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Gabriela Montaguti Farinha de Oliveira Leishmaniose Visceral Canina: relato de caso alóctone em Curitiba - PR Curitiba/PR 2015 Gabriela Montaguti Farinha de Oliveira Leishmaniose Visceral Canina: relato de caso alóctone em Curitiba - PR Monografia apresentada como requisito para conclusão do Curso de Pós-Graduação, Especialização em Clínica Médica e Cirúrgica de Pequenos Animais, do Centro Estudos Superiores de Maceió da Fundação Educacional Jayme de Altavila, orientada pela Msc. Ana Laura D’Amico Fam. Curitiba/PR 2015 Gabriela Montaguti Farinha de Oliveira Leishmaniose Visceral Canina: relato de caso alóctone em Curitiba - PR Monografia apresentada como requisito para conclusão do Curso de Pós-Graduação, Especialização em Clínica Médica e Cirúrgica de Pequenos Animais, do Centro Estudos Superiores de Maceió da Fundação Educacional Jayme de Altavila, orientada pela M.Sc. Ana Laura D’Amico Fam. Curitiba/PR, 27 de fevereiro de 2015. __________________________________ Profª. M.Sc. Valéria Natasha Teixeira PUCPR __________________________________ Profª. M.Sc. Andrea Rodrigues Barros __________________________________ Prof. Dr. Leandro Lima Curitiba/PR 2015 Agradecimento Agradeço ao meu marido, Anderson, e aos colegas de trabalho, especialmente à Deborah, por todo apoio e compreensão durante a realização deste curso de especialização e do presente trabalho. Aos colegas médicos veterinários agradeço pela ajuda e orientação. À todos os meus clientes e pacientes, que são o motivo que me leva a buscar sempre mais o conhecimento. Aos proprietários da Nina, Franciana, Pedro e família, agradeço imensamente pela colaboração com a realização dos exames, retornos e todo o cuidado com a nossa paciente. À minha orientadora, Ana Laura, sou grata de coração por toda ajuda e orientação na conduta do trabalho. Resumo A Leishmaniose é uma importante zoonose no mundo todo. No Brasil, a doença é endêmica e vem aumentando a cada ano. É causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitida por mosquito vetor do gênero Lutzomyia. Os cães são os principais reservatórios e cumprem importante papel na epidemiologia da doença. Os sinais clínicos e alterações patológicas nos cães podem ser diversos. A maioria apresenta sinais inespecíficos como febre, perda de peso, apatia e anorexia. Anemia, lesões na pele, linfoadenomegalia e onicogrifose são outras alterações comuns. O diagnóstico da doença pode ser realizado por testes sorológicos, PCR e citologia de linfonodos ou medula óssea. Vários protocolos de tratamento são descritos para controle dos sinais clínicos e diminuição da infectividade, porem nenhum atinge a cura parasitológica. O tratamento dos cães não é recomendado pela Organização Mundial da Saúde ou pelo Conselho Federal de Medicina Veterinária devido à riscos de resistência dos parasitos aos medicamentos utilizados em humanos. No Brasil, a eutanásia de cães infectados vem sendo utilizada como forma de controle da doença, embora muito questionada. Diversas vacinas contra Leishmaniose estão em fase de desenvolvimento e apresentam resultados promissores. O objetivo do presente estudo foi realizar uma revisão literária sobre a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) e relatar um caso alóctone da doença no município de Curitiba, Paraná, Brasil, em um cão da raça Daschund, apresentando lesões cutâneas, anorexia e perda de peso, com histórico de viagem para Araguaína (TO). O animal foi diagnosticado por exame histopatológico de pele e tratado com imunoterapia com a vacina Leishmune® e Alopurinol. Houve remissão total dos sinais clínicos permanecendo apenas com alterações no hemograma. Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina, imunoterapia, tratamento, diagnóstico, imunoprofilaxia, Paraná. Lista de Figuras Figura 1 – Distribuição da Leishmaniose Visceral no mundo .................................... 13 Figura 2 – Distribuição de casos de LV por regiões brasileiras em 2008 .................. 14 Figura 3 – Forma promastigota ou flagelada da Leishmania .................................... 16 Figura 4 – Forma amastigota ou aflagelada da Leishmania ...................................... 16 Figura 5 – Fêmea de flebotomídeo adulto, engurgitada ............................................ 19 Figura 6 – Ciclo de vida da L. infantum ..................................................................... 22 Figura 7 – Sinais clínicos da Leishmaniose Canina .................................................. 