA Los orígenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la ciudad de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas con el mundo del espectáculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el telescopio. Hans Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes de anteojos, se mencionan como posibles inventores. Sin embargo, algunos atribuyen a Galileo Galilei su invención en la primera mitad del siglo XVII, gracias a que difundió el microscopio y su uso. El microscopio compuesto original consistía en dos o más lentes colocadas en un tubo rígido (Parker, 1933). Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van Leeuwenhoek, de Holanda; R. Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek fabricó un microscopio simple (Ross et al., 2005) (Figura 1.1) y Hooke utilizó un microscopio compuesto. Los instrumentos empleados por Leeuwenhoek eran superiores a aquellos utilizados por Hooke, en parte debido a que se desconocía el efecto de las aberraciones de las lentes y como corregirlas. El microscopio compuesto de Hooke sumaba los defectos de los dos juegos de lentes (objetivo y ocular), dificultando la observación, de manera que en la historia de la microscopía fue Leeuwenhoek quien realizó la mayor cantidad de descubrimientos con su microscopio simple. Sin embargo, el microscopio compuesto fue el instrumento con más futuro. El instrumento de Hooke del año 1665 tenía las partes básicas, dos lentes (una que aumentaba la imagen de la otra), una Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 4 ~ estructura mecánica, mecanismos de enfoque y un frasco esférico para concentrar la luz (Figura 1.2). Desde entonces se han realizado considerables mejoras de los microscopios. Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios apropiados y mejorados por modelos con bases en trípode y la conocida base en herradura; no obstante, el verdadero microscopio útil apareció con la invención de las lentes acromáticas, desarrolladas en Inglaterra por Chester Moore Hall en 1729. El desarrollo de los instrumentos de óptica es inseparable de la industria del vidrio y la fabricación de las lentes (Turriere, 1925). Sin embargo, aún era difícil fabricar lentes acromáticas poderosas y a finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la comercialización de objetivos acromáticos. Las lentes con mayores aperturas numéricas fueron realizadas alrededor de 1890. Un fabricante famoso de microscopios de calidad superior era la firma de Powell y de Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder, apocromáticos y de inmersión con una apertura numérica de 1,50. Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realizó objetivos de inmersión diseñados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teoría óptica de las lentes del microscopio y desarrolló el diseño de las mismas basado en un procedimiento matemático riguroso (Richards, 1972). A finales del siglo XIX los microscopios de campo claro fueron modificados para obtener campo oscuro y polarización, detalles que permitieron incrementar el contraste. A principios del siglo XX la fabricación de microscopios se concentró en Alemania y en los años sucesivos se desarrolló la fluorescencia, contraste de fase, interferencia, holografía, luz ultravioleta, rayos X, métodos con electrones y protones, microscopios computarizados para la observación, cuantificación y análisis tridimensional. Estos instrumentos abrieron muchas posibilidades en el campo de la microscopía. Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas necesidades, haciendo microscopios más efectivos, de uso universal, capaces de utilizar el tipo de radiación (luz visible o no) que revele de la mejor manera posible la naturaleza del espécimen y convierta detalles invisibles de la imagen en un patrón visible que pueda ser analizado. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 5 ~ Figura 1.1. Microscopio de Leeuwenhoek. La lente está instalada entre dos placas de bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un tornillo, de manera que se puede regular en forma precisa la distancia entre el objeto y la lente. Modificado de imágenes. Ministerio de Educación y Ciencia. España (Banco de imágenes. Ministerio de Educación y Ciencia. España. Recuperado en Noviembre 30, 2007, de la World Wide Web: http://recursos.cnice.mec.es/bancoimagenes2/buscador/index.php). Figura 1.2. Microscopio utilizado por Hooke. Tomado de Lanfranconi, M. Historia de la Microscopía. (Lanfranconi, M. Historia de la Microscopía. Introducción a la Biología. Fac. de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad Nacional de Mar de Plata. Recuperado en Noviembre 30, 2007, de la World Wide Web: http://www.mdp.edu.ar/exactas/biologia/grupos/version%201_1/Practicos/archivo s/049_055_LECTURA_Microscopia.pdf). 1.3. CONSIDERACIONES ESPECIALES 1.3.1. Enfoque interpupilar El espacio entre los ojos es variable para cada persona. Necesita ajustar los oculares a su distancia interpupilar, para ver por los dos oculares un solo campo luminoso. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 6 ~ Encienda el microscopio a una intensidad confortable. Ahora mire por los oculares. Verá un campo luminoso con el ojo izquierdo y otro con el ojo derecho. Para lograr la distancia interpupilar correcta continúe viendo el campo a través de un ocular mientras acerca o separa los oculares, ya sea usando la rosca entre ambos o tomando los oculares con ambas manos y presionando para juntarlos o separarlos. Cuando la imagen del ojo izquierdo y la imagen del ojo derecho se fusionan o juntan y se ve un solo campo luminoso con ambos ojos, habrá encontrado su distancia correcta. 1.3.2. Enfoque ocular El siguiente paso es el de ajustar los oculares a cada ojo. Si no hace esto, nunca verá una imagen nítida. Enfoque la preparación con el micrométrico lo más claro que pueda, viendo con ambos ojos. Ahora coloque una tarjeta enfrente del ojo izquierdo y vuelva a enfocar lo más claro que pueda, haciendo girar suavemente la rosca micrométrica o la micrométrica. Cuando logre esto, coloque la tarjeta cubriendo el ojo derecho. Al hacer esto, ya no toque ni el macro ni el micro enfoque. Para enfocar la imagen, mueva la rosca del ocular izquierdo hacia un lado u otro hasta que vea nítidamente el objeto enfocado. Ahora los oculares ya están ajustados a cada ojo, asegurando así una observación clara y que la vista no se canse ni se esfuerce. 1.4. PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO MODERNO El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio óptico debido a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas. Está constituido por cuatro gruposde dispositivos o sistemas articulados de tal manera que garantizan un funcionamiento óptimo y ergonómico (Abbe, 1878) (Figura 1.3). 1.4.1. Sistema mecánico del microscopio La parte mecánica del microscopio también se denomina montura y es de forma y dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el precio del instrumento. De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeños o portátiles. Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un trabajo profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para realizar los trabajos más variados y su costo es el más elevado. Los modelos medianos no convienen a todo tipo de investigación pero son más prácticos puesto que su precio es menor gracias a su construcción más simple. Los microscopios portátiles responden a necesidades más restringidas y producen aumentos menores, conviniendo para observaciones someras. Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o base, mecanismo de enfoque, la platina, el revólver y el tubo del ocular. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 7 ~ Figura 1.3. Microscopio compuesto moderno con sus partes. Modificado de District School Board of Niagara (District School Board of Niagara. Recuperado en Noviembre 29, 2007, de la World Wide Web: http://www.dsbn.edu.on.ca/schools/Westlane /Science/simon/SBI3C1/micro.gif). a) Pie o base. Generalmente tiene forma de “herradura” o “Y”, aunque también puede ser rectangular, con un peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la fuente de iluminación y puede contener un mecanismo para regular la intensidad luminosa. Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato. La columna puede ser inclinada; en su parte más inferior se dispone el condensador y la parte superior posee una cremallera que permite desplazar en sentido vertical el condensador, la platina o el revólver y el tubo. Las ventajas que procura el microscopio inclinado son múltiples y la posición es más confortable para el observador (actividad que es muy incómoda cuando el tubo del microscopio es vertical). b) Mecanismo de enfoque. Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el espécimen o el revólver donde están colocados los objetivos, de modo que se pueda centrar el punto focal del objetivo que se está utilizando en ese Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 8 ~ momento. Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rápido del tornillo macrométrico y segundo, otro lento del tornillo micrométrico. La cremallera que permite el movimiento rápido del tornillo macrométrico posee dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para subirlos rápidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el preparado histológico. El tornillo micrométrico por el contrario posee una graduación que permite que cada división de la rosca tenga un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0.001 mm. Esta disposición permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos, considerando el número de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte más superficial y luego la más profunda. El movimiento del tornillo micrométrico tiene una extensión de 5 mm aproximadamente y está limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los objetivos de mayor aumento (Langueron, 1949). c) La platina. Es el soporte horizontal donde se colocan las distintas preparaciones que pretendemos examinar. Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador. Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijación e inmovilización de la lámina porta-objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro. Este dispositivo permite el examen metódico y completo de la preparación al proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia atrás y de derecha a izquierda y viceversa. Otra pieza, el vernier (denominado así gracias al nombre de su inventor en 1631), también llamado nonius, consiste en dos pequeñas reglas graduadas en milímetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura determinada en la preparación. En la práctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y más difícil aún colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestión. Además, estas cifras solo son válidas para el microscopio en el cual se obtuvieron. Hay otros procedimientos más simples para tal fin (Langueron, 1949.; Abramowitz, 2003). d) El revólver. Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que permite el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento de rotación. El revólver está constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que está colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual manera, alojar un número variable de objetivos (dos, tres, cuatro o más). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 9 ~ c) El tubo Soporta la porción óptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable, cuyo interior está pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formación de reflejos y facilitar la observación. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la microfotografía, hay un tercer tubo accesorio, generalmente más largo y vertical que sirve para conectar una cámara fotográfica sin necesidad de lente ocular. 1.4.2. Sistema óptico del microscopio Los microscopios modernos están diseñados para proporcionar imágenes aumentadas y nítidas de los especímenes es que se observan. Los componentes ópticos están colocados en una base estable que permite un intercambio rápido y un alineamiento preciso. El sistema óptico está constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular. a) Los objetivos. Representan el componente óptico más importante del microscopio. Su principal función consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio. Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje óptico del sistema. Sus lentes están hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento, resolución y de la corrección de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales. Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones y existen dos categorías de objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En cada categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersión (Abramowitz, 2003): • Objetivos acromáticos. Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrección de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo esacromático cuando no posee ninguna denominación. • Objetivos semi-apocromáticos. Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor diseñados para la microfotografía en colores. • Objetivos apocromáticos. Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 10 ~ oscuro, azul, rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos objetivos poseen mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observación se presenta un poco curvo. Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos, plan-fluoritas o plan-apocromáticos. Objetivos secos y objetivos de inmersión. Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objetos de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objetos (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersión el medio que separa al cubre-objetos de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua destilada (n=1.33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción (n=1.515) casi idéntico al del vidrio. La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (Langueron, 1949 (Figura 1.4) y sólo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento (Möllring, 1970). Figura 1.4. A la izquierda el espacio entre el cubreobjeto (1) y el objetivo (2) es ocupado por el aire; a la derecha el espacio es ocupado por un líquido de inmersión (3). Apréciese que el cono de luz y el ángulo a son mayores con inmersión. Modificado de de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (Kapitza, H. G. (1997). Microscopy from the very begining. (2ª ed.). Carl Zeiss Jena GmbH Frankfurt: Dipl.Bibl. Susanne Lichtenberg). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 11 ~ 1.4.3. Óptica finita y óptica infinita La microscopía de luz o fotónica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas ópticos en los últimos años. El tubo que soporta tanto el revólver por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160 mm y en algunos casos (Leitz) a 170 mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es rectilíneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para fotografía. Emplear objetivos diseñados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente. Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los fabricantes están elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseñados para realizar una corrección infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con esta corrección poseen el símbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparición de imágenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos nuevos modelos son de mayor tamaño (Wegerhoff et al., 2005) (Figura 1.5). Figura 1.5. Esquema que muestra el principio de los objetivos con corrección al infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center (Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Diciembre 10, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/tubelength.html). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 12 ~ 1.4.3.1. Estructura de los objetivos Generalmente es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti- reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (Figura 1.6). En la parte externa posee grabadas las especificaciones y características. Figura 1.6. Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esférica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Noviembre 28, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com). 1.4.3.2. Nomenclatura de los objetivos La identificación de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias para su uso apropiado (Langueron, 1949; Davison y Abramowitz, 2007). La minuciosa información, generalmente en el idioma inglés, puede contener (Figura 1.7): Nombre del fabricante: Casa comercial. Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0.5X hasta 200X. Correcciones ópticas: Achro, Achromat (acromáticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromáticos); Apo (apocromáticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante. Apertura numérica: Es un valor que indica el ángulo de apertura del cono luminoso. Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milímetros (160, 170, 220) o con el símbolo para objetivos con corrección infinita. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 13 ~ Espesor del cubre-objetos a emplear: Ha sido estandarizada a 0.17 mm pero existen diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de corrección en las lentes internas para realizar la corrección y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada móvil para el ajuste. Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milímetros. Propiedades ópticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados óptimos (para luz polarizada, contrastede fase, entre otros). Rosca del objetivo: La mayoría de objetivos están estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan con las siglas RMS; sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El diámetro general es de 20 mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca más amplia y sólo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente. Medio de inmersión: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersión y para ello se emplea un código de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol). Código de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para facilitar la identificación del aumento (Cuadro 1.1). Figura 1.7. Nomenclatura del objetivo. Las propiedades ópticas especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Noviembre 28, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 14 ~ 1.4.4. El ocular El ocular (del latín oculus = el ojo) está formado por lentes que generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones: Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la imagen. Aplana y aclara el campo óptico o plano circular en el que aparece el objeto. La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior también se denomina colectora y es la que aplana y aclara el campo (Figura 1.8). Cuadro 1.1. Códigos de color en los objetivos microscópicos más usados en investigación. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Noviembre 28, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com). Código de color de inmersión Medio de inmersión Negro Aceite Naranja Glicerol Blanco Agua Rojo Especial o multiuso Código de color de aumento Aumento Negro 1X, 2.5X Marrón 2X, 2.5X Rojo 4X, 5X Amarillo 10X Verde 16X, 20X Azul turquesa 25X, 32X Azul celeste 40X, 50X Azul cobalto 60X, 63X Blanco, crema 100X, 250X, 200X Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 15 ~ Figura 1.8. Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (Digit Life. Recuperado en Diciembre 10, 2007, de la World Wide Web: http://www.digit- life.com/articles/intelplayqx3/index.html). A continuación se mencionan los tipos de oculares que existen y pueden ser utilizados para el estudio de los parásitos. Oculares de Huygens. Empleados con los objetivos acromáticos y formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad está dirigida hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. También denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy común en modelos de microscopios antiguos (Langueron, 1949). Oculares de Ramsden. Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas entre sí y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera óptima con los objetivos corregidos al infinito (Davison y Abramowitz, 2007). Oculares compensadores. Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromática de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromáticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromáticos secos. Oculares de proyección. Posee una lente que permite la proyección de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibición. Oculares aplanéticos. Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolución es igual tanto en el centro como en la periferia del campo óptico. Oculares peri-planáticos. Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular (Langueron, 1949). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 16 ~ Uno de los diseños de oculares más avanzados es el ocular Periplan (Figura 1.9) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromáticas, la curvatura de campo y su empleo óptimo es en combinación con objetivos de gran poder de aumento. Figura 1.9. Diagrama de la constitución del ocular Periplan. Es un ocular negativo. Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Noviembre 28, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com). Los modelos de microscopios más simples poseen un solo ocular (mono-oculares); sin embargo, existen microscopios binoculares y algunos modelos más modernos son trinoculares, especiales para la microfotografía. Los binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinación de 45º para realizar la observación cómodamente. Campo del microscopio: Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en el ocular. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo está determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy útil al realizar estudios de coprología o hematología, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de observación de la preparación, lo cual se dificulta con un campo circular clásico al quedar zonas superpuestas. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 17 ~ El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10X, 12.5X, 15X, 20X o 25X. Otro valor es el número de campo que consiste en el diámetro en milímetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18 mm hasta 26.5 mm. Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus características: UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio. H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observación microscópica. K, C, comp: Para oculares compensadores. Plan-comp: Objetivosque corrigen curvatura de campo y dan campos planos. Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificación o medición de estructuras del espécimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el número, tamaño o dimensiones de las células y demás elementos del tejido. Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio con una escala o gradilla, la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del espécimen al encontrarse en el plano de formación de la misma. Los oculares para la medición poseen un mecanismo de enfoque mediante rotación. Se debe calibrar la escala del ocular micrométrico (Figura 1.10) con cada objetivo que se use. En la actualidad se puede emplear algún software de computación para realizar mediciones sobre las imágenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el método más económico y de uso más generalizado es la medición con los oculares. En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre, pestaña, cerda) denominada señalador, con la finalidad de indicar de manera específica alguna estructura en particular en el campo de observación. El señalador se aprecia como una línea oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo. Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observación y por otra, impedir la formación de reflejos luminosos que dificulten la visualización. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptrías en caso que el observador posea una disminución de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 18 ~ Figura 1.10. Fotografía de un Ocular Micrométrico. 1.4.5. Sistema de iluminación El sistema de iluminación está constituido por las partes del microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la observación microscópica. Uno de los aspectos críticos a considerar en la microscopía óptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espécimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se verá afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema óptico. La iluminación óptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observación. Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine fotónico. En sus inicios, la microscopía se practicaba con iluminación por reflexión; se utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lámparas de aceite o petróleo) y la desviaba hacia la preparación. Este método se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el vacío y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino, carbón, tungsteno, entre otros) que al paso de una corriente eléctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar. Con el uso de la bombilla eléctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios actuales, desde los más sencillos y económicos hasta los más sofisticados, aún poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en el caso que ésta no se encuentre alineada con la platina. El sistema de iluminación está constituido por la fuente de luz, el condensador y un diafragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminación está colocado debajo de la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la mayoría de los Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 19 ~ casos el estudio de las preparaciones histológicas se hace por transiluminación. En otros casos muy específicos se emplea el método de luz reflejada, en el cual se ilumina la superficie del espécimen mediante epi-iluminación. La fuente de luz emite una radiación que es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un cono luminoso necesario para la visualización con objetivos de mayor aumento. Fuentes de luz Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen numerosas fuentes de iluminación artificial, tanto para la observación rutinaria como para la microfotografía. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la constancia, la uniformidad y la intensidad; además es muy favorable para los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial: Bombillas de tungsteno y halógenas: La mayoría de microscopios de luz están dotados de lámparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lámparas son radiadores térmicos que emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300 y 1200 nm. Están constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que es activado por una corriente eléctrica produciendo una importante cantidad de luz y calor. Varían mucho en tamaño, diseño y forma. Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy brillante para la observación y se reduce con filtros que disminuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la intensidad sin alterar los colores. También se emplean filtros de colores que compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del espécimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el tinte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la definición. Lámparas de arco eléctrico: Son lámparas que pueden contener gases (vapor de mercurio, xenón o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromática con filtros apropiados, es ideal para microfotografía en blanco y negro o a colores. También se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia). Láser: En los últimos años se ha incrementado el uso de láser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificación de Luz por Emisión Estimulada de Radiación), que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con características de tamaño, coherencia, forma y pureza controladas. El láser de argón es uno de los más utilizados, cuya emisión está en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente en microscopía confocal. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 20 ~ LED: De las siglas en inglés Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un dispositivo emisor de luz con características muy próximas a la luz monocromática (espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente eléctrica pasa a través del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que están hechos. Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lámparas. En comparación con las bombillas incandescentes, son más interesantes porque permiten ahorro de energía con un mayor rendimiento lumínico. Para microscopía se emplean LED de larga duración que provee una luz muy brillante y fría; esto último es una gran ventaja, ya que no genera calor y la observación es más cómoda para el usuario. En la actualidadse producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca. 1.4.6. Condensador Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El término condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensación de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la sección del cono luminoso que a su vez forma una imagen más clara. El condensador está conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espécimen. El primer condensador que se fabricó en 1838 (por Dujardin) poseía tres lentes acromáticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y también producen aberraciones, sin embargo, éstas también pueden corregirse. Tipos de condensadores de acuerdo al grado de corrección de aberraciones ópticas (Davison y Abramowitz, 2007): Condensador de Abbe: Es el más simple, sin corrección de aberraciones y el más económico. Compuesto de dos o más lentes. Puede llegar a tener una apertura numérica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observación de rutina y con objetivos de modesta apertura numérica y amplificación. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminación que puede producir. Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad. Acromático: Corrige aberraciones cromáticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es útil para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografía (blanco y negro o color). Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección para microfotografía a color con luz blanca. Puede Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 21 ~ contener ocho lentes y su uso es óptimo con inmersión y objetivos de mayor aumento. El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada para optimizar la intensidad y el ángulo de apertura. Cada vez que se cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la apertura numérica del nuevo objetivo. A menudo no es práctico utilizar el mismo condensador para un amplio rango de objetivos (2X hasta 100X). Para objetivos de bajo poder de aumento (menor a 10X) algunos condensadores poseen una lente frontal adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante un mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercándolo o no a la platina donde está colocado el espécimen (Figura 1.11). Además de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro, existe una variedad de modelos de condensadores especializados que se utilizan en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento del contraste entre los detalles de la estructura del espécimen. Se han desarrollado condensadores especiales para microscopía de campo oscuro, contraste de fase, luz polarizada y contraste de interferencia diferencial. Figura 1.11. Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotónico. El medio de inmersión, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el preparado histológico como entre el preparado y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Noviembre 28, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 22 ~ 1.4.7. Diafragma o iris Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros diafragmas consistían en un disco de metal con agujeros de diferente diámetro, el cual se rotaba según la necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo más elaborado y con un diseño que le permite cambiar de diámetro. La apertura del diafragma se regula en relación con el tipo de objetivo que se esté utilizando. El diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto (Davis, 1882) (Figura 1.12). Figura 1.12. Iris con mecanismo para variar la apertura. Tomado de Cross M, Cole M. Modern Microscope (Cross, M., Cole, M. (1912). Modern Microscopy. A Handbook for Beginners and Students. (4ª ed.). Chicago: Chicago Medical Book Company). 1.5. NORMAS BÁSICAS PARA EL CUIDADO DEL MICROSCOPIO Al ser el microscopio un aparato de precisión y, por lo tanto, delicado, es muy conveniente asegurar un buen funcionamiento atendiendo siempre a las siguientes normas: Para transportar el microscopio deben utilizarse siempre las dos manos, sujetándolo por el brazo con una mano y por el pie con la palma de la otra. Una vez colocado el microscopio en su sitio, no debe moverse hasta que finalice la práctica. Cuando se vaya a cambiar de observador se debe mover él y no el microscopio. Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del microscopio. Nunca poner los dedos en las lentes del ocular ni del objetivo. Si se ensucian dichas lentes se limpiarán con un paño suave de algodón, sin utilizar ningún disolvente. No sacar de su sitio el ocular ni los objetivos, a no ser que vayan a ser sustituidos, en cuyo caso la operación debe realizarse lo más rápidamente posible, para evitar la entrada de polvo. Asegurarse de que el portaobjetos está bien seco cuando va a ser colocado sobre la platina. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 23 ~ Al enfocar, sobre todo con los objetivos de mayor aumento, hay que evitar que el extremo del objetivo choque con la preparación. Para ello acercaremos el objetivo a la preparación mirando lateralmente y luego, mirando ya a través del ocular, enfocamos alejando el objetivo. Muchos errores y accidentes en la práctica microscópica se pueden evitar atendiendo las siguientes normas básicas del uso del microscopio (Möllring, 1970): Quitar la funda protectora del microscopio. Enchufar el microscopio. Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Este pasó en muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitirá la observación de una panorámica del preparado histológico y la ubicación de áreas de interés para su análisis posterior. Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente. Colocar la laminilla histológica sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y sujetándola con las pinzas. Colocar la lámpara en la posición correcta y encenderla. Enfoque la lámina mirando a través del ocular y lentamente mueva el tornillo macrométrico. Recorra todo el preparado histológico y haga sus observaciones. Sitúe la lámina en el sitio donde debe seguir observando a mayor aumento. Cambie al objetivo de mediano aumento (10X) y para lograr el enfoque siga moviendo lentamente el tornillo macrométrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar ligeramente enfocada gracias a que la mayoría de microscopios son parafocales, es decir, una vez logrado el primer enfoque, al pasar al objetivo de aumento inmediato superiorla imagen queda en un foco aproximado y solo se debe realizar un ajuste. Realice la observación y haga sus anotaciones. Determine cuál es la estructura que va a observar a mayor aumento y colóquela en el centro del campo. Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta con el objetivo anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen sólo se debe enfocar girando única y lentamente el tornillo micrométrico. Nunca se debe utilizar el tornillo macrométrico con los objetivos de mayor aumento, ya que al estar éste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo. Si al pasar al objetivo de mayor aumento se pierde el enfoque, es recomendable verificar si el cubre-objetos esta hacia arriba. Si la lámina se coloca invertida, no se podrá lograr el enfoque con este objetivo. Comience nuevamente con los enfoques a menores aumentos y repita la operación desde el principio. Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observación moviendo constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abra o cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste. Haga sus observaciones. Una vez finalizada la observación, coloque nuevamente el objetivo de menor aumento para retirar más fácilmente el preparado histológico. Retire el preparado histológico y colóquelo el porta-láminas. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 24 ~ Apague la lámpara, desenchufe y coloque el cable alrededor del microscopio, de manera holgada y sin apretarlo. Cubra el microscopio con la funda protectora. 1.5.1. Frecuencias en el cuidado del microscopio 1.5.1.1. Cuidados de frecuencia diaria (después del uso) A continuación se señalan los cuidados diarios que se deben realizar al microscopio: Limpiar el aceite de inmersión del objetivo 100X. Usar papel para limpieza de lentes o en su defecto algodón tipo medicinal. Limpiar el carro porta muestras. Limpiar el condensador. Colocar el reóstato de control de intensidad luminosa en la posición mínima y luego apagar completamente el sistema de iluminación. Cubrir el microscopio con una funda protectora plástica o de tela. Asegurar que queda ubicado en un lugar bien ventilado, en el cual estén controladas la humedad y la temperatura. Si se dispone de caja de almacenamiento ventilada dotada con bombillo para control de humedad, colocar allí el microscopio, encender la lámpara y cerrar la puerta de la misma. 1.5.1.2. Cuidados de frecuencia mensual A continuación se señalan los cuidados que se deben realizar al microscopio cada mes: Remover las partículas de polvo que pueda tener el cuerpo del microscopio. Usar una pieza de tela humedecida con agua destilada. Retirar las partículas de polvo de los oculares, objetivos y del condensador. Utilizar la pera para soplar aire. A continuación, limpiar la superficie de los lentes con solución limpiadora de lentes. No aplicar directamente esta solución a los lentes, sino en papel para limpiar lentes y luego frotar suavemente la superficie de los mismos con el papel mencionado. Retirar el mecanismo de sujeción de las placas porta muestras; limpiar cuidadosamente y reinstalar. 1.5.1.3. Cuidados de frecuencia semestral Como complemento a las rutinas mensuales de mantenimiento se recomienda lo siguiente: Efectuar una inspección visual general del microscopio. Verificar que cada componente se encuentre en buen estado, esté limpio y bien ajustado mecánicamente. Verificar que en el lugar de instalación se conserven las condiciones de buena ventilación, control de humedad y temperatura. Comprobar la calidad del sistema eléctrico que alimenta el microscopio. Verificar la integridad de los conectores, los fusibles y la lámpara incandescente. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 25 ~ 1.5.2. Procedimientos de limpieza La limpieza del microscopio es una de las rutinas más importantes y debe considerarse un procedimiento rutinario. Para realizar la rutina de limpieza se requiere los siguientes materiales: Materiales: Una pieza de tela limpia, de textura similar a los pañuelos. Una botella de líquido para limpieza de lentes. Se consigue en las ópticas. Normalmente no afecta los recubrimientos de los lentes y tampoco afecta los pegantes o cementos utilizados para el montaje de los mismos. Entre los líquidos de limpieza más utilizados se encuentran el etil éter, el xileno y la gasolina blanca. Papel para limpieza de lentes. Se consigue normalmente en las ópticas. Si no es posible conseguir este material, se puede sustituir con papel absorbente suave o con algodón tipo medicinal. También puede utilizarse un trozo de seda suave. Una pieza de gamuza muy fina. Se puede conseguir en peleterías. Una pera de caucho para soplar aire. Se puede fabricar en el laboratorio un dispositivo con este propósito, acoplando una pipeta tipo Pasteur, con la pera de caucho. Una cubierta plástica. Se utiliza para proteger el microscopio del ambiente externo cuando no está en uso. También podría utilizarse una bolsa de tela de textura similar a los pañuelos. Un pincel suave de pelo de camello o un pincel fino para pintura. Lo importante es que el pelo del pincel sea natural, de longitud uniforme, textura muy suave, esté seco y libre de grasa. En los almacenes que distribuyen artículos de fotografía, es posible conseguir este accesorio. También es posible encontrar un equivalente en tiendas especializadas en suministro de cosméticos. Un paquete 250 g de material desecante (sílica gel). Este material se utiliza para mantener controlada la humedad en la caja de almacenamiento del microscopio, si la misma es hermética. Este material cambia de color cuando se encuentra saturado de humedad, aspecto que permite detectar si requiere ser sustituido o renovado. Cuando está en buen estado, por lo general, es de color azul; cuando se encuentra saturado de humedad, es de color rosado. Bombillos y fusibles de repuesto. De la clase instalada por el fabricante o un equivalente de las mismas características del original. 1.6. IDENTIFICACIÓN Y SOLUCIÓN DE LOS PROBLEMAS MÁS COMUNES A continuación se presentan algunos de los problemas más comunes que presentan los microscopios respecto a su funcionamiento y soluciones prácticas. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 26 ~ 1.6.1. Sistema de Iluminación PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN El sistema de iluminación no enciende. El cable de alimentación eléctrica esta desconectado. Conectar el cable de alimentación eléctrica. El fusible de protección está quemado. Reemplazar el fusible de protección. El bombillo esta quemado. Reemplazar el bombillo de iluminación. Asegurar que el mismo quede bien alineado. El interruptor de encendido está defectuoso. Reemplazar el interruptor de encendido. El sistema de iluminación no produce luz uniforme. El sistema eléctrico presenta fallas de voltaje. Revisar y reparar el sistema eléctrico. Conectar el microscopio mediante un estabilizador de voltaje. El conector del microscopio a la toma de pared está flojo. Conectar bien el enchufe a la toma. Si alguno de los elementos está defectuoso, sustituirlo. El bombillo está mal instalado y no hace buen contacto. Reinstalar el bombillo. El bombillo presenta metalizado o puntos negros sobre su superficie. Sustituir el bombillo de iluminación. La muestra no es iluminadade forma uniforme. La fuente de luz no está centrada Rectificar el alineamiento del condensador. El objetivo no se encuentra bien centrado. Girar lentamente el revólver porta objetivos hasta que suene el trinquete de ajuste. La muestra es iluminada defectuosamente. El iris del diafragma está casi cerrado. Abrir el iris del diafragma hasta que la iluminación sea adecuada El condensador está muy alejado (muy bajo). Acercar el condensador. Los lentes del condensador presentan polvo o crecimiento de hongos. Limpiar el condensador. Retirar el polvo con pincel. Remover el hongo con solución para limpieza de lentes. Hay excesivo contraste en la imagen. El iris del diafragma del condenador está casi cerrado. Abrir un poco el iris del diafragma. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 27 ~ 1.6.2. Sistema mecánico PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN La plataforma porta muestras no mantiene su posición y la imagen se desenfoca continuamente. La tensión de ajuste de la plataforma porta muestras está floja. Ajustar el mecanismo de tensión de la plataforma. La plataforma porta muestras no puede ser levantada a su límite superior. La plataforma mecánica está bloqueada muy bajo. Aflojar el mecanismo de bloqueo de la plataforma. Ajustar a la altura deseada. Reajustar el mecanismo de bloqueo. PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN La imagen es poco clara y con brillo. El iris del diafragma del condensador está muy abierto. Cerrar un poco el iris del diafragma. No hay luz cuando se opera el interruptor de encendido. No hay corriente. Verifique que el cable de poder esté conectado a la toma de corriente No hay foco en el microscopio o existe falso contacto en los conectores de la lámpara de halógeno. Inserte el foco en su conector en forma adecuada y asegure el contacto. No hay luz cuando se opera el interruptor de encendido. Existe un falso contacto entre el conector del foco y su enchufe. Afloje el conector del foco y reinsértelo correctamente. El foco se fundió. Cambie el foco Brillantez pobre. El voltaje principal es muy bajo. Equipe el microscopio con un estabilizador de voltaje o suba el voltaje con un regulador de corriente. Precaución: no suba el voltaje más allá de 110 a 127 v CA. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 28 ~ 1.6.3. Sistema óptico PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN Mala calidad de la imagen en el objetivo 40X. Los lentes presentan hongos. Remover los hongos utilizando una solución limpiadora. Seguir las instrucciones del fabricante del dispositivo. Lentes dañados. Revisar el objetivo. Verificar si los lentes presentan rayones, picaduras o muescas. Reemplazar el objetivo Mala calidad de la imagen en el objetivo 40X. El objetivo está siendo usado sin aceite de inmersión. Colocar aceite de inmersión sobre la placa El aceite de inmersión es de bajo índice de refracción. Utilizar aceite de buena calidad El aceite de inmersión ha invadido el interior del objetivo. Limpiar los lentes con papel especial para limpiar lentes. Si la limpieza externa no es solución, enviar el objetivo a un laboratorio especializado para su reparación (desmonte de lentes, limpieza, cambio de sellos, cementación, realineación y ensamble) Polvo o suciedad visible en el campo de visión. Polvo sobre el lente colector de la fuente de iluminación. Retirar las partículas de polvo con un pincel de pelo de camello. Polvo sobre el lente superior del condensador Retirar las partículas de polvo con un pincel de pelo de camello Polvo en el ocular Retirar las partículas de polvo con un pincel de pelo de camello Borde obscuro/no hay iluminación en el campo visual/no se encuentra campo visual. El revólver no se encuentra posicionado adecuadamente. Coloque el revólver en la forma adecuada El condensador no está colocado adecuadamente. Fije el condensador. Manchas de polvo o grasa en el campo visual. Los guardapolvos todavía están en los binoculares o revólver Quite los guardapolvos. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 29 ~ PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN Hay polvo, o huellas dáctiles, manchas de grasa en el componente óptico (condensador/ objetivos/lentes oculares/ portaobjetos/ recolector). Limpie los componentes. Operación inadecuada del condensador. Consulte el párrafo concerniente para su operación correcta (iluminación de Köhler) Resolución y contraste de imagen pobre. Hay polvo, huellas dáctiles, o manchas de grasa en los lentes oculares (condensador/ objetivos/ oculares) Limpie las lentes que tengan el problema Hay polvo o manchas de grasa en el portaobjetos o en el cubreobjetos. Limpie el portaobjetos o cubreobjetos. Hay polvo o manchas de grasa en los componentes ópticos (condensador/objetivos/lentes oculares/portaobjetos) Limpie los componentes ópticos. Resolución y contraste de imagen pobre. No hay cubre objetos en los especímenes que lo necesitan Consulte el párrafo concerniente (sección de objetivos) El cubre objetos es demasiado grueso o delgado. Usar cubre objetos de 0.17mm No hay aceite de inmersión en el objeto de inmersión. Ponga una gota de aceite de inmersión. Los objetos secos están contaminados por el aceite de inmersión. Limpie los objetivos concernientes. Calidad pobre de la imagen. La apertura del condensador es demasiado pequeña. Reajuste la apertura (diafragma de iris del condensador). La posición del condensador es demasiado baja. Vuelva ajustar el condensador (iluminación de Köhler). La mitad del campo visual esta obscura. El revólver no se encuentra posicionado adecuadamente. Posicione en forma adecuada el revólver. La lámpara o el eje del condensador no están conforme al eje de los objetivos. Reajuste la lámpara o el eje del condensador, o bien, el diafragma de campo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 30 ~ PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN La imagen cambia cuando se enfoca. El espécimen está levantado de la platina. Presione el espécimen cerca de la platina. El revólver no está en su posición adecuada. Posicione el revólver adecuadamente. El objetivo no está bien atornillado al revólver. Atornille bien el objetivo al revólver. Los objetivos no quedan en forma “par-focal” cuando se gira el revólver. Los oculares u objetivos están flojos. Verifique que los lentes suplementarios estén firmemente ajustados en su base. 1.6.4. Sistema operativo PROBLEMA CAUSA SOLUCIÓN Los objetivos de alto poder no brindan una imagen dentro de foco. El cubreobjetos es demasiado grueso Usar cubreobjetos de 0.17 mm. El portaobjetos está invertido en posición vertical respecto al movimiento de la platina. Gire 180° el portaobjetos. El objetivo toca el portaobjetos cuando cambia de poder bajo a alto. El cubreobjetos es demasiado grueso o no está el objetivo frente al objeto. Usar cubreobjetos de 0.17 mm. El portaobjetos está invertido en posición vertical respecto al movimiento de la platina. Gire 180° el portaobjetos. La imagen no se mueve suavemente cuando se desplaza laplatina mecánica. El sujeta-espécimen no está funcionando adecuadamente. Sujete el espécimen de nuevo. Solo algunas partes de la imagen del espécimen pueden verse cuando se desplaza la platina longitudinalmente. El sujeta-espécimen no está instalado correctamente. Instale el sujeta- espécimen correctamente. Las dos imágenes en los binoculares no coinciden. La distancia interpupilar no es la correcta. Reajuste de nuevo la distancia interpupilar. Los ojos se fatigan rápidamente durante la observación. La brillantez del campo visual es demasiado alta/baja. Reajuste el controlador de iluminación de forma adecuada. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 31 ~ 1.7. TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA 1.7.1. Iluminación Köhler La iluminación es una variable crítica que hay que considerar al poner en funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminación, aún en equipos sofisticados, conduce a la obtención de imágenes defectuosas. El espécimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede producir artificios en la imagen que se observa. Fundamento En el año 1893, el profesor August Köhler propuso un método de iluminación para optimizar la observación microscópica y la microfotografía (Davison y Abramowitz, 2007), que permite aprovechar al máximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo diámetro sea igual al área de captura del objetivo. Los microscopios modernos están diseñados para aplicar la iluminación Köhler y los requerimientos son (Figuras 1.13 y 1.14): Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz. Bombilla con lente colectora. Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lámpara y un diafragma de apertura, colocado debajo del condensador. Figura 1.13. Iluminación Köhler. Se debe iluminar el espécimen siguiendo el esquema. La lámpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S’ del filamento de la lámpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que su punto focal esté en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es proyectada en el plano de la preparación por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio (Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio. Recuperado en Diciembre 12, 2007, de la World Wide Web: http://www.cie.uva.es/optica/Practicas/primero/opticaI/diafragmas/cdiafragmas.htm#1). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 32 ~ Procedimiento El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen nítida del diafragma de campo. La iluminación ideal se consigue cuando el condensador se encuentra lo más cerca de la preparación. El diafragma de campo regula el diámetro de la apertura de la iluminación y al cerrarlo se incrementan los contrastes. Una vez ajustada la iluminación Köhler no se debe regular la intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lámpara mediante un ajuste de voltaje. Figura 14. Trayectoria de la luz en la iluminación Köhler. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (Davison, M., Abramowitz, M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center. Recuperado en Noviembre 28, 2007, de la World Wide Web: http://www.olympusmicro.com). Ventajas de la iluminación de Köhler A continuación se enlistan las ventajas de la iluminación de Köhler: A pesar del pequeño filamento incandescente, todas las superficies del diafragma de campo luminoso se ilumina con la luminancia del filamento y, por lo tanto, la lámpara tiene un consumo reducido. Graduando el diafragma de campo luminoso, se ilumina la preparación solamente lo que se proyecta, limitado por el diafragma de campo visual. Por lo tanto, no se produce una innecesaria irradiación del objeto (importante para la observación en vivo), ni tampoco luz dispersa, susceptible de disminuir el contraste, y que procede de las zonas de la preparación cuya imagen no es reproducida. Regulación de la apertura y, por lo tanto, del contraste y la profundidad de imagen mediante el diafragma del condensador. Vista desde la preparación, la fuente de luz se encuentra en el infinito (rayos paralelos en la marcha de los rayos de la pupila). Por esta razón, la falta de Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 33 ~ uniformidad en la fuente de luz es la que menos se nota en el plano de la preparación. Puesto que debido a la regulación del diafragma de campo luminoso, el diafragma de campo visual no se ilumina más de lo necesario, no puede llegar luz a las paredes interiores del tubo, ni causar molestias reflejos. De este modo se obtiene imágenes particularmente brillantes. Dificultades eventuales Al regular la iluminación de Köhler puede suceder bajo ciertas condiciones que Vd. Vea, además de la preparación una especie de estructura granulosa de todo el campo visual, se trata de la estructura de un cristal deslustrado o de una lente de colector mateada, piezas ambas cuyo fin es eliminar la falta de uniformidad de la fuente de luz. Si por casualidad este plano también resulta enfocado nítidamente, basta con subir un poco el condensador para suprimir este efecto. En el caso de los condensadores con aperturas grandes, muchas veces solamente es posible enfocar nítidamente el diafragma de campo luminoso al utilizar un porta objetivos cuyo espesor no excede 1 mm. Los principios de las técnicas especiales de iluminación de microscopía se basan en la modificación de: a) El modo de incidencia del haz de luz sobre el espécimen mediante el uso de condensadores y filtros: Iluminación de campo oscuro. Microscopía de contraste de fase. Microscopía de luz polarizada. b) La fuente emisora de luz: Microscopía de fluorescencia. Microscopía confocal. 1.7.2. Iluminación de campo oscuro Fundamento La iluminación de campo oscuro consiste en bloquear los rayos de luz centrales que normalmente pasan a través o alrededor del espécimen y permite solamente que los rayos oblicuos lo iluminen. Este método se emplea para observar especímenes no teñidos, que son visualizados como objetos iluminados en un fondo oscuro. Los rayos de luz oblicuos que emanan de un condensador de campo oscuro impactan el espécimen y son difractados, reflejados y refractados al objetivo del microscopio (Davidson y Abramowitz, 2002). Es decir, el haz de luz que interactúa con el espécimen puede ser transmitido directamente (luz no desviada), o bien, la luz es difractada por la naturaleza particulada del espécimen. Al elevar el condensador y abrir el diafragma, se ilumina el espécimen solamente con la luz oblicua que proviene de los bordes de la lente del condensador. Un cono hueco de luz pasa a través del espécimen. Si esa luz Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 34 ~ no interactúa con éste, emerge desde un plano de manera no desviada y no alcanza la superficie de la lente del objetivo, por lo que la imagen permanece oscura. La luz oblicua que no interactúe con el espécimen es difractada y sale de cada borde o partícula como un nuevo punto. La luz desviada es recogidapor la lente del objetivo y forma la imagen. De este modo, el espécimen se visualiza como un objeto luminoso y tanto los bordes como las partículas interactúan con mayor fuerza difractando la mayoría de la luz; por lo que se ven más acentuados en la imagen, pues sus dimensiones son cercanas a la longitud de onda de la luz. Esta técnica se utiliza para la observación de preparaciones delgadas y sin teñir y en el caso de parasitología, resulta útil para observar contenido intestinal de animales con diarrea compatible con una infección causada por protozoarios, líquido abomasal de fetos abortados y células en suspensión. Los condensadores diseñados y fabricados especialmente para la microscopía de campo oscuro están formados por una lente gruesa oscura convexa que tienen como finalidad concentrar los rayos en la cara superior del portaobjeto. Estas lentes pueden tener una curvatura paraboloide (una superficie espejada) o cardioide (dos superficies espejadas). Ambos evitan que los rayos luminosos penetren directamente en el objetivo (Willis, 2007). De este modo, la luz ilumina oblicuamente la preparación y por lo tanto incide con una apertura numérica mayor a la del objetivo. Materiales Muestra biológica sin teñir. Microscopio de campo claro con todos sus componentes. Diafragma o interceptor para campo oscuro (obturador). Una manera sencilla de fabricar un diafragma que produzca campo oscuro en un microscopio de estudiante es elaborar con una cartulina negra un diafragma que se coloca debajo del condensador del microscopio. Portaobjetos. Cubreobjetos. Papel para limpiar lentes. Procedimiento El material a estudiar debe emulsionarse sobre un portaobjetos. Colocar la preparación sobre la platina. Bajar el condensador de campo oscuro. Mover la preparación en la platina de tal modo que al subir por completo el condensador, la cara superior de su lente quede cubierta por la preparación en su mitad posterior. Centrar la preparación y observarla primero con objetivos de poco aumento. Incrementar el aumento hasta observar la preparación. 1.7.3. Iluminación parcial de Rheinberg Fundamento Esta técnica de iluminación sigue los mismos principios que la microscopía de campo oscuro y se utiliza con objetivos de bajo y mediano aumento. Es un tipo de coloración Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 35 ~ óptica que usa filtros de colores que iluminan tanto al espécimen como el fondo oscuro. Utiliza un filtro central rodeado de otros filtros en uno o varios colores que contrastan con él. En este caso, la luz directa no se ocluye, sino que se entinta por un disco central. Es decir, la amplitud de la luz directa se reduce, mientras que un disco central de color provee la iluminación del fondo (Samson y Blanca, 2007). Materiales Hojas de plástico de colores cortadas en forma de disco al tamaño que permita que se inserten en el área porta filtros. Cinta adhesiva blanca u opaca. Procedimiento Elaborar un filtro Rheinberg como se indica a continuación: Cortar un agujero de 1.5 cm en el centro del círculo de color. Cortar un disco de 1.75 cm de cinta adhesiva opaca y cubrir el agujero. Colocar la preparación en el microscopio. 4. Colocar el filtro Rheinberg dentro del porta filtro y ajustar el condensador igual que para campo oscuro (condensador hasta arriba y diafragma abierto por completo). 1.7.4. Observación con luz polarizada Fundamento Los fotones tienen un plano de vibración o polaridad. La mayoría de las fuentes luminosas emiten fotones que vibran en cada plano posible. Algunos materiales o superficies interactúan con la luz de un modo asimétrico, reflejando o transmitiendo los fotones que vibran en un plano particular. Las superficies altamente reflectivas tales como el agua o el metal tienden a reflejar la luz preferentemente en un plano determinado. Los materiales polarizantes únicamente transmiten la luz que está vibrando en un plano altamente selectivo y absorben o reflejan el resto. La luz aleatorizada que pasa a través de un filtro polarizador emerge como luz polarizada con sus fotones vibrando en un plano particular. Al orientar dos piezas de material polarizante en los ángulos correctos, es posible bloquear toda la luz. Algunas sustancias poseen una característica conocida como birrefringencia estructural. La birrefringencia resulta de la alineación de átomos o moléculas en un determinado plano del objeto. Estos materiales, tales como los cristales y los polímeros biológicos orientados, interactúan con la luz polarizada. Por otro lado, las estructuras monorrefringentes o anisotrópicas son las que tienen un arreglo molecular que les confiere un mismo índice de refracción. Esta disposición espacial impide que las ondas luminosas polarizadas puedan ser giradas (Rieppo et al., 2008). Un microscopio de luz polarizada es un microscopio de campo claro al cual se le añaden filtros que modifican la luz. Este microscopio facilita la investigación de las propiedades ópticas de los especímenes y se utiliza para visualizar estructuras que son Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 36 ~ visibles gracias a la anisotropía, por lo que se emplea en cristalografía. No obstante, también se utiliza para observar algunas estructuras celulares que posean carácter birrefringente. Este microscopio está equipado con un filtro polarizador colocado entre la fuente de luz y el condensador que se puede rotar 360º y un analizador o segundo polarizador, colocado por encima del objetivo, entre su lente posterior y el tubo de observación. También tiene un condensador polarizador, una platina circular, objetivos polarizadores, oculares y lentes que permiten ver la interferencia con la finalidad de ajustar la iluminación de una manera adecuada. El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción de la luz polarizada con los elementos birrefringentes del espécimen que producen las dos ondas refractadas, cada una de ellas polarizada en planos perpendiculares (Davidson y Abramowitz, 2002). Una vez que las ondas de luz salen del espécimen lo hacen de manera desfasada pero son recombinadas al pasar por otro filtro o filtro analizador. Materiales y procedimiento Los detalles sobre la operación de un microscopio con filtros polarizantes dependen del diseño del equipo. 1.7.5. Observación con fluorescencia Fundamento La fluorescencia es un fenómeno relacionado con la luz que consiste en la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluorocromos o fluoróforos de emitir luz visible cuando incide sobre ellos una radiación intensa. Es decir, absorben una luz de una longitud de onda determinada y emiten otra luz de una mayor longitud de onda. La luz con longitud de onda corta y alta energía, tales como lámparas de halógeno o de vapor de mercurio se utiliza para excitar las moléculas dentro del espécimen o teñir las que están unidas a éste. Estas moléculas excitadas emiten luz de diferentes longitudes de onda, generalmente de colores brillantes (Davidson y Abramowitz, 2002). En la microscopía de fluorescencia, los especímenes se tiñen con fluorocromos o complejos de fluorocromo que son marcadores colorantes fluorescentes. Existen diferentes tipos de fluorocromos que difieren en su espectro de absorción y emisión de longitudes de onda. Entre los más utilizados se encuentran la fluoresceína (FITC), rodamina (TRITC), naranja de acridina y yoduro de propidio, entre otros (Wessels et al., 2010). Materiales El microscopio de fluorescencia debe tener una fuente de luz intensa. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión quefuncionan de un modo diferente a las lámparas Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 37 ~ de filamentos incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y láser. Los filtros se utilizan para permitir el paso de luz de una determinada longitud de onda, rango y color necesarios para excitar al fluorocromo en particular. Estos filtros bloquean las longitudes no deseadas. Los objetivos deben tener una apertura numérica grande. Procedimiento Los detalles del procedimiento están en dependencia del elemento al que se une el flurocromo de tal forma que se puede unir directamente al objeto de estudio o indirectamente mediante el marcaje de un elemento de la reacción antígeno anticuerpo. Procedimiento directo. Consiste en unir directamente el fluorocromo, a ciertos componentes de las células o tejidos que se pretenden estudiar; por ejemplo, el naranja de acridina se une a los ácidos nucleicos. La auramina que se une selectivamente con los bacilos de la tuberculosis (como en este caso el Mycobacterium tuberculosis que fluoresce de color amarillo dorado). En otros casos es posible inyectar soluciones de fluorocromos vitales al interior de las células para observar el transporte de sustancias de una célula a otra (Franco-Cardoza, 2005). Procedimiento indirecto. Para que se produzca fluorescencia es indispensable que el fluorocromo se ligue a una sustancia proteínica, mediante enlaces que generalmente son covalentes a estos complejos flurocromo/proteína se les llama conjugados, mediante la reacción inmunológica antígeno-anticuerpo, antígeno (componente que se desea identificar) y anticuerpo (sustancia ligada con el fluorocromo), o bien mediante el uso de anti-anticuerpos para identificar anticuerpos, en ambos casos se genera una unión específica. Por ejemplo se ligan fluorocromos con anticuerpos dirigidos contra anti-anticuerpos de Leishmania y el conjugado se vierte en una muestra de suero de un individuo sospechoso de padecer Leishmaniosis, en muestras positivas estos anti- anticuerpos marcados hacen que se dé la fluorescencia en la muestra (Franco-Cardoza, 2005). 1.7.6. Observación mediante contraste de fases Fundamento El ojo humano puede observar diferencias en el color e intensidades de color, pero no puede diferenciar las fases, es decir, las diferencias producidas por los distintos índices de refracción que tienen los objetos. Para poder hacerlo, se debe utilizar un microscopio de contraste de fase, el cual es el microscopio fotónico más utilizado para observar objetos o estructuras transparentes sin teñir. Al igual que el microscopio de campo oscuro facilita la observación de células vivas para distinguir y analizar sus componentes morfológicos. El fundamento de este microscopio consiste en la capacidad que tiene para transformar los índices de refracción que cada uno de los componentes de los objetos transparentes poseen, en diferencias de intensidad luminosa (Newton, 1998). Esto permite obtener imágenes en las que las estructuras del Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 38 ~ objeto aparecen contrastadas en tonos oscuros o tonos brillantes y tonos intermedios. El microscopio de contraste de fase tiene como finalidad transformar la diferencia de fase, insensible al ojo, en diferencia de amplitud, visibles por medios puramente ópticos. Cuando la luz pasa por las muestras se originan dos tipos de haces: haces directos y difractados. Éstos inciden sobre las lentes convergentes del objetivo de modo tal que originan en el plano focal posterior, una imagen de difracción (imagen de amplitud). Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio óptico de campo claro con algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales. El condensador presenta un disco que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos, se agregan unos “anillos de fase”, que son discos transparentes con un diseño en relieve, cabe destacar que existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre la luz y por lo tanto, las imágenes se ven diferentes en cada uno de ellos. 1.7.7. Fotomicrografía El uso de la fotografía para capturar imágenes en un microscopio data del tiempo en que se inventó el proceso fotográfico (Abramowitz, 1998). Las primeras fotomicrografías se caracterizaban por su elevada calidad, pero las técnicas eran laboriosas y poseían grandes cargas de exposiciones prolongadas y procesos difíciles de relevado de placas de emulsión. El primer medio para la fotomicrografía fue la película, pero durante las últimas décadas la tecnología digital ha propiciado que la fotomicrografía sea más barata y sencilla de utilizar que la fotografía convencional (Davidson y Abramowitz, 2002). La calidad de una fotomicrografía, ya sea digital o analógica depende de la calidad del microscopio y de la técnica de iluminación aplicada. Es esencial que los diafragmas de campo y condensador estén ajustados correctamente y que se optimice la altura de este último. Una fotomicrografía es también una fotografía y como tal, no solamente debe revelar información sobre el espécimen, sino que también debe cuidar la estética de la imagen completa. Siempre se debe componer una fotomicrografía con un sentido del equilibrio entre los elementos de color del marco de la imagen. Se sugiere utilizar diagonales para aumentar el impacto visual y evitar la captura de artefactos o detritos. Se debe seleccionar un aumento que muestre los detalles de interés. 1.7.8. Micrometría Sin lugar a duda una de las alternativas de mayor utilidad a la hora de establecer la identificación ya sea de formas de dispersión, larvas infectantes o de parásitos adultos es la medición de estos mediante métodos micrométricos la forma más común de realizarlo es por medio de un ocular micrométrico, para calibrar este aditamento se requiere de una lámina patrón, los elementos y la forma de realizar dicha calibración a continuación se describe: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 39 ~ Materiales y procedimiento Lámina patrón (LP), es una regla de 1 mm dividida en 100 partes iguales, de tal manera que cada espacio es igual 1 mm 100 =10µ. Ocular micrométrico (OM), es una escala dispuesta en una lentilla que se coloca en el ocular del microscopio y las subdivisiones dependen del fabricante (Figura 1.15). Figura 1.15. Lamina Patrón (LP) y Ocular Micrométrico (OM), adaptado de (Foreyt, W.J., 2001. Veterinary Parasitology Reference Manual. 5a Ed. Editorial Iowa State University Press.Ames Iowa, USA, 10-25). Para calibrar el ocular del micrométrico. Se inicia con el objetivo de menor magnificación para luego hacerlo con los de mayor. Se coloca la LP en la platina y se enfoca la escala (Figura 1.16) Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 40 ~ Figura 1.16. Detalle de la escala de la Lamina Patrón. El OM colocado en el ocular, se rota para sobre poner ambas escalas y mediante la LP se hacen coincidir los ceros de ambas escalas (Figura 1.17). Figura 1.17. Detalle de la escala del Ocular Micrométrico y detalle de la sobre posición de las escalas del OM y LP. Se cuentan las exactas coincidencias de la LP y el OM (Figura 1.17). Por ejemplo: Con el objetivo de 10X, en este caso habrá una exacta coincidencia de 11 divisiones del OM con 10 divisiones de la LP, de tal forma que cada espacio del OM en 10Xcorresponderá a: Cada espacio del OM= (LP 10)(constante 10µ) = 9µ. (OM 11) Con el objetivo de 40X, 56 divisiones del OM coinciden con 21 divisiones de la LP de tal forma que: Cada espacio del OM= (LP 21) (10µ) = 3.75µ. (OM 56) Nota: Primero se calibran los objetivos secos (3, 10, 20, 40 y 50X) y luego los de inmersión de (50 y 100X) La calibración específica para cada objetivo y para cada microscopio. Los resultados de esta calibración deben colocarse en una parte visible del microscopio. Por ejemplo: 10X =9µ, 40X =3.75 µ y 100X =1.5µ. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 41 ~ Figura 1.18. Detalle de la sobre posición de la escala del OM sobre un huevo de Trichuris ovis. El desarrollo de sistemas de cómputo en los últimos años también ha afectado los accesorios perifasales de los microscopios. Captura, manipulación, medición (análisis) y organización (archivo) de imágenes microscópicas forman parte importante del futuro de la microscopía. Como respuesta a estas necesidades se han desarrollado sistemas de análisis de imágenes para trabajar en conjunto con su microscopio (Möllring, 1970; Foreyt, 2001). Técnica para medición de parásitos. Se coloca sobre la platina del microscopio una escala objetiva y enfocar con el objetivo de 10X las divisiones centrales de la escala. Ajustar el ocular micrométrico en el tubo del microscopio y comparar los marcos. En seguida se hace coincidir la primera raya de la escala objetiva con la primera raya de la escala ocular, haciendo lo mismo con la escala objetiva hasta el punto donde vuelvan a coincidir las dos escalas. Una vez contado el número de rayas oculares y objetivas, se utiliza la siguiente fórmula: Núm. de unidades de la escala objetiva / Núm. de unidades de la escala ocular X 10 = Factor en Micras El microscopio se ha calibrado para la medición microscópica de parásitos. La escala objetiva tiene un mm de longitud, el cual está dividido en 100 espacios, por lo que cada espacio equivale a diez micras. Para medir parásitos o sus huevos: Retirar la escala objetiva de la platina. Colocar la laminilla con el parásito que se va a medir y enfocarlo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 42 ~ Una vez colocado el parásito en la primera línea de la escala ocular, contar el número de espacios que abarca el objeto que se va a medir y multiplicar el resultado por el factor en micras obtenido con la fórmula descrita anteriormente. Referencias Abbe, E., 1878. Die optischen Hilfsmittel der Mikroskopie. Brunswick: Vieweg. Abramowitz, M., 1998. 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Cristina Guerrero Molina1 Dr. Carlos Cruz Vázquez2 Dra. Irene Cruz Mendoza1 M. en C. Ismael Escutia Sánchez3 1Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. 2Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes. División de Estudios de Posgrado e Investigación.3Dirección General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera SENASICA. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, México, D.F. MUESTRAS BIOLÓGICAS Y MUESTREOS PARA ESTUDIOS PARASITOLÓGICOS Capítulo 2 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 45 ~ 2.1. INTRODUCCIÓN El diagnóstico correcto de las parasitosis se hace por el reconocimiento del agente etiológico o sus formas evolutivas. La mayoría de los helmintos de los animales domésticos se encuentran en el tracto gastrointestinal y anexos. Los huevos y larvas de los nematodos pulmonares llegan al tracto intestinal debido a que los animales los re ingieren cuando están bajo condiciones de pastoreo. Por lo que, el examen de la materia fecal es importante para el diagnóstico de los diferentes géneros de parásitos gastrointestinales y pulmonares. Para determinar el grado de contaminación de un potrero con larvas infectantes de tercer estadio (L3) de nematodos gastrointestinales y/o pulmonares, se utiliza la técnica de colección de pasto. La cual nos indica el grado de contaminación de los potreros y los géneros de nematodos presentes en el pasto. La colecta de muestras de materia fecal se debe toman de forma individual por vía rectal para grandes especies (bovinos y equinos) y para pequeños rumiantes (ovinos y caprinos) (Wood et al., 1995; Duncan et al., 2002). En Inglaterra, al mover los rebaños de ovinos de las praderas para meterlos en corrales portátilespara obtener las muestras de materia fecal vía rectal, se dieron cuenta que los animales se estresaban mucho por el recorrido, el manejo en el corral y la toma de la muestra. Esto dio como resultado que muchas borregas abortaran afectando la economía de los propietarios. Al inicio de los ochentas, ya se mencionaba que las muestras de materia fecal deberían obtenerse del piso de los corrales, en cabras lecheras para evitar el estrés con la consecuente baja en la producción de leche, al tomar las muestras fecales por vía rectal (Cabaret et al., 1986). Las muestras para realizar exámenes parasitológicos a través de la materia fecal, se comenzaron a tomar del piso de potreros y corrales donde se encontraban los animales en Australia (Baldock et al., 1990), en ovinos de Francia (Cabaret y Berrag, 2004), en ovinos de Inglaterra (Morgan et al., 2005) y en ovinos de Nueva Zelanda (Mc Kenna, 2007) y en ovinos en México (Guerrero et al., 2010). En bovinos en Argentina (Anziani y Marín, 2008) y en equinos en Francia y en México (Cabaret el al., 2011; Guerrero et al., 2010, 2011). Para los organismos unicelulares, la colecta de muestras para diagnosticar por ejemplo la Tritricomoniosis bovina, requiere de la observación del parásito vivo y móvil en el flujo vaginal o prepucial en los animales en edad reproductiva y en el líquido placentario o el contenido del abomaso del feto abortado (Irons et al., 2002). En el caso de los artrópodos, como garrapatas, moscas, piojos, pulgas, etc., se van a colectar para determinar los géneros presentes y el grado de infestación que presentan los animales (Quintero, 2006). El objetivo de tomar una muestra para realizar un estudio parasitológico es en primer lugar conocer el género del parásito presente y segundo lugar establecer el grado de infestación que presenta el animal. Por lo que, las muestras biológicas deben ser colectadas de manera correcta y en un número adecuado para poder establecer un Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 46 ~ diagnóstico correcto. De acuerdo con el tipo de muestras biológicas colectadas y la cantidad de éstas se analizarán para establecer el grado de infestación de los animales. 2.2. TÉCNICA DE COLECCIÓN DE PASTO Fundamento Debido a que las praderas donde pastorean los rumiantes pueden estar infestadas con larvas infectantes (L3) de nematodos gastrointestinales y ser una fuente de contaminación para los animales, antes de introducir animales jóvenes a una pradera es necesario conocer su estado de contaminación, para tomar las medidas preventivas necesarias para proteger los animales de futuras infestaciones parasitarias (Rodríguez- Vivas y Cob-Galera, 2005) Materiales Overol y botas. Guantes de plástico. Bolsas de plástico para colocar el pasto. Plumones permanentes para identificar el o los potreros. Estacas de madera para señalar los sitios de muestreo. Tijeras para cortar el pasto. Pasto de la pradera que se analizará. Báscula para pesar el pasto. Procedimiento Colecta de pasto en forma de “W” Colectar la hierba o pasto de 400 lugares sobre el área que será muestreada. La persona que colectará el pasto sigue un transepto (ruta) predeterminada en forma de “W” parándose 25 veces durante todo el transepto, arrancando la hierba con los dedos índice y pulgar de 4 lugares (de los lados, del frente y detrás de la persona). Esto se efectúa al amanecer (entre las 5:30 y 6:30 horas), cuando la mayoría de las larvas se encuentran sobre los tallos y hojas de las plantas (los rayos del sol hacen que las larvas busquen los lugares más obscuros con suficiente humedad, esto es debido a su fototropismo negativo descienden casi al nivel de la tierra y son difícilmente recuperables con el pasto cortado) (Figura 2.1A). El pasto debe de arrancarse tan cerca del suelo como sea posible aproximadamente a una altura de 5 cm del suelo. Si dos trabajadores están disponibles, pueden ser convenientemente recolectar 800 muestras mediante un muestreo de 2 vías “W”. La cantidad total de pasto colectado del área muestreada debe ser de 500 g. Colecta de pasto en forma de “2 N” Si la pradera es bastante uniforme o pareja es más fácil muestrear el pasto; sin embargo, si la pradera presenta partes bajas y altas, la pradera se divide en dos Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 47 ~ o más sectores. Como la distribución de larvas en el pasto es muy dispareja, la extracción de muestras debe realizarse en el mayor número posible de lugares del potrero. El área elegida se divide por “rutas” en forma de “W” o “N”, las rutas se trazan con estacas de madera y se unen con un cordel. Las personas recolectoras caminan a lo largo de la “ruta” parando cada determinado paso (según la superficie del terreno). Las paradas deben estar a igual distancia una de otra, se mide la distancia con ayuda de una cinta métrica. En cada parada se corta con tijeras cuatro pequeñas (15 cm) porciones de pasto, cercano al pie del recolector, en cuatro direcciones. También se puede colectar pasto a lo largo de 2 “N” rutas en forma de ángulo recto ajustado uno al otro, se realizan en 33 paradas en cada transepto (Figura 2.1B). Colecta de pasto en forma de cruz La distribución de las larvas en los pastos es muy irregular y por ello debe usar un método de muestreo que se obtenga muestras de un número elevado de sitios diferentes de la pradera. Es menos importante que los puntos donde se recogen las muestras se hallen distribuidos al azar y se emplee un método de muestreo en cruz. La muestra se recoge de 800 puntos del área que va a muestrearse, se recoge de la manera siguiente: en forma de “W” a través del campo deteniéndose 100 veces (a igual distancia entre cada parada) y cortan pequeñas cantidades de hierba junto al suelo, de cuatro puntos en cada parada, cogiéndose una muestra inmediatamente delante de la punta del zapato y otras tres tan separadas como convenga para que pueda alcanzarse la hierba delante y cada lado. La cantidad a cortar en cada punto se determina aproximadamente para que cada persona recolectora reúna en total unos 500 g (Figura 2.1C), (Vilas, 1971). Conservación y envío de las muestras de pasto Cualquiera que sea la técnica de muestreo de pasto que se decida a realizar, se debe de tener cuidado de evitar la toma de muestras de heces de los animales, de lombriz de tierra y de lodo, ya que la preparación final se obtiene muy sucia y es difícil de examinar al microscopio (Vilas, 1971; Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). El pasto colectado se coloca en bolsas de plástico previamente identificadas, para ser transportadas en condiciones de refrigeración a 4 ºC usando una nevera para tal fin. Las muestras de pasto colectadas deberán procesarse rápido para evitar la muerte de las larvas (Cardona y Quijano, 2005). Es importante que cada muestra de pasto contenga datos del remitente, la ubicación geográfica, la identificación del potrero y tipo de animales que pastan en este. Finalmente, con las muestras colectadas se realiza la técnica de Baermann. Se amarra con un hilo de cáñamo de 500 a 1000 g del pasto colectado, se suspende ese manojo de pasto con ayuda de hilo de cáñamo en una cubeta con un poco de agua (500 ml), se coloca uno de los extremos del pasto en contacto con la superficie del agua. Las larvas presentes en el pasto por gravedad y afinidad hacia el agua bajan del pasto y caerán en el fondo de la Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 48 ~ cubeta. Se espera 8 h. Al término de este tiempo, se retira el pasto de la cubeta, se decanta el líquidoy se obtiene el sedimento con las larvas. Figura 2.1. Representación esquemática del muestreo de pasto para la obtención de larvas L3 de nematodos gastrointestinales en praderas. A) colecta de pasto en forma de “W”, B) colecta de pasto en forma “2N”, y C) colecta de pasto en forma de cruz. Interpretación Del líquido obtenido con las larvas se toma 1 ml y se cuenta el número de larvas y el o los géneros de nematodos gastrointestinales de rumiantes presentes. El resultado se reporta como el número de larvas por kg de pasto. Cuando hay más de 1000 larvas L3 por kg de pasto, se recomienda realizar medidas preventivas como fin de limpiar los pastos de larvas de nematodos gastrointestinales y un tratamiento antihelmíntico a los animales que se alimentan de la pradera (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). 2.3. COLECTA DE MUESTRAS DE HECES COMPUESTAS EN RUMIANTES Y EQUINOS Fundamento Colectar muestras de materia fecal de la superficie del pasto del potrero o del piso de un corral donde se encuentren los animales, para conocer los géneros de nematodos gastrointestinales presentes y el grado de infestación, así como evitar el estrés de los animales. Las muestras se agrupan por potrero o corral lo que da origen a las muestras compuestas (Baldock et al., 1990; Ward et al., 1997). Materiales Guantes de plástico. Bolsas de plástico. Plumones indelebles. Refrigerantes. Hielera de polietileno. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 49 ~ Procedimiento Las muestras de materia fecal compuestas se pueden obtener de dos formas: a) En animales en pastoreo. Se colecta la materia fecal que está sobre el pasto de un potrero de preferencia recién emitida o lo más fresca posible, se toma una muestra de la parte superior de estas de 20 g. Se colocan en una bolsa de plástico con la identificación del potrero todas las muestras. El número de muestras que se colectan es el 20% del total de los animales presentes en la pradera (Figura 2.1) (Guerrero et al., 2010, 2011). b) En animales en corrales de engorda. Se colectan las muestras de materia fecal del piso del corral, de preferencia recién emitida o lo más fresca posible, se toma una muestra de la parte superior de estas de 20 g. Se colocan en una bolsa de plástico con la identificación del corral todas las muestras. El número de muestras que se colectan es el 20% del total de los animales que están en el corral (Figura 2.3). En este caso se deben de tomar las muestras muy temprano por la mañana, antes de que los animales pisoteen la materia fecal (Guerrero et al., 2010) En el laboratorio el contenido de cada bolsa se homogeniza, se toman de 10 a 15 muestras de 5 g cada una y se analizan con la técnica de McMaster modificada (Nicholls y Obendorf, 1994). Interpretación Las muestras se llaman compuestas porque después de colectar la materia fecal de los animales que se encuentran en un potrero o en un corral y homogeneizarla, se obtiene una muestra representativa de los estos animales. Las muestras se analizan a través de una técnica cuantitativa. De acuerdo al número de huevos por gramo de heces encontrados en las muestras, se establecerá el grado de infección que presentan de manera general los animales de ese potrero o corral, para finalmente sugerir un tratamiento antiparasitario (Hood et al., 2006; McKenna, 2007). Figura 2.2. Toma de muestra de materia fecal de equino en pastoreo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 50 ~ Figura 2.3. Toma de muestra de materia fecal de ovino en corral. 2.4. COLECTA DE MUESTRAS PARA Tritrichomonas foetus Y Trichomonas gallinae Tritrichomonas foetus Fundamento Para realizar el diagnóstico de este protozoario requiere de la observación del parásito vivo y móvil en el moco vaginal, flujo piometral, en el líquido placentario o en el contenido estomacal del feto abortado. Sin embargo, el material más confiable para el diagnóstico son los lavados o raspados prepuciales (OIE, 2013; Yao, 2013). Materiales Pipetas de inseminación. Espéculos de vidrio estériles. Jeringas desechables estériles. Manguera de látex. Guantes de plástico para palpación. Medios de transporte o de cultivo. Solución salina fisiológica estéril (ver apéndice del libro). Procedimiento Toros Los toros deben de haber tenido un periodo de reposo sexual de al menos una semana antes del muestreo con la finalidad de maximizar la cantidad de organismos en la cavidad prepucial; entre muestreos consecutivos debe de haber al menos 10 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 51 ~ días (Sager et al., 2007). El animal debe de contenerse en una manga de manejo o similar de tal forma que la persona que tome la muestra trabaje con seguridad. Previo a la toma de muestra, debe de realizarse el recorte de los pelos presentes en la región del anillo prepucial con una tijera limpia, y después de esto lavar con abundante agua la zona para retirar cualquier presencia de lodo o excremento (no utilizar jabón, detergente o desinfectantes), posteriormente secar con tollas de papel desechables; todos los procedimientos deben de desarrollarse con guantes de látex desechables. Algunos autores recomiendan proporcionar un masaje vigoroso a la región prepucial antes del muestreo con la finalidad de favorecer el desprendimiento de T. foetus a la superficie del pene (Sager et al., 2007). La muestra se puede colectar por alguno de los siguientes métodos: por lavado con pipeta de inseminación artificial combinado con aspiración, o por raspado prepucial (Irons et al., 2002). Para la primera opción, se debe de introducir hasta el fondo del saco prepucial una pipeta de inseminación estéril (tipo Cassou), la cual debe de estar conectada mediante una manguera de látex a una jeringa hipodérmica desechable estéril. Para el segundo caso, se debe de introducir un raspador, este instrumento puede ser metálico o de plástico de 70 cm de largo que tiene en el extremo anterior un cilindro rígido, con ranuras paralelas perpendiculares a su eje longitudinal, de aproximadamente 10 cm de largo y 8 mm de diámetro (Figura 2.4), por medio del cual se facilita la acción del raspado sobre los pliegues prepuciales. El raspado puede hacerse también con la pipeta de inseminación artificial combinándolo con aspiración mediante una jeringa hipodérmica conectada a la pipeta (Yao, 2013). El lavado se hace introduciendo de 3 a 5 ml de solución salina fisiológica, dando un masaje en la zona de 10 a 100 veces, y succionando de nuevo para recoger el producto del lavado. En el caso del raspado, una vez introducido el raspador al fondo del saco prepucial, deben de efectuarse de 15 a 20 movimientos del instrumento en sentido antero posterior, al finalizarlos se retira el raspador y se lava en el medio de transporte efectuando movimientos rotatorios para desprender el esmegma de las ranuras del instrumento. En el caso de hacer el raspado con pipeta de inseminación artificial, se debe de proceder al igual que con el raspador y al realizar los movimientos de la pipeta ir succionando con la jeringa para obtener el esmegma, éste se coloca en el medio de transporte (Sager et al., 2007; Yao, 2013). La literatura indica que no existen diferencias en la eficiencia del muestreo entre las técnicas mencionadas anteriormente (Schönmann et al., 1994; Mendoza-Ibarra et al., 2012), así que la decisión depende de cada caso; cabe señalar que existe un reporte que indica que la colecciónde muestras realizadas del lado derecho de la cavidad prepucial de los toros por personas diestras tiende a dar más resultados positivos en el cultivo del protozoario (Parker et al., 2003). Las pipetas de inseminación artificial se deben descartar después de usadas, mientras que los raspadores deben de lavarse y desinfectarse al término de su uso para poder volver Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 52 ~ a ser usados en caso de que los materiales así lo permitan, de otra forma, deben desecharse. La conservación para el transporte de las muestras puede hacerse en solución de lactato de Ringer, cuando se estime menos de 24 h de traslado. La mejor opción será la inoculación directamente en alguno de los medios de cultivo que se mencionan en el capítulo correspondiente de este Manual, el medio de Diamond modificado es generalmente el más recomendado; actualmente, puede utilizarse el sistema comercial denominado InPouchTM TF (Tritrichomonas foetus Test, Biomed Diagnostics, White City, Oregon, Estados Unidos de América) por sus ventajas prácticas, ya que es útil tanto como medio de transporte como de cultivo y diagnóstico (Sanger et al., 2007; OIE, 2013; Yao, 2013), cuando se opte por utilizar este sistema habrá que seguir las instrucciones acerca de la toma de muestra que acompañan al producto, mismas que se pueden consultar en la página electrónica del proveedor (www. biomeddiagnostics.com). Los lavados y los raspados prepuciales, son útiles para el aislamiento de ácido desoxirribonucleico (ADN) necesario para el diagnóstico molecular (Sanger et al., 2007). En los toros los métodos más prácticos para la toma de muestras para diagnóstico es son la colecta del moco y el lavado prepucial en orden de importancia. Las muestras de exudado prepucial se obtienen por el lavado de la mucosa, previo aseo de la región, para lo cual se utilizan 50 ml de solución salina fisiológica estéril al 0.85%, una jeringa desechable y una sonda de hule estéril, la solución debe tener una temperatura de 30-35°C al momento de introducirla al saco prepucial, luego se da un masaje al prepucio durante tres minutos con el objeto de lavar la superficie de la mucosa, el líquido con el exudado se recogen en un frasco estéril de boca ancha, el cual se tapa para evitar la contaminación de la muestra; si el animal orina, se debe descartar la muestra y repetir el procedimiento (Figura 2.5). La muestra se lleva al laboratorio y se centrifuga a 2000 rpm durante 2 a 5 minutos, se tira el sobrenadante y se realiza un examen directo colocando unas gotas del sedimento en un portaobjetos (con cubreobjeto) y observándolo al microscopio. Las muestras de moco prepucial se toman previo lavado externo y depilación al introducir al saco prepucial una pipeta de plástico de las usadas en inseminación artificial (cubierta con un espéculo de vidrio estéril), unida mediante una sonda de hule a una jeringa desechable de 5-10 ml. La pipeta se introduce hasta el fondo del saco prepucial y se mueve hacia adelante y hacia atrás entre el pene y la mucosa del prepucio, al mismo tiempo se hace succión con la jeringa, ya que al ejercer una presión negativa se obtienen las muestras de moco. La orientación de la pipeta se controla a través del prepucio con una mano, moviendo la pipeta y manipulando la jeringa con la otra, de este modo las muestras obtenidas tendrán volumen y consistencia variable (Figura 2.6). Con las muestras de moco se pueden hacer frotis en fresco utilizando unas gotas de solución salina fisiológica, de ser negativas las muestras se inocula el sedimento resultante de la centrifugación del exudado o bien el esmegma en tubos de ensaye que contengan 5 ml del medio de cultivo BGPS (Escutia 1981, 1985). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 53 ~ Figura 2.4. Raspador de plástico se puede utilizar para obtener muestra de esmegma en los toros. Figura 2.5. Esquema que muestra la forma de colectar una muestra de lavado o moco prepucial en toros para la detección. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 54 ~ Figura 2.6. Esquema que muestra la forma de obtener una muestra de lavado vaginal en hembras bovinas para la detección de T. foetus. Vacas Las vacas deben de estar separadas de los toros por al menos cuatro días previos a la toma de muestras, en caso de muestreos consecutivos, deben de pasar siete días entre los mismos. Para fines de diagnóstico de hato, es recomendable tomar muestras del 10 al 20% de las vacas, de preferencia animales con antecedentes de repetición de celo o celos irregulares, y durante la época de empadre; cualquier momento del ciclo estral es adecuado para la toma de muestras; sin embargo, es mejor hacerlo durante la semana anterior del celo (el moco es fluido y claro), y no es recomendable hacerlo durante el mismo. Lavar con abundante agua la región perineal eliminando cualquier presencia de lodo o excremento (no utilizar jabón, detergente o desinfectantes), posteriormente secar con tollas de papel desechables; todos los procedimientos deben de realizarse con guantes de látex desechables. Se prepara una pipeta de inseminación artificial estéril la cual debe de estar conectada mediante una manguera de látex a una jeringa hipodérmica desechable estéril. Separando ambos labios vulvares, sin necesidad de fijar el cérvix por vía rectal, se introduce la pipeta por la parte superior de la comisura Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 55 ~ vulvar hasta el área dorso-craneal de la vagina, evitando que se introduzca en la uretra. La muestra será tomada de la parte inferior del cérvix moviendo la pipeta hacia delante y atrás realizando movimientos de aspiración con la jeringa para colectar el moco cervico-vaginal; en caso de que el volumen colectado sea bajo, se pueden instilar 3 a 5 ml de solución salina fisiológica para realizar un lavado e inmediatamente extraerlo (Figura 2.6). La muestra puede conservarse en solución de lactato de Ringer o inocularse en algún medio de cultivo como en el caso de las muestras provenientes de toros, tal como se explicó anteriormente (Sanger et al., 2007; OIE, 2013). Los lavados y el moco vaginales, son útiles para el aislamiento de ácido desoxirribonucleico (ADN) necesario para el diagnóstico molecular (Sanger et al., 2007). Los procedimientos de muestreo en México se realizan de la siguiente manera: después de limpiar los genitales externos, las muestras de exudado vaginal se obtienen irrigando en la vagina 100 ml de solución salina fisiológica estéril por una sonda de hule. Con una mano se cierran los labios de la vulva y con la otra se da masaje por recto durante 2 minutos de modo que la solución lave las paredes de la vagina (es necesario usar guantes), el líquido con el exudado se recoge en un frasco de boca ancha, si se realiza la observación microscópica inmediata (a pie de establo) la solución se sedimenta 1-3 h y se observan unas gotas del sedimento entre porta y cubreobjetos al microscopio. Si se lleva al laboratorio la solución se centrifuga a 2000 rpm durante 3 minutos, se decanta el sobrenadante y se observan unas gotas del sedimento o se procede a su cultivo. Para las muestras de moco se introduce en la vagina por la parte superior de la comisura vulvar una pipeta de inseminación cubierta por un espéculo de vidrio estéril, evitar introducirla por uretra, llevándola hacia adelante al nivel del cuello uterino. La muestra se toma de la parteinferior del cérvix, moviendo la pipeta hacia adelante y atrás, succionando la jeringa. El paso siguiente es realizar el frotis directo o su cultivo (Escutia, 1981, 1985). Fetos y Placentas Las muestras tomadas de la necropsia del feto estarán dirigidas a realizar la identificación del parásito por observación directa o para inocular un medio de cultivo y posteriormente realizar la detección del protozoario; también para incluir porciones de tejido en parafina con fines de practicar la técnica de inmunohistoquímica o de extracción de ADN para el diagnóstico molecular mediante PCR; el ADN puede también extraerse del líquido abomasal, amniótico y alantoideo (Sager et al., 2007; OIE, 2013). Al presentarse un aborto, lo más recomendable será enviar al laboratorio el feto completo para que se practique una necropsia y toma de muestras de forma aséptica, siendo recomendable que no pasen más de 24 h entre el aborto y la recepción en el laboratorio; también es recomendable enviar una porción de Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 56 ~ placenta con dos o tres cotiledones. El envío deberá de hacerse en condiciones de refrigeración. Durante la necropsia practicada en campo o en el laboratorio, obtener muestras de líquido abomasal, amniótico y alantoideo, así como de los pulmones. De ser posible, obtener una porción de placenta. El líquido abomasal debe de ser colectado en recipientes estériles ya que la muestra se destinará a observación directa bajo el microscopio, para inocular medio de cultivo o para extracción de ADN, cualquiera de estas actividades debe de hacerse a la brevedad después de la colecta. Las porciones de pulmón se fijarán en formalina bufferada al 10% para su posterior uso en histopatología, inmunohistoquímica o detección molecular. Envío La toma de las muestras necesarias para el diagnóstico parasitológico así como su adecuado transporte son de especial importancia para asegurar una detección acertada; el traslado de las muestras al laboratorio debe de realizarse en el menor tiempo posible, ya que está demostrado que el tiempo entre la colecta y el procesamiento en el laboratorio inciden en el número de organismos viables previos al diagnóstico (Sager et al., 2007; OIE, 2013). Trichomonas gallinae Materiales Para la preparación húmeda: Hisopos estériles. Portaobjetos Cubreobjetos. Microscopio compuesto. Fundamento El diagnóstico de esta enfermedad, en las aves muertas y/o sometidas a necropsia, requiere de la identificación de lesiones necróticas, de amarillentas a grisáceas, localizadas en la cavidad bucal, esófago y buche; los parásitos pueden ser observados en el material fluido verdoso que se presenta en la cavidad bucal, en el buche, o en las áreas necróticas, realizando un frotis; el cultivo puede realizarse a partir de este tipo de muestras. En las aves vivas, la adecuada toma de las muestras para el diagnóstico así como su transporte al laboratorio en el menor tiempo posible, son fundamentales para asegurar una detección acertada (McDougald y Calnek, 2000; Borji et al., 2011). Procedimiento Tomar el ave a examinar conteniéndola de forma manual de manera que se pueda tener acceso a la cavidad bucal. Introducir en la cavidad un hisopo estéril que se pasará por la cavidad bucal, esófago y buche en un trayecto de ida y vuelta para sustraer una muestra de la mucosa de estas estructuras anatómicas. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 57 ~ Este hisopo se destina a realizar una preparación húmeda a manera de frotis en un portaobjetos nuevo, esta preparación se puede observar al microscopio compuesto para identificar la presencia del protozoario. El hisopo también puede ser empleado para inocular el sistema InPouchTM TF (Biomed Diagnostics, White City, Oregón, Estados Unidos de América), que se utiliza para el diagnóstico de T. foetus, ya que es útil tanto como medio de transporte como de cultivo y se pueden observar los organismos directamente bajo el microscopio, este sistema ya ha sido probado en T. gallinae (Cover et al., 1994; Bunbury et al., 2005). Interpretación de los resultados La identificación de los organismos en una preparación entre porta y cubreobjetos, confirmarán la presencia de los protozoarios en la muestra. 2.5. COLECTA Y CONSERVACIÓN DE ECTOPARÁSITOS: ÁCAROS, GARRAPATAS, MOSCAS, PIOJOS Y PULGAS Fundamento Los artrópodos constituyen un extenso grupo de organismos que afectan la salud de los animales, ya que son agentes causales de enfermedades o provocan daño directo sobre los cuerpos estos. Por lo que se debe conocerse el sitio de donde se pueden colectar estos parásitos en los animales o en los diferentes hábitats, con el fin de identificar los géneros y especies presentes para controlarlos o eliminarlos a través de un tratamiento antiparasitario (Quintero, 2006). Material Guantes de plástico. Bolsas de plástico. Frascos de plástico. Viales. Plumones indelebles. Torundas de algodón. Alcohol etílico. Glicerina. Tijeras. Pinzas entomológicas. Pinceles. Hojas de bisturí. Refrigerantes. Hielera de polietileno. Procedimiento Ácaros y garrapatas Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 58 ~ Los ácaros pertenecen a la clase Arácnida. Los ácaros del orden Metastigmata se dividen en dos familias Argasidae (con los géneros Argas y Otobius) e Ixodidae (con los géneros Ixodes, Amblyomma, Rhipicephalus (Boophilus) (Figuras 2.7 y 2.8), Haemophysalis, Rhipicephalus, Dermacentor y Anocentor, entre otros); así como los ácaros del orden Mesostigmata con la familia varroidae (con el género Varroa) (Quintero, 2006). Figura 2.7. Rhipicephalus (Boophilus) spp. (hembra). Figura 2.8. Rhipicephalus (Boophilus) spp. (macho). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 59 ~ Las larvas, ninfas y adultos de las garrapatas se alimentan sobre el cuerpo de los animales. Las garrapatas adultas se colectan con mucho cuidado para no dejar las piezas bucales que están firmemente sujetas a la piel. Se toman con la ayuda de pinzas entomológicas. El cuerpo de las garrapatas se sujeta con suavidad con las pinzas, se voltear la garrapata sobre su dorso y se tirar rápidamente en dirección perpendicular a la piel (Sonenshine, 1993). Para capturar las fases de garrapatas que están sobre la vegetación se utilizan dos métodos de bandera y de arrastre. Para el método de bandera se utiliza tela de sabana de color claro, esta se fija sobre un mango largo a modo de bandera (Figura 2.9), se recomienda para aéreas de matorral o maleza. Para el método de arrastre que es muy parecido al anterior, se usa tela de manta clara, está se fija en uno de sus lados a una barra, la cual se atada en sus dos extremos a una cuerda (Figura 2.10). Se recomienda para aéreas con superficies vegetales bajas y uniformes. Estos dos métodos se deben emplear cuando la vegetación este seca, se debe de evitar los días lluviosos o el roció de la mañana, puesto que sabana o manta deben estar secas para que sean eficaces. Estos métodos tienen una eficacia de captura del 8% de población de garrapatas presentes en el área de muestreo (Barrera, 2006; Barandika, 2010) Figura 2.9. Método de Bandera para colecta de estadios larvarios de garrapatas en la vegetación (Barrera et al., 2006). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importanciaen salud pública y veterinaria ~ 60 ~ Figura 2.10. Método de arrastre para la captura estadios larvarios de garrapatas en la vegetación (Barrera et al., 2006). En el conducto auditivo externo de varias especies animales se pueden encontrar larvas y ninfas de Otobius megnini (garrapata espinosa de las orejas), (Figura 2.11), esta se colecta con la ayuda de unas pinzas entomológicas con la indicación de no presionar mucho para no dejar las piezas bucales en la piel. Las fases adultas se encuentran en el suelo, en grietas de las paredes y en los techos de las instalaciones donde se encuentran los animales (Quintero, 2005). Figura 2.11. Otobius megnini (Ninfas y larva). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 61 ~ En las aves domésticas Argas persicus (Figura 2.12) se puede colectar sobre el cuerpo de estas o en las instalaciones de madera, de material rústico o en las grietas de pisos o paredes. En las aves silvestres se colecta de los nidos (Quintero, 2005). Figura 2.12. Argas persicus (Adulto). Para la Varroa destructor (Figura 2.13) que afecta a las crías y a las abejas adultas. Se colectan 200 abejas y se colocan en un envase de plástico de boca ancha con 500 ml de alcohol al 70%. El frasco se agita vigorosamente, el contenido se pasa por una coladera de malla de alambre, los ácaros se quedan en la malla y se colectan con unas pinzas o pincel. Para obtener el porcentaje de infestación en abejas adultas la fórmula es: número de varroas colectadas/número de abejas colectas X 100k (De Jong et al., 1982). Para detectar el ácaro en las crías, se corta una sección del panal que contenga 100 celdas de cría operculada por ambas caras del panal, se envuelve en papel de estraza, se coloca en una bolsa de plástico y se conserva en refrigeración. Se desoperculan 100 celdas, se retiran las prepupas o las pupas y se observan las celdas positivas al ácaro. Para obtener el porcentaje de infestación en la cría se aplica la fórmula siguiente: número de celdas ocupadas por el ácaro/número de celdas examinadas X 100 (De Jong et al., 1997). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 62 ~ Figura 2.13. Varroa destructor (Adultos). Otra posibilidad para detectar abejas adultas es la utilización de una trampa que se coloca en el piso de la colmena. Consiste un marco de madera al que se le engrapa una malla de alambre sobre una base de triplay. En el espacio que queda entre la malla y la base se coloca una cartulina blanca, la que previamente se cubre con grasa vegetal o vaselina con el fin de que los ácaros se peguen. La trampa se deja de 3 a 7 días. Al término de este tiempo, se cuentan los ácaros caídos por día y se aplica la siguiente fórmula: total de varroas colectadas/días que permaneció la trampa en la colmena X 100 (Espinosa, 2008). Para Acarapis woodii (Figura 2.14) se realiza la disección del primer par de tráqueas. Se colectan 10 abejas adultas, se colocan en un papel que absorba el exceso de alcohol. Con un bisturí se separa el primer anillo traqueal de cada abeja, se coloca en un portaobjetos y se le agrega una gota de ácido láctico al 85%. Se espera 24 h y se observa al microscopio óptico. El nivel de infestación por abeja se realiza contando los ácaros que parasitan cada tráquea. También se pueden contar el número de abejas positivas y obtener un porcentaje (Espinosa, 2008). Ácaros productores de sarna Los ácaros causantes de sarna pertenecen al suborden Astigmata. Los géneros Psoroptes spp. (Figura 2.15), Sarcoptes spp. (Figura 2.16) y Demodex spp. (Figura 2.17), se colectan por medio de raspados de las lesiones, se utiliza un bisturí y glicerina como vehículo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 63 ~ Figura 2.14. Acarapis woodi (Adulto). Figura 2.15. Psoroptes cuniculi, a) macho y b) hembra. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 64 ~ Figura 2.16. Sarcoptes spp. (Adulto) Figura 2.17. Demodex spp. (Adulto). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 65 ~ El raspado debe realizarse en forma vigorosa directo en las zonas alopécicas del animal hasta que la piel se ponga roja o esté a punto de sangrar. Para Demodex canis (Figura 2.18) se recomienda tomar varios raspados de todo el cuerpo. Figura 2.18. Toma de muestra mediante un raspado de piel para el diagóstico de Demodex canis. Para Psoroptes cuniculi (Figura 2.15) y Otodectes cynotis (Figuras 2.19 y 2.20) se introduce al conducto auditivo externo un hisopo impregnado con glicerina y se realizan movimientos circulares. También se pueden retirar con mucho cuidado con un poco de glicerina las costras que se forman en el conducto auditivo externo del conejo, ya que debajo de estas se encuentran los ácaros. Figura 2.19. Toma de muestra para el diagnóstico de Otodectes cynotis. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 66 ~ En general, los raspados se pueden colocar en una o varias laminillas, los hisopos deslizarse en una laminilla o enviarlas solos, todas estas muestras se pueden introducir en un envase de plástico o en una bolsa de plástico, se les agrega un poco de glicerina (Quintero, 2005). Figura 2.20. Otodectes spp. (Adulto). Dípteros (moscas adultas y sus larvas) Los insectos de la orden díptera presentan uno o dos pares de alas. Existen muchos géneros y especies que causan daño. En su forma adulta como transmisores de agentes patógenos o en su fase de larva causando miasis (infestación por larvas de moscas) (Quintero, 2006). Para capturar moscas adultas existen dos métodos: Las trampas activas, que atraen a los dípteros mediante distintos procedimientos como son: luz, colores, cebos naturales o químicos. Las trampas pasivas, atrapan a los dípteros de manera fortuita aprovechando ciertas características naturales de los estos. Trampa de luz Se utiliza para la captura de insectos nocturnos, los insectos voladores son atraídos por luz blanca. La fuente de luz se coloca en un embudo, los insectos ingresan a este y quedan atrapados (Barrera et al., 2006). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 67 ~ Trampas con atrayentes volátiles Los atrayentes se clasifican dependiendo del origen y naturaleza del compuesto. Existen dos clases de atrayentes, los relacionados con olores alimenticios, como extractos de plantas, frutas maduras y trituradas o harina de pescado, así como los atrayentes sexuales como las feromonas. Estas trampas se colocan en dirección de donde viene el viento (Barrera et al., 2006). Trampas de color Se utilizan de acuerdo al grupo de insectos que se quiera capturar. Los colores más empleados son: blanco, amarillo, azul y rojo (CESTA, 2011). Trampas móviles El propósito de estas trampas es aplicarlas por toda un área. El uso de estas es para atrapar y eliminar plagas de insectos u otros organismos(CESTA, 2011). Trampas Malaise Esta se emplea para colecta insectos voladores, se coloca en un corredor de vuelo de insectos, como puede ser entre árboles o cerca del agua. Esta trampa se elabora con tela fina similar a la de las redes aéreas (tul) y tiene forma de casa de campaña pequeña, se instala entre la vegetación (Barrera et al., 2006). Trampas de cebo Las trampas más sencillas consisten en un recipiente hundido a ras del suelo, se coloca un embudo y al interior de este una sustancia atrayente. Dependiendo del insecto que se quiere colectar y su biología será el tipo de cebo. El cebo más común es el excremento para insectos coprófagos, la carne en putrefacción para capturar insectos necrófagos, diferentes frutos en estado de fermentación para atracción de ciertas familias de moscas (Barrera et al., 2006). Para Haematobia irritans se debe ir al potrero o corral donde estén los animales, se puede atrapar las moscas con una bolsa de plástico, esta se pasa suavemente sobre el cuerpo del animal, también con una red entomológica, con el uso de binoculares para contar el número de moscas sobre el animal, o bien tomando una fotografía para posteriormente contar las moscas adultas presentes (Quintero, 2005). Las larvas de las moscas causantes de miasis, se colectan de acuerdo a su sitio de localización. Para las que están en cavidades como Oestrus ovis (Figura 2.21) o Gasterophilus spp. (Figura 2.22) se realiza un lavado nasal o gástrico con una solución de bicarbonato de sodio al 2%. Para Hypoderma spp. (Figura 2.23) se colectan por extracción manual, con el uso de agua oxigenada sobre el sitio donde este la larva para que esta salga sola, o realizando una pequeña incisión para obtener las larvas; esto durante los meses de octubre a noviembre (sólo en los estados fronterizos con Estados Unidos), cuando las larvas están en el dorso de los animales (Quintero, 2005). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 68 ~ Figura 2.21. Larva tres de Oestrus ovis. Figura 2.22. Larva tres de Gasterophilus nasalis. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 69 ~ Figura 2.23. Vista dorsal de la larva tres de Hypoderma spp. Piojos y Pulgas Los piojos son insectos neópteros (sin alas) pertenecen a la clase Pthiraptera y se divide en dos órdenes. La Mallophaga (Figura 2.24) conocida como masticadora y Anoplura (Figura 2.25) conocida como chupadora. En las aves sólo existen piojos masticadores mientras que en las demás especies animales hay masticadores y chupadores (Quintero, 2006). Figura 2.24. Piojo Mallophaga (Menopon spp.) Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 70 ~ Figura 2.25. Piojo Anoplura (Linognathus spp.) Los piojos se pueden colectar al examinar meticulosamente el pelo, lana o plumas de los animales vivos, se emplea un algodón empapado con alcohol éter, este se pasa por diferentes regiones anatómicas dependiendo de la especie animal. Los algodones deben colocarse en frascos con alcohol al 70% o en bolsas de plástico que se puedan sellar. Si un animal muere, se pueden obtener las muestras entre los 5 y 15 minutos posteriores al fallecimiento. Los piojos se mueven hacia la superficie externa del pelo y se puede aprovechar esta situación para colectarlos con ayuda de unas pinzas. También los piojos y pulgas se pueden colectar por inmersión del cadáver en agua con jabón, este se agita vigorosamente y después se decanta el agua jabonosa en un contenedor. Los parásitos se colectan con un pincel o pinzas (Walter y Krantz, 2009). En las aves se pueden aplicar insecticidas en polvo sobre el cuerpo de los animales, después se colocan las aves en una caja de plástico o de madera con pequeños orificios en la tapa para que puedan respirar, se dejan durante 10 minutos y después se libera el ave. El polvo con los artrópodos se queda en la caja, los parásitos se colectan con ayuda de unas pinzas entomológicas o pinceles humedecidos en alcohol (Walter y Clayton, 1997). Las pulgas son insectos neópteros (sin alas) pertenecen al orden Siphonaptera en el que se agrupa una gran cantidad de familias. La familia Pulicidae agrupa a las pulgas más comunes de los animales domésticos. En esta familia se encuentran Ctenocephalides canis (Figura 2.26), Ctenocephalides felis (Figura 2.27), Pulex irritans (Figura 2.28) y Echidnophaga gallinace (Figura 2.29). Se pueden colectar del hospedero con el uso de un algodón empapado con alcohol éter y después colocarlos en frascos con alcohol al 70%. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 71 ~ Figura 2.26. Ctenocephalides canis. Figura 2.27. Ctenocephalides felis. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 72 ~ Figura 2.28. Pulex irritans. Figura 2.29. Echidnophaga gallinacea. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 73 ~ Otra manera de colectar piojos y pulgas en los mamíferos consiste en colocar a los animales debajo de una hoja de papel blanco y después cepillar el pelo de estos. Un problema de este procedimiento es que los ectoparásitos se pueden perder o escapar. Para evitar esto, se puede agregar unas gotas de glicerina directamente del área que se esté peinando (Pritchard y Kruse, 1982). Conservación Los ectoparásitos se colocan en frascos de plástico, vidrio o viales con alcohol etílico de 70 a 80%. Para ejemplares que se analizaran para obtención de DNA se recomienda alcohol etílico de 95 a 100%. Los parásitos que se colectan también se pueden introducir poner en una bolsa de plástico y después ponerse en refrigeración. Si un animal se muere se puede congelar el cadáver y después descongelar para obtener los artrópodos. Los adultos de los dípteros deben preservarse en seco, para que se mantengan las sedas y la coloración de las escamas. Si se planea almacenarlos temporalmente, se deben guardar en frascos de plástico o aluminio antioxidante con una cama de algodón y otra de papel cebolla, con su etiqueta de colecta con los datos del parásito y lugar de obtención. Si el almacén va a ser permanente, deberá realizarse un montaje con alfileres entomológicos, pintando una línea imaginaria en el tórax del ejemplar y atravesando el alfiler del número uno o dos en la parte superior derecha de este, se guarda en cajas entomológicas (Walter y Krantz, 2009). Nota: Todas las imágenes fueron donadas por el Dr. Juan Antonio Figueroa Castillo del Departamento de Parasitología de la FMVZ-UNAM. Referencias Anzian, O.S., Marin, M., 2008. El uso de muestras compuestas de material fecal para el conteo de huevos de nematodos gastrointestinales en bovinos. XVII Reunión científica técnica de la asociación Argentina de veterinarios de laboratorios de diagnóstico. Santa Fé, Argentina. 29-31 de octubre de 2008. Baldock, F.C., Lyndal-Murphy, M., Pearse, B., 1990. An assessment of a composite sampling method for counting strongyle eggs in sheep faeces. Aust. Vet. J. 67, 165-167. Barandika, I.J.F., 2010. 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Técnica coproparasitoscópica en cama de pollo 3.3.8. Técnica de Kinyoun 3.3.9. Técnica de migración larvaria o Baermann 3.3.10. Técnica de cultivo larvario 3.4. Técnicas para el diagnóstico de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales. 3.4.1. Técnica para la limpieza de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales por gradientes de densidad con sacarosa 3.4.2. Identificación de larvas infectantes de estrongilidos de rumiantes 3.4.3. Características morfológicas de las larvas infectantes de rumiantes Dr. Juan Antonio Figueroa Castillo1 M. en C. Carlos Jasso Villazul2 M. en C. Enrique Liébano Hernández3 Dr. Pablo Martínez Labat4 Dr. Roger Iván Rodríguez Vivas5 Dr. Juan José Zárate Ramos6 1Departamento de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México. 2Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal. SAGARPA. 3CENID-Parasitología Veterinaria /INIFAP. Jiutepec, Morelos. 4Facultad de Estudios Superiores, Cuautitlán. Universidad Nacional Autónoma de México. 5Laboratorio de Parasitología. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuaria. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Yucatán. 6Laboratorio de Parasitología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Nuevo León. EXAMEN COPROPARASITOSCÓPICO Capítulo 3 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 79 ~ 3.1. INTRODUCCIÓN Junto con las heces salen del hospedador ooquistes, quistes, huevos, larvas e incluso especímenes adultos de parásitos que se localizan en el tracto digestivo, respiratorio o en el hígado. Por esta razón las heces son una gran fuente de información sobre los endoparásitos que alberga un hospedador (Thienpont et al., 1979; Soulsby, 1987; Sánchez, 2010). El examen coproparasitoscópico consiste en la observación macro y microscópica de las materias fecales en busca de parásitos. Las técnicas que sólo revelan la presencia de parásitos son las llamadas técnicas cualitativas y las que denotan la intensidad y las consideraciones clínicas de la infección son las llamadas técnicas cuantitativas; ambas son estudios microscópicos de laboratorio. Las características deseadas de un método coproparasitoscópico son polivalencia, sensibilidad, fácil ejecución y resultados confiables. La polivalencia está dada por la capacidad de revelar la presencia de un mayor número de elementos parasitarios como son: huevos, ooquistes de protozoarios, larvas de nematodos, segmentos grávidos de cestodos, nematodos adultos, etc. Los diversos métodos poseen diferente grado de capacidad polivalente determinada por el nivel de densidad de la solución utilizada que permite hacer flotar a las estructuras parasitarias. Un método rutinario es aquel que permite realizar el mayor número de análisis en el menor tiempo posible (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Para su interpretación se deben considerar los factores que determinan la variación en la cantidad de ooquistes y/o huevos eliminados, tales como: diferencias en la prolificidad de las especies, ritmo en la ovoposición, número de hembras, consistencia de las heces, la distribución de los parásitos en las heces, entre otros factores. Se debe tener en cuenta que las técnicas coproparasitoscópicas están enfocadas a la detección de parásitos en el periodo patente. Por los motivos anteriores, los resultados negativos (cuando no se observan estructuras parasitarias), no son concluyentes y se recomienda hacer más pruebas (ver antecedentes de la técnica de Faust) (Anónimo, 1971; Thienpont et al., 1979; Hendrix y Robinson, 2006; Bowman, 2011). Los huevos de los nematodos continúan desarrollándose durante el transporte de las muestras, por lo que se recomienda examinarlas lo más frescas posible o refrigerarlas. Las muestras colectadas directamente del suelo y que estuvieron en contacto con tierra, agua o pasto pueden contener nematodos de vida libre o de las plantas o huevos de ácaros (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Para un correcto diagnóstico de las parasitosis gastrointestinales que afectan a los animales es necesario realizar estudios clínicos de los pacientes o poblaciones animales, así el estudio de las condiciones epidemiológicas imperante en una región. Esto debe ir acompañado de un diagnóstico de laboratorio apropiado que permita identificar los parásitos gastrointestinales que afectan a los animales. En este capítulo se presentan las principales técnicas de diagnóstico de parásitos en heces para apoyar Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 80 ~ al profesionista en la toma de decisiones para los programas de prevención y control de enfermedades parasitaria en los animales. 3.2. EXAMEN MACROSCÓPICO Fundamento El examen macroscópico de las heces puede revelar en algunos casos la presencia de parásitos adultos (nematodos, trematodos, proglótidos de cestodos, etc.) que son expulsados en las heces de los animales. Además es necesario reportar las características de las heces tales como la consistencia (suave, diarreica, dura), color, presencia de sangre (semidigerida, estrías), moco y el tiempo de haber tomada las heces (Hendrix y Robinson, 2006). En el examen macroscópico se recomienda separar parásitos o fragmentos de estos, ya sea de las heces o del contenido del tracto gastrointestinal. Es de utilidad para la detección de proglótidos de Dipylidium caninum y Taenia spp. en perros y gatos, y del género Moniezia en rumiantes, así como como de larvas de Gasterophilus en équidos (Besné et al., 2006). Material y equipo Caja de Petri o charola de fondo obscuro. Solución salina fisiológica. Cuchara, espátula, aguja de disección o pinceles. Lupa (preferible con luz). Procedimiento Diluir una porción de heces en solución salina fisiológica en un vaso o recipiente. Colocar una porción de heces diluidas, en una caja de Petri o charola con fondo obscuro. Examinar a ojo desnudo o con el auxilio de una lupa. Dispersar las heces con ayuda de una espátula o aguja de disección. Separar los parásitos con una aguja de disección o un pincel. Colocar otra porción de muestra y examinar. Repetir hasta terminar la muestra. En la Figura 3.1 se muestra una representación gráfica del examen macroscópico directo. Interpretación Es un procedimiento auxiliar, no se recomienda como prueba de diagnóstico única, los hallazgos negativos no son concluyentes pero los resultados positivos son tan válidos como los obtenidos con las técnicas de concentración más eficaces (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 81 ~ Factores que pueden alterar los resultados Los elementos parasitarios obtenidos por este medio, nunca se deben identificar de visu. Si se hiciera, se puede perder información o inducir a errores de diagnóstico. La identificación debe realizarse una vez aclarados, teñidos o montados, según el caso (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Figura 3.1. Examen macroscópico directo, 1) Colocar una muestra de heces en una charola de fondo obscuro o las heces diluidas en agua o solución salina fisiológica, 2) Agregar agua, 3) Dispersar las heces, 4) Colectar los parásitos e identificarlos en el microscopio. 3.3. EXAMEN MICROSCÓPICO El examen microscópico es fundamental en coprología, para cubrir mayor diversidad de formas parasitarias es recomendable hacerlo en dos etapas complementarias: examen microscópico directo y examen microscópico con alguna técnica de concentración (Besné et al., 2006; Hendrix y Robinson, 2006). 3.3.1. Técnica directa Fundamento El frotis directo obtenido por disolución de una partícula muy pequeña de heces en una gota de solución salina fisiológica o lugol, constituye una técnica sencilla y rápida de Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 82 ~ examen. El uso de la solución salina fisiológica en vez del agua evita la lisis de trofozoitos de protozoos muy lábiles a los cambios osmóticos (Bowman, 2011). El frotis tiene ciertas ventajas diagnósticas sobre otras técnicas y estas son: a) la flotación en soluciones hipertónicas tiende a deformar las larvas, dificultando así la diferenciación de infecciones causadas por el orden Strongyloides y vermes pulmonares, y b) el frotis puede poner de manifiesto formas de protozoarios y duelas, así como ciertos huevos de cestodos que pueden pasar inadvertidos con las técnicas de concentración. Los frotis directos de materia fecal permiten observar la movilidad de amebas, flagelados como los géneros Giardia, Hexamita, Chilomastix, así como de Trichomonas muris, larvas de nematodos, etc. (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005; Hendrix y Robinson, 2006). La técnica directa tiene desventajas tales como (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005; Bowman, 2011): Sólo se puede examinarse una pequeña porción de heces. Es efectiva sólo donde la concentración de huevos es alta. Frecuentemente es difícil identificar los huevos ya que están parcialmente cubiertos por detritus, y No pueden obtenerse resultados cuantitativos. Material y equipo Microscopio óptico. Solución salina fisiológica. Lugol. Aplicadores. Cubreobjetos. Procedimiento Sobre un portaobjetos colocar separadamente, una gota de solución salina fisiológica y otra de lugol. Con un aplicador de madera, depositar una muestra de 1-2 mg de heces (del tamaño de un grano de arroz) y mezclarla con la solución salina fisiológica. Con el mismo aplicador retirar las fibras y otros fragmentos gruesos. Colocar un cubreobjetos. Efectuar la misma operación con la gota de lugol. Observar al microscopio con los objetivos de 10X y 40X. En la Figura 3.2 se muestra una representación gráfica examen microscópico directo. Interpretación Los hallazgos negativos no son concluyentes pero los resultados positivos son tan válidos como los obtenidos con las técnicas más eficaces de concentración (Hendrix y Robinson, 2006). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 83 ~ Factores que pueden alterar los resultados Como la suspensión resultante debe ser lo suficientemente fina para leer a través de la misma tan sólo pueden examinarse partículas pequeñas de heces, siendo este el principal inconveniente de la técnica (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Recomendaciones En pequeñas especies, se pueden realizar frotis con las heces adheridas al termómetro rectal. El uso de cubreobjetos mejora la visualización y ayuda a evitar que ensucie la lente de los objetivos del microscopio (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Figura 3.2. Examen microscópico directo. 1) En un portaobjetos colocar una gota de solución salina fisiológica y una de lugol, 2) Colocar una pequeña muestra de heces en cada gota, retirar el material grueso y observar en el microscopio. 3.3.2. Técnica de flotación Fundamento Existen variantes de esta técnica; sin embargo, todas se fundamentan en que los huevos u ooquistes de una gran diversidad de parásitos flotan en una solución más densa que el agua, mientras que los detritus sedimentan. También se conocen como técnicas de concentración o enriquecimiento y permiten desenmascarar infecciones leves (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Debido a que muchos de los huevos y ooquistes suelen tener una densidad entre 1.050 y 1.150, se utilizan soluciones con densidades relativas de 1.200 a 1.300 (la del agua destilada es de 1.000 a 4ºC) (Hendrix y Robinson, 2006). Las soluciones saturadas más usadas en la práctica veterinaria son: sal común (densidad de 1.120 a 1.200), Sulfato de Zinc al 33% (densidad de 1.180 a 1.200), Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 84 ~ sulfato de magnesio al 35% (densidad de 1.220 a 1.280) y solución saturada de azúcar (densidad de 1.200), solución de Sheather o sobresaturada de azúcar (densidad de 1.300), nitrato sódico (densidad de 1.200 a 1.360). El rango de densidad depende de la cantidad de soluto y la temperatura (Hendrix y Robinson, 2006; Flynn, 2007). Los huevos de trematodos son generalmente más pesados y requieren soluciones como la de yoduro mercurato de potasio con densidad de 1.440; sin embargo, por ser muy tóxica y corrosiva, ha caído en desuso (Sánchez, 2010). Los laboratoristas tienen preferencias personales en la selección de la solución saturada a utilizar, la recomendación es verificar la densidad cada cierto tiempo, mediante el uso de un densímetro (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Esta técnica se recomienda para todas las especies domésticas. Se pueden observar huevos de nematodos (Figuras 3.3., 3.4. y 3.5), ooquistes de protozoarios y huevos de cestodos (excepto Dipylidium caninum) (Figura 3.6). Figura 3.3. Huevos de nematodos obtenidos por flotación. 1) Toxocara cati, 2) Toxascaris leonina, 3) Parascaris equorum,4) Ascaris suum, 5) Heterakis gallinarum, 6) Ascaridia galli. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 85 ~ Figura 3.4. Huevos de nematodos,obtenidos por la técnica de Flotación. 1) Ancylostoma caninum, 2) Nematodirus y estrongilido de borrego, 3) Estrongilidos de caballo, 4) Dictyocaulus arnfieldi, 5) Strongyloides westerii. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 86 ~ Figura 3.5. Huevos de nematodos, obtenidos por la técnica de Flotación. 1) Capillaria spp., 2) Trichuris spp., 3) Spirocerca lupi, 4) Mammomonogamus spp., 5) Macracanthorrynchus hirudinaceus (Acantocephala), 6) Linguatula serrata (Pentastomida). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 87 ~ Figura 3.6. Huevos de cestodos obtenidos por la técnica de Flotación. 1) Hymenolepis nana, 2) Raillietina spp., 3) variantes del huevo de Moniezia spp., 4) Anoplocephala spp., 5) Taenia spp. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 88 ~ Material y equipo Microscopio óptico. Mortero. Cuchara. Dos vasos de plástico o vidrio. Solución de flotación. Colador. Mechero. Asa metálica. Portaobjetos. Procedimiento Homogenizar la muestra. Si las heces son de ovino, caprino o conejo, macerarlas en un mortero y después homogeneizarlas. Por medio de una cuchara depositar aproximadamente 5 g de materia fecal dentro de uno de los vasos. Añadir 1 ml de la solución saturada de azúcar hasta obtener una pasta. Agitar constantemente y añadir de 60 a 100 ml de solución saturada hasta formar una solución homogénea. Pasar esta suspensión por un colador colocándola en un segundo vaso para que quede libre de partículas gruesas. Dejar reposar de 15 a 20 minutos. Después de este tiempo, con el asa tomar tres gotas de la superficie de la suspensión y colocarlas en un portaobjetos. Antes de colectar la muestra, el asa debe pasarse por una flama para asegurarse que no lleva algún huevo u ooquiste. Observar al microscopio con el objetivo de 10X. Enfocar la superficie de las gotas. Interpretación Los resultados negativos no son concluyentes. Se recomienda realizar una serie de tres exámenes con muestras de tres días consecutivos para incrementar la sensibilidad de la prueba (ver antecedentes de la técnica de Faust). Los resultados positivos evidencian la presencia de parásitos en periodo patente. Factores que pueden alterar los resultados La densidad de la solución de flotación es un factor crítico en esta prueba, por lo que debe verificarse periódicamente. En soluciones que no alcanzan la densidad las formas parasitarias tardan más tiempo en flotar o nunca lo hacen. Cuando se sobresatura una Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 89 ~ solución de flotación, se cristaliza en un par de minutos y en menos tiempo si se coloca un cubreobjetos. En la Figura 3.7 se muestra una representación gráfica de la técnica de flotación. Figura 3.7. Técnica de flotación. 1) Colocar una muestra de heces en un vaso, 2) Agregar un par de mililitros de solución saturada. 3) Revolver hasta formar una pasta, 4) Agregar de 60 a 100 ml de solución saturada, 5) Revolver y colar a otro vaso, 6) Esperar de 15 a 20 minutos, 7) Flamear el asa, 8) Colectar con el asa tres muestras de la superficie, y 9) colocar las gotas en un portaobjetos y observar en el microscopio compuesto. Es importante respetar el tiempo de reposo para permitir que los huevos floten y se concentren en la superficie de la mezcla de heces y solución saturada; sin embargo, mientras mayor tiempo transcurra, flotarán más detritus y después de algunas horas los huevos se deforman o rompen. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 90 ~ Al momento de colectar la muestra del vaso, el asa debe tocar levemente la superficie del líquido, que es donde se concentran las formas parasitarias. Cuando no se homogeneiza perfectamente la muestra con la solución de flotación los huevos u ooquistes quedan atrapados entre los detritus (O´Grady y Slocombe, 1980). Recomendaciones Para incrementar la sensibilidad de la técnica, se puede pasar la suspensión de materia fecal a través de un colador y un embudo a dos tubos de centrífuga, centrifugándolos durante dos o tres minutos a 650 g. Es preferible la solución de Sheather para concentrar los ooquistes del género Cryptosporidium. La solución de azúcar tarda más tiempo en cristalizarse, pero requiere de la adición de formol o fenol como conservadores. 3.3.3. Técnica de Faust Fundamento Esta técnica fue desarrollada por el distinguido parasitólogo el Dr. Ernest Carroll Faust y sus colaboradores en 1938 en virtud de que los procedimientos disponibles en aquella época provocaban una destrucción muy elevada de estructuras parasitarias, particularmente de los quistes. La combinación del procedimiento y los reactivos empleados permitió seleccionar al menos 13 variantes probadas, el sistema con los mejores resultados en cuanto a capacidad para detección y preservación estructural de la mayoría de los quistes y huevos que comúnmente se presentaban en las heces humanas. Se complementó el planteamiento al usar un esquema de procesamiento de tres muestras seriadas que permitió detectar hasta el 96% de los individuos parasitados. Durante un lapso muy prolongado el uso de esta técnica se enfocó a laboratorios de diagnóstico en humanos y hace relativamente poco tiempo ha sido adoptada en el procesamiento de muestras fecales de perros y gatos debido a que aumenta la probabilidad de detección del protozoario Giardia lamblia (Figura 3.8), aunque también pueden detectarse huevos de cestodo y nematodo (no permite detectar huevos de trematodo) y su uso puede extenderse a muestras de todas las especies domésticas (Faust et al., 1938; Martínez y Morales, 1995). En esta técnica se emplea una solución de alta densidad la cual permite que las estructuras parasitarias con menor peso específico tiendan a flotar manteniendo su estructura normal, el proceso se acelera al centrifugarse la muestra separando de una forma muy satisfactoria los elementos residuales en las heces, eliminando muchos de los desechos y ofreciendo un aspecto muy limpio que facilita la observación de las Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 91 ~ estructuras quísticas (Figura 3.8. y 3.9). Además el uso de lugol permite un marcado contraste entre estructuras parasitarias (captan bien el colorante) y artefactos (Thienpont et al., 1979). Figura 3.8. Giardia spp. 1) Quistes sin teñir, 2) Quistes teñidos con lugol, 3) Trofozoito teñido con lugol. Figura 3.9. Cryptosporidium obtenidos por la técnica de Faust de un perro con diarrea. 1) Quistes sin teñir, 2) Quistes teñidos con la técnica de Kinyoun, 3) Detalle del ooquiste de Cryptosporidium a 100X. Material y equipo Tubos de centrífuga cónicos con capacidad para 15 ml (15x150 mm) (pueden utilizarse otros tubos de 13x100 mm). Gradilla. Varilla de vidrio de 3 mm de diámetro. Colador de plástico o metal. Recipientes de plástico o vidrio (vasos de 250 ml). Cuchara. Técnicas para el diagnósticode parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 92 ~ Portaobjetos. Cubreobjetos (se recomienda emplear de 18x18 mm). Asa de alambre terminada en círculo con diámetro de 5 a 8 mm formando un ángulo recto con el resto del alambre modificado para su uso en el laboratorio de Parasitología (se usan asas bacteriológicas de tugsteno que se modifican). Centrífuga clínica. Microscopio compuesto. Mechero de Bunsen. Solución saturada de Sulfato de Zinc al 33% con una densidad de 1.180. Lugol parasitológico Agua destilada o corriente. Procedimiento Colocar aproximadamente 5 g de materia fecal en un vaso, disolverla en 50 ml de agua destilada y homogeneizarla hasta suspenderla perfectamente. Colar a un segundo recipiente y depositar la suspensión en el tubo de centrifuga (llenar hasta un centímetro del borde del tubo) y proceder a centrifugar a 650 g por 2 minutos. Decantar el sobrenadante y resuspender nuevamente con agua destilada (esto puede hacerse por medio de una varilla de vidrío, por agitación manual o mecánica) y volver a centrifugar tirando el sobrenadante, repitiendo el proceso hasta que el sobrenadante quede transparente, generalmente se requiere de 3 a 4 centrifugaciones. Una vez aclarado el sobrenadante resuspender (esto puede hacerse por medio de una varilla de vidrío, por agitación manual o mecánica) la pastilla de sedimento con la solución saturada de Sulfato Zinc centrifugando nuevamente a 650 g por 2 minutos. Retirar el tubo de la centrifuga y depositarlo en la gradilla y a continuación se pueden seguir hasta tres opciones para obtener el material que flota: o Con el asa de alambre (previamente flameada), tomar de la superficie del líquido tres gotas del material flotante y depositarlas separadas sobre un portaobjetos para hacer la observación directamente al microscopio (para la revisión en esta opción debe considerarse la convexidad que presenta la gota de líquido en una superficie plana debiendo adaptar el enfoque de la misma al plano de la superficie a observar). o Por medio del asa de alambre (previamente flameada),tomar una gota de sobrenadante directamente de la superficie que debe depositarse en un portaobjetos, sobre esta gota debe depositarse una gota de lugol parasitológico y homogeneizarlas, sobre esta se deposita un cubreobjetos de 16 x 16 mm que permite que la muestra se extienda para poder realizar la observación. o Transcurrido el tiempo de centrifugación adicionar al tubo solución saturada de Sulfato de Zinc hasta llenarlo y formar un menisco en la superficie. Dejar Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 93 ~ reposar el tubo por un lapso de 10 minutos y colocar sobre el menisco un cubreobjetos de tal manera que la totalidad de la superficie líquida del menisco haga contacto, retirarlo y colocarlo sobre un portaobjetos en el que previamente se ha depositado una gota de lugol y observar al microscopio. El material obtenido debe revisarse en su totalidad para detectar las estructuras parasitarias empleando el objetivo de 10X y en caso de observar estructuras sugerentes pasar a 40X para mejorar la observación, la revisión de la muestra se hace llevando una secuencia de zig-zag hasta cubrir la totalidad de la muestra. En la Figura 3.10 se muestra una representación gráfica de la técnica de Faust. Interpretación Esta es una prueba de tipo cualitativo por lo cual en los resultados simplemente se reporta el estadio y nombre correcto de los organismos observados, en caso contrario será negativo, como se ha señalado previamente se recomienda tomar muestras del paciente de tres distintos días o de distintas evacuaciones para aumentar la probabilidad de detección de parásitos. De la experiencia obtenida en humanos se desprende que cuando se analizan series de tres diferentes muestras secuenciales la probabilidad de detección aumenta hasta un 86% y el esquema es recomendable cuando se procesan las muestras de caninos y felinos (Faust et al., 1938; Martínez y Morales, 1995). Factores que pueden alterar los resultados El más frecuente es que la densidad de la solución se encuentre por debajo de 1.180. Que erróneamente se hagan las primeras centrifugaciones con la solución saturada eliminando por completo las estructuras que pueden flotar con esa densidad. Recomendaciones En general el uso de esta técnica manejando la densidad de 1.180 en la solución saturada reduce el número de huevos de nematodos detectados comparada con la técnica convencional de flotación (aunque debe considerarse que es una prueba cualitativa, no cuantitativa por lo que los criterios no van a variar, esto en especial con huevos de ascáridos y estrongilidos). En este caso se puede usar material desechable según sea el caso, pero cuando se va a trabajar con muestras de forma rutinaria es recomendable comprar vasos de material plástico de paredes gruesas que pueden durar años y son fáciles de limpiar y difícilmente se rompen. Se recomienda el empleo de tubos de centrifuga de poliestireno que resultan muy resistentes para el trabajo cotidiano y procesamiento de grandes volúmenes de muestras o bien sustituirlos por tubos Vacutainer® anchos los cuales permiten procesar un volumen mayor de muestra incrementando la posibilidad de detectar estructuras parasitarias y que resultan de bajo costo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 94 ~ Figura 3.4. Técnica de Faust. 1) Depositar una muestra de heces en un vaso, 2) Agregar agua, 3) Disolver las heces, 4) Colar a otro vaso, 5) Depositar la dilución en un tubo cónico, 6) Centrifugar, 7) Decantar, 8) Resuspender el botón con agua, 9) Centrifugar, 10) Repetir los pasos decantar- resuspender- centrifugar hasta que el sobrenadante este claro, 11) Resuspender el botón con Sulfato de Zinc, 12) Centrifugar, 13) Colectar una muestra de la superficie y depositarla en un portaobjetos o 14) Llenar el tubo con Sulfato de Zinc hasta formar un menisco convexo y colocar un cubreobjetos dejar reposar, 15) Retirar cuidadosamente el cubreobjetos y colocarlo en un portaobjetos. Observar en el microscopio. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 95 ~ Es preciso analizar la condición del lugol que se emplea para contrastar y colorear las estructuras parasitarias ya que con el tiempo se va aclarando, otorgando una coloración cada vez más pálida a las muestras a revisar (el contenido de los goteros conteniendo este colorante debe cambiarse cada tres a cuatro meses). La prueba puede ser apta para la detección de huevos de trematodo cuando la densidad se incrementa a 1.250 e incluso algunas personas la han convertido en semicuantitativa usando cantidades definidas de heces diluidas en volúmenes conocidos de solución. Si se llegan a procesar muestras formalinizadas es preciso elevar la densidad de la solución a 1.200. Deben evitarse desaceleraciones bruscas o una detención repentina de la centrífuga en la última fase, ya que eso puede hacer que las estructuras parasitarias sufran sedimentación y no sean detectadas con facilidad. Si se opta por el uso del asa de alambre para recuperar materiales debe aumentarse su diámetro para captar una mayor cantidad de sobrenadante (7-8 mm de diámetro). Una vez procesada la muestra en la solución saturada de Sulfato de Zinc es necesario realizar la revisión en un plazo no mayor de una hora ya que tanto los quistes de protozoariocomo los huevos de nematodo tienden a colapsarse y cambiar su morfología. No es factible la detección de trofozoitos de protozoarios o larvas de nematodos en este procedimiento. Algunos autores recomiendan que partiendo del hecho de haber eliminado una gran cantidad de material que regularmente obstaculiza la visión es preciso revisar también el sedimento obtenido en los tubos lo cual permite observar aquellas estructuras que han sedimentado (resulta poco práctico cuando se van a revisar una gran cantidad de muestras). Algunos laboratorios asignan valores de cuantificación de acuerdo con la cantidad de estructuras encontradas por campo microscópico (1 a 4 +, 4 a 8 ++, 9 a 13 +++, 14 o más ++++) aunque debe considerarse que la densidad de estructuras parasitarias puede variar por influencia de muchos factores, especialmente en el caso de las estructuras quísticas. 3.3.4. Técnica de sedimentación (sedimentación múltiple, cualitativa) Fundamento La técnica coproparasitoscópica de Sedimentación es una técnica cualitativa para determinar la presencia de huevos de trematodos presentes en la materia fecal. El principio de esta técnica es el de concentrar los huevos de trematodos a partir de una muestra de heces y se basa en la diferencia del peso específico del líquido empleado (agua) y el peso de los huevos de estos parásitos, los cuales tienden a concentrarse en el fondo del recipiente. Es recomendable su utilización para la detección de huevos de Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 96 ~ Fasciola hepatica y paramfistomidos: P. cervi, Cotylophoron spp., Calycophoron spp. y ocasionalmente Dicrocoelium dendriticum, así como Paragonimus en perros y Macracanthorrhynchus en cerdos (Figura 3.11) (Flores et al., 1986; FAO, 1994; Sánchez, 2010). Figura 3.11. Huevos de helmintos obtenidos por la técnica de sedimentación. A) Huevo de Fasciola hepatica (amarillo) y paranfistomido (incoloro) observados con el lente de 4X, 2) Huevo de Fasciola hepatica (amarillo) y paranfistomido (incoloro) observados con el lente de 4X. Material y equipo Bolsas de plástico. Caja de Petri. Coladera de malla fina. Cuchara. Marcador de tinta indeleble. Cinta adherible. Mortero. Piseta. Recipientes de boca ancha con volumen de 100 a 250 ml o vaso de precipitado de 250 ml. Varilla de vidrio o aplicador de madera. Agua de la llave. Balanza granataria. Microscopio compuesto. Refrigerador. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 97 ~ Procedimiento Homogeneizar 5 g de materia fecal. En el caso de ovinos, debe macerarse la muestra. Marcar el vaso de precipitado con la identificación de la muestra. Colocar en el frasco 5 g de heces, agregando agua suficiente para disolverla, mezclándola hasta lograr una muestra homogénea. Colar con una malla fina o un tamiz para colar la muestra, al pasarla a otro frasco o vaso de precipitado, para eliminar los fragmentos de forraje de gran tamaño. Agregar agua de la llave al contenido colado hasta el cuello del frasco o del vaso. Dejar reposar 5 minutos, decantar y volver a resuspender el sedimento con agua de la llave, este paso se repite las veces necesarias hasta que el sobrenadante este claro. Decantar y pasar el sedimento a una caja Petri. Colocar la caja Petri en un microscopio compuesto para observar su contenido con el objetivo de menor aumento 10X, revisar cuidadosamente en zigzag, analizando todo el sedimento, la diferenciación de los huevos se lleva a cabo en relación a sus características morfológicas. Para poder diferenciar los huevos de Fasciola hepatica o los de Paramphistomum spp. debe considerarse la morfología de los huevos de Fasciola hepatica, ya que estos son de un color amarillo dorado característico, diferente al de Paramphistomum spp., que son de color blanco plateado. En la Figura 3.12 se muestra una descripción gráfica de la técnica de sedimentación. Interpretación El resultado positivo es cuando se detecta la presencia de huevos de trematodos en el sedimento de la muestra problema, reportándose en la columna correspondiente al parásito identificado como positivo. El resultado negativo es cuando no hay presencia de huevos de trematodos en la muestra de sedimento. Factores que pueden alterar los resultados Cuando el tiempo de reposo es menor, se corre el riesgo de desechar los huevos al momento de decantar, lo mismo ocurre si se agita mucho el sedimento al decantar. Demasiado detritus pueden ocultar los huevos. Recomendaciones El agua tibia favorece la sedimentación de los huevos. Utilizar solución jabonosa al 1% en lugar de agua, favorece la eliminación de detritus. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 98 ~ Figura 3.12. Descripción gráfica de la técnica de sedimentación. 1) Homogeneizar la muestra en su misma bolsa, 2) Pesar 5 g de muestra, 3) Agregar agua para disolver la muestra en forma homogénea, 4) Pasar la muestra por un colador para eliminar el forraje grande y recibirlo en otro vaso de precipitado, 5) Dejar reposar la muestra por al menos 5 minutos, 6) Decantar la muestra y volver a llenarla con agua de la llave cuantas veces sea necesario, 7) Pasar el sedimento a una caja de Petri, 8) Revisar la muestra en el microscopio compuesto con el objetivo 10X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 99 ~ 3.3.5. Técnica de Graham Fundamento Esta técnica se basa en que las hembras de los oxiuros salen a través del esfínter anal del hospedero para depositar sus huevos. La ovoposición va acompañada de una substancia gelatinosa que mantiene pegados los huevos a la región perianal. Los proglótidos de algunos cestodos como el género Dipylidium se separan del estróbilo y salen por el esfínter anal, las contracciones y elongaciones que realiza el proglótido para moverse expulsan una gran cantidad de bolsas ovígeras que se quedan pegadas alrededor del ano, algunos proglótidos quedan atrapados en el pelo de la región perianal. Se recomienda para la detección de oxiuros (Oxyuris en équidos, Passalurus en conejos, Skjrabinema en ovejas y cabras, Shyphacia en ratas y ratones), y Dipylidium en perros y gatos (Figura 3.13) (Besné et al., 2006). Figura 3.13. Huevos obtenidos por la técnica de Graham. 1) Paquetes ovígeros de Dipylidium caninum y detalle de los embriones, 2) Skrjabinema ovis, 3) Syphacia spp., 4) Oxyuris equi. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 100 ~ Material y equipo Cinta adhesiva transparente. Abatelenguas. Portaobjetos. Microscopio compuesto. Procedimiento Pegar alrededor de un extremo del abatelenguas, la cinta transparente con la parte adhesiva hacia fuera. Sujetar con los dedos índice y pulgar el abatelenguas y colocarlos en la región perianal haciendo presión a uno y otro lado. Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y pegarla sobre el portaobjetos para observar en el microscopio compuesto con el objetivo seco débil (10X). En la Figura 3.14 se muestra una descripción gráfica de la técnica de Graham. Interpretación Se considera positivo si se observa al menos un huevo, bolsa ovígera o proglótidos. Factores que pueden alterarlos resultados Que no se haga suficiente presión al pegar la cinta adhesiva en la región perianal. Recomendaciones En caballos es frecuente observar las manchas blanquecinas que dejan las ovoposiciones de Oxyuris equi en la región perianal, de ahí se toma la muestra. La mayoría de los huevos o bolsas ovígeras se quedan pegadas a la cinta adhesiva en la primera vez que se toma la muestra. Para una segunda toma utilice una porción de cinta nueva, ya que si pega y despega la misma cinta en varias partes de la región perianal se corre el riesgo de que se despeguen los elementos parasitarios. En lugar del abatelenguas se pueden utilizar los dedos. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 101 ~ Figura 3.14. Técnica de Graham. 1) Colocar la cinta transparente con el adhesivo, 2) Detalle de la región perianal de un gato, la cinta adhesiva debe pegarse en la zona de la elipse. Las flechas señalan proglótidos, 3) Se retira la cinta con la impronta y se pega en un portaobjetos, 4) Recortar los extremos sobrantes de la cinta y observar en el microscopio compuesto. 3.3.6. Técnica de McMaster Fundamento La técnica coproparasitoscópica de McMaster es una técnica cuantitativa para determinar la eliminación de huevos de helmintos u ooquistes de protozoarios presentes en la materia fecal. El principio de esta técnica de diagnóstico se basa en la utilización de una solución saturada, generalmente elaborada con cloruro de sodio, aunque pueden utilizarse otras Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 102 ~ soluciones saturadas, las cuales por su densidad, permiten que los huevos de helmintos y ooquistes de protozoarios (formas parásitas) presentes en la materia fecal, floten y puedan ser observados y contabilizados en una cámara de McMaster, para determinar su cantidad por gramo de heces. En el caso de la mayoría de los detritos, se van al fondo, evitando así su interferencia en la observación y contabilidad de ooquistes o huevos. La base matemática de esta técnica cuantitativa, es que una muestra de 2 g de heces se diluye en solución saturada en un volumen de 28 ml en una probeta, los cuales permiten el desplazamiento de la suspensión en un volumen total de 30 ml. Esta muestra es homogeinizada para depositar mediante un gotero, en una cámara de McMaster, la cual cuenta con dos compartimentos, cada uno de los cuales mide un cm2, con una altura de 0.15 cm, dando una suma total de los dos compartimentos de 0.30 ml que corresponden al 100%, por lo que la cantidad de huevos u ooquistes contabilizados, se multiplican por 100 y se divide entre dos puesto que se utilizaron 2 g de heces, expresándose el resultados, como el número de ooquistes o huevos de helmintos por gramo de heces (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Algunas cámaras de McMaster cuentan con dos o tres compartimentos los cuales deben medir 1 cm2, con una abertura de 0.15 cm. Según el fabricante de la cámara se puede encontrar que algunas tienen dividido el compartimento en seis a diez canales que permitirán realizar el conteo de huevos u ooquistes. Esta técnica puede ser aplicada en el laboratorio o a nivel de campo (Hendrix y Robinson, 2006; Sánchez, 2010). Material y equipo Bala magnética. Bolsas de plástico. Cámara de McMaster. Cuchara. Densímetro de 1:100 a 1:200. Frasco de 30 ml con tapa de plástico (Frasco de McMaster) o probeta de 30 ml con tapa. Gasa. Gotero o pipeta Pasteur. Matraz de vidrio de 4 000 ml. Solución saturada de Cloruro de Sodio. Balanza granataria. Refrigerador. Microscopio compuesto. Contadores de 1 y 5 teclas. Platina con agitador. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 103 ~ Procedimiento Identificar el frasco y la cámara de McMaster que se utilizarán, con misma identificación de la muestra. Homogenizar la muestra que se va a procesar, dentro de la bolsa de plástico o guante de palpación, donde se resguarda. Pesar en una balanza o en un frasco de 30 ml (frasco de McMaster o probeta de 30 ml con tapa), por medio del desplazamiento del líquido (equivalente aproximadamente a 2 ml), 2 g de la muestra fecal problema. Agregar solución salina saturada de Cloruro de Sodio hasta la marca de 30 ml indicada en el frasco. También puede medirse el volumen de 28 ml de solución salina fisiológica mediante una pipeta. Agitar la muestra hasta que se disuelva completamente y después de abrir la tapa, colocar una gasa en la boca de la probeta antes de introducir el gotero, para evitar los residuos vegetales. Inmediatamente con el gotero, tomar un volumen suficiente para llenar el espacio de lectura de la cámara de McMaster, evitando la formación de burbujas, en sus dos compartimentos. Dejar reposar de 1 a 2 minutos para que floten las formas parasitarias. Observar al microscopio con el objetivo de menor aumento 10X enfocando los canales marcados en la parte inferior del cubreobjetos de la cámara. Mediante la observación directa: o Primero se realiza el diagnóstico diferencial identificando los géneros de parásitos en relación a las características morfológicas que presentan los huevos y ooquistes, apoyándose en la bibliografía de referencia. o Realizar el conteo de huevos y ooquistes de parásitos en los canales (6 a 10 según el fabricante) de la cámara, auxiliado con un contador manual. En la Figura 3.15 se presenta una descripción gráfica de la técnica de McMaster. NOTA. La manipulación de la cámara debe ser rápida para evitar que se deshidrate la muestra e impida su lectura. Interpretación El número de huevos no es necesariamente indicativo del número de gusanos presentes en el tracto gastrointestinal. Los huevos son producidos solamente por gusanos hembras, adultas, fértiles (o hermafroditas) y por tanto, podrán estar ausentes en infecciones con parásitos inmaduros o de un solo sexo. La producción diaria de huevos por hembras fértiles está influenciada por factores fisiológicos del hospedero, por ejemplo, hay un aumento cuando hay estrés o durante la lactación, o puede disminuir cuando hay una buena inmunidad del hospedador. La quimioterapia también puede afectar la producción de huevo, como cuando se aplican corticosteroides, en cuyo caso hay un incremento o cuando se aplican Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 104 ~ dosis sub-letales de antihelmínticos, en el que se presenta una disminución en la eliminación de huevos. Algunos alimentos y piensos pueden tener un efecto similar, por ejemplo, forrajes ricos en taninos, tienden a presentar un decremento. La concentración de huevos también puede estar influenciada por el volumen diario de heces, producido por el hospedador, la tasa de pasaje de la ingesta a través del intestino y la distribución de los huevos en la masa fecal. Figura 3.15. Descripción gráfica de la técnica de McMaster, 1) Homogeneizar la muestra, 2) Pesar 2 g de muestra, 3) Agregar 28 ml de solución salina saturada o hasta la marca de 30 ml, 4) Agitar la muestra hasta disolverla completamente, 5) Colocar una gasa en la boca de la probeta y tomar un volumen suficiente para llenar una cámara, 6) Llenar la cámara McMaster evitando las burbujas y dejarla reposar, 7) Enfocar los canales con el objetivo 10X y contabilizar los ooquistes o huevos. Algunos tipos de huevos son máspesados que otros y podrían no flotar, en soluciones de baja gravedad específica, por ejemplo los huevos de Fasciola hepatica. Algunos huevos de diferentes especies de helmintos son indistinguibles (particularmente trichostrongilidos). Esto complica la interpretación clínica debido a que algunos géneros de parásitos, por ejemplo Haemonchus, producen mucho más huevos por día que otras, por ejemplo, Ostertagia. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 105 ~ En referencia a la interpretación diagnóstica sobre la cantidad de ooquistes de protozoarios o huevos de helmintos que pueden encontrarse en las heces, mediante esta técnica, puede considerarse la información contenida en el Cuadro 3.1. Cuadro 3.1. Interpretación diagnóstica y posibles daños ocasionados las diferentes especies de helmintos o protozoarios identificados en muestras fecales. Parásito identificado Detección de ooquistes o huevos (por gramo de heces) No. de parásitos que provocan daño Pérdi- das de carne (Kg) Pérdi- das en litros de leche Leve Ligera Moderada Grave Criptosporidium spp. < 300 301 - 1000 1001 - 5000 >10000 Sin datos --- --- Eimeria spp. < 300 301 - 1000 1001 - 5000 > 5000 Desde 300 --- --- Dictyocaulus spp. 1 - 100 101 - 200 200 – 300 < 300 Desde 10 -- -- Fasciola hepatica 1 - 5 5 - 10 11 – 20 > 20 Desde 1 3 - 10 1 - 7 Paramphistomum spp. 1 - 100 101 - 1000 1001 - 5000 > 5000 Desde 200 1 – 2 1 - 3 Moniezia spp. 1 - 100 101 – 900 901 - 5000 > 5000 Desde 1 40-50 -- Thysanosoma actinoides 1 – 100 101 – 900 901 - 5000 > 5000 Desde 5 -- -- Haemonchus spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 100 10-20 2 - 5 Ostertagia spp. < 100 101 - 300 301 – 2000 > 2000 500 10-25 2 - 7 Trichostrongylus spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 2,000 5 - 70 --- Mecistocirrus spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 500 --- 2 - 4 Bunostomum spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 50 -- 2 - 5 Cooperia spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 200 --- -- Toxocara spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 20 -- -- Strongyloides spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 200 -- -- Nematodirus spp. < 100 101 – 300 301 – 2000 > 2000 50 --- --- Oesophagostomum spp. < 100 101 - 300 301 – 2000 > 2000 25 25-50 1-5 Trichuris spp. < 100 101 - 300 301 – 2000 > 2000 50 10-20 -- Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 106 ~ 3.3.7. Técnica coproparasitoscópica en cama de pollo Antecedentes La técnica coproparasitoscópica en cama de pollo es una técnica cuantitativa para cuantificar los ooquistes de protozoarios del género Eimeria presentes en el material de cama, en pollos alojados en condiciones en piso (Long y Rowell, 1975). La técnica de cama es un método cuantitativo mediante la dilución, centrifugación y flotación, determinando el número de ooquistes por gramo de cama; de acuerdo a las características morfológicas de las especies de Eimeria, presente en el material de cama, así como el porcentaje de esporulación de los ooquistes presentes. Esta técnica permite identificar los factores de riesgo presentes durante la crianza de pollos en condiciones en piso, al contabilizar los ooquistes presentes en su fase infectiva o de esporulación, así como los no esporulados (Long y Rowell, 1975; Long, 1982; Donal et al., 2007). Material y equipo Aplicadores. Bolsas de plástico. Cámara de McMaster. Coladera. Cuchara. Goteros. Gradilla. Marcador de tinta indeleble. Recipientes de boca ancha con un volumen de 120 a 150 ml. Tubos de ensaye de 15 ml. Vaso de precipitado de 4,000 ml. Agua de la llave. Solución saturada de cloruro de sodio. Agitador Vortex. Báscula digital. Centrífuga. Contadores de 1 y 5 teclas. Microscopio compuesto. Refrigerador. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 107 ~ Toma de muestra Para la toma de muestra, en la caseta, se puede utilizar métodos de cinco puntos, es decir, tomar las muestras de las esquinas de la caseta y del centro; otro método es el de tomar en cinco o seis punto en zigzag; también puede utilizarse el método de línea recta, eligiendo cinco o seis puntos a lo largo de la caseta. Estos puntos deben ser al azar. Procedimiento Pesar 10 g de muestra de cama e identificar el frasco en donde se coloca. Agregar a la muestra de cama, 100 ml de agua, dejarla reposar en refrigeración a una temperatura de 2 a 9°C durante la noche. Homogeneizar perfectamente la muestra y colarla con una malla fina. Mezclar bien y vaciar 15 ml de la muestra colada en un tubo de centrifuga. Centrifugar durante 10 minutos de 700 a 900 g. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con solución saturada de cloruro de sodio, agitando perfectamente con el agitador Vortex, hasta los 15 ml del tubo. Con un gotero llenar la cámara de McMaster, dejando reposar 2 minutos. Contar en el microscopio, los ooquistes presentes en la cámara de McMaster con el objetivo 10X. Multiplicar el número de ooquistes por el factor 67 (estimado de las cantidades de muestra manejada [100X100/15X1/10]) (Long, 1982). En la Figura 3.16 se muestra una representación gráfica de la técnica coproparasitoscópica en cama de pollo. Interpretación El resultado positivo corresponde a la suma de ooquistes de coccidia presentes en todos los espacios de recuento de la cámara de McMaster, multiplicando por el factor 67 y es expresado como el número de ooquistes por gramo de cama. El resultado negativo es cuando no existe la presencia de ooquistes en los compartimentos de la cámara y es expresado como cero. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 108 ~ Figura 3.16. Representación gráfica de la técnica coproparasitoscópica en cama de pollo. 1) Homogeinización de la muestra, 2) Pesar 10 g de muestra de material de cama, 3) Agregar 100 ml de agua a la muestra de cama y dejarla reposar durante la noche, a una temperatura de 2 a 9°C, 4) Colar la muestra al pasarla a otro vaso de precipitado, 5) Pasar el líquido filtrado a un tubo de centrifuga de 15 ml, 6) Centrifugar el contenido del tubo (de 2 500 a 3 500 rpm), 7) Homogeinizar la muestra, 8) Con el contenido, llenar la cámara de McMaster, 9) Contar los ooquistes de la muestra con el lente 10X del microscopio compuesto. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 109 ~ 3.3.8. Técnica de Kinyoun Fundamento Esta técnica se derivó de la desarrollada por los médicos alemanes Franz Ziehl y Friedrich Neelsen y se empleó en el proceso de coloración específica de las bacterias alcohol-ácido resistentes que se caracterizan porque sus paredes celulares contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (con 50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir a la decoloración con el alcohol ácido después de emplear colorantes básicos, de lo cual se deriva la denominación de bacterias alcohol- ácido resistentes (la técnica fue enfocada al género Mycobacterium). El procedimiento original incluía el calentamiento de la preparación que permitía fundir las ceras de la pared bacteriana permitiendo que el colorante pasara y al enfriarse la muestra quedara atrapado y no le fuera posible salir de la bacteria manifestándose la coloración roja característica en estos organismos. A partir de esa técnica se desarrollaron una serie de variantes que permitieroncolorear otro tipo de agentes infecciosos y es el caso de la tinción de Kinyoun la cual difiere por la ausencia de calentamiento de la muestra en proceso, este aspecto ha sido aplicado en el caso de las fases ooquísticas de diferentes géneros de coccidios como: Cryptosporidium, Cyclospora y su extensión a Sarcocystis e Isospora, aunque en Parasitología Veterinaria principalmente se enfoca al primer género, inicialmente este procedimiento se usó para confirmación en muestras de heces de humano (debido a que en individuos con inmunodeficiencia resulta muy común este tipo de infecciones) y en aquellas muestras en las que hay dudas, esta coloración permite confirmar la presencia de cuatro esporozoitos en el interior de los ooquistes, que en el caso de Cryptosporidium parvum. Los ooquistes de este protozoario son pequeños y miden de 4 a 6 μm y no son fácilmente visibles cuando el observador no tiene experiencia. Gradualmente la técnica de Kinyoun se ha adaptado para su uso en animales que son afectados por diferentes especies de Cryptosporidium (Figura 3.17). También tiene una aplicación para hacer monitoreo en la contaminación de aguas residuales. Figura 3.17. Quistes de Cyclospora cayetanensis, 1) sin teñir, 2) teñidos con la técnica de Kinyoun. 100X, 3) Ooquiste de Eimeria leuckarti. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 110 ~ La efectividad de esta técnica una vez estandarizada alcanza el 100 % de detección de ooquistes en las muestras y puede compararse con la obtenida con técnicas inmunológicas como la inmunofluorescencia (Bernal et al., 1998; Ash et al., 2007; Arrendó et al., 2008). Material y equipo Portaobjetos. Metanol absoluto. Mechero Bunsen o platina para calentamiento (opcionales). Carbol-fucsina (fucsina fenicada). Alcohol-Ácido (dos posibles variantes). Solución de verde de malaquita o de azul de metileno. Aceite de inmersión. Microscopio óptico con micrómetro. Procedimiento Depositar aproximadamente 25 μl de suspensión de heces sospechosas en el centro del portaobjetos y hacer una extensión del material. Dejar secar a temperatura ambiente, fijar con metanol por 3 minutos y dejar secar. Cubrir con carbol-fucsina durante 5 minutos enjuagar hasta que el agua salga transparente. Lavar con el alcohol-ácido (ácido clorhídrico al 3% en alcohol al 95%) y enjuagar hasta que el agua quede clara (el alcohol puede ser sustituido por una solución de Ácido Sulfúrico al 1% en alcohol al 95% que resulta menos enérgico como decolorante resultando muy útil cuando los organismos son muy susceptibles a la acción del ácido). Cubrir las preparaciones con verde de malaquita por 1 minuto; lavar con agua de la llave y dejar secar. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de 100X. Las estructuras ooquísticas en caso de estar presentes se observan de color rojo púrpura en un fondo azul o verde dependiendo del colorante de contraste que se use. En la Figura 3.18 se muestra una representación gráfica de la técnica de Kinyoun. Interpretación La muestra se considera positiva si se observa por lo menos un ooquiste. Debido a la poca cantidad de muestra examinada los resultados negativos no son concluyentes y se sugiere repetir la prueba. Factores que pueden alterar los resultados En ocasiones se desprende el extendido de heces, para evitarlo se desengrasan los portaobjetos antes de utilizarlos Para mejorar la adherencia de la extensión los Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 111 ~ portaobjetos pueden ser tratados previamente con una pequeña gota de albumina formando una capa fina (Ramírez et al., 2010). Figura 3.18. Técnica de Kinyoun. 1) Diluir las heces con solución salina fisiológica, 2) Revolver con un palillo y con la muestra impregnada en el palillo, realizar un círculo sobre un portaobjetos, 3) Impregnar el palillo nuevamente con heces y realizar otro círculo. Repetir hasta realizar 6 a 8 círculos, 4) Dejar secar y fijar con alcohol metílico, 5) Agregar Fucsina fenicada hasta cubrir las improntas, 6) Enjuagar, 7) Agregar alcohol- ácido hasta que se destiña la impronta, 8) Enjuagar, 9) Cubrir las improntas con azul de metileno y dejar actuar, 10) Enjuagar, 11) Secar, 12) Enfocar a 100X y medir los ooquistes. Recomendaciones El verde de malaquita puede ser sustituido aplicando una solución de azul de metileno por 1-3 minutos y enjuagar suavemente hasta que el agua quede clara. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 112 ~ En algunos laboratorios se fija el frotis de heces por calentamiento suave (empleando un mechero o platina caliente). El mantenimiento de las muestras en formol puede afectar la afinidad tintorial de los ooquistes. El grado de tinción puede sufrir fluctuaciones con las diferentes muestras que se procesan. Algunas levaduras y esporas bacterianas pueden adquirir la coloración rojiza tenue pero habrá que tomar en cuenta que presentan dimensiones mucho más reducidas Las extensiones de material deben ser delgadas para favorecer la observación. Es recomendable que la muestra se concentre (por sedimentación) para facilitar la observación. Es frecuente que las heces de los animales con criptosporidiosis presenten un exceso de moco por lo que pueden ser tratadas con 10 gotas de Hidróxido de Potasio al 10% para eliminarlo, facilitando la liberación y tinción de los ooquistes. Infecciones muy ligeras de Cryptosporidium pueden pasar desapercibidas por lo cual es preciso hacer una concentración de la muestra por sedimentación. Filtrar los colorantes al menos una vez al mes. Hacer control a los colorantes con muestras positivas de referencia que pueden ser mantenidas en Dicromato de Potasio al 2.5% en refrigeración a 4°C. 3.3.9. Técnica de migración larvaria o Baermann Fundamento Muchos de los nematodos pulmonares tienen huevos larvados que se rompen en el tracto respiratorio o durante su paso por el tracto digestivo y liberan a la larva de primer estadio (L1). La técnica de Baermann tiene como principio aprovechar el higrotropismo y termotropismo positivo de las L1 y la gravedad; lo que permite que las larvas migren de las heces hacia el agua tibia, desciendan y se concentren en el fondo del embudo por efecto de la gravedad. Se recomienda para la detección de Dictyocaulus viviparus en bovinos, D. filaria, Muellerius capillaris y Protostrongylus rufescens en pequeños rumiantes y D. arnfieldi en equinos. No es recomendable para el diagnóstico de Metastrongylus en el cerdo debido a que generalmente la L1 no eclosiona del huevo hasta que es consumida por el hospedador intermediario (Baermann, 1917; Besné et al., 2006). Material y equipo Aparato de Baermann. o Soporte universal. o Embudo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 113 ~ o Manguera de hule látex conectada al embudo. o Pinzas Mörh. o Colador. Gasa o servitoalla. Cuchara. Agua corriente. Vidrio de reloj o caja de Petri. Portaobjetos y cubreobjetos. Pipeta Pasteur. Lugol. Microscopio estereoscópico. Microscopio compuesto. Procedimiento Armar el aparato de Baermann. Envolver 3-5 g de heces con una gasa o servitoalla y colocarla sobre la coladera. Agregar agua tibia por las paredes del embudo hasta que cubra la mitad de la muestra, dejar reposardurante 8 a 12 h. Obtener en un vidrio de reloj 2-3 ml del contenido aflojando la pinza Möhr y observar en el microscopio estereoscópico. Extraer con la pipeta Pasteur las larvas y depositarlas en un portaobjetos, se agrega una gota de lugol para su fijación y colocar un cubreobjetos. Observar en el microscopio compuesto con el objetivo (10X y 40X). La identificación es de acuerdo a sus características morfológicas. En la Figura 3.10 se muestra una representación gráfica de la técnica de Baermann o migración larvaria. Factores que pueden alterar los resultados Si la muestra no tiene contacto con el agua, las larvas no podrán migrar. Si las muestras no son frescas o no estuvieron en refrigeración, se corre el riego de que las larvas continúen su desarrollo, dificultando su identificación debido que las claves fueron hechas para L1 (Figura 3.19). Recomendaciones Aunque las larvas empiezan a migrar a los pocos minutos de iniciada la prueba, a las ocho horas la mayoría de las larvas ya se encuentran en el fondo del aparato de Baermann. El agua tibia acelera la migración de las larvas. Se puede agregar el lugol a los mililitros colectados del aparato de Baermann. Esto teñirá y fijará a las larvas haciendo más fácil su localización y captura. La identificación de larvas de Muellerius capillaris requiere de su observación a 40X (Figura 3.20). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 114 ~ Figura 3.19. Técnica de Baermann o migración larvaria. 1) Armar el aparato de Baermann, 2) Agregar agua hasta un par de centímetros antes del borde del embudo, 3) Colocar una muestra de heces (10 g aproximadamente) en una gasa o servilleta de papel, 4) Colocar el envoltorio sobre una coladera y ponerla en el embudo. El agua debe tocar la muestra, 5) Dejar reposar 8 a 12 h, 6) Abrir la pinza y colectar 3 ó 4 ml del líquido, 7) Agregar una gota de lugol y observar en el microscopio estereoscópico, 8) Colectar las larvas teñidas con una pipeta Pasteur, colocarlas en un portaobjetos e identificarlas en el microscopio compuesto. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 115 ~ Figura 3.20. Larvas de primer estadio obtenidas por la técnica de migración larvaria. 1) Dictyocaulus filaria, 2) Muellerius capillaris teñida con carmín. 3.3.10. Técnica de cultivo larvario Fundamento Debido a que muchos de los huevos de los nematodos gastrointestinales estrongilidos de rumiantes y équidos son muy parecidos, difícilmente se puede determinar el género del parásito. Cuando se requiere identificar el género de estos nematodos es necesario obtener las larvas de tercer estadio, las cuales se pueden distinguir por su tamaño, forma, número de células intestinales, estructuras del extremo anterior y posterior, entre otras características (Van Wyk et al., 2003; Liébano, 2010, 2011). El cultivo larvario o coprocultivo, se basa en proporcionar a los huevos, humedad, temperatura y oxigenación de manera artificial, para que puedan desarrollarse hasta larva de tercer estadio (L3), tal y como lo hacen en el suelo en condiciones naturales. Se han diseñado diversos métodos y variantes de cultivos fecales, la que a continuación se describe permite concentrar las larvas y se pueden utilizar recipientes más grandes cuando se necesitan miles de larvas (Liébano, 2010, 2011). Esta técnica es ampliamente recomendable en rumiantes. Su utilidad en équidos es limitada, debido a que no existen claves para la identificación de todos los géneros larvarios. Material y equipo Recipiente. Sustrato, puede ser serrín estéril o limpio, hule espuma u otro. Cuchara. Agua. Estufa de cultivo (opcional en climas cálidos). Vidrio de reloj o caja de Petri. Portaobjetos y cubreobjetos. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 116 ~ Pipeta Pasteur. Lugol. Microscopio estereoscópico. Microscopio compuesto con escala micrométrica. Procedimiento En el recipiente colocar aproximadamente 10 g de materia fecal positiva a nematodos gastrointestinales. Agregar una cantidad similar de sustrato, adicionar unas gotas de agua y mezclar con la ayuda de una cuchara, agregar pequeñas cantidades de agua hasta que el contenido del vaso se observe con suficiente húmeda (no excederse de agua). Identificar el cultivo, la fecha de entrada fecha de entrada y fecha de salida del coprocultivo. Se mete a la estufa de cultivo a una temperatura de 27°C durante 10 a 12 días, el tiempo suficiente para que los huevos de los nematodos se desarrollen hasta L3. Se debe revisar diariamente la humedad en el interior del recipiente y mover el contenido con una cuchara para oxigenar el cultivo. Después de 10 ó 12 días, sacar el cultivo y todo el contenido se coloca en uno o varios Baermann, dejar reposar por 8 h, posteriormente se quita la pinza Möhr y se obtiene el líquido en un vidrio de reloj. Observar las larvas en el microscopio estereoscópico. Extraer con la pipeta Pasteur las larvas y depositarlas en un portaobjetos, se agrega una gota de lugol para su fijación y colocar un cubreobjetos. Observar en el microscopio compuesto con el objetivo (10X y 40X). La identificación es de acuerdo a sus características morfológicas. Ver el apartado de identificación de larvas más adelante. NOTA. Transcurrido el tiempo estimado de cultivo, se recomienda verificar el estado de desarrollo de las larvas antes de sacar todo el cultivo. Deslizar un par de mililitros de agua sobre una de las paredes del recipiente y girarlo sobre su propio eje en dos o tres ocasiones. Este paso debe hacerse lenta y cuidadosamente para que el agua humedezca completamente toda la pared del frasco. Con cuidado inclinar el recipiente para obtener el líquido en una caja de Petri. Si las larvas han alcanzado el tercer estadio se procederá a concentrarlas en el aparato de Baermann, de lo contrario se continuará el cultivo. Interpretación Se identifican 100 larvas y la frecuencia de géneros se expresa en porcentaje. Factores que pueden alterar los resultados La humedad es indispensable para el metabolismo de las formas parasitarias principalmente para mantener hidratada la cubierta externa de los huevos y la cutícula de las larvas. El nivel óptimo de humedad relativa es de 80 a 90 %. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 117 ~ El tiempo de incubación depende de la especie de nematodo y la temperatura, en general es suficiente de 10 a 12 días a 27°C. Si se realiza a temperatura ambiente (20°C), el tiempo de incubación se puede prolongar hasta 20 días, para el género Nematodirus debido a las variaciones de temperatura entre el día y la noche. Si se incrementa la temperatura a 30°C el tiempo de incubación se reduce a 5 días en el caso de Haemonchus contortus. El sustrato facilita la aireación del cultivo y la oxigenación de los huevos y larvas. Los requerimientos de oxígeno son altos para las mudas, pero bajos para las larvas infectantes. Revolver el cultivo tiene dos objetivos: proveer oxígeno y disminuir el crecimiento de hongos. Las heces tienen un pH óptimo para el desarrollo larvario que va de 6.5 a 7.5, ambientes ácidos impiden el desarrollo. Se recomienda que la colecta de heces se realice de manera directa por extracción rectal; procurando no tomar muestras del suelo, para evitarla contaminación con larvas de vida libre (Anónimo, 1971; Liébano, 2004, 2010, 2011; Karki, 2008). 3.4. TÉCNICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LARVAS INFECTANTES DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES 3.4.1. Técnica para la limpieza de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales por gradientes de densidad con sacarosa Fundamento Cuando se concentran las larvas en el aparato de Baermann van acompañadas de detritus que podrían interferir en algunos experimentos. Para eliminar las impurezas se puede filtrar la suspensión de larvas a través de papel limpia lentes, si se requiere mayor limpieza se puede utilizar un gradiente de sacarosa (Liébano, 2010). Material y equipo Tubos de plástico de 50 ml. Tubos de ensaye de 15 ml. Pipeta Pasteur. Balanza. Centrifuga clínica. Solución de sacarosa al 40%. Refrigerador. Procedimiento El material resultante de la técnica de filtración se transfiere a tubos de plástico de 50 ml y se deja reposar en el refrigerador a 4 ºC por una hora, con la finalidad de eliminar el sobrenadante, junto con algunas partículas en suspensión. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 118 ~ Depositar con mucho cuidado 1 ó 2 ml de la suspensión de larvas en dos tubos de 15 ml que contienen 9 ml de sacarosa al 40%. Centrifugar a 1000g rpm durante 5 min. Este proceso, permitirá que la mayor cantidad de contaminantes y residuos provenientes de los cultivos fecales sedimenten y las larvas se concentre en la superficie formando un anillo blanquecino. Colectar las larvas con la pipeta Pasteur y transferirlas a un par de tubos con 10 ml de agua destilada. Centrifugar a 1000 rpm durante 3 minutos. Las larvas sedimentarán. Desechar el sobrenadante y agregar más agua destilada. Centrifugar nuevamente. Repetir este proceso de lavado para eliminar la sacarosa y evitar un desequilibrio osmótico y muerte de las larvas. Generalmente con tres lavados es suficiente. 3.4.2. Identificación de larvas infectantes de estrongilidos de rumiantes Fundamento Es importante distinguir las larvas o nematodos del suelo (que no son parásitos) de las larvas de nematodos parásitos (Figura 3.21). Los fitonematodos o nematodos del suelo se distinguen por que los machos presentan espículas y a las hembras se les ven huevos en el útero. Figura 3.21. Estructura típica de una larva de un nematodo gastrointestinal. La vaina es una cubierta que cubre a la larva y la protege del medio ambiente: CL: Cola de la larva o parte interna que va desde el ano hasta al final de la larva (no de la vaina), PD: Porción Distal es la distancia que separa el extremo de la cola de la larva del final de la cola de la vaina, CV: Cola de la Vaina es la porción de la Vaina desde el ano hasta el extremo posterior de la Vaina (Según el género existen diferentes longitudes y formas: cónicas, afiladas, etc.) CV=CL+PD, LT: Longitud Total es la distancia que va desde el extremo anterior al extremo posterior de la vaina, CI: Células Intestinales pueden ser de diferentes formas y el número varía según el género. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 119 ~ Las larvas L1 y L2 de los nematodos parásitos son muy parecidas, tienen esófago rabditiforme, y la boca abierta lo cual les permite alimentarse. Estos estadios carecen de vaina y contienen gránulos alimenticios. La L3 tiene una vaina por lo tanto ya no se alimentan, su sobrevivencia depende de sus reservas alimenticias y las condiciones ambientales, el esófago es filariforme, presenta células a lo largo de su intestino las cuales varían en forma, triangulares, hexagonales y pentagonales así como en número de 8, 16, 24, y 32; dependiendo del género y especie que se trate (Niec, 1968; Liébano, 2011; Bowman, 2004) (Figura 3.22 y 3.23). Figura 3.22. Diferentes estadios de Haemonchus contortus. 1) Larva 1. a.-ausencia de vaina, b.- contenido granular a lo largo de su celoma, 2) Larva 2 c.-formación de células, d-esófago rabditiforme, e.-cavidad oral, 3) Larva 3 f.-esófago filariforme, g.- células a lo largo de su celoma, h.-vaina que envuelve a la larva, i.- punta de la cola de la vaina. Figura 3.23. Nematodos obtenidos en el cultivo larvario. 1) Larva 3 del nematodo parásito Mecistocirrus digitatus, 2) Fitonematodo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 120 ~ Material y equipo Larvas. Lugol. Portaobjetos. Cubreobjetos. Pipeta Pasteur. Microscopio compuesto con micrómetro ocular. Procedimiento Agregar una o dos gotas de lugol a una fracción de la suspensión de larvas. Con la pipeta Pasteur depositar varias larvas entre porta y cubreobjetos y se observan al microscopio compuesto a 10X y posteriormente a 40X. Identificar cada una de las larvas hasta llegar a 100. La clasificación de los diferentes géneros de larvas infectantes de nematodos gatrointestinales, de acuerdo a lo largo de la cola de la vaina larva (Niec, 1968; Liébano, 2011), formando así tres grupos: El largo de cola de la vaina permite separar las larvas en tres grupos: a) Larvas con cola de vaina corta: Trichostrongylus axei, T. colubriformis, T. vitrinus, Teladorsagia/Ostertagia circumcincta y T. ostertagi, b) Larvas con cola mediana: Haemonchus contortus, H. placei, Cooperia oncophora, C. punctata y otras especies, Mecistocirrus digitatus, y C) Larvas con cola de vaina larga: Nematodirus spathiger, N. battus, N. fillicolis, helvetianus, Oesophagostomum radiatum, O. venulosum y Chabertia ovina. Además de los grupos mencionados, se considera por separado a las L3 de Strongyloides papillosus y Bunostomum spp., por ser las más pequeñas en longitud. Las siguientes medidas son de utilidad para lograr la plena identificación: Longitud total: de la cavidad bucal a la punta de la cola de la vaina. Longitud del cuerpo de la larva: de la cavidad bucal a la punta de la cola de larva. Longitud del esófago: de la cavidad bucal al comienzo del intestino. Longitud de la cola de la larva: del ano a la punta de la cola de la larva. Longitud de la cola de la vaina: del ano a la punta de la cola de la vaina. Ancho del cuerpo de la larva, medición tomada al inicio del intestino. 3.4.3. Características morfológicas de las larvas infectantes de rumiantes En la Figura 3.24 se muestra una representación de las características morfológicas de la extremidad anterior, media y posterior de los diferentes géneros de larvas (L 3 ) de nematodos gastrointestinales de rumiantes. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 121 ~ Figura 3.24. Características morfológicas de la extremidad anterior, media y posterior de los diferentes géneros de larvas (L 3 ) de nematodos gastrointestinales de rumiantes. A) Strongyloides spp., B) Bunostomum spp., C) Trichostrongylus spp., D) Teladorsagia spp., E) Cooperia spp., F) Mecistocirrus digitatus, G) Haemonchus spp., H) Chabertia ovina, I) Oesophagostomum spp., J) Nematodirus spp. Larva infectante de Strongyloides papillosus. Esta larva se desenvuelve de acuerdo a las condiciones de la naturaleza, si las condiciones principalmente de temperatura y humedad son adversas, esta permanece en forma de vida libre. Sin embargo, cuando las condiciones son favorables las larvasdesarrollan para infectar a los rumiantes. Existen varios géneros que afectan a diversas especies: S. papillosus: ovinos, caprinos, bovinos, búfalos y conejos; S. ramsoni: cerdos; S. stercolaris: hombre, antropoides, Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 122 ~ perro y gatos; S. westeri: caballo, asno; S. fuelleborni: hombre y primates; S. rati: ratas; y S. avium: aves (Organización Panamericana de la Salud, 2003). Larva infectante de Bunostomum trigonocephalum. Es la larva más pequeña de todas las larvas de este grupo. Su cubierta está provista de una vaina protectora. Las larvas de este género además de penetrar por vía oral lo hacen por la piel. Existen varios géneros: B. trigonocephalum: ovinos y caprinos. B. phlebotomum: bovinos. La extremidad anterior es redondeada, la cavidad bucal es pequeña y tiene forma de cono o embudo con engrosamiento. El intestino está bordeado por dieciséis células intestinales, las cuales miden 33 x 6 , pocas veces bien diferenciadas, con su respectivo núcleo y primordium genital, el cual ésta situado de 240 a 295 del extremo anterior de la larva. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es obtusa y mide de 55 a 68 de largo, además la cola de la vaina larval se proyecta a una distancia de 85 a 150 del extremo de la larva (Mehlnorn, 2001). Larva infectante de Trichostrongylus colubriformis. Es una larva robusta, provista de vaina de tamaño pequeño que pertenece al grupo de colas cortas (Niec, 1968). La extremidad anterior es redondeada y presenta una cavidad bucal. El intestino está bordeado por 16 células intestinales de forma rectangular o triangular. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en diferentes formas o tubérculos, dependiendo de la especie de que se trate. La cola de la vaina es corta, cónica y aguda (Niec, 1968). Larva infectante de Teladorsagia circumcincta. Es una larva delgada, provista de vaina de tamaño pequeño y de cola corta. Existen varios géneros: O. ostertagi: bovinos. O. circumcincta: ovinos y caprinos. O. trifurcata: ovinos y caprinos. En una observación más detallada, la extremidad anterior es redondeada con cavidad presente, el intestino es bordeado por 16 células intestinales de forma triangular. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es redondeada con pequeña incisión en la parte ventral de la larva. La cola de la vaina larval es alargada, puntiaguda con una desviación característica. Las formas pre-parasíticas de éste género, resisten más las temperaturas bajas que la mayor parte de los otros géneros de la familia, por lo que las parasitosis por Ostertagia predominan en zonas frías. En temperaturas de 22-24°C se desarrollan las larvas infectantes en seis días (Liébano, 2011). Larva infectante de Cooperia curticei. Es una larva delgada, provista de vaina, pertenece al grupo de cola mediana la extremidad anterior es redondeada, su cavidad bucal tiene forma de pera o globular. Existen varios géneros: C. curticei: ovinos y caprinos, C. oncophora: bovinos, C. punctata: bovinos, C. pectinata: bovinos. La cavidad bucal comienza en la faringe y posee una cinta fibrinosa, al observarse al microscopio con un objetivo de mayor aumento, se ven dos puntos refringentes o una línea, detalle morfológico característico para éste género. Posee 16 células, en la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es obtusa, redondeada. La cola de la vaina larval es ligeramente ondulada. Las fases preparasíticas de este género son las menos resistentes a las temperaturas bajas y a la desecación, por lo que muy pocas Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 123 ~ sobreviven después del invierno en los días templados. En el cultivo las larvas infectantes a temperatura de 22-24 ºC se forman en 7 días. La baja temperatura ambiental y la falta de lluvias, provocan un decremento en la infección por Cooperia spp., pudiendo sobrevivir sobre las pasturas los estados libres de éste parásito durante el invierno, aunque puede haber un incremento de la infección en animales susceptibles durante el invierno. En Australia se ha establecido que las larvas infectantes de Cooperia spp. persisten viables sobre la pastura por 24 semanas durante el verano y el otoño, que es cuando hay mayor precipitación pluvial (Rosenberg, 1975). Larva infectante de Mecistocirrus digitatus. Existe poca información de la clave de identificación larvaria de esta especie (Fernando, 1965; García y Mejía, 1984). Es una larva delgada, provista de vaina, pertenece al grupo de vaina corta. En una observación más detallada la extremidad anterior es redondeada, su esófago es filariforme. Presenta en la extremidad anterior dos estructuras en forma arriñonada, situadas paralelamente y de color café obscuro. Es evidente la presencia de estriaciones cuticulares más marcadas en la región cervical, se observan también 16 células intestinales de forma pentagonal provistas de un gran núcleo, así como posibles gránulos alimenticios de gran tamaño y de aspecto transparente dentro del intestino. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en forma redondeada y la cola de la vaina es corta, cónica aguda. Larva infectante de Haemonchus contortus. La larva de este género requiere de una temperatura más elevada que las de Ostertagia spp., para llegar a su fase de L3. H. contortus se puede encontrar en: ovinos y caprinos. H. similis: rumiantes. H. placei: bovinos, H. longistipes: ovinos, cabras y camellos. Todas las especies del género Haemonchus son hematófagos. Es una larva delgada, provista de vaina de tamaño medio y de cola mediana. En una observación más detallada, la extremidad anterior es redondeada, su cavidad bucal es de forma globular y el esófago es filariforme. El intestino está bordeado por 16 células intestinales con su respectivo núcleo y un primodium genital, siendo las primeras células cortas y triangulares y las últimas alargadas y de forma más pentagonal. La primera célula es pequeña e irregular y la última no se encuentra alineada a sus células contigua si no que termina en forma individual. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en forma cónica y la cola de la vaina, se va adelgazando hasta finalizar en punta fina, además presenta una torcedura o fractura inmediatamente después de la terminación de la punta de la larva, asemejando a una bayoneta (Urquhart, 2001, Liébano, 2011). Larva infectante de Chabertia ovina. Esta larva pertenece a la familia trichostrongyloidea. Es una larva provista de vaina delgada, es de tamaño grande, morfológicamente es muy parecida a la de Oesophagostomum. El intestino está bordeada de 28 a 32 células de forma rectangular. Pertenece al grupo de larvas de cola grande. En una observación más detallada, en la extremidad anterior, la cavidad bucal entra al esófago a través de una armadura esofágica, la punta de la cola de la larva es roma, siendo la cola de la vaina muy delgada en su extremo posterior. La Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 124 ~ resistencia de los huevos principalmente a la desecación e influencias externas, es grande (Niec, 1968). Larva infectante de Oesophagostomum columbianum. Es una larva bastante ancha, provista de una vaina gruesa y floja que forma ondulaciones muy visibles. Existen varios géneros: O. columbianum: ovinos, caprinos y camellos; O. venulosum: ovinos y caprinos; y O. radiatum: bovinos y búfalo. Es una larva bastante ancha, provista de una vaina gruesa y floja que forma ondulaciones muy visibles. Pertenece al grupo de las llamadas cola grande, la extremidad anteriores redondeada, su cavidad bucal recta, de paredes engrosadas y el esófago filariforme en el estado infectante o L3. El intestino está bordeado por una cantidad de células intestinales características para cada especie, que pueden ser de 16, 24 ó 32. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva termina en forma cónica y la cola de la vaina se va adelgazando hasta finalizar en una punta fina, en forma de látigo. Esta larvas se cultiva a temperaturas de 22 a 24°C en 7-8 días, son poco resistentes al calor y a la acción de la luz solar. En cuanto a su efecto sobre el hospedero, las larvas infectivas se refugian en la pared Intestinal, formándose en el hospedador nódulos del tamaño de una abeja, conocidos como granulomas, estos impiden el funcionamiento del intestino alternando con la absorción de líquidos, el resultado es una diarrea negra y mal oliente. La supervivencia de las larvas en el suelo húmedo es de 3 meses, siendo la temperatura óptima para su desarrollo de 30°C. Los huevos no resisten la desecación, pero en cambio cada hembra adulta puede poner alrededor de 12,000 huevos al día. La supervivencia de las L3 requiere de una humedad de 100% (Soulsby, 1987; Van Wyk et al., 2003). Larva infectante de Nematodirus spathiger. Las especies de éste género poseen resistencia a los cambios climáticos extremos mayor al resto de los trichostrongylidos. Existen varios géneros: N. fillicolis: ovinos y caprinos; N. spathiger: ovinos y caprinos; y N. battus: bovinos: ovinos y camellos. Su capacidad de sobrevivir bajo condiciones de congelamiento es muy grande; también soportan la desecación durante varios meses. Este género se desarrolla entre 24 y 48°C. Es una larva robusta, provista de vaina de tamaño grande, la extremidad anterior es redondeada, la cavidad bucal está en forma de tubo recto y el esófago es filariforme. El intestino está bordeado por 8 grandes células bien delimitadas por un material denso y granular; con su respectivo núcleo. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es característica para cada especie. La cola de la vaina larval es bastante larga en forma de látigo. El género Nematodirus puede resistir uno o dos años en las praderas. El género Nematodirus se diferencia en que la larva L1, no abandona el huevo formándose la L3 infectante en 15 a 30 días según especie a temperatura de 24-28°C. La humedad de los pastos reduce su existencia pero puede soportar la congelación (Johnstone, 1998). 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Diagnóstico de las helmintiasis por medio de examen coprológico. Janssen Research Foundation. pp. 7-183. Urquhart, G.M. 2001. Parasitología Veterinaria. Editorial Acribia, Zaragoza. España: 355. Van Wyk, J., Cabaret, J., Michael, L.M., 2003. Morphological identification of nematode larvae of small ruminants and cattle simplified. Vet. Parasitol. 119, 277-306. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 129 ~ CONTENIDO 4.1. Introducción 4.2. Diagnóstico de hemoparásitos: microfilarias y amastigotes del género Leishmania 4.3. Diagnóstico de microfilarias 4.3.1. Examen en fresco 4.3.2. Capa lucoplaquetaria o capa flogística (“Buffy coat”) 4.3.3. Técnica modificada de Knott (método de sedimentación) 4.3.4. Técnica de filtración sanguínea 4.3.5. Identificación e interpretación de microfilarias 4.4. Diagnóstico del género Leishmania 4.4.1. Diagnóstico de amastigotes de Leishmania spp. 4.4.1.1. Improntas de tejido 4.4.1.2. Punción de ganglios y médula 4.4.1.3. Biopsias de piel 4.4.1.4. Frotis de material subyacente de úlceras 4.4.1.5. Frotis de líquido abdominal 4.4.1.6. Identificación e interpretación de amastigotes de Leishmania spp. 4.5. Diagnóstico de hemoparásitos: protozoarios y rickettsias 4.6. Interpretación del examen microscópico de frotis sanguíneo Dr. Manuel Emilio Bolio González1 Dr. Julio V. Figueroa Millán2* Dr. Jesús Antonio Álvarez Martínez2 M. en C. Carmen Rojas Martínez2 Dr. Carlos A. Vega y Murguía2 M. en C. Martín López Rojas3 1Depto. de Salud Animal y Medicina Preventiva. Cuerpo Académico de Salud Animal. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Universidad Autónoma de Yucatán. 2Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. 3Corazón del Camino Blanco A. C. *Coordinador del capítulo. EXAMEN DE LABORATORIO PARA PARÁSITOS DE LA SANGRE Capítulo 4 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 130 ~ 4.1. INTRODUCCIÓN La sangre de los animales domésticos puede ser invadida por diferentes microrganismos, patógenos y no patógenos, ejemplos de estos son las bacterias, virus, rickettsias, hongos y levaduras. Existen otros parásitos que invaden la sangre, ya sea para una localización primaria en este tejido o como un medio de transporte hacia otras zonas del cuerpo donde terminarán su desarrollo. Este tipo de parásitos incluye a varias especies de protozoarios y algunas especies de helmintos en su fase larval. Algunos parásitos ingresan a la sangre por penetración activa a través de la piel o de las membranas mucosas. Otros son introducidos pasivamente a través de lesiones de continuidad causadas por cuerpos extraños; por la mordedura de insectos, ácaros y garrapatas y también iatrogénicamente mediante agujas e instrumentos contaminados con sangre infectada o por transfusiones sanguíneas con sangre de donadores infectados (Uilenberg, 1995; Schoeman, 2009; Zajac y Conboy, 2012). Los procedimientos de laboratorio representan un gran apoyo para los clínicos en su actividad profesional diaria, ya que por medio de estos se pueden confirmar y establecer diagnósticos definitivos. Es necesario por lo anterior, elegir la(s) técnica(s) más apropiada(s), que le permita descartar diagnósticos clínicos previos o sugestivos. La sangre es uno de los tejidos que puede ser explorado desde el punto de vista diagnóstico y que provee datos de gran utilidad clínico-médica. Diferentes parásitos (helmintos, protozoarios, rickettsias, etc.) pueden afectar la salud de los animales domésticos (perro, gato, caballo, cerdo, etc.) y la sangre, es una fuente importante de diagnóstico ya que por medio de diversas técnicas de laboratorio se pueden observar formas de estos parásitos (Zajac y Conboy, 2012). Además de que la gran mayoría de los parásitos producen daño celular en glóbulos rojos, blancos, plaquetas, macrófagos, etc. (Allison y Meinkoth, 2010). En este capítulo se describen brevemente algunos parásitosprotozoarios, rickettsias y larvas de nematodos que pueden ser encontrados más frecuentemente en la sangre de animales domésticos, precisando los procedimientos más idóneos para su identificación microscópica en el laboratorio y agregando imágenes alusivas a los parásitos sanguíneos para una mejor comprensión por parte del lector (Bernal et al., 2000; Rochette, 2003; Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005; Allison y Meinkoth, 2010; Bolio- Gonzalez et al., 2011; Zajac y Conboy, 2012). 4.2. DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS: MICROFILARIAS Y AMASTIGOTES DEL GÉNERO LEISHMANIA En el presente tema, se abordará las principales técnicas parasitológicas de uso común en la práctica médico clínica para el diagnóstico de hemoparásitos (microfilarias y amastigotes de Leishmania) en los animales. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 131 ~ 4.3. DIAGNÓSTICO DE MICROFILARIAS 4.3.1. Examen en fresco Fundamento. Se emplea para la detección de microfilarias en la sangre de los animales. Materiales Portaobjetos. Cubreobjetos. Microscopio óptico. Lápiz con punta de diamante. Procedimiento Identificar la muestra en el extremo de un portaobjetos usando un lápiz de diamante. Poner una gota de sangre sobre el portaobjetos. Cubrir la gota con un cubreobjetos. Observar al microscopio con el objetivo de 4X y 10X. La presencia de microfilarias se observa mediante la visualización de los nematodos moviéndose en forma de serpiente (Figura 4.1) (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005; Bolio-González et al., 2011). Figura 4.1. Examen en fresco, microfilaria 10X (Donada por el M. en C. Carlos Humberto Sauri Arceo, HUPG-FMVZ-UADY). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 132 ~ 4.3.2. Capa Leucoplaquetaria ó capa flogística (“Buffy coat”) Fundamento. Es la capa de leucocitos entre los eritrocitos y el plasma, la sangre se centrifuga y se obtiene esta capa. La densidad de las microfilarias hace que se localicen en la zona superior de la capa de leucocitos. Materiales Tubo de microhematocrito. Plastilina. Microcentrífuga. Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Llenar un tubo de microhematocrito con una muestra de sangre total y sellar un extremo con plastilina. Centrifugar el tubo durante 2 min en la centrífuga de hematocrito. Colocar el tubo de microhematocrito sobre la platina del microscopio. Examinar la zona entre el “buffy coat” y el plasma para detectar la presencia de actividad debida a microfilarias. Utilizar el diafragma del microscopio para reducir la intensidad de la luz, ya que la luz baja y un elevado contraste aumenta la visualización de las microfilarias (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005; Bolio-González et al., 2011). 4.3.3. Técnica modificada de Knott (método de sedimentación) Fundamento. Esta es la técnica de concentración sanguínea y por medio de esta se detectan microfilarias. Materiales Tubos de ensayo (10ml). Formaldehido al 2%. Centrifuga. Portaobjetos. Cubreobjetos. Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Centrifugar la sangre (1ml de sangre + 9 ml de formaldehido al 2%) a 800 x g por 1 min. Decantar el sobrenadante y examinar el sedimento. Depositar una o dos gotas del sedimento en un portaobjetos y observar al microscopio. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 133 ~ Las microfilarias se localizan entre el sedimento, algunos leucocitos y eritrocitos (Figuras 4.2., 4.3., 4.4) (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005; Bolio-González et al., 2011). Figura 4.2. Técnica modificada de Knott, microfilaria 10X (Donada por el M. en C. Carlos Humberto Sauri Arceo, HUPG-FMVZ-UADY). Figura 4.3. Técnica modificada de Knott, microfilaria 40X (Donada por M. en C. Carlos Humberto Sauri Arceo, HUPG-FMVZ-UADY). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 134 ~ Figura 4.4. Técnica modificada de Knott, microfilaria 40X (Donada por el M. en C. Carlos Humberto Sauri Arceo, HUPG-FMVZ-UADY). 4.3.4. Técnica de filtración sanguínea Fundamento. Esta técnica se lleva a cabo a través de membranas de policarbonato (3- 5µm de diámetro de poro), donde quedan atrapadas las microfilarias. Materiales Jeringas. Filtro tamiz. Portaobjetos. Cubreobjetos. Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Se emplea sangre hemolizada con formaldehido donde quedan atrapadas las microfilarias. Mediante esta técnica sólo se puede indicar la presencia de microfilarias en sangre, no se identifica a la especie observada. La filtración produce acortamiento de las microfilarias, se dificulta la identificación morfométrica (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 135 ~ 4.3.5. Identificación e interpretación de microfilarias Tradicionalmente esta identificación se realiza por medio del método modificado de Knott. Se evalúa la morfometría de las microfilarias (longitud, ancho del anillo nervioso, localización del espacio cefálico, poros excretor y anal, cuerpo intermedio). Dirofilaria immitis (218-340 µm), es una larva ancha con extremo anterior cónico y de cola larga, recta y fina. Dirofilaria repens (200-360 µm) puede presentar similares características morfológicas de D. immitis. Dipetalonema dracunculoides (245-310 µm) presenta un cuerpo interno o intermedio. Dip. reconditum (240-293 µm), manifiesta una extremidad anterior globosa, cola en forma de gancho y no es tan ancha (Cuadro 4.1; Figuras 4.1., 4.2, 4.3 y 4.4). El movimiento y la densidad de las microfilarias también se han empleado como criterio de identificación para D. immitis y Dip. reconditum, las primeras, manifiestan movimiento ondulante y no progresivo, las segundas, movimiento rectilíneo, ambos criterios son subjetivos, puesto que no siempre se pueden apreciar (Rodríguez Vivas y Cob-Galera, 2005; Bolio-González et al., 2011). Cuadro 4.1. Dimensiones y morfometría de microfilarias en sangre de los animales domésticos. Especie* Longitud y ancho (µm) Morfometría Dirofilaria immitis 306 (218-340) 5.9 (4.5-7.3) Se observa una larva ancha con extremo anterior cónico y de cola larga, recta y fina. Dirofilaria repens 345 (200-360) 6.4 (5.0-8.0) Se observa similares características morfológicas que D. immitis. Dipetalonema dracunculoides 263 (245-310) 5.0 (5.0-6.4) Se observa cuerpo interno o intermedio. Dipetalonema reconditum 261 (240-293) 4.5 (3.5-4.5) Se observa que no es tan ancha, con extremidad anterior globosa y cola en forma de gancho. *Rodríguez-Vivas y Cob-Galera (2005); Bolio-González et al. (2011). 4.4. DIAGNÓSTICO DEL GÉNERO LEISHMANIA 4.4.1. Diagnóstico de amastigotes de Leishmania spp Pretende el diagnóstico parasitológico evidenciar la presencia del parásito a partir de muestras de animales enfermos. Los métodos son conocidos como directos. Las formas observadas son amastigotes de Leishmania (Bernal et al., 2000; Harvey y Mckeever, 2003; Rochette, 2003; Dantas Torres, 2006; Velasco-Castrejón et al., 2009). Sin embargo, losamastigotes son encontrados raramente en sangre periférica, Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 136 ~ incrementando la probabilidad de detección sólo cuando la capa flogística de sangre de perros infectados se somete a cito-centrifugación (Giudice y Passantino, 2011; Nardoni et al., 2012). 4.4.1.1. Improntas de tejido Fundamento. Se emplea para evidenciar la presencia de fases de desarrollo del género Leishmania en muestras tomadas de animales sospechosos y/o enfermos. Permite una rápida visualización de las formas del parásito. Materiales Portaobjetos. Cubreobjetos. Tinciones de Giemsa o Diff Quick. Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Se toma la muestra de las úlceras de piel que presente el animal afectado. Se presiona el portaobjeto sobre el sitio de la lesión. Se procede a realizar la tinción con Giemsa o Diff Quick. Se dejan secar las muestras. Se observan al microscopio. Los hallazgos observados son formas de amastigotes de Leishmania spp. (Bernal et al., 2000; Rochette, 2003). 4.4.1.2. Punción de ganglios y médula Fundamento. Esta técnica se emplea para evidenciar la presencia de fases de desarrollo de Leishmania spp. en muestras tomadas de animales sospechosos y/o enfermos. Permite una rápida visualización de las formas del parásito. También es conocida como técnica de aspirado con aguja fina o gruesa. Materiales Jeringas de 3 ó 5 ml. Portaobjetos. Cubreobjetos. Tinciones de Giemsa o Diff Quick. Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento La punción ganglionar se realiza en ganglios poplíteos y/o preescapulares. La punción medular se realiza en la cara interna del fémur, cresta ilíaca o en la unión costoesternal. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 137 ~ Se aspira con aguja y se recoge tejido del ganglio o de la médula que son depositados sobre portaobjetos. Se tiñen con Giemsa o Diff Quick. Se observan al microscopio. Los hallazgos a evidenciar en la revisión son formas de amastigotes de Leishmania spp. (Harvey y Mckeever, 2003; Rochette, 2003). 4.4.1.3. Biopsias de piel Fundamento. Esta técnica se emplea para evidenciar la presencia de fases de desarrollo de Leishmania spp. en muestras de piel tomadas de animales con y sin lesiones, para la realización de improntas o cortes histológicos que permitan una rápida visualización de las formas del parásito. Materiales Punch o sacabocado. Hojas de bisturí. Portaobjetos. Cubreobjetos. Tinciones de Giemsa o Diff Quick. Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Se realiza la toma de la muestra con punch, sacabocado u hojas de bisturí. Se recoge tejido de la piel. Se realizan improntas de la piel. Se tiñen con Giemsa o Diff Quick. Se observan al microscopio para investigar la presencia de formas de amastigotes de Leishmania spp. (Bernal et al., 2000; Harvey y Mckeever, 2003; Rochette, 2003). 4.4.1.4. Frotis de material subyacente de úlceras Fundamento. Se emplea esta técnica para evidenciar la presencia de fases de desarrollo de la Leishmania spp. en frotis de muestras de material subyacente a úlceras para investigar la presencia de formas del parásito. Materiales Jeringas de 3 ó 5 ml. Portaobjetos. Cubreobjetos. Tinciones de Giemsa o Diff Quick. Microscopio óptico. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 138 ~ Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Se recoge material subyacente de la úlcera observada en el animal. Se emplea para la toma de la muestra. Se realizan frotis con ese material obtenido. Se tiñen con Giemsa o Diff Quick. Se observan al microscopio para evidenciar la presencia de formas de amastigotes de Leishmania spp. (Rochette, 2003). 4.4.1.5. Frotis de líquido abdominal Fundamento. Aunque no común, esta técnica ofrece una posibilidad más de diagnóstico sobre todo en animales que muestren efusión abdominal. Se emplea para evidenciar la presencia de fases de desarrollo de Leishmania spp. en frotis. Materiales Jeringas de 3 ó 5 ml. Portaobjetos. Cubreobjetos. Tinciones de Giemsa o Diff Quick Microscopio óptico. Lápiz de punta de diamante. Procedimiento Se realiza la toma de la muestra de la efusión abdominal con jeringas. Se realizan frotis con el material obtenido. Se tiñen con Giemsa o Diff Quick. Se observan al microscopio para evidenciar la presencia de formas de amastigotes de Leishmania spp. (Dantas Torres, 2006). 4.4.1.6. Identificación e interpretación de amastigotes de Leishmania spp El género Leishmania es un flagelado unicelular que pertenece a la familia Trypanosomatidae. En el hospedador final el parásito está presente en una forma conocida como amastigote no flagelado (este hallazgo se aprecia en la observación al microscopio en muestras de los animales positivos), principalmente se observan en macrófagos de la piel, en los órganos reticulolinfáticos (ganglios, médula ósea, hígado y bazo), riñones y tracto gastrointestinal. El amastigote presenta forma entre redonda y ovalada que puede medir entre 2.5-5.0 y 1.5-2.0 µm (se aprecia el núcleo y el cinetoplasto en forma de barra) (Rochette, 2003). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 139 ~ 4.5. DIAGNÓSTICO DE HEMOPARÁSITOS: PROTOZOARIOS Y RICKETTSIAS La mayoría de los parásitos protozoarios y rickettsiales que invaden el torrente sanguíneo pueden destruir a los eritrocitos. Por tanto, cuando los animales muestren signos clínicos de anemia, su sangre debería ser examinada para determinar por un lado, el contenido de hemoglobina y las cuentas celulares. Por otro lado, la morfología, el tamaño, y las características tintoriales de los eritrocitos, así como la presencia de parásitos sanguíneos, sólo podrán evidenciarse mediante la observación microscópica de extensiones de sangre (frotis) cuidadosamente elaboradas y meticulosamente examinadas (Uilenberg, 1995; Allison y Meinkoth, 2010; Zajac y Conboy, 2012). Técnica de examen microscópico directo de frotis sanguíneo Fundamento. Esta técnica se emplea para evidenciar la presencia de distintivas fases de desarrollo de parásitos extracelulares, intraeritrocíticos, intraleucocíticos o intraplaquetarios en frotis de muestras de sangre. Materiales Agujas y tubos vacutainer con anticoagulante (EDTA, heparina), o lancetas y capilar heparinizado de microhematocrito para colección de sangre. Centrífuga clínica o de microhematocrito. Pipetas de transferencia o pipetas serológicas. Micropipeta y punta para micropipeta de 10 µl. Portaobjetos. Alcohol metílico absoluto y colorante de Giemsa o de Wright. Vaso de Coplin. Forceps para portaobjetos. Microscopio compuesto. Aceite de inmersión. Procedimiento Las tinciones metacromáticas de extensiones de sangre son muy útiles para la identificación de parásitos sanguíneos. La tinción con colorante de Giemsa es la más útil, aunque la tinción de Wright es satisfactoria, especialmente cuando se desea hacer una cuenta diferencial de leucocitos. Colectar una muestra de sangre con el sistema vacutainer a partir de la vena caudal (bovinos), yugular (bovinos, equinos, pequeños rumiantes), o safena (perros y gatos). Alternativamente, y si sólo serequieren pequeños volúmenes para realización de frotis y estimación del volumen celular aglomerado, utilizar una lanceta para pinchar la vena auricular y colectar la gota de sangre con un capilar heparinizado. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 140 ~ Utilizando una micropipeta, o directamente del tubo capilar heparinizado, colocar de 2 a 6 µl de sangre en un extremo de un portaobjetos. Inmediatamente y utilizando como acarreador o extensor otro portaobjetos colocado en un ángulo de 45°, realizar una extensión delgada de la gota de sangre. Secar al aire la extensión de sangre y fijar en metanol absoluto por 5 min. Secar al aire. Diluir el colorante Giemsa 1:20 con agua de grifo y verter en un vaso de Coplin. Sumergir los portaobjetos y teñir durante 30 min. Retirar los portaobjetos y lavar a chorro de agua. Secar al aire y observar al microscopio utilizando el objetivo de inmersión (100X) (Sloss y Kemp, 1985). Consideraciones Se recomienda realizar el examen microscópico en un borde del frotis, desde el inicio de la extensión de sangre hasta las extensiones a manera de pluma del término. Examinar los espacios intercelulares y los elementos celulares para búsqueda de parásitos extracelulares, intraeritrocíticos, intraleucocíticos o intraplaquetarios (especialmente en perros). La realización de un frotis a partir de la capa flogística (posterior a la centrifugación del tubo vacutainer o capilar heparinazado) incrementará la probabilidad de encontrar los parásitos sanguíneos, particularmente cuando se presentan parasitemias bajas. Esto, derivado de la menor densidad, con respecto a los eritrocitos, de los parásitos extracelulares (por ejemplo, Trypanosoma spp.) de los parásitos intraeritrocíticos (por ejemplo, Babesia spp.), de los parásitos intraleucocíticos (por ejemplo, Ehrlichia spp.), o intraplaquetarios (por ejemplo, Anaplasma platys). Una variante del frotis delgado, es el examen microscópico de un frotis grueso. Consiste en extender parcialmente una gota de sangre colocada en un cubreobjetos con un movimiento circular realizado con el ángulo de otro cubreobjetos. No requiere fijación en metanol después del secado al aire, y simplemente se tiñe con Giemsa. Esta técnica es más sensible que la de frotis delgado pero no siempre se puede lograr una identificación específica del parásito. 4.6. INTERPRETACIÓN DEL EXAMEN MICROSCÓPICO DE FROTIS SANGUÍNEO El examen microscópico de frotis sanguíneo permite identificar la presencia de parásitos extracelulares e intracelulares. A continuación se describen las características morfológicas de algunos de los diferentes parásitos protozoarios y rickettsiales más frecuentemente encontrados en los animales domésticos: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 141 ~ Trypanosoma theileri. Es un protozoario flagelado unicelular de los bovinos relativamente no patogénico y transmitido mecánicamente por vectores de la familia Tabanidae y Stomoxynae. En la sangre del hospedero se puede encontrar más frecuentemente el típico estadio de tripomastigote en plasma cuando se examina el frotis de sangre (espacios intercelulares) o en el hemocitómetro cuando se realiza una cuenta eritrocitaria con este método. El tripomastigote es elongado, adelgazándose hacia los extremos, con un cinetoplasto situado lejos del núcleo. Presenta una membrana ondulante que se extiende a lo largo del tercio anterior del cuerpo del parásito y se continúa con un flagelo largo (Sloss y Kemp, 1985; Allison y Meinkoth, 2010; Desquesnes et al., 2010). Puede medir entre 14 a 40 µm de largo x 3.8 a 5 µm de ancho, aunque la longitud total incluyendo el flagelo pude ser de 75 µm (Figura 4.5). Figura 4.5. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Trypanosoma theileri (flechas), en muestra co-infectada con Babesia sp., 100X (composición a partir de 4 imágenes). Trypanosoma cruzi. gente causal de la “Enfermedad de Chagas” en el humano que también parasita a más de 100 mamíferos domésticos y salvajes que pueden actuar como reservorios, destacando una elevada frecuencia en mapaches, zarigüeyas y perros domésticos. T. cruzi es transmitido por vectores de la familia Reduviidae a través de sus heces que contienen metatripanosomas infectivos, el tripomastigote que puede ser encontrado en sangre se caracteriza por su forma de “C” o “S”, extremo posterior puntiagudo y un voluminoso cinetoplasto muy cercano al extremo posterior. El tripomastigote se evidencia en sangre periférica de un canino sólo en la forma aguda de la enfermedad. Sin embargo, resulta difícil diferenciar T. cruzi de la especie morfológicamente similar, T. rangeli, no patogénica (The Center for Food Security and Public Health, 2009; Desquesnes et al., 2010). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 142 ~ Toxoplasma gondii. Protozoario perteneciente al phylum Apicomplexa y agente de la Toxoplasmosis en todos los animales domésticos y varios salvajes, además del humano. El organismo se encuentra en plasma sanguíneo solamente durante su diseminación hacia los órganos y tejidos donde realiza su establecimiento y multiplicación. Los organismos individuales (taquizoitos) presentan una forma creciente midiendo de 6-8 µm de largo por 3-4 µm de ancho (Figura 4.6). De importancia clínica en pequeños rumiantes por los abortos que puede causar en las hembras gestantes (De Waal, 2010). Babesia bigemina. Parásito intraeritrocítico Apicomplexa de la familia Babesidae. Uno de los agentes causales de la Babesiosis bovina transmitido por garrapatas del género Rhipicephalus (Boophilus). En general, es fácilmente detectada en los casos agudos de la infección. Los cuerpos intraeritrocíticos presentan forma redonda-ovoide (trofozoito) a conoidal o de pera (merozoito) y pueden evidenciarse en el eritrocito en forma única, en pares, o en infección múltiple. Considerada como Babesia grande ya que mide de 4.5 µm de largo x 2.5 µm de ancho (Figueroa et al., 2010). El ángulo de apertura de los merozoitos es en promedio de 57° (Figura 4.7). Figura 4.6. Examen microscópico de líquido peritoneal, Toxoplasma gondii, 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 143 ~ Figura 4.7. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Babesia bigemina, 100X. Babesia bovis. Otro de los agentes causales de la Babesiosis bovina. Los cuerpos intraeritrocíticos presentan forma redonda-ovoide (trofozoito) a conoidal o de pera (merozoito) y pueden evidenciarse en el eritrocito en forma única, en pares, o en infección múltiple. Sin embargo, es considerada como una Babesia pequeña ya que el merozoito mide en promedio 2.4 μm de largo x 1.5 µm de ancho (Figueroa et al., 2010). El ángulo de apertura de los merozoitos es en promedio de 130° (Figura 4.8). Figura 4.8. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Babesia bovis, 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 144 ~ Babesia divergens. Agentes causal de la Babesiosis bovina en Europa transmitida por la garrapata Ixodes ricinus. Aunque no reportada en México, su importancia radica en su probada capacidad de infectar múltiples especies de animales domésticos y salvajes, su potencial zoonótico y la reciente notificación del parásito en humanos de los Estados Unidos de América(EEUUA). La especie es una Babesia pequeña (1 μm x 0.5 µm), con pares formando un ángulo obtuso. Las formas ovoides son frecuentes y los merozoitos pueden evidenciarse en el eritrocito en forma única, en pares, tétradas o en infección múltiple (Figura 4.9). El parásito se encuentra comúnmente en la periferia del eritrocito, pero su forma y posición en el eritrocito varía dependiendo de la especie hospedera (Figueroa et al., 2010). Babesia canis. Una de las especies causales de la Babesiosis canina transmitida por la garrapata Rhipicephalus sanguineus. Los cuerpos intraeritrocíticos presentan una morfología similar a la descrita para B. bigemina y por tanto, considerada como una Babesia grande midiendo el merozoito de 4 a 5 μm de largo (Figura 4.10). Aun cuando morfológicamente similares, pero dependiendo de su patogenicidad y el vector que la transmita, se han identificado tres subespecies: B canis vogeli, B. canis canis y B. canis rossi, transmitidas por Rhipicephalus sanguineous, Dermacentor reticulatus y Haemaphysalis leachi, predominantemente encontradas en América, Europa y África, respectivamente. Babesia gibsoni, una segunda especie que afecta a los perros domésticos y transmitida por R. sanguineus, se presenta en forma redonda u oval y pequeña (1 a 3 μm). La forma de pera es mucho menos distintiva que B. canis. B. gibsoni infecta a los caninos en el Norte de África, lejano oriente y ha sido recientemente reportada en varios estados de los EEUUA (Figueroa-Millán, 2008; Allison y Meinkoth, 2010; Zajac y Conboy, 2012). Figura 4.9. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Babesia divergens en eritrocitos de humano, 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 145 ~ Babesia caballi. Una de las especies causales de la Babesiosis (piroplasmosis) equina transmitida por garrapatas de los géneros Rhipicephalus, Hyalomma y Dermacentor. Los cuerpos intraeritrocíticos presentan una morfología similar a la descrita para B. bigemina y por tanto, considerada como una Babesia grande (Allison y Meinkoth 2010; Figueroa et al., 2010; Zajac y Conboy, 2012). Los merozoitos son más delgados y ligeramente más cortos que los de B. bigemina, midiendo de 2.5 a 4 μm de largo (Figura 4.11). Theileria equi. Previamente conocida como Babesia equi, es el agente etiológico de la Teileriosis (Piroplasmosis) equina transmitida por Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Rh. evertsi y Hyalomma anatolicum. La forma intraeritrocítica del estadio de merozoito es pequeña (2 μm de largo) pero su característica distintiva de especie es la presentación de tétradas en los eritrocitos infectados, diferenciándose así de B. caballi (Figura 4.12). El estadio de esquizonte presente en células mononucleares usualmente no se encuentra en sangre periférica y es difícil de identificar en biopsias de ganglios linfáticos inflamados (Allison y Meinkoth 2010; Figueroa et al., 2010; Zajac y Conboy, 2012). Figura 4.10. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Babesia canis canis, 100X. (Composición a partir de cinco imágenes). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 146 ~ Figura 4.11. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Babesia caballi, 100X. (composición a partir de 4 imágenes). Figura 4.12. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Theileria equi (Babesia equi), 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 147 ~ Complejo Theileria buffeli. La Teileriosis bovina benigna es una enfermedad cosmopolita causada por piroplasmas del complejo T buffeli (T. orientalis, T. buffeli, T. sergenti) cuya posición taxonómica y clasificación no son todavía definitivas. A diferencia del diagnóstico de las especies patógenas para los bovinos (T. parva, T. annulata, T. taurotragi) cuyos esporozoitos infectan células mononucleares (linfocitos y/o monocitos) para dar lugar al esquizonte, evidenciar la presencia de este estadio en los bovinos infectados por T. buffeli es sumamente difícil (Darghouth et al., 2010). Lo más común es encontrar las formas intraeritrocíticas, consideradas como el estadio patogénico, las cuales muestran características morfológicas variables pero similares a los piroplasmas de T. annulata o de T. parva (Figuras 4.13, 4.14) y las cuales pueden confundir el diagnóstico de la Babesiosis bovina. Anaplasma marginale. Organismo rickettsial de la familia Anaplasmataceae, agente causal de la Anaplasmosis bovina, mecánicamente transmitido por moscas e instrumentos, y biológicamente por varios géneros/especies de garrapatas. El examen de frotis sanguíneo de un animal afectado revela la presencia de cuerpos iniciales intraeritrocíticos, de color violeta obscuro, de contorno algo irregular y de forma redonda (algunas veces oval) de 0.1 a 0.8 µm en diámetro, localizados mayoritariamente en el margen del eritrocito infectado (Figura 4.15). Los cuerpos de inclusión de los anaplasmas tienen que ser distinguidos de artificios (precipitaciones de colorante) y de los cuerpos de Howell-Jolly (los cuales tienen un contorno perfectamente liso). En África se ha descrito una segunda especie menos patógena, A. centrale (actualmente reclasificado como A. marginale subsp centrale), cuyo nombre científico deriva precisamente de su localización, predominantemente central, en el eritrocito infectado (Camus y Uilenberg, 2010). Los ovinos podrán ser infectados por una tercer especie, A. ovis, con similares características morfológicas a las otras especies, excepto que su localización puede ser tanto central como marginal (Figura 4.16). Figura 4.13. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Theileria annulata, piroplasmas intraeritrocíticos, 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 148 ~ Figura 4.14. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Theileria parva, piroplasmas intraeritrocíticos (flecha) y esquizonte en célula mononuclear (doble flecha), 100X. Figura 4.15. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Anaplasma marginale, 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 149 ~ Figura 4.16. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Anaplasma ovis, 100X. Anaplasma phagocytophilum (previamente Ehrlichia phagocytophila). Agente causal de la enfermedad denominada “Fiebre transmitida por garrapatas” (Ixodes ricinus) de los rumiantes domésticos y salvajes descrita en Europa, Asia, y Sudáfrica. En conjunto con Ehrlichia equi y el agente de la Erliquiosis granulocítica humana (HGE) han sido agrupados y reclasificados recientemente para incluirse en la familia Anaplasmataceae. En general, los organismos infectantes de los leucocitos que causan Ehrliquiosis o Anaplasmosis son cocobacilos Gram (-) pleomórficos intracelulares obligados, presentándose tres formas intracitoplásmicas: Cuerpos iniciales, cuerpos elementales, y mórulas (un clúster de organismos rodeado de una vacuola que aparece como una inclusión basofílica) en monocitos o granulocitos, y plaquetas, como el caso de A. platys. En los frotis sanguíneos el hallazgo de una mórula es factor diagnóstico. A. phagocytophilum se evidencia como pequeños cocobacilos que infectanprincipalmente a los neutrófilos de bovinos, ovinos, equinos, caninos y del humano. En estos últimos, la enfermedad es denominada actualmente como Anaplasmosis granulocítica equina, canina o humana, respectivamente, y es transmitida en Norteamérica por garrapatas I. scapularis e I. pacificus (Dumler et al., 2001; Allison y Meinkoth, 2010; The Center for Food Security and Public Health, 2013). En los frotis sanguíneos teñidos por Giemsa se observan cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos o mórulas de color magenta o azul grisáceas de 1.5 a 6 μm en los neutrófilos, que pueden contener partículas ricketsiales de diversas formas y tamaños dentro de vacuolas citoplásmicas (Figura 4.17). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 150 ~ Figura 4.17. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Anaplasma phagocytophilum (Ehrlichia phagocytophila), mórula en neutrófilo equino (flecha) en muestra co-infectada con Theileria equi, 100X. Anaplasma bovis (previamente Ehrlichia bovis). Uno de los agentes causales de la erliquiosis tropical de los rumiantes (actualmente denominada “ naplasmosis monocítica bovina”) transmitido por garrapatas Amblyomma, Hyaloma y Rhipicephalus. En los frotis sanguíneos teñidos por Giemsa, A. bovis se evidencia en las células mononucleares de bovinos, como cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos de color rojizo a magenta o mórulas de 1.5 a 6 μm, que pueden contener partículas ricketsiales de diversas formas y tamaños dentro de vacuolas citoplásmicas (Figura 4.18). El organismo equivalente en pequeños rumiantes es Ehrlichia ovina, agente patógeno de la erliquiosis monocítica ovina. Un tercer patógeno ha sido descrito en África, E. ondiri, agente causal de la condición conocida como fiebre petequial bovina o enfermedad de Ondiri. En este caso, los monocitos, neutrófilos y eosinofilos de los bovinos afectados muestran típicas inclusiones intracitoplásmicas, morfológicamente similares a las presentes en A. phagocytophilum (Woldehiwet, 2010). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 151 ~ Figura 4.18. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Anaplasma bovis (Ehrlichia bovis), cuerpos de inclusión intracitoplásmicos en monocito bovino (flecha), 100X. Anaplasma platys (previamente Ehrlichia platys). Es un microorganismo rickettsial intracelular obligatorio, perteneciente a la familia Anaplasmataceae. La enfermedad ocasionada por A. platys es llamada Trombocitopenia Cíclica Infecciosa Canina. Infecta específicamente a las plaquetas de caninos, pudiendo ser observados en su citoplasma como inclusiones (mórulas) de color azul oscuro a púrpura dentro de las plaquetas en los frotis de sangre periférica o en extendidos de capa flogística teñidos con colorante Giemsa (Figura 4.19). Cada inclusión anaplasmal contiene un número variable de organismos. Los organismos individuales varían en el tamaño, entre 0.35 a 1.55 μm de diámetro (The Center for Food Security and Public Health, 2013; Lira-Amaya et al., 2013). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 152 ~ Figura 4.19. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Anaplasma platys (Ehrlichia platys), mórula en plaqueta (flecha), 100X. Ehrlichia canis. Una de las tres especies de Ehrlichia que pueden ser encontradas en sangre periférica de caninos. E. canis, y ocasionalmente E. chaffeensis, es el agente causal de la Ehrlichiosis monocítica canina (también conocida como Pancitopenia tropical canina), con amplia distribución mundial, principalmente en áreas infestadas con la garrapata vector R. sanguineus y Amblyomma americanum, respectivamente (Rodríguez-Vivas et al., 2005; Figueroa-Millán, 2008). El agente se desarrolla dentro de vacuolas intracitoplásmicas (Allison y Meinkoth, 2010). Dentro de la vacuola, la cual puede ser de hasta 10 μm de diámetro, los organismos redondos en forma y de 1m de diámetro se dividen por fisión binaria, dando origen a la mórula de importancia diagnóstica (Figura 4.20). La Ehrliquiosis granulocítica canina puede ser causada por Anaplasma phagocytophilum y Ehrlichia ewingii, transmitidas en EEUUA por I. scapularis/pacificus y A. americanum, respectivamente (The Center for Food Security and Public Health, 2013; Lira-Amaya et al., 2013). Mycoplasma wenyonii (previamente Eperythrozoon wenyoni). Los micoplasmas hemotróficos representan un nuevo y distintivo clúster dentro de la familia Mycoplasmataceae, género Mycoplasma, y han recibido el nombre trivial de “hemoplasmas” (Neimark y Kocan, 1997; Neimark et al., 2002; Messick, 2004). M. wenyonii es moderadamente patógeno y agente causal de la eperytrozoonosis bovina. Típicamente, los organismos se evidencian en un frotis sanguíneo teñido con Giemsa como parásitos epi-eritrocíticos de forma anular (0.3-1.5 µm de diámetro) presentes sobre la superficie de los eritrocitos, o libres en plasma, que toman una coloración azul claro o azul rosado (Allison y Meinkoth, 2010). En cerdos se ha descrito una especie Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 153 ~ patógena, Mycoplasma haemosuis (previamente Eperythrozoon suis), con morfología similar a M. wenyonii, excepto que de mayor tamaño (0.8-2.5 µm diámetro) en sus formas circulares adheridas sobre los eritrocitos, los cuales pueden aparecer de forma individual, en cadenas, o aglutinados entre ellos (Figura 4.21). De significancia clínica es también el agente causal de la Eperytrozoonosis de los borregos causada por Mycoplasma (Eperythrozoon) ovis con características morfológicas similares a M. wenyonni (Scott y Uilenberg, 2010). Figura 4.20. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Ehrlichia canis, mórula en célula mononuclear (flecha), 100X. Figura 4.21. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Mycoplasma haemosuis (Eperythrozoon suis), 100X. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 154 ~ “Candidatus” Mycoplasma haemobovis (previamente Haemobartonella bovis). Hemoplasma causal de la hemobartonelosis bovina. El examen microscópico de un frotis sanguíneo revela pleomorfismo en los organismos: cuerpos esféricos, usualmente en pares, ovoides o en forma de bastón, solos o encadenados adheridos sobre la superficie del eritrocito y ocasionalmente libres en el plasma. Miden aproximadamente 2 µm de diámetro (Figura 4.22). En caninos y felinos se pueden encontrar tanto organismos patógenos como de moderada patogenicidad. Dentro de los patógenos, el examen de frotis puede revelar Mycoplasma haemocanis (previamente Haemobartonella canis) agente causal de la Hemoplasmosis (hemobartonelosis) canina, el cual presenta morfología similar a M. haemobovis, salvo que las formas esféricas y ovoides miden 0.2 a 0.4 µm de diámetro, mientras que los bastones alcanzan hasta 6 µm de largo. M. haemofelis (previamente Haemobartonella felis) agente causal de la Hemoplasmosis felina (también denominada como anemia infecciosa felina) presenta formas esféricas y ovoidales de 0.2 a 0.3 µm de diámetro, mientras que los bastones miden de 0.7 a 0.9 µm de largo con un diámetro de 0.3 µm (Messick, 2004; Allison y Meinkoth, 2010). Figura 4.22. Examen microscópico de frotis sanguíneo, Mycoplasma (Haemobartonella) sp, cuerpos cocoidesepieritrocíticos (flechas), en muestra co-infectada con Babesia sp. 100X. Referencias Allison, R.W., Meinkoth, J.H., 2010. Anemia caused by rickettsia, mycoplasma and protozoa. 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Técnica para recuperar helmintos adultos (nematodos gastrointestinales, nematodos pulmonares y trematodos) a la necropsia 5.2.2. Obtención de nematodos del tracto gastrointestinal 5.2.3. Obtención de nematodos adultos del sistema respiratorio 5.2.4. Obtención de trematodos del hígado 5.2.5. Recuperación de nematodos inmaduros del tracto digestivo 5.3. Técnica para contar nematodos del tracto digestivo, del sistema pulmonar y complejo hepático 5.3.1. Técnica para contar nematodos del lumen del tracto gastrointestinal 5.3.2 Conteo de larvas de nematodos tisulares en el tracto gastrointestinal 5.3.3 Conteo de nematodos del sistema pulmonar y el complejo hepático 5.4. Identificaciónde nematodos adultos de los rumiantes 5.4.1. Aspectos generales en la identificación 5.4.2. Preparación de especímenes 5.4.3. Claves para determinar el género de los principales nematodos gastrointestinales 5.4.4. Claves para identificar géneros importantes de la familia Trichostrongylidae 5.4.5. Claves para identificar géneros importantes de la familia Strongylididae 5.4.6. Claves para identificar géneros importantes de la Familia Trichuridae 5.4.7. Claves para identificar géneros importantes de la familia Chabertiidae Dr. Juan Felipe de Jesús Torres Acosta1 Dr. Juan José Vargas Magaña2 M. en C. José Israel Chan Pérez1 Dr. Armando Aguilar Caballero1 Dr. Miguel Ángel Alonso Díaz3 Dra. Nadia Florencia Ojeda Robertos4 1Campus de Ciencias Biológicas Agropecuarias, FMVZ-UADY, 2Escuela Superior de Ciencias Agropecuarias, UACAM, 3Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical, FMVZ-UNAM, 4División Académica de Ciencias Agropecuarias, UJAT. RECUPERACIÓN DE HELMINTOS A LA NECROPSIA Capítulo 5 Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 159 ~ 5.4.8. Claves para identificar géneros importantes de la familia Oxyuridae 5.4.9. Claves para identificar géneros importantes de la familia Ascarididae 5.4.10. Claves para identificar géneros importantes de la familia Ancylostomatidae 5.4.11. Claves para identificar géneros importantes de la familia Dictyocaulidae 5.4.12. Claves para identificar géneros importantes de la familia Protostrongylidae 5.5. Técnica para medir la longitud y contabilizar el número de huevos in utero de hembras de nematodos gastrointestinales Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 160 ~ 5.1. INTRODUCCIÓN El diagnóstico de los problemas ocasionados por los helmintos del tracto gastrointestinal y respiratorio de los rumiantes se realiza de manera rutinaria basándose en técnicas coproparasitoscópicas tales como la flotación centrifugada, McMaster, sedimentación y el cultivo e identificación de larvas de nematodos en heces. Sin embargo, estas técnicas sólo pueden ser utilizadas como un indicador indirecto de las poblaciones totales de parásitos adultos presentes en los individuos afectados. Por esta razón, es indispensable realizar la necropsia en todos los casos donde se quiera confirmar la presencia de helmintos. Este procedimiento sirve para: (i) identificar las diferentes especies de helmintos en el animal (riqueza de especies), y (ii) determinar la cantidad (abundancia) de helmintos presentes en los diferentes órganos y sistemas del animal (tracto digestivo, músculos, hígado, pulmones, etc.). La necropsia hace posible obtener muestras para recuperar helmintos en sus diferentes fases de desarrollo. Para esto existen procedimientos específicos que se aplican para el tracto gastrointestinal, músculos, hígado, pulmones, riñones, cerebro, etc. La recuperación de helmintos de los diferentes órganos de los animales tiene relevancia en la investigación científica. Su importancia radica en el descubrimiento de nuevas especies de parásitos (Joshi et al., 1997), la descripción más profunda de especies pobremente descritas (Tantaleán y Sánchez, 2007), su uso en la evaluación de nuevas moléculas o productos antiparasitarios (Wood et al., 1995), incluyendo antihelmínticos no convencionales (Hoste et al., 2012; Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2013). La necropsia también se utiliza como herramienta para conocer la epidemiología de los helmintos. Para esto se utilizan animales centinelas o trazadores de manera sistemática (cada mes, cada época o año) para conocer la infectividad de una pradera o pastura de interés (Torres-Acosta, 1999; Aguilar-Caballero, 2004). La necropsia puede ser utilizada en estudios en los que se obtienen animales de zonas naturales (preservadas o perturbadas) y se utilizan a los parásitos para hacer inferencias de la salud del ecosistema, o algún otro tipo de estudio biológico (Braicovich y Timi, 2008). En un solo animal se pueden obtener diversos helmintos en diferentes fases de vida (fases larval, juvenil y adulta) y su presencia depende del tiempo que ha pasado desde que se infectó el hospedero, el grado de infección, la respuesta inmune o la frecuencia de infección. También se debe tener en cuenta si el hospedero es definitivo, es intermediario o puede ser ambos simultáneamente. El presente capítulo tiene como objetivo describir las técnicas post-mortem comúnmente utilizadas para obtener diferentes fases de helmintos de diferentes órganos o sistemas. Aunque se utiliza como modelo a los rumiantes, los principios podrían ser aplicados a otras especies animales. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 161 ~ 5.2. TÉCNICA PARA LA RECUPERACIÓN DE HELMINTOS A LA NECROPSIA 5.2.1. Técnica para recuperar helmintos adultos (nematodos gastrointestinales, nematodos pulmonares y trematodos) a la necropsia Fundamento El ciclo biológico de los nematodos gastrointestinales (NGI) incluye una fase parásita dentro de su hospedero. Las larvas infectantes (L3) de NGI son ingeridas por los rumiantes al consumir vegetación contaminada con las mismas. Las L3 se alojan en diferentes compartimientos del tracto gastrointestinal (para el caso de los NGI). Otras especies de helmintos migran a través de la mucosa de los órganos digestivos hasta el sistema sanguíneo y se trasladan hasta localizar su órgano blanco (por ejemplo, nematodos pulmonares o trematodos del hígado). Por lo tanto, la obtención de los órganos blanco de estos parásitos (tracto gastrointestinal, tracto respiratorio, hígado, etc.), permitirá recuperar las poblaciones de helmintos presentes en estos órganos. El procedimiento de recuperación de helmintos se debe realizar en animales recién sacrificados o recién fallecidos (antes de mostrar rigor mortis). Esto debido a que los helmintos se destruyen rápidamente dentro de los cadáveres, especialmente en condiciones cálidas, las cuales prevalecen en el trópico. En caso de sacrificar algún animal para una necropsia, se deberán respetar las normas de bioética correspondientes a la especie animal, así como las normas vigentes en México (por ejemplo la NOM-033-Zoo-1995). Debido a que muchos parásitos no se pueden observar a simple vista (por su tamaño pequeño o por algún otro factor como su color y forma) se requerirá hacer observaciones con la ayuda de un estereoscopio y en algunos casos con microscopio. Para esto es necesario realizar diferentes procedimientos que se describirán a continuación. Materiales Mesa de acero o cualquier superficie disponible para realizar una necropsia. Guantes de látex. Indumentaria de protección del cuerpo (mandil). Máscara o careta protectora. Cuchillos y afilador. Tijeras. Hilo de algodón para ligar las diferentes secciones del tracto gastrointestinal. Charolas para colocar órganos. Recipiente de plástico con capacidad de 4, 12 y 20 L. Tabla para cortar. Pizetas de 1 L. Tamizes No. 200 (0.075 mm), 270 (0.053 mm) y 400 (0.038 mm). Frascos de plástico de 2 L de capacidad. Marcadores indelebles. Formalina al 5%. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 162 ~ 5.2.2. Obtención de nematodos del tracto gastrointestinal Método Obtención de las diferentes secciones del tracto gastrointestinal. Se coloca el cadáver del animal en decúbito lateral derecho. Se realiza una incisión sobre la línea media para tener acceso a la cavidad abdominal que permita la extracción del abomaso, intestino delgado e intestino grueso(Figura 5.1a). Se realiza una doble ligadura (amarre) con hilo de algodón al final del abomaso (ligadura abomaso-duodenal) (Figura 5.1b). En caso de requerir el intestino delgado, se realiza otra doble ligadura en la unión íleo-cecal. Si se requiere el intestino grueso, se realiza una última ligadura a nivel de recto. Las dobles ligaduras se realizan para evitar que los contenidos de las diferentes partes del tracto gastrointestinal se mezclen llevando consigo helmintos a lugares donde normalmente no habitan. Obtención de nematodos gastrointestinales adultos del abomaso. Se separa el omaso del abomaso y se corta entre las dos ligaduras de la unión abomaso-duodenal. Se debrida cuidadosamente la unión al peritoneo, para extraer el órgano que será depositado en una bandeja. Se realiza una incisión en la curvatura menor del abomaso para extraer el contenido abomasal, el cual se deposita en un recipiente (charola) (Figura 5.1c). La mucosa del órgano se lava ejerciendo presión leve mediante agua corriente para retirar los residuos de contenido abomasal. Simultáneamente, la mucosa se frota cuidadosamente con los dedos para remover cualquier parásito adherido a ella (Figura 5.2a). El agua usada para el lavado se colecta y se mezcla en el mismo recipiente del contenido abomasal. Posteriormente, se tamiza todo el material colectado en un tamiz No. 400. Este proceso se realiza mediante un chorro de agua a presión hasta que el líquido que atraviesa el tamiz se vea transparente (incoloro) (Figura 5.2b). El material que permanece en el tamiz se vierte a un frasco de plástico con tapa de rosca previamente identificado (Figura 5.2c) y se fija con formalina al 5% (MAFF, 1986). Figura 5.1. De izquierda a derecha: incisión en la línea media del cadáver (a), doble ligadura en unión abomaso-duodenal (b) y apertura por curvatura menor (c). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 163 ~ Figura 5.2. De izquierda a derecha: Lavado de mucosa abomasal mediante agua a presión (a) tamizado de materiales del contenido abomasal y del lavado (b), y envasado de materiales una vez tamizados (c). Obtención de nematodos gastrointestinales adultos del intestino delgado. Se separa cuidadosamente el mesenterio de las asas intestinales. El intestino delgado se abre longitudinalmente, con la ayuda de tijeras, y se vierte el contenido intestinal en un recipiente (cubeta de 5 L). Se lava la pared de la mucosa ejerciendo presión con agua corriente y frotando la mucosa con dos dedos, para remover los parásitos adheridos a la pared del intestino. El contenido y el material de lavado se mezclan y se procede al tamizado del material. El tamizado del material y la conservación de la muestra se realiza con el procedimiento descrito para el abomaso (MAFF, 1986). Obtención de nematodos gastrointestinales adultos del intestino grueso. De esta sección del tracto se utiliza el ciego y la primera mitad del colon, ya que en esta zona se concentran los helmintos. Las asas intestinales se separan cuidadosamente del mesenterio. Se abre el órgano longitudinalmente con la ayuda de tijeras. Se lava la mucosa con la ayuda de agua a baja presión y se pasan cuidadosamente dos dedos para separar a los parásitos adheridos a la mucosa. El contenido del intestino y toda el agua que sirvió para separar a los parásitos de la mucosa se mezclan y colocan en un recipiente de plástico (10 L). Posteriormente se realiza el tamizado de los materiales del recipiente utilizando un tamiz No. 200 siguiendo el procedimiento descrito para abomaso (MAFF, 1986). 5.2.3. Obtención de nematodos adultos del sistema respiratorio Método La obtención de nematodos adultos del sistema respiratorio requiere de diferentes técnicas que dependen de la especie de nematodo que se sospecha. El examen de las vías aéreas permite la obtención de nematodos que se alojan en esta sección del sistema respiratorio, tales como Dictyocaulus spp. o Metastrongylus spp. Mientras que, Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 164 ~ el examen del tejido se realiza específicamente para recuperar parásitos de los nódulos formados en el tejido pulmonar por nematodos como Muellerius spp. Las metodologías para realizar la cuenta de parásitos de las diferentes especies de nematodos se describen por separado: Obtención de nematodos adultos de las vías aéreas. Se abre el tórax del cadáver a un costado del esternón para permitir el acceso a la cavidad torácica. Se extrae el aparato respiratorio, incluida la tráquea, y se deposita en una charola. La tráquea y los bronquios se abren longitudinalmente con tijeras (Figura 5.3a,b). Se abre en su totalidad los bronquiolos principales, y este procedimiento se continúa con los bronquiolos laterales de manera sistemática (Figura 5.3c). Cualquier parásito observado durante este proceso es recuperado. Los parásitos pulmonares grandes pueden enredarse y formar nudos difíciles de separar sin romper los parásitos, por lo que es necesario colocar los parásitos vivos en un recipiente que contenga formalina al 5% (para el caso de D. filaria). Para el caso de D. viviparus se requiere colocar los parásitos en una solución salina fisiológica y almacenarlos a 4°C por 16 h para separar los parásitos. Después de esto se fijan con formalina al 5%. Figura 5.3. De izquierda a derecha: Apertura longitudinal de la tráquea (a), revisión de tráquea (b), revisión de bronquiolos principales (c). Una vez que se ha abierto el árbol bronquial, este se llena con solución salina fisiológica y se lava por completo. El contenido recuperado se tamiza (tamiz No. 400) y el material retenido en el tamiz es lavado para luego almacenarlo en un frasco de plástico debidamente identificado y se procede a fijar el material con formalina al 5%. Los parásitos recuperados (adultos e inmaduros), son contados usando un estereoscopio. Con esta metodología se tiene que revisar la totalidad del material tamizado debido al bajo número de parásitos presentes. Obtención de nematodos adultos de tejido pulmonar. El pulmón es seccionado y examinado en busca de nódulos que pueden tener una tonalidad grisácea clara o casi negra (de 1 mm a algunos centímetros). Los nódulos se retiran del tejido pulmonar y los Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 165 ~ nematodos se extraen del interior de los nódulos mediante una compresión leve del mismo entre dos piezas de vidrio, extrayendo al nematodo mediante una aguja. Los parásitos se conservan en una solución de formalina al 5%. Esta técnica es únicamente cuantitativa ya que difícilmente se logra encontrar y extraer todos los nódulos en todo el tejido pulmonar. 5.2.4. Obtención de trematodos del hígado Método Se abre la cavidad abdominal del cadáver en la línea media para ubicar el hígado del animal y ligar el conducto colédoco evitando el escape de los trematodos desde la vesícula biliar. Si el conducto no se liga de inmediato es importante revisar parte del intestino delgado para determinar si los trematodos migraron a esta sección del tracto gastrointestinal. El hígado se lava con solución salina fisiológica y cualquier trematodo adherido a la superficie se colecta y almacena en un frasco previamente identificado. El hígado se coloca en una tabla para cortar tejidos y se cortan rebanadas de 1 cm de grosor aproximadamente (Figura 5.4a). Las rebanadas de hígado son presionadas gentilmente con las manos en solución salina fisiológica para extraer los trematodos adultos y juveniles presentes (Figura 5.4b). Estas porciones se cortan nuevamente en pequeñas piezas de 1 x 5 cm, las cuales son lavadasy presionadas de nuevo. Estas piezas son lavadas y desechadas previa inspección (Figura 5.4c). Se mezclan la solución salina fisiológica y la solución con los trematodos recuperados y se lavan utilizando un tamiz No. 270. Los parásitos se lavan con agua hasta que quedan limpios y se recuperan en un pequeño volumen de solución salina fisiológica. Son fijan con una solución de formalina al 5% para realizar su conteo posterior (Gibbons et al., 1996). Figura 5.4. De izquierda a derecha: Corte del hígado en rebanadas (a), presión sobre las rebanadas en solución salina fisiológica (b), y presión de las piezas de 1x5 cm en solución salina fisiológica. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 166 ~ 5.2.4. Recuperación de nematodos inmaduros del tracto digestivo Fundamento Las diferentes especies de NGI tienen su hábitat en una sección específica del tracto gastrointestinal que es donde completan su ciclo biológico. Cuando las larvas L3 de NGI son ingeridas por un animal, migran a través del tracto gastrointestinal hasta alcanzar su órgano blanco (por ejemplo, Haemonchus contortus en abomaso, Trichostrongylus colubriformis en intestino delgado y Oesophagostomum columbianum en intestino grueso). En estos sitios las larvas L3 invaden la mucosa del órgano respectivo y continúan su desarrollo en el interior de la mucosa (fase de larva L4 o larva tisular). Posteriormente emergen como larvas L5 o parásitos juveniles. Sin embargo, si se presentan condiciones adversas para el desarrollo de las larvas, estas entran en un estado de hipobiosis (inhibición temporal o prolongada del desarrollo larvario). Las larvas hipobióticas no emergerán de la mucosa hasta que mejoren las condiciones del medioambiente. Este fenómeno también se asocia a una regulación inmunitaria por parte del hospedero en contra de los parásitos. Para la recuperación de larvas tisulares se requiere extraerlas de los tejidos del animal. Para esto se realiza la digestión artificial de los diferentes tejidos involucrados. En el caso de los nematodos del género Oesophagostomum las larvas forman nódulos en el intestino grueso, y el uso de la digestión artificial puede destruir a las larvas. En este caso la recuperación se realiza de acuerdo a la metodología descrita por Roepstorff y Nansen (1998). Materiales Tamiz No. 400 (0.038 mm). Botes de plástico (2 L capacidad). Vasos de precipitado de cristal (50 ml y 10 ml). Cajas de Petri No.10. Marcadores indelebles. Lugol. Portaobjetos. Cubreobjetos. Estereoscopio. Microscopio. Pepsina. Ácido clorhídrico concentrado. Cloruro de sodio. Agua destilada. Método Preparación de la solución de digestión. Se prepara la solución para la digestión artificial con pepsina (grado de reactividad 1:10,000). Esta solución se prepara mezclando 8 g de pepsina, 20 ml de ácido clorhídrico grado reactivo y 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua a 37°C. Esta cantidad es suficiente para digerir 500 g de Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 167 ~ tejido. Por lo tanto, es importante ajustar los volúmenes que se agregan de acuerdo al peso de cada órgano. Digestión de los órganos. El abomaso se corta en piezas (2 x 3 cm), se deposita en vasos de precipitado de cristal o en frascos de plástico con tapa de rosca (capacidad 2 L) y se agrega la solución de digestión. El proceso a seguir puede ser de dos formas: Para una digestión rápida (5 h para abomasos de ovinos y caprinos y 8 h para abomasos de bovinos), el recipiente de cristal con la solución de digestión se deposita en el baño María sobre una platina de calentamiento. Se agrega un agitador magnético al recipiente con la digestión. La platina se programa a 37°C de temperatura y 5 r.p.m. Para una digestión lenta, el recipiente con la solución de digestión se introduce a una estufa bacteriológica, pre-calentada a 37°C. La digestión se realiza al incubar los tejidos de 15 a 17 h. Durante el proceso de incubación es recomendable mover los contenidos de manera manual en forma sistemática (cada 3 ó 4 h). Al final del proceso, se verifica que el órgano esté completamente digerido. El material digerido se tamiza (tamiz No. 400) y se lava con agua corriente hasta verificar que el agua eliminada sea transparente. En el caso de digestiones con grandes cantidades de grasa, se debe usar agua caliente, que ayudará a disolver la grasa, en los lavados. El remanente que se encuentra en el tamiz se deposita en un frasco con tapa de rosca, previamente identificado y se fija con formalina al 5% para su posterior examen. La digestión artificial del intestino delgado e intestino grueso se realiza con el mismo proceso descrito anteriormente. 5.3. TÉCNICA PARA CONTAR NEMATODOS DEL TRACTO DIGESTIVO Y DE LOS SISTEMAS PULMONAR Y HEPÁTICO Fundamento Las cargas de parásitos de los animales de pastoreo pueden ser considerables. Por lo tanto, es difícil contabilizar el total de parásitos recuperados en un órgano ya que implica mucho esfuerzo y tiempo. Ante esta situación, se recomienda contar los parásitos obtenidos en muestras representativas del contenido (para adultos) y de la digestión artificial (para larvas tisulares). Este conteo de muestras representativas, llamadas alícuotas, permite conocer las poblaciones totales de nematodos y larvas tisulares por sección del tracto gastrointestinal, sin necesidad de realizar la revisión total de contenido de los diferentes órganos. El conteo de NGI se realiza en el contenido recuperado del lumen de los diferentes órganos separadamente (abomaso, intestino delgado e intestino grueso). A continuación se describe la técnica de conteo de NGI adultos en rumiantes. Para el caso los bovinos se requieren recipientes de colección acordes al volumen de contenido y tamaño de los órganos. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 168 ~ Materiales Frascos con capacidad mayor a 2 L. Vasos de precipitado (capacidad de 10 y 50 ml aforado). Tamiz No. 400 (0.038 mm). Cajas de Petri No. 10 (marcadas en la base con líneas paralelas con 0.5 cm de separación). Asas bacteriológicas. Esterescopio. Microscopio. Portaobjetos. Cubreobjetos. Contador. 5.3.1. Técnica para contar nematodos del lumen del tracto gastrointestinal Método Los contenidos obtenidos de las diferentes secciones del tracto gastrointestinal (abomaso, intestino delgado e intestino grueso) se procesan separadamente. Primero se lava el contenido respectivo con agua corriente para retirar el exceso de formalina utilizando un tamiz No. 400. Los contenidos lavados se depositan en frascos y se aforan con agua hasta alcanzar 2000 ml en pequeños rumiantes y 6000 ml en bovinos (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005). Previa agitación, de la solución, se toma el 10% del contenido dividido en 5 alícuotas de 40 ml cada una para pequeños rumiantes (Hansen y Perry, 1994) (Figura 5.5). Para el caso de bovinos se toman 5 alícuotas de 120 ml. Las muestras se toman mientras la solución se mantiene en agitación. Figura 5.5. De izquierda a derecha: Aforado de contenido abomasal a 2 L (a), toma de alícuota con contenido en movimiento (b), y alícuota de 40 ml en vaso de precipitado (c). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 169 ~ El conteo de los parásitos se realiza en el 10% del volumen total de la muestra. Se toman pequeñas cantidades de muestra y se colocan en la caja de Petri de tal manera que el contenidoevaluado forme una delgada película de material semi-digerido y que permita ver en el fondo de la caja de Petri las líneas paralelas que servirán de guía para mover y observar todo el fondo con apoyo de un estereoscopio (Figura 5.6a,b). Al observar la muestra sistemáticamente, siguiendo cada línea marcada, se van recuperando los parásitos que se encuentren para colectarlos y contabilizarlos. Incluso se pueden contar separadamente machos y hembras de NGI (Figura 5.6c). El número total de parásitos adultos encontrados se multiplica por 10 para obtener el total de parásitos presentes en cada órgano. Total de parásitos adultos = Parásitos contados X 10 Los parásitos recuperados son identificados como se describe posteriormente. En caso necesario, los especímenes pueden ser conservados para su posterior identificación. Para esto, se requiere fijar a los parásitos utilizando formalina (concentración de 3-5%) o alcohol etílico (70%). Los nematodos son colocados dentro de frascos con tapa, identificándolos de acuerdo a hospedero y región anatómica donde fueron colectados. Figura 5.6. De izquierda a derecha: Depósito de parte de la alícuota en una caja de Petri (a), lectura del contenido con un estereoscopio, y (b) recuperación de nematodos adultos (c). 5.3.2 Conteo de larvas de nematodos tisulares en el tracto gastrointestinal Método Los materiales de la digestión de cada órgano deben lavarse por separado utilizando agua y un tamiz No. 400 para eliminar el exceso de formalina de manera semejante a lo Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 170 ~ descrito para el conteo de nematodos adultos. Al finalizar el lavado, el contenido del tamiz se vierte en un recipiente y se afora a 200 ml con agua purificada. De esta solución se toma una muestra del 10% (cinco alícuotas de 4 ml cada una) para el conteo del número de larvas tisulares. El contenido se coloca en una caja de Petri de la misma manera que para el conteo de parásitos adultos. El conteo se realiza utilizando un estereoscopio a 4X. Las larvas recuperadas se colocan en portaobjetos, con su respectivo cubreobjetos y se observan en un microscopio, utilizando los objetivos 10X y 40X. El número de larvas recuperadas se multiplica por 10 para obtener el total de larvas presentes por órgano. En caso de no encontrar larvas en la primera muestra se recomienda tomar una segunda muestra del 10% para su lectura. Para este caso el factor de corrección para el cálculo del total de larvas presentes será multiplicar por 5. En el caso de que existan larvas tisulares de diferentes especies en el mismo órgano se recomienda utilizar las claves de identificación del MAFF (1986). 5.3.3. Conteo de nematodos del sistemas pulmonar y el complejo hepático Métodos Examen para el conteo de nematodos de los géneros Dictyocaulus, Metastrongylus y trematodos. Los contenidos recuperados del pulmón e hígado se lavan por separado con abundante agua (tamiz No. 400) para eliminar el exceso de formalina. La solución se deposita en cajas de Petri marcadas para el conteo de los parásitos. Los parásitos son contabilizados con la ayuda de un estereoscopio. Para el caso de los trematodos, debido a que al momento de su obtención estos son cortados en secciones, se debe decidir la metodología para su cuenta en cabezas o colas. Examen para la cuenta de nematodos de los géneros Muellerius o Cystocaulus. Este procedimiento se realiza con la misma metodología descrita para el género Dictyocaulus. Ante la dificultad para obtener especímenes completos de Muellerius capillaris por su adherencia al tejido pulmonar, el conteo se realiza contabilizando ya sea las cabezas o las colas de los parásitos. 5.4. IDENTIFICACIÓN DE NEMATODOS ADULTOS DE LOS RUMIANTES Fundamento La identificación de los nematodos adultos presentes en los hospederos se basa en la observación de sus características morfológicas. Existen guías para una correcta identificación de las especies parásitas en los pequeños rumiantes y otras especies en general. La identificación a nivel de especie se realiza observando los detalles Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 171 ~ morfológicos de los órganos sexuales (bolsa copulatriz) de los machos. En las hembras, los órganos sexuales comparten los rasgos del género al que pertenecen. Materiales Guantes de látex. Cajas de Petri de cristal (15 cm de diámetro). Asas bacteriológicas. Portaobjetos. Cubreobjetos. Microscopio. Método Los parásitos adultos deben ser identificados poco después de su recuperación y conteo ya que se conservan claros. Los nematodos se depositan en las cajas de Petri con solución salina fisiológica (5.7a). Estos se toman individualmente mediante una aguja y se montan cuidadosamente en portaobjetos para su identificación en el microscopio (Figura 5.7b,c). Es conveniente que los nematodos se encuentren extendidos antes de ser fijados. Para determinar el porcentaje de las especies que componen una población parasitaria se deben observar al menos 50 individuos de la población. Figura 5.7. De izquierda a derecha: Fase adulta de Haemonchus contortus en solución salina fisiológica (a), montaje del parásito para su identificación (b), y región caudal de H. contortus, bursa y rayos dorsales. 5.4.1. Aspectos generales en la identificación Los parásitos adultos pueden ser identificados de acuerdo a su género considerando sus características macroscópicas generales, sus hospederos y el órgano donde fueron recuperados (Cuadro 5.1). También existen algunas claves de identificación en la zona cefálica que son características de algunos géneros (Figura 5.8). La identificación de la especie se realiza examinando nematodos machos adultos en los cuales se observan Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 172 ~ las espículas, el gubernáculo, bolsa copulatriz, rayo dorsal y los rayos laterales que la conforman (Figura 5.9). Cuadro 5.1. Diferentes especies de nematodos en los ovinos, caprinos y bovinos y sus sitio de predilección dentro del organismo. Región anatómica Ovinos-caprinos Bovinos Bronquios y tráquea Dictyocaulus filaria Muellerius capillaris Dictyocaulus viviparus Abomaso Haemochus contortus Teladorsagia circumcinta Ostertagia trifurcata Trichostrongylus axei Marshallagia marshalli Haemonchus placei Ostertagia ostertagi Ostertagia lyrata Ostertagia leptospicularis Trichostrongylus axei Intestino delgado Trichostrongylus colubriformis Trichostrongylus vitrinus Trichostrongylus capricola Nematodirus battus Nematodirus spathiger Nematodirus filicolis Nematodirus adnormalis Nematodirus oiratianus Cooperia curticei Cooperia oncophora Cooperia mcmasteri Strongyloides papillosus Bunostomum trigonocephalum Gaigeria pachyscelis Capillaria spp. Trichostrongylus longispicularis Bunostomum phlebotomum Strongyloides papillosus Cooperia oncophora Cooperia mcmasteri Cooperia punctata Cooperia pectinata Nematodirus helvetianus Capillaria spp. Toxocara vitulorum Intestino grueso Oesophagostomum colombianum Oesophagostomum venulosum Chabertia ovina Trichuris ovis Skrjabinema ovis Oesophagostomum radiatum Trichuris spp. Modificado de: MAFF (1986); Gibbons et al. (1996). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 173 ~ Figura 5.8. Representación esquemática del extremo anterior de un nematodo conlas modificaciones de la cutícula que pueden observarse en la región cefálica. Figura 5.9. Representación esquemática del extremo posterior de un nematodo macho con bolsa copulatriz. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 174 ~ 5.4.2. Preparación de especímenes Materiales Guantes. Lactofenol. Cajas de Petri chicas (60x15 mm) o viales Eppendorf (capacidad de 1.5 ml). Portaobjetos y cubreobjetos. Asa bacteriológica. Microscopio. Gotero. Métodos Preparación del aclarante. El lactofenol se prepara mezclando 1 g cristales de fenol + 1 ml de ácido láctico + 2 ml de glicerina + 1 ml de agua. Proceso de aclarado. Los nematodos son retirados del conservador con el asa bacteriológica y se colocan en cajas de Petri con lactofenol donde los nematodos estén completamente sumergidos. Los parásitos se mantienen en el aclarante de 1 a 4 días dependiendo del tamaño de los nematodos. Mientras más tiempo permanezcan en el lactofenol más claros se tornan. Proceso de identificación. Los nematodos aclarados, se deben extender en portaobjetos. Se agrega unas gotas de agua para evitar que se resequen y se cubren con un cubreobjetos (Figura 5.10). En el microscopio, se deben observan las regiones anterior y posterior para registrar las estructuras que se encuentran en cada región. Si la bolsa copulatriz de los machos no se observa en posición dorso-ventral, es necesario mover el cubreobjetos hasta que los nematodos queden en esta posición para poder observar la totalidad de las estructuras de esta sección del parásito. El proceso debe realizarse con cuidado para no dañar a los especímenes. Se toma registro de las características y medidas de los especímenes examinados para ser comparados con las guías de identificación. Se recomienda llevar un registro fotográfico. Figura 5.10. Colocación de nematodos aclarados para observación en el microscopio. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 175 ~ 5.4.3. Claves para determinar el género de los principales nematodos gastrointestinales (Modificado de MAFF, 1986). (1) Lóbulo dorsal de la bolsa copulatriz asimétrico - Haemonchus. Lóbulo dorsal simétrico (2). (2) Espículas muy largas y delgadas unidas en el extremo posterior en una membrana - Nematodirus. Espículas no unidas en el extremo posterior (3). (3) Membrana bursal accesoria presente pero puede estar modificada - Ostertagia. Membrana bursal accesoria ausente (4). (4) Extremo anterior más angosto que el extremo posterior, poro excretorio anterior localizado en una muesca, gubernáculo presente - Trichostrongylus. Extremo anterior con expansión cuticular cefálica, poro excretorio anterior no localizado en una muesca, gubernáculo ausente - Cooperia. (5) Capsula bucal pequeña y cilíndrica - Oesophagostomum. Capsula bucal bien desarrollada (6). (6) Capsula bucal bien desarrollada con placas centrales cortantes y dentado. Corona ausente - Bunostomum. Capsula bucal sin placas cortantes o dentado. Corona presente - Chabertia. (7) Cuerpo dividido marcadamente en una porción anterior delgada y una porción posterior gruesa - Trichuris. Cuerpo largo y delgado, no presenta una división marcada - Capillaria. A continuación se describirán las principales características de los géneros de nematodos que parasitan a los rumiantes. En los géneros donde las especies pertenecientes exhiben características morfológicas muy específicas son mencionadas. 5.4.4. Claves para identificar géneros importantes de la familia Trichostrongylidae Género Trichostrongylus Nematodos pequeños y filiformes difíciles de observar a simple vista (♂ 4-6 mm y ♀ 5-7 mm) (Figura 5.11). No presentan una cavidad bucal o diente. Las papilas cervicales son muy pequeñas y difíciles de ver. No presenta modificaciones en la cutícula en la región anterior del cuerpo. El poro excretor anterior se observa en una muesca bien definida (Figura 5.12). En los machos, los lóbulos laterales de la bolsa copulatriz son largos. El lóbulo dorsal está posicionado de forma simétrica, generalmente reducido o más corto que los lóbulos laterales. Las espículas son cortas, ligeramente desiguales en el largo, torcidas y tienen una terminación en forma de lengüeta. El extremo distal de estas aparenta una garra. Presenta gubernáculo en forma de bote (Figura 5.13). Las hembras tienen ubicada la vulva en la parte posterior del cuerpo. El sistema reproductor es didélfico (dos ovarios). El extremo de la cola de las hembras es corto y puntiagudo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 176 ~ Figura 5.11. Vista del cuerpo completo de un macho de la especie Trichostrongylus colubriformis. Figura 5.12. Extremo anterior de un macho de la especie Trichostrongylus colubriformis. No se observan de modificaciones en cutícula. La muesca del poro excretor en la porción anterior se observa definida (típica del género). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 177 ~ Figura 5.13. Extremo posterior de un macho de la especie Trichostrongylus colubriformis. Se observan las espículas, gubernáculo y parte de la bolsa copulatriz. Género Haemonchus Nematodos fácilmente visibles a simple vista (♂ 13-20 mm y ♀ 18-32 mm). Presentan una cavidad bucal pequeña la cual contiene un diente o lanceta (Figura 5.14). Presenta papilas cervicales. En los machos, los lóbulos laterales de la bolsa copulatriz son largos. El rayo dorsal está posicionado de forma asimétrica. Las espículas tienen una terminación en forma de lengüeta. Presenta gubernáculo (Figura 5.15). En las hembras, los ovarios se encuentran en espiral alrededor del intestino (Figura 5.16). La vulva puede encontrarse expuesta o cubierta por un proceso lingüiforme (solapa) el cual puede presentarse en diferentes tamaños o estar ausente. La vulva se encuentra ubicada en la parte posterior del cuerpo (Figura 5.17). El sistema reproductor es didélfico. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 178 ~ Figura 5.14. Extremo anterior de un macho de la especie Haemonchus contortus. Se observa la cavidad bucal pequeña y la presencia de un diente en el interior de esta. Figura 5.15. Extremo posterior de un macho de la especie Haemonchus contortus. Se observan las espículas, gubernáculo, lóbulo lateral y rayo dorsal característico. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 179 ~ Figura 5.16. Extremo posterior de una hembra de la especie Haemonchus contortus. Se observan los ovarios alrededor del intestino. Figura 5.17. Extremo posterior de hembras de la especie Haemonchus contortus. Se observan ejemplos de la configuración de la solapa que puede estar presente o ausente en la región de la vulva. Género Cooperia Nematodos difíciles de observar a simple vista (♂ 4-7 mm y ♀ 5-7 mm). Su cuerpo es pequeño, filiforme y presentan una vesícula cefálica con estrías transversales (Figura 5.18). No presentan una cavidad bucal o diente. Las papilas cervicales son muy pequeñas difíciles de ver. En los machos, los lóbulos laterales de la bolsa copulatriz y el lóbulo dorsal pueden tener el mismo largo o estar reducido. Los rayos ventrales están ampliamente separados. El rayo dorsal tiene forma de lira. Las espículas son cortas y gruesascon estrías en la mayoría de los casos. No presenta gubernáculo (Figura 5.19). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 180 ~ Las hembras tiene la vulva ubicada en la parte posterior del cuerpo. El sistema reproductor es didelfico. El extremo de la cola de las hembras es puntiagudo. Figura 5.18. Extremo anterior de un macho de la especie Cooperia curticei. Se observa vesícula cefálica característica del género. Figura 5.19. Extremo posterior de un macho de la especie Cooperia curticei. Se observan las espículas con estrías y la ausencia de gubernáculo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 181 ~ Género Nematodirus Nematodos no visibles a simple vista (♂ 8-19 mm y ♀ 12-29 mm). La parte externa de la cavidad bucal está rodeada de una reducida corona. Presenta una vesícula cefálica larga semejante a la del género Cooperia. La región anterior posee estrías transversales prominentes (Figura 5.20). En los machos, los lóbulos laterales de la bolsa copulatriz son largos y el lóbulo dorsal esta reducido. Los rayos ventrales están cercanos. Los rayos laterales tienen un mismo tallo, con una separación antero lateral de los otros. El rayo dorsal está separado de la base sin tallo. Las espículas son largas y filiformes; el extremo distal de las espículas se une y están ornamentadas (diferenciación entre especies) (Figura 5.21). No presenta gubernáculo. Las hembras tienen la vulva ubicada en el tercio posterior del cuerpo. El sistema reproductor es didélfico con dos úteros funcionales. El extremo final de la cola de las hembras es fina o presenta una espina. Figura 5.20. Representación esquemática del extremo anterior de un nematodo del género Nematodirus. La vesícula cefálica es similar a Cooperia. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 182 ~ Figura 5.21. Representación esquemática del extremo terminal de las espículas en las diferentes especies de Nematodirus. Género Ostertagia Nematodos con cuerpo filiforme difíciles de ver a simple vista (♂ 6-8 mm y ♀ 7-12 mm). La boca es pequeña y el esófago es relativamente corto. En la cabeza se observa una vesícula cefálica poco desarrollada. Poseen papilas cervicales (semejantes a Haemonchus) que se encuentran antes o en la mitad del largo del esófago. En los machos, el rayo y lóbulo dorsal no están muy reducidos; el rayo dorsal se bifurca en dos ramas cortas que terminan con tres protuberancias cada una. Los rayos de la bolsa copulatriz tienen un arreglo de tipo 2-1-2. La punta de los rayos ventrales están juntos, el rayo antero lateral está separado, los rayos medio y posterior lateral está juntos. Las espículas son cortas y presentan dos ramas delgadas; una o ambas tienen un gancho o lengüeta en el extremo distal. Presenta gubernáculo. Presentan una membrana bursal accesoria modificada (órgano de Sjöberg) (Figura 5.22). Posee papilas prebursales. Las hembras tienen la vulva entre la quinta y sexta parte del cuerpo. En la mayoría de las especies la vulva está cubierta por una prolongación cuticular que se extiende alrededor del cuerpo (360º). La solapa puede estar modificada o ausente. Presentan estructuras membranosas delgadas asociadas a la vulva. El extremo final de la cola es pequeño y puntiagudo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 183 ~ Figura 5.22. Representación esquemática del extremo posterior de un macho del género Ostertagia. Se observa la membrana bursal accesoria y la presencia del órgano sensorial de Sjöberg. Arreglo 2-1-2 de los rayos que conforman la bolsa copulatriz. Género Teladorsagia Nematodos con cuerpo filiforme difíciles de ver a simple vista (♂ 7-8.5 mm y ♀ 9-12 mm). Poseen papilas cervicales (semejantes a Haemonchus) que se encuentran alrededor de la mitad del esófago. En los machos, la bolsa copulatriz se asemeja a la de Ostertagia pero el rayo del lóbulo dorsal es más largo y bifurcado en forma de “V”. Cada rama en su último tercio tiene una rama más pequeña y termina bifurcada en dos ramas desiguales. Los rayos de la bolsa copulatriz tienen un arreglo de tipo 2-2-1. La punta de los rayos ventrales están juntos, el rayo antero lateral y medio lateral están juntos y el rayo posterior lateral está separado. Las espículas son largas y delgadas. Cada espícula tiene un tallo principal y dos ramas puntiagudas. Presentan una membrana bursal accesoria simple modificada (órgano de Sjöberg) (Figura 5.23). Presenta gubernáculo y no posee papilas prebursales. Las hembras tienen la vulva cubierta con una solapa alrededor del cuerpo, la cual nunca es tan extensa como las hembras de Ostertagia (máximo 210º). La solapa puede estar modificada o ausente. No presentan estructuras membranosas asociadas a la vulva. En la mayoría de las especies la vulva está cubierta por una prolongación cuticular. Es sistema reproductor es didélfico. El extremo final de la cola es puntiagudo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 184 ~ Figura 5.23. Representación esquemática del extremo posterior de un macho del género Teladorsagia. Se observa la membrana bursal accesoria y la presencia del órgano sensorial de Sjöberg. Arreglo 2-2-1 de los rayos que conforman la bolsa copulatriz. 5.4.5. Claves para identificar géneros importantes de la familia Strongylididae Género Strongyloides A diferencia del resto de los nematodos gastrointestinales, solo las hembras de este género son parásitos de los animales. Son nematodos difíciles de observar a simple vista (♀ 3.5-6 mm). Su cuerpo es pequeño y delgado. El esófago es largo y filiforme. La vulva se encuentra ubicada en la mitad posterior del cuerpo. El sistema reproductor es didélfico. El extremo de la cola es corto y con punta redondeada (Figura 5.24). En la fase de vida libre, se presentan hembras y machos. Su tamaño es pequeño comparado con la fase parásita. Poseen esófago rhabditiforme. La cola de los machos es corta. Presentan papilas pre y post cloacal. Las espículas son cortas. Presenta gubernáculo. La vulva está ubicada cerca de la mitad del cuerpo. Presentan pocos huevos, embrionados cuando se eyectan (Figura 5.25). Figura 5.24. Representación esquemática de una hembra parásita de Strongyloides papillosus. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 185 ~ Figura 5.25. Nematodos adultos de vida libre de Strongyloides papillosus: hembra (A), macho de vida libre (B) y detalle de las espículas (C). 5.4.6. Claves para identificar géneros importantes de la familia Trichuridae Género Trichuris Son nematodos que pueden ser observados a simple vista (♂ 50-80 mm y ♀ 50-70 mm). Gran parte del largo anterior del cuerpo es delgado y el extremo posterior es grueso y corto (forma de látigo). Presentan una cavidad bucal simple. Posee una banda lateral al esófago que termina cerca del extremo posterior del cuerpo. El esófago es largo con una sola columna de 40 a 200 estichocitos. Los machos no poseen bolsa copulatriz. Presentan una sola espícula larga y delgada. Poseen una vaina (prepucio) que puede ser lisa o tener pequeñas espinas (Figura 5.26). Las hembras presentan una vulva en la región cercana a la unión entre la parte anterior delgada y la posterior gruesa del cuerpo (Figura 5.27). El sistema reproductor es monodélfico. La cola de las hembras es corta y redondeada. Figura 5.26. Extremo posterior de un macho de la especieTrichuris ovis. Se observan la espícula y la vaina de la espícula. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 186 ~ Figura 5.27. Apertura de la vulva de una hembra de la especie Trichuris ovis. Se observan las gruesas paredes que componen la vagina. No presenta solapas o apéndices. Género Capillaria Nematodos difíciles de observar a simple vista (♂ 11-13 mm y ♀ 18-25 mm). Tienen el cuerpo delgado o filamentoso, sin una evidente diferencia entre la región anterior y posterior del cuerpo. El esófago es largo extendiéndose hasta casi la mitad del cuerpo. Posee de 1 a 3 columnas de 20 a 60 estichocitos. Los machos poseen una rudimentaria bolsa copulatriz. Presentan una sola espícula larga y delgada. Posee una vaina espicular lisa. Las hembras presentan una vulva en la región cercana al extremo distal del esófago. El sistema reproductor es monodélfico. La cola de las hembras es corta y redondeada. 5.4.7. Claves para identificar géneros importantes de la familia Chabertiidae Género Chabertia Nematodos fáciles de observar a simple vista (♂ 14-18 mm y ♀ 14-26 mm). Presentan una cavidad bucal muy amplia y globular cuya abertura está orientada ventralmente. No posee dientes. Presenta una corona alrededor de la boca pero está poco desarrollada. (Figura 5.28a). Los machos poseen una bolsa copulatriz bien desarrollada. Los rayos ventrales están cercanos, los rayos laterales tienen una base o tronco común. Los rayos antero laterales divergen de los otros dos laterales. El rayo dorsal es característico de la familia (rayo dorsal bifurcado con dos ramas en cada bifurcación) (Figura 5.28b). Las espículas son largas. Presenta gubernáculo en forma de pera. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 187 ~ En las hembras, la vulva se encuentra ubicada en el extremo posterior del cuerpo cerca del ano. El sistema reproductor es monodélfico. Figura 5.28. Representación esquemática del extremo anterior de Chabertia ovina. Se observa la cavidad bucal amplia y la corona alrededor de la boca (A). El rayo dorsal característico con ramas bifurcadas (B). Género Oesophagostomum Nematodos fácilmente visibles a simple vista (♂ 12-16 mm y ♀ 15-20 mm). Presentan una corona desarrollada alrededor de la cavidad bucal. Presenta una vesícula cefálica evidente (Figura 5.29). Posee alas en los laterales del cuerpo y pueden presentar un anillo transversal a la altura del primer tercio del esófago. Presentan papilas cervicales (Figura 5.30). Las modificaciones entre las especies pueden observarse en la región anterior (4.31). En los machos, los lóbulos de la bolsa copulatriz son del mismo tamaño. El rayo dorsal es característico de la familia (rayo dorsal bifurcado con dos ramas en cada bifurcación). Los rayos ventrales están cercanos y tienen una base común, los rayos laterales tienen una base común también. Los rayos antero laterales son cortos y separados de los demás. Las espículas son largas y presentan una membrana a en uno de los lados a manera de ala. Presenta gubernáculo (Figura 5.32). En las hembras, la vulva se encuentra ubicada en el extremo posterior del cuerpo cerca del ano. El sistema reproductor es monodélfico. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 188 ~ Figura 5.29. Extremo anterior de un macho de la especie Oesophagostomum columbianum. Se observan los detalles de la región cefálica (presencia ce corona, vesícula y alas cefálicas). Figura 5.30. Extremo anterior de un macho de la especie Oesophagostomum columbianum. Se observan las diferentes modificaciones en la cutícula. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 189 ~ Figura 5.31. Representación esquemática del extremo anterior de dos especies del género Oesophagostomum: O. venulosum (A) y O. radiatum (B). Figura 5.32. Extremo posterior de un macho de la especie Oesophagostomum columbianum. Se observan espículas largas con alas membranosas y rayo dorsal característico de la familia Chabertiidae (ramas bifurcadas) (A). Se observan lóbulos característicos de O. columbianum (B). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 190 ~ 5.4.8. Claves para identificar géneros importantes de la familia Oxyuridae Género Skrjabinema Nematodos difíciles de ver a simple vista (♂ 2.3-3.7 mm y ♀ 5-10 mm). Presentan cavidad bucal con tres lóbulos labiales. El esófago está compuesto de una región anterior larga cilíndrica y una región en forma de bulbo característico (Figura 5.33). Los machos tienen una gran ala cuticular caudal soportada por un par de proyecciones pre-anales que tienen numerosas papilas pequeñas. Poseen una sola espícula corta. Presenta gubernáculo. En las hembras, la vulva se encuentra ubicada en la parte anterior del cuerpo. Figura 5.33. Extremo anterior de una hembra de la especie Skrjabinema ovis. 5.4.9. Claves para identificar géneros importantes de la familia Ascarididae Género Toxocara Nematodos fáciles de observar a simple vista (♂ 150-260 mm y ♀ 220-300 mm). Poseen alas cefálicas, en algunas especies pueden estar reducidas a prolongaciones laterales cortas. Presentan cavidad bucal con tres lóbulos labiales con finas crestas (Figura 5.34). El esófago está compuesto de una región anterior larga cilíndrica unido a un pequeño bulbo. Los machos tienen un apéndice en la cola. Las espículas son casi idénticas en forma de alas y no poseen gubernáculo. En las hembras, la vulva se encuentra ubicada en el cuarto anterior del cuerpo. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 191 ~ Figura 5.34. Representación esquemática del extremo anterior de Toxocara vitulorum. Se observa los labios y alas cefálicas reducidas (A). Vista superior de los tres labios característicos del género Toxocara (B). 5.4.10. Claves para identificar géneros importantes de la familia Ancylostomatidae Género Bunostomum Nematodos difíciles de ver a simple vista (♂ 10-17 mm y ♀ 16-26 mm). El extremo final anterior se curva dorsalmente. Presentan una cavidad bucal amplia la cual alberga un gran diente dorsal con dos dientes subventrales. Posee dos placas ventrales semilunares (Figura 5.35a). En los machos, los lóbulos de la bolsa son de tamaños similares. El rayo dorsal es asimétrico. Los rayos externo-dorsales emergen a diferentes niveles de la misma base. Los rayos ventral y lateral comparten la misma base. Los rayos ventrales están muy próximos entre sí. El rayo antero lateral diverge de los otros dos rayos laterales. Las espículas son delgadas, torcidas y relativamente cortas en B. trigonocephalum (Figura 5.35b). En B. phlebotomum son largas y filiformes. En las hembras, la vulva se encuentra ubicada cerca de la cola o puede estar cerca de la mitad del cuerpo (B. trigonocephalum y B. phlebotomum, respectivamente). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 192 ~ Figura 5.35. Representación esquemática del extremo anterior y posterior de un macho Bunostomum. Se observan dientes y placa semilunar presentes en la cavidad bucal (A). Bolsa copulatriz de Bunostomum trigonocephalum (espículas cortas) con rayo dorsal asimétrico (B). Género Gaigeria Nematodos difíciles de ver a simple vista (♂ 20 mm y ♀ 30 mm). El extremo final anterior se curva dorsalmente.Presentan una cavidad bucal amplia en forma de embudo, la cual alberga un diente dorsal corto con dos dientes subventrales. Posee dos placas ventrales semilunares (Figura 5.36a). En los machos, los lóbulos laterales de la bolsa copulatriz son cortos y el lóbulo dorsal es muy grande (Figura 5.36b). Los rayos ventrales comparten una misma base. Los rayos laterales tienen una misma base. El rayo antero lateral es corto y está separado del resto. Las espículas son delgadas y cortas con el extremo distal en forma de gancho. En las hembras, la vulva se encuentra ubicada cerca de la mitad del cuerpo. Figura 5.36. Representación esquemática del extremo anterior y posterior del macho de Gaigeria pachyscelis. Se observan dientes y placa semilunar en la cavidad bucal (A). Bolsa copulatriz característica con el rayo y lóbulo dorsal muy desarrollados (B). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 193 ~ 5.4.11. Claves para identificar géneros importantes de la familia Dictyocaulidae Género Dictyocaulus Nematodos fáciles de ver a simple vista (♂ 30-80 mm y ♀ 50-100 mm). Presentan una cavidad bucal pequeña con paredes quitinizadas. En la base de la cavidad bucal se observa un solo diente. En los machos, el rayo dorsal de la bolsa copulatriz se divide en dos desde la base y en cada bifurcación, el extremo distal presenta de 2 a 3 pequeñas ramificaciones (Figura 5.37). Los rayos externo dorsales están separados del rayo dorsal. Los rayos ventrales están próximos entre sí, mientras que los rayos antero laterales están separados. Los rayos medio lateral y postero lateral están fusionados por completo o en parte. Las espículas son cortas de textura porosa con alas laterales (D. filaria) o con una a dos ramificaciones (D. viviparus). Presenta gubernáculo. En las hembras, la vulva se encuentra ubicada en la mitad del cuerpo. Figura 5.37. Representación esquemática del extremo posterior de un macho Dictyocaulus filaria. Se observan espículas cortas de textura porosa con alas laterales características de D. filaria. El rayo dorsal es bifurcado desde la base. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 194 ~ 5.4.12. Claves para identificar géneros importantes de la familia Protostrongylidae Género Protostrongylus Nematodos fáciles de ver a simple vista (♂ 16-46 mm y ♀ 25-65 mm). No presentan cavidad bucal. En los machos, los lóbulos de la bolsa copulatriz pueden o no estar claramente definidos. El rayo antero lateral está separado de los otros rayos laterales. El rayo dorsal tiene seis pequeñas papilas. Presenta una estructura llamada Telamon que está formada por placas simples y arcos. Presentan un gubernáculo compuesto (capitulum, corpus y crura). Las espículas con cortas (Figura 5.38). En las hembras poseen una provagina. Figura 5.38. Representación esquemática del extremo posterior de un macho Protostrongylus rufescens. Se observan espículas con alas laterales y parte del gubernáculo compuesto (capitulum y crura; el corpus se encuentra oculto entre las alas de las espículas). El telamón se observa en el centro de la bolsa copulatriz. Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 195 ~ Género Muellerius Nematodos difíciles de ver a simple vista (♂ 11-14 mm y ♀ 19-23 mm). No presentan cavidad bucal. En los machos, los lóbulos de la bolsa copulatriz se encuentran reducidos en tamaño. Los rayos ventrales y laterales son cortos. El rayo dorsal está muy desarrollado y posee tres ramas. Presenta Telamon formado por placas basales simples transversales. Presentan un gubernáculo simple. Las espículas son cortas y están separadas solo hasta el primer tercio o hasta la mitad de su largo (Figura 5.39). Las hembras poseen una provagina pobremente desarrollada. Figura 5.39. Representación esquemática del extremo posterior de un macho Muellerius capillaris. Se observan espículas con alas laterales, el telamón simple (A) y el rayo dorsal desarrollado con tres ramas (B). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 196 ~ Figura 5.40. Clasificación taxonómica de los nematodos parásitos que integran la clase Nematoda. Los géneros en negritas son parásitos de los rumiantes (Modificado de: Gibbons et al., 1996). Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 197 ~ 5.5. TÉCNICA PARA MEDIR LA LONGITUD Y CONTABILIZAR EL NÚMERO DE HUEVOS IN UTERO DE HEMBRAS DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES Fundamento Los parásitos de diferentes especies tienen una longitud característica que es acorde a su especie. Lo mismo ocurre con la cantidad de huevos que una hembra adulta puede tener en su útero (fecundidad). De esta manera se tienen especies de parásitos de tamaño considerable (macroscópicas) y especies de menor talla. Así mismo, se tienen especies en las que las hembras tienen gran cantidad de huevos in utero (cualidad por la cual se les considera de elevado potencial biótico o elevada fecundidad) y especies que tienen cantidades medias o bajas de huevos in utero (de bajo potencial biótico o baja fecundidad). Sin embargo, existen factores del animal y del medio ambiente que pueden ocasionar la reducción del tamaño de los especímenes de una especie y que incluso pueden reducir la cantidad de huevos in utero con respecto a los parásitos que no son expuestos a estos factores (Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2010). La cantidad de huevos dentro del útero de una hembra se evalúa contabilizando a través de la observación directa del espécimen al microscopio. Por otro lado, existen especies de parásitos que pueden contener varios cientos de huevos in utero. En estos casos se requiere de romper el espécimen para suspenderlo en una cantidad conocida de agua y contar huevos en alícuotas (10% del volumen). Materiales Viales Eppendorf (capacidad de 1.5 ml). Portaobjetos. Pincel No. 2. Regla de medir (10 cm). Microscopio-estereoscópico. Microscopio compuesto. Métodos Para determinar la longitud. El espécimen se coloca sobre un portaobjetos y se procede a posicionar el espécimen (parásito) en línea recta con la ayuda de un pincel No. 2. Para que el espécimen se mantenga en línea recta se aplica una gota de agua al portaobjetos y se utiliza el pincel para manipular el verme. El portaobjetos se coloca sobre una regla de 10 cm y se posicionan en el microscopio estereoscópico. Se alinea el espécimen para comenzar exactamente sobre la línea de 0 cm y se registra la longitud total observada con aumento de 1.6x (Torres-Acosta, 1999). Para determinar la fecundidad de un nematodo gastrointestinal hembra. Se coloca cada hembra adulta (completa) dentro de un vial con 0.5 ml de agua. Cada una de las hembras se despedaza en el interior del vial con la ayuda de un pistilo de plástico (puede usarse la parte plástica del embolo de una jeringa de insulina sin la goma) para liberar los huevos del interior del cuerpo del parásito. La suspensión de parásito molido Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria ~ 198 ~ se complementa con 0.5 ml de agua y se homogeniza con un agitador vortex durante 10 segundos. Se toman 5 alícuotas de 20 µl y se cuenta el número de huevos con un microscopio compuesto utilizando un aumento de 100X. El número de huevos encontrado en las 5 alícuotas se multiplica por 10 para obtener el número total de huevos por
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