Clonagem

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Professor: Christian Reis 
Disciplina: Biologia Molecular 
CLONAGEM GÊNICA 
O QUE É UM DNA RECOMBINANTE? 
- É uma molécula de DNA formada pela 
ligação de duas moléculas de origens 
diferentes (Ex. DNA humano ligado a um 
plasmídio) 
O QUE É NECESSÁRIO PARA FAZER UMA 
MOLÉCULA RECOMBINANTE? 
1) VETOR 
2) ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E LIGAÇÃO 
3) INSERTO DE DNA 
 
VETORES: MOLÉCULAS DE 
TRANSPORTE 
TIPOS DE VETORES 
 
 
Vetores Hospedeiros Utilização 
Plasmídeos 
Cosmídeos 
Virus 
 
Bactérias / leveduras 
clonagem 
Terapia gênica Células eucarióticas 
Bacteriófagos 
Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA de 
4.000pb em média. 
Bacteriófagos: são usados para clonar fragmentos de DNA de 
até 23.000 pares de bases. 
Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem 
características do bacteriófago associadas à do plasmídeo 
pBR322, e são utilizadas para a clonagem de segmentos de 
DNA por volta de 40.000pb . 
Chromosomos artificiais para bactérias (BAC) e leveduras 
(YACs): podem ser usados para clonagem de fragmentos de 
DNA até 200.000pb (BACs) e 400.00pb(YACs) 
TIPOS DE VETORES 
PLASMÍDEO 
• Plasmídeos são moléculas de DNA circular, 
extracromossômico, que ocorrem naturalmente em 
bactérias e algumas leveduras. 
Plasmídeo 
pUC 18 
QUAIS SÃO AS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DE UM 
PLASMÍDEO? 
• Replicação autônoma 
• Marcador de seleção (antibiótico) 
• Sítio múltiplo de clonagem (MCS- Multiple cloning 
sites). 
CLONAGEM GÊNICA 
CLONAGEM 
• Produção de cópias idênticas de uma molécula 
de DNA. 
O que é necessário para clonagem gênica? 
4- Ligase 
1- Vetor 
2-Inserto 
(fragmento) 
de DNA 
3- Enzima 
de Restrição 
CLONAGEM 
1- Vetor 
2- Gene humano 
3- Enzima restrição- HpyCH4IV 
4- DNA ligase- T4 DNA ligase 
1 2 
3 3 
4 
LIGAÇÃO 
DN
A 
RE
CO
M
BI
N
AN
TE
 
TRANSFORMAÇÃO 
• Introdução do 
Plasmídio 
Recombinante na 
bactéria 
– Choque térmico ou 
eletroporação. 
 
 
TRANSFORMAÇÃO QUÍMICA (CaCl2) 
TRANSFORMAÇÃO QUÍMICA (CaCl2) 
ELETROPORAÇÃO 
SELEÇÃO DE CLONES 
• Segue-se seleção 
– Cultivo em meio seletivo = meio com antibiótico. 
– Somente vão crescer as bactérias com o 
plasmídio. 
SEMEIO EM MEIO SÓLIDO 
Extração de DNA 
plasmidial 
Digestão com 
enzimas restrição 
CONFIRMAÇÃO CLONAGEM 
Crescimento clones 
em meio liquído + 
antibiótico 
Sequenciamento de DNA 
Indução de 
Proteínas – Uso IPTG 
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS 
Crescimento clones 
em meio liquído + 
antibiótico 
QUAL A VANTAGEM DE UMA 
MOLÉCULA RECOMBINANTE? 
QUANTIDADES DE DNA, RNA E PROTEÍNA PRODUZIDOS!!! 
QUAL A VANTAGEM DE UMA 
MOLÉCULA RECOMBINANTE? 
Há muito pouco tempo atrás, mais de 50 porcos eram 
sacrificados para que um diabético pudesse sobreviver por 
um ano. Na década de 70, a OMS advertiu que em pouco 
tempo a insulina derivada de porcos não seria suficiente. 
Desde 1982 surgiu uma alternativa: a insulina humana 
produzida por engenharia genética. Hoje mais de 90% dos 
diabéticos são tratados com ela. É mais bem tolerada, causa 
menos efeitos colaterais, pode ser produzida em grande 
quantidade e não causa mais a morte dos porcos 
POR QUE CONSTRUIR UMA MOLÉCULA DE 
DNA RECOMBINANTE? 
• Sequenciamento de DNA; 
• Produção de transgênicos; 
• Produção de insumos para diagnóstico, como 
síntese proteínas recombinantes; 
• Produção de proteínas raras e vacinas para 
tratamento de doenças; 
• Criação de modelos animais; 
• Terapia gênica. 
 
 
APLICAÇÕES 
	Número do slide 1
	O QUE É UM DNA RECOMBINANTE?
	Número do slide 3
	O QUE É NECESSÁRIO PARA FAZER UMA MOLÉCULA RECOMBINANTE?
	Número do slide 5
	TIPOS DE VETORES
	Número do slide 7
	Número do slide 8
	Número do slide 9
	Número do slide 10
	Número do slide 11
	CLONAGEM
	O que é necessário para clonagem gênica?
	Número do slide 14
	Número do slide 15
	Número do slide 16
	TRANSFORMAÇÃO
	Número do slide 18
	Número do slide 19
	Número do slide 20
	SELEÇÃO DE CLONES
	Número do slide 22
	Número do slide 23
	Número do slide 24
	Número do slide 25
	Número do slide 26
	POR QUE CONSTRUIR UMA MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE?
	APLICAÇÕES