26 Figura 8 – Diferentes padrões de lesões cutâneas na Leishmaniose Canina ........... 27 Figura 9 – Diagrama para conduta diagnóstica da Leishmaniose Canina ................ 31 Figura 10 – Interpretação de citologia ....................................................................... 34 Figura 11 – Cão, daschund, fêmea, 4 meses, de nome Nina diagnosticada com Demodiciose .............................................................................................................. 53 Figura 12 – Cão, daschund, fêmea, 10 meses, de nome Nina, diagnosticada com Leishmaniose, apresentando rarefação pilosa generalizada e baixo escore corporal .................................................................................................................................. 54 Figura 13 – Cão, daschund, fêmea, 10 meses, de nome Nina, diagnosticada com Leishmaniose, apresentando rarefação pilosa periocular e blefarite ......................... 62 Figura 14 – Citologia da medula óssea da paciente Nina, canina, fêmea, Daschund, mostrando macrófago contendo duas Leishmania spp. Intracitoplasmáticas e uma no espaço extracelular ................................................................................................... 68 Lista de Gráficos Gráfico 1 – Comparação da incidência dos sinais clínicos em três diferentes estudos e regiões.................................................................................................................... 29 Gráfico 2 – Valores do hematócrito da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção) ............................... 65 Gráfico 3 – Valores do leucograma da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção) ............................... 65 Gráfico 4 – Valores das plaquetas da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção) ............................... 66 Gráfico 5 – Valores das proteínas plasmáticas da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção) ........ 66 Lista de Quadros Quadro 1 – Espécies de leishmania existentes ......................................................... 16 Quadro 2 – Vetores da Leishmaniose Canina e sua distribuição .............................. 18 Quando 3 – Vantagens e desvantagens dos diferentes métodos diagnósticos de L. infantum em cães ..................................................................................................32 Quadro 4 – Técnicas sorológicas comumente usadas para diagnóstico da Leishmaniose ............................................................................................................ 36 Quadro 5 – Protocolos atuais para o tratamento da LVC .......................................... 39 Quadro 6 – Diferentes protocolos terapêuticos com o Antimoniato de Meglumina ................................................................................................................. 41 Lista de Tabelas Tabela 1 – Valores obtidos no hemograma da paciente Nina, canina, fêmea, 10 meses, diagnosticada com Leishmaniose ................................................................. 56 Tabela 2 – Valores obtidos na avaliação bioquímica sérica da paciente Nina, canina, fêmea, 10 meses, diagnosticada com Leishmaniose ................................................ 57 Tabela 3 – Valores obtidos no hemograma da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose após 7 e 45 dias do seu primeiro atendimento ............................................................................................................... 58 Tabela 4 – Valores dos exames de hemograma mensais realizados no ano de 2013 após confirmação do diagnóstico de Leishmaniose na paciente Nina, canina, fêmea ............................................................................................................ 63 Tabela 5 – Valores dos exames de hemograma realizados no ano de 2014 após confirmação do diagnóstico de Leishmaniose na paciente Nina, canina, fêmea ........................................................................................................................ 64 Tabela 6 – Valores dos parâmetros bioquímicos realizados para acompanhamento após confirmação do diagnóstico de Leishmaniose na paciente Nina, canina, fêmea .................................................................................... 67 Tabela 7 – Valores obtidos na contagem celular a partir da citologia de medula óssea da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose ............................................................................................................ 69 Lista de Abreviaturas Ag ALT BA BID CAAF CBC CE CHCM CIC DAT DF DNA ELISA FML HCM IC IFN- IgE IgG IgM IL IM LV LVC MAPA MDP MG MPL-SE MS MT OBS Antígeno Alanina aminotransferase Bahia Bis in die (duas vezes ao dia) Citologia aspirativa por agulha fina Complete blood count Ceará Concentração de hemoglobina corpuscular média Complexos imunes circulantes Direct agglutination test Distrito Federal Deoxyribonucleic acid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Fucose mannose ligan Hemoglobina corpuscular média Imunocromatografia Interferon gama Imunoglobulina E Imunoglobulina G Imunoglobulina M Interleucina Intramuscular Leishmaniose visceral Leishmaniose visceral canina Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Muramil dipeptídeo Minas Gerais Monophosphoril lipid A - stable emulsion Mato Grosso do Sul Mato Grosso Observação OMS PA PCR PI P-MAPA RIFI RJ RN RNA RT-PCR SC SE SID SNC SP Th TNF TO UFMG VCM Organização Mundial da Saúde Pará Polymerase chain reaction Piauí Proteic magnesium ammonium phospholinoleate palmitoleate anhydride Reação de imunofluorescencia indireta Rio de Janeiro Rio Grande do Norte Ribonucleic acid Real time – polymerase chain reaction Subcutâneo Sergipe Semel in die (uma vez ao dia) Sistema nervoso central São Paulo T helper (linfócitos) Tumor necrosis factor Tocantins Universidade Federal de Minas Gerais Volume corpuscular médio SUMÁRIO INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 10 1. REVISÃO DE LITERATURA – LEISHMANIOSE CANINA .................................. 12 1.1. Epidemiologia ..................................................................................................... 12 1.2. Etiologia .............................................................................................................. 15 1.3. Vetor ................................................................................................................... 17 1.4. Reservatório ....................................................................................................... 20 1.5. Transmissão ....................................................................................................... 21 1.6. Patogenia ........................................................................................................... 23 1.7. Sinais Clínicos .................................................................................................... 25 1.8. Achados Laboratoriais ........................................................................................ 29 1.9. Diagnóstico ......................................................................................................... 30 1.9.1. Diagnóstico Parasitológico ...................................................................... 33 1.9.2. Diagnóstico imunológico ......................................................................... 34 1.9.3. Técnicas Moleculares ............................................................................. 37 1.10. Tratamento ....................................................................................................... 38 1.10.1. Antimoniais Pentavalentes .................................................................... 40 1.10.2. Miltefosina ............................................................................................. 41 1.10.3. Anfotericina B ........................................................................................ 42 1.10.4. Anfotericina B Lipossomal ..................................................................... 43 1.10.5. Alopurinol .............................................................................................. 43 1.10.6. Outros Fármacos .................................................................................. 44 1.10.7. Imunoterapia ......................................................................................... 45 1.11. Controle e Profilaxia ......................................................................................... 47 1.11.1. Direcionada ao vetor ............................................................................. 47 1.11.2. Direcionada aos cães............................................................................ 48 1.11.3. Imunoprofilaxia ...................................................................................... 49 2. RELATO DE CASO .............................................................................................. 53 2.1. Anamnese e Exame Clínico ............................................................................... 53 2.2. Exames Complementares .................................................................................. 54 2.3.1. Pesquisa direta de ectoparasitas ............................................................ 55 2.3.2. Hemograma ............................................................................................ 55 2.3.3. Avaliação bioquímica sérica ....................................................................56 2.3.4. Pesquisa de hemoparasitas .................................................................... 57 2.3.5. Sorologia para Leishmaniose (RIFI/ELISA) ........................................... 57 2.3. Evolução do caso ............................................................................................... 58 2.4. Exames diagnósticos ......................................................................................... 59 2.4.1. Histopatológico de pele ........................................................................... 59 2.4.2. Sorologia para Leishmaniose (RIFI/ELISA) ........................................... 60 2.4.3. PCR para Leishmaniose ......................................................................... 60 2.4.4. Citologia de linfonodo.............................................................................. 60 2.5. Tratamento instituído .......................................................................................... 61 2.6. Monitoramento do paciente ................................................................................ 61 2.6.1. Exames Laboratoriais ............................................................................. 62 2.6.2. Citologia de medula óssea ...................................................................... 67 3. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 70 CONCLUSÃO ........................................................................................................... 72 REFERENCIAS ......................................................................................................... 73 10 INTRODUÇÃO A Leishmaniose é um grupo de doenças que afeta os seres humanos e outros animais (DANTAS-TORRES; OTRANTO, 2013). É uma zoonose importante porem negligenciada. Ocorre em todo o mundo com exceção à Antártida e Oceania, com estimativa de 1,3 milhões de casos humanos ao ano, sendo que destes, entre 20.000 a 30.000 resultam em óbito (WHO, 2014). Nas Américas, 12 países entre México e Argentina são considerados endêmicos, e no Brasil, 21 dos 27 estados (STEINDEL et al., 2013). A doença é causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitida por um mosquito vetor dos gêneros Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo). Embora outras espécies de animais silvestres possam carrear o parasita, os cães são considerados os principais reservatórios e cumprem um importante papel na transmissão da doença (RIBEIRO et al., 2013; STEINDEL et al., 2013). Na última década a doença vem aumentando sua incidência e se alastrando por cidades e estados brasileiros. O desmatamento associado a condições sanitárias precárias e transporte de animais infectados de uma área para outra são as principais razões para este aumento (STEINDEL et al., 2013). Os sinais clínicos e alterações patológicas nos cães podem ser diversos. A maioria apresenta sinais inespecíficos como febre, perda de peso, apatia e anorexia. Anemia, lesões na pele, linfoadenomegalia, onicogrifose, lesões oculares, vômitos e diarreia são outras alterações comuns (SOLANO-GALLEGO et al., 2009; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). O diagnóstico da doença é realizado, na maioria das vezes, por testes sorológicos, PCR ou punção de linfonodos ou medula óssea. Existem diversas medicações e protocolos para o tratamento da Leishmaniose Visceral (LV). Embora nenhum deles alcance a cura parasitária, podem controlar os sintomas e diminuir o grau de infectividade (PINHÃO, 2009). No Brasil, desde o começo dos anos 60, as autoridades têm utilizado a eutanásia de cães infectados como principal forma de controle da transmissão da 11 doença para humanos. Entretanto, a julgar pelo crescente número de casos e proliferação por diversas novas áreas, a estratégia é inadequada (TRIGO et al., 2010). Diversas vacinas contra a LV estão em fase de desenvolvimento e algumas veterinárias já estão disponíveis no mercado. A vacinação e colocação de coleira de deltametrina nos cães, juntamente com aplicação de inseticidas nas casas, são medidas preventivas que tem demonstrado bons resultados. O presente trabalho tem por objetivo relatar um caso de Leishmaniose Visceral Canina alóctone na cidade de Curitiba – PR e apresentar uma revisão bibliográfica sobre a doença abordando sua etiologia e epidemiologia, vetor, sinais clínicos e fisiopatologia, diagnóstico, tratamento e controle. 12 1. REVISÃO DE LITERATURA - LEISHMANIOSE CANINA 1.1. Epidemiologia A Leishmaniose apresenta ampla distribuição mundial, ocorrendo em 69 países de todos os continentes, com exceção da Antártida e Oceania (GONÇALVES et al., 2013). Estima-se que 1,3 milhões de novos casos ocorrem anualmente em todo o mundo, gerando 20.000 a 30.000 mortes por ano. Em torno de 90% dos casos de Leishmaniose Visceral ocorrem entre Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia e Sudão (WHO, 2014). A doença ocorre também na Europa. Marques (2008) cita que estudos de soroprevalência realizados na Espanha, França, Itália e Portugal estimam que aproximadamente 2,5 milhões de cães nestes países estavam infectados com a Leishmaniose Visceral. Nas Américas, 12 países entre México e Argentina são considerados endêmicos para a doença (STEINDEL et al., 2013), sendo que o Brasil representa 90% das notificações americanas, com cerca de 3.000 novos casos anuais. Desta maneira, o Brasil tem a maior incidência de Leishmaniose Visceral zoonótica no mundo (GONÇALVES et al., 2013). A Figura 1 representa a distribuição da doença no mundo. 13 Figura 1 – Distribuição da Leishmaniose Visceral no mundo. Fonte: Andrade et al., 2006. O processo de urbanização desorganizado, com intensas migrações de áreas rurais para centros urbanos, associado ao desmatamento e secas periódicas, resultou na expansão das áreas endêmicas e o aparecimento de novos focos (BRASIL, 2013). Hoje, praticamente todos os estados brasileiros são afetados pela Leishmaniose, incluindo áreas rurais e urbanas. Em 1994, 92,9% dos casos estavam concentrados na região Nordeste e 2,6% na região Sudeste; já em 2006, a prevalência diminuiu para 56,2% no Nordeste e aumentou para 21% no Sudeste (PACHECO et al., 2013). Além disso, uma doença que inicialmente era considerada de caráter rural, hoje afeta médias e grandes cidades, com surtos no Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte e Montes Claros (MG), Araçatuba, Bauru e Piracicaba (SP), Santarém (PA), Corumbá, Campo Grande e Três Lagoas (MS), Teresina e Tomon (PI), Natal (RN), São Luiz, Caxias e Imperatriz (MA), Aracajú (SE), Fortaleza (CE) Camaçari e Jequié (BA), Palmas (TO), Várzea Grande (MT) e Brasília (DF) (COSTA, 2008; BRASIL, 2013). 14 A distribuição no Brasil em 2008 está representada na Figura 2. Figura 2 – Distribuição de casos de LV por regiões brasileiras em 2008. Fonte: Website Scalibor. Dispinível em: http://www.scalibor.com.br/ leishmaniose/leishmaniose.asp. Acesso em dez. 2014. A região Sul, até recentemente, era considerada livre da doença. Porem, em 2007, houve registros de casos caninos no estado do Rio Grande do Sul, nas cidades de Uruguaiana e Cruz Alta. Estes casos eram considerados alóctones, ou seja, de cães que vieram de regiões endêmicas. Dois anos depois houve um surto na cidade de São Borja (RS) com mais de 1.200 cães infectados e cinco casos humanos autóctones, ou seja, pessoas que não haviam saído da região (PACHECOet al., 2013). Além disso, um estudo entomológico comprovou a presença do principal vetor Lutzomyia longipalpis em sete municípios neste estado (STEINDEL et al. 2013). 15 No estado de Santa Catarina também já foram identificados casos caninos autóctones nas cidades de Balneário Camboriú, Chapecó, Blumenau e, mais recentemente, Florianópolis (PACHECO et al., 2013). No estado do Paraná, região Sul, ao norte de SC, já foram relatados 14 casos de Leishmaniose alóctone (STEINDEL et al. 2013). A Leishmaniose é mais propensa a ocorrer em regiões secas e de baixo nível socioeconômico, onde há alta densidade populacional, carência à assistência médica e falta de saneamento básico (COSTA, 2005). Em humanos, as crianças com menos de 10 anos são mais suscetíveis e homens são mais afetados (60%) (BRASIL, 2013). Nos cães não foi confirmada predileção sexual ou racial, mas Sononda et al. (2013) em confronto com outras literaturas, encontrou em SP uma predisposição de idade para jovens adultos. Além disso, Almeida et al. (2012), constatou que cães com acesso livre a rua ou que habitam área externa da casa tem chances muito maiores de adquirir a doença. 1.2. Etiologia A Leishmaniose Canina é uma zoonose causada por um protozoário difásico do Reino Protista, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania. (MARQUES, 2008). Podem ser encontradas nas formas: promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, com forma alongada e presença de flagelo (Figura 3); e forma amastigota, quando nos tecidos dos vertebrados, forma ovalada ou arredondada, sem flagelo ou com flagelo rudimentar (Figura 4) (MARQUES, 2008; BRASIL, 2013). 16 Figura 3 – Forma promastigota ou Figura 4 – Forma amastigota ou flagelada da Leishmania. aflagelada da Leishmania. Fonte: Brasil, 2013. Fonte: Brasil, 2013. Existem em torno de 30 espécies diferentes de Leishmania em todo o mundo, sendo que cerca de 20 delas são responsáveis pela doença clínica no homem, e a maioria é considerada zoonótica (MARQUES, 2008). No Quadro 1 pode-se verificar as espécies nos países do Velho Mundo (Europa, Ásia e África) e do Novo Mundo (Américas). Quadro 1 – Espécies de Leishmania existentes. Países do Velho Mundo Países do Novo Mundo Leishmania infantum Leishmania donovani Leishmania tropica Leishmania aethiopica Leishmania major Leishmania chagasi (sin. L. infantum) Leishmania mexicana Leishmania amasonensis Leishmania venezuelensis Leishmania brasiliensis Leishmania panamensis Leishmania peruviana Leishmania guyanensis Leishmania lainsoni Leishmania naiff Leishmania shawi Fonte: Marques, 2008. No velho mundo as espécies mais comuns são a Leishmania donovani, causadora da Leishmaniose Visceral humana e não afeta cães; a Leishmania 17 tropica, agente da Leishmaniose tegumentar com raríssimos casos relatados em cães; e a Leishmania infantum (ou Leishmania chagasi), responsável pela LV nos cães e potencialmente zoonótica (MARQUES, 2008). Nas Américas, ainda são encontradas muitas outras espécies do protozoário, o que dificulta o quadro epidemiológico, controle e diagnóstico específico da doença (DANTAS-TORRES; OTRANTO, 2013). Apesar de já terem sido identificadas pelo menos 12 diferentes espécies infectantes de Leishmania em cães, a mais frequente em todo o mundo é a Leishmania infantum (DANTAS-TORRES; OTRANTO, 2013). Por muito tempo acreditou-se que a L. infantum e a L. chagasi fossem duas espécies diferentes, porem atualmente são considerados sinônimos (GONÇALVES et al., 2013). Na América do Sul, ainda encontramos infecções em cães e humanos por L. brasiliensis, que é, nesta região, o maior agente causador da Leishmaniose Tegumentar, outra forma da doença. Em um levantamento epidemiológico recente, foi identificada, através de PCR, a prevalência de 58,5% de cães infectados com L. brasiliensis em uma comunidade rural do nordeste brasileiro, revelando a importância da identificação do agente (FIGUEREDO et al., 2012). 1.3. Vetor O vetor transmissor da Leishmaniose é considerado um vetor biológico ciclopropagativo já que se trata de um mosquito e o parasito se multiplica no seu interior (MARQUES, 2008). Os vetores envolvidos são da Classe Insecta e subfamília Phlebotominae (MARQUES, 2008). Denominados flebotomídeos, no Brasil são popularmente conhecidos como mosquito palha, tatuquiras, birigui, entre outros (BRASIL, 2013). São reconhecidos seis gêneros de insetos, mas apenas dois são de importância médica: o gênero Phlebotomus nos países do Velho Mundo, e o gênero Lutzomyia nos países do Novo Mundo. Dentre esses gêneros existem varias 18 espécies, de acordo com a região. Algumas delas estão referidas no Quadro 2 (MARQUES, 2008). Quadro 2 – Vetores da Leishmaniose Canina e sua distribuição. GÊNERO Phlebotomus DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL GÊNERO Lutzomyia DISTRIBUIÇÃO MUNDIAL P. chinensis China do Norte e Central Lu. Longipalpis America do Sul e Central P. longiductus Ásia Central e Norte da África P. perniciosus Bacia Mediterrânea P. ariasia Mediterrâneo Ocidental P. perfiliewi Bacia Mediterrânea Lu. Evansi Colômbia, Costa Rica, Venezuela P. longicuspis Espanha e Norte da África P. neglectus Zona Oriental do Mediterrâneo P. tobbi Zona Oriental do Mediterrâneo Lu. Youngi America do Sul e Central P. kandelakii Líbano, Turquia, Irã e Afeganistão P. syriacus Israel, Jordânia e Síria Lu. shannomi América do Sul e Sudeste dos Estados Unidos P. langeroni Espanha e Norte da África P. smiovi Ásia Central P. transcaucasicus Azerbaijão Fonte: Marques, 2008. Nas Américas, a principal espécie transmissora é o Lutzomyia longipalpis, embora recentemente no Brasil, o Lutzomyia cruzi foi reconhecido como importante vetor transmissor (BRASIL, 2013). Outros autores ainda apontam evidências de outros possíveis vetores como o Lutzomyia evansi e Migonemya migonei (STEINDEL et al., 2013), Nyssomya neivai (PACHECO et al., 2013), Nyssomya. whitmani, Lutzomyia pessoai e Lutzomyia intermedia (GONÇALVES et al., 2013). Um estudo realizado no Paraná entre 2004 e 2005 analisou a presença de diferentes espécies de flebotomídeos em 37 municípios paranaenses, mas não foi evidenciada a presença do Lu. longipalpis. Já em outro estudo em 2012, Santos, 19 Ferreira e Bisetto Jr. identificaram a espécie Lu. longipalpis na cidade de Foz do Iguaçu, no Paraná. Mais estudos são necessários para avaliar a presença de vetores no estado e fazer o controle das espécies de mosquitos em áreas potenciais (SILVA; CAMARGO; SANTOS, 2008). Esses insetos são pequenos, medindo de um a três milímetros, possuem o corpo revestido por pelos e são de coloração castanha clara ou cor de palha (Figura 5). Tem hábitos crepusculares e noturnos e apenas as fêmeas precisam se alimentar de sangue para a maturação dos ovos, podendo fazer o repasto em várias espécies de animais, incluindo os humanos, podendo o cão ser o mais vulnerável (BRASIL, 2013). Figura 5 - Fêmea de flebotomídeo adulto, engurgitada. Fonte: Brasil, 2013. As fêmeas vivem em torno de 20 dias e colocam seus ovos sobre um substrato úmido no solo e com alto teor de matéria orgânica, paragarantir a alimentação das larvas (BRASIL, 2013). Atualmente estes insetos estão altamente adaptados aos mais variados ambientes, podendo ser encontrados nos mais variados lugares como galinheiros, chiqueiros, canis, paióis, e até ambientes intradomiciliares (BRASIL, 2013). 1.4. Reservatórios 20 O cão doméstico (Canis familiaris) é considerado o principal reservatório da doença e, portanto, o mais importante mantenedor do parasito no ambiente urbano e rural. No ambiente silvestre, a raposa (Lycalopex vetulus), o cachorro-do- mato (Cerdocyon thous) e os gambás (Didelphis albiventris) cumprem a função de perpetuar o agente (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012; BRASIL, 2013; GONÇALVES et al., 2013; STEINDEL et al., 2013). Outros animais, como lobos, marsupiais, roedores, felinos e equídeos, também podem ser infectados (MARQUES, 2008; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). No entanto, o cão ainda é considerado o mais importante reservatório, pois além de ter uma prevalência muito alta de infecção, podendo chegar até 40% da população em algumas áreas, o número de animais assintomáticos é muito alto, com taxas de até 80%, o que torna o cão uma fonte muito vasta para o mosquito vetor (PACHECO et al., 2013). Além disso, geralmente a infecção em cães precede a infecção em humanos e é apontada como uma das responsáveis pela expansão da doença (GONÇALVES et al., 2013). Diversas pesquisas no mundo todo têm constatado a infecção do felino doméstico (Felis sylvestris catus) com o protozoário Leishmania das mais variadas espécies (MARQUES, 2008, COSTA et al., 2010). Aparentemente os felinos desenvolvem uma resposta imune à infecção por Leishmania diferente da observada em cães, com baixos níveis de anticorpos mesmo nos animais infectados e ausência de sinais clínicos na grande maioria. Esse fato pode subestimar o número real de gatos infectados e, desta forma, facilitar a transmissão da doença (COSTA et al., 2010; SILVA et al., 2014). Mendonça, Nascimento e Batista (2014) constataram a infecção em 3,61% de uma amostragem de gatos em Teresina (Piauí); Silva et al. (2014) encontraram anticorpos anti-leishmania em 3,9% em Pernambuco; e Miró et al. (2014) em 3,2% em Madri (Espanha), todas áreas endêmicas. Apesar das pesquisas, mais estudos são necessários para entender o papel do felino e de outros hospedeiros na manutenção da doença em regiões endêmicas. 1.5. Transmissão 21 A transmissão da Leishmaniose ocorre através do repasto sanguíneo das fêmeas do mosquito vetor. O mosquito se contamina ao se alimentar de sangue de animais vertebrados infectados, ingerindo a forma amastigota do protozoário. No tubo digestivo do mosquito, essas formas se diferenciam em promastigotas, com um flagelo externo, e migram para o aparelho bucal (MARQUES, 2008; SOUZA, 2010; GONÇALVES et al., 2013). Ao se alimentar novamente, a fêmea injeta essas formas promastigotas na pele do hospedeiro através da saliva e, tão logo inoculadas, estas formas são fagocitadas pelos macrófagos. No interior dos macrófagos se transformam novamente em amastigotas, perdendo o flagelo e se multiplicam continuamente até destruírem a célula, sendo liberadas na corrente sanguínea. São, então, fagocitadas novