repeticoes e polimorfismos

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POLIMORFISMOS DE DNA E 
IDENTIFICAÇÃO HUMANA 
Objetivo 
 Comparar e contrastar diferentes tipos de sequencias 
polimórficas 
 Polimorfismos de fragmentos de repetição 
 short tandem repeat 
 sexo - locus amelogenese imperfeita 
 STR monitoramento de engrafment 
 SNP 
 DNA mitocondrial 
Polimorfismo 
 Polimorfismo de DNA - sequência diferente 
quando comparada a um referencial 
• Presente em 1–2% da população. 
• Polimorfismos podem ser de única base (SNP) ou 
de milhares de bases 
 Polimorfismos podem ou não ter efeito fenotípico. 
Sequências polimórficas de DNA 
 Polimorfismos são encontrados em todo o 
genoma. 
 Se a localização ou a sequência polimórfica é 
conhecida  serve como um marcador de uma 
região genética ou localidade gênica 
 Cada marcador polimórfico possui diferentes 
versões ou alelos. 
 
 
Tipos de seqüências de DNA 
polimórficas 
 RFLP: Polimorfismos de fragmento de 
repetição 
 VNTR: variação em número de repetições em 
tandem (8 to >50 base pairs) 
 STR: repetições em tandem curtas (1–8 base 
pairs) 
 SNP: Polimorfismo de repetição única 
RFLP 
 Os tamanhos dos fragmentos de restrição são 
alterados por uma mudança na sítio de 
reconhecimento da enzima de restrição 
GTCCAGTCTAGC GAATTC GTGGCAAAGGCT 
CAGGTCAGATCG CTTAAG CACCGTTTCCGA 
GTCCAGTCTAGC GAA A TC CG TGGC C A AGGCT 
CAGGTCAGATCG CTT T AG GC ACCG G T TCCGA 
Point mutations 
GTCCAGTCTAGC GA AGCGA ATTC GTGGC AAAGGCT 
CAGGTCAGATCG CT TCGCT TAAG CACCG TTTCCGA 
Insertion (duplication) 
Fragment insertion (or deletion) 
GTTCTAGC GAATTC GTGGC AAA GGCT GAATTC GTGG 
TCAGATCG CTTAAG CACCG TTT CCGA CTTAAG CACC 
GTTCTAGC GAATTC GTGGC AAAAAA GGCT GAATTC GTGG 
TCAGATCG CTTAAG CACCG TTTTT T CCGA CTTAAG CACC 
RFLP 
A presença de RFLP é deduzida pelas alterações 
nos tamanhos de fragmentos. 
 
1 2
A B C
 + -
AGATCT ATATCT
TCTAGA TATAGA
1 2 Size Number
+ + A,B,C 3
+ - A, (B+C) 2
- + (A+B), C 2
- - (A+B+C) 1
+/+ +/- -/+ -/-
Polymorphism 
Restriction site 
Gel band 
pattern 
RFLP 
A presença de RFLP é deduzida pelas alterações 
nos tamanhos de fragmentos. 
 
Probe 
Southern blot 
 band patterns 
1 2 
A B C 
1 2 Fragments visualized 
+ + B 
+ - (B+C) 
- + (A+B) 
- - (A+B+C) 
Genotype Fragments visualized 
I ++/+- B, (B+C) 
II +-/-+ (A+B), (B+C) 
III ++/-- B,(A+B+C) 
+/+ +/- -/+ -/- 
I II III 
RFLP 
 Genótipos RFLP são herdados 
 Para cada locus, cada alelos é herdado de um dos 
genitores 
 
 Father Mother
 Locus Locus
 1 2 1 2
Parents
Child
 Locus
 1 2
Southern blot 
 band patterns 
Teste de Paternidade por RFLP 
 Como é herdado os alelos parentais 
 
 AF 1 
 
 AF2 Mother 
 Locus Locus Locus 
 1 2 1 2 1 2 
 
 Child Locus 
 1 2 
Evidence Testing by RFLP 
 Qual suspeito estava na cena do crime (S1 ou S2)? 
 (V = vitima, E = evidencia , M = Marcador de peso 
molecular) 
 
M S1 S2 V E M 
 
M S1 S2 V E M 
 
M S1 S2 V E M 
 Locus 1 Locus 2 Locus 3 
Short Tandem Repeat Polymorphisms 
(STR) 
 STR são repetições de nucleotídeos em sequencia. 
 AAAAAA… - mononucleotideo 
 ATATAT… - dinucleotide o 
 TAGTAGTAG… - trinucleotideo 
 TAGTTAGTTAGT… - tetranucleotideo 
 TAGGCTAGGCTAGGC… - pentanucleotideo 
 Diferentes alelos contem diferentes números de 
repetições. 
 TTCTTCTTCTTC – 4 repetições 
 TTCTTCTTCTTCTTC – 5 repetições 
STR 
 STR - Alelos podem ser analisados por 
tamanho do fragmento (Southern blot). 
 
GTTCTAGC GGCC GTGGC AGCTAGCTAGCTAGCT GCTG GGCC GTGG 
CAAGATCG CCGG CACCG TCGATCGATCGATCGA CGAC CCGG CACC 
One repeat unit 
tandem repeat 
GTTCTAGC GGCC GTGGC AGCTAGCTAGCT GCTG GGCC GTGG 
CAAGATCG CCGG CACCG TCGATCGATCGA CGAC CCGG CACC 
Restriction site 
Allele 1 
Allele 2 
 Allele 
M 1 2 M 
STR 
 STR - alelos podem ser analisados por 
tamanho do amplicon (PCR). 
 
....TCATTCATT CATT CATT CATTCATT CAT....
....AGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTA....
....TCAT TCATT CATTCATT CATT CATTCATTCAT....
....AGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTA....
Allele 1
Allele 2
PCR products:
Allele 1 187 bp (7 repeats)
Allele 2 191 bp (8 repeats)
7/8
(Genotype) 
STR 
 Marcadores alélicos representam todos os 
alelos observados numa população 
 
(Allelic ladder) 
11 repeats 
 
 
 
 
 
 
5 repeats 
Genotype: 7,9 Genotype: 6,8 
STR 
 Multiplos loci podem ser genotipados ao 
mesmo tempo na mesmo reação usando 
Multiplex PCR. 
 Marcadores alélicos não devem ter 
sobreposição na mesma reação 
STR - Multiplex PCR 
FGA 
 
 
 
TPOX 
 
 
 
 
 
D8S1179 
 
 
 
 
 
 
 
vWA 
PentaE 
 
 
 
D18S51 
 
 
 
D2S11 
 
 
 
THO1 
 
 
 
 
D3S1358 
 
Amelogenin Locus HUMAMEL 
 O locus da amelogenina não é um STR 
 HUMAMEL gene codifica para a proteína 
amelogenin-like. 
 Xp22.1–22.3 e no Y. 
 
X alelo = 212 bp 
Y alelo = 218 bp 
 
Feminino (X, X) - homozigota 
Homem (X, Y) - heterozigoto 
 
Análise de STR por PCR 
 STR genótipos são analisados usando gel ou 
eletrofore em gel capilar 
Genotype: 7,9 
11 repeats 
 
 
 
 
 
 
5 repeats 
11 repeats 5 repeats 
(Allelic ladder) 
STR-PCR 
 STR genótipos são herdados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Sendo cada alelo herdado de cada um dos genitores 
Child’s alleles 
Mother’s alleles 
Father’s alleles 
Teste de Paternidade STR por 
PCR 
Locus Child Mother 1 2
D3S1358 16/17 16 17 17
vWA 14/18 16/18 14/15 16/17
FGA 21/24 20/21 24 24
TH01 6 6/9.3 6/9 6/7
TPOX 10/11 10/11 8/11 8/9
CSF1PO 11/12 12 11 11/13
D5S818 11/13 10/11 13 9/13
D13S317 9/12 9 12/13 11/12
 Qual o genótipo presente na criança é de que 
suposto genótipo paterno ? 
 
Análise de Evidencia por STR-
PCR 
 Qual suspeito —S1 ou S2— estava presente na cena do 
crime? 
 (V = vitima, E = evidencia, AL = marcador alélico) 
 
 
AL S1 S2 V E M 
 
AL S1 S2 V E M 
 
AL S1 S2 V E M 
Locus 1 Locus 2 Locus 3 
Polomorfismo Y-STR 
 O cromossomo Y é herdado em bloco sem 
que ocorra recombinação. 
 STR no cromossomo Y são herdados do pai 
como uma haplótip0 
 Y haplótipos são usados como exclusão da 
linhagem parental 
 
 
Teste de quimerismo usando STR 
 Transplante alogênico de BM são monitorados 
por STR. 
 
Transplante 
 autólogo 
 
 
Transplante 
alogênico 
Receptor recebe 
seu próprio 
grupo de células 
 
 
Receptor recebe 
de outros 
doadores 
O Receptor pos BM é uma quimera 
Teste de quimerismo usando STR 
 Existem 2 partes neste tipo de teste pre- transplante 
análise informática e pos-transplante análise de enxerto 
Antes do transplante 
Donor Recipient 
Depois do transplante 
 Complete (Full) Mixed Graft failureTeste de quimerismo usando STR: 
Análise informativa 
 STR são “ escaneados” para encontrar marcadores 
informativos (alelo do doador diferente do alelo do 
receptor) 
 Quais loci são informativos? 
Teste de quimerismo usando STR: 
Análise informativa 
 Diferente grau de “ informatividade “. 
 Marcadores do doador diferente do receptor. 
Donor 
Recipient 
Recipient 
Donor 
Stutter 
Exemplos de loci informativos 
(Type 5) [Thiede et al., Leukemia 18:248 
(2004)] 
Donor 
Recipient 
Exemplos de loci não 
informativos (Type 1) 
vWA TH01 Amel TPOX CSF1PO 
Teste de quimerismo usando STR: 
Análise informativa 
 qual loci é informativo? 
Análise do enxerto 
 
 
 
 
 
 
 A(R) 
 A(D) 
A(D) A(R) 
A(R) + A(D) 
Polimorfismo de um único 
nucleotídeo (SNP) 
 Nucleotídeos únicos diferem no genoma. 
 Um SNP para cada 1,250 base pairs DNA 
humano 
 SNPs são detectados por sequenciamento, 
análise de curva de melt. 
 99% sem efeito biológico; 
60,000 dentro do gene. 
 
5′ AGTCTG 5′ AG(T/A)CTG 5′ AGACTG 
T/T T/A A/A 
Detecção de SNP por sequenciamento 
 
haplotype
~10,000 bp
Haplótipos SNP 
SNPs são herdados de forma de haplótipos. 
 
Applicações na análise de SNP 
 Mapeamento gênico 
 Identificação humana 
 Análise de quimerismo 
 HapMap 
 
HV 1
(342 bp)
HV 2
(268 bp)
Mitochondrial genome
16, 600 bp
PL
PH1
PH2
Polimorfismo de DNA - 
Mitocondria 
 análise de diferentes sequencias nas Sequence 
differences in the regiões hipervariáveis (HV) 
no genoma mitocondrial 
 
Polimorfismos no DNA 
mitocondrial 
 Herança materna. 
 Média de 8.5 bases de diferenças no HV em 
indivíduos não aparentados. 
 Irmãos com mesma mãe –mesma sequencia. 
 Exclusão legal de um indivíduo ou linhagem 
materna. 
Summary 
 Four types of polymorphisms are used for a 
variety of purposes in the laboratory: RFLP, 
VNTR, STR, and SNP. 
 Polymorphisms are used for human 
identification and parentage testing. 
 Y-STR haplotypes are paternally inherited. 
 Polymorphisms are used to measure 
engraftment after allogeneic bone marrow 
transplants. 
Summary 
 Single-nucleotide polymorphisms are 
detected by sequencing, melt curve analysis, 
or other methods. 
 SNPs can be used for the same applications 
as other polymorphisms. 
 Mitochondrial DNA typing is performed by 
sequencing the mitochondrial HV regions. 
 Mitochondrial types are maternally inherited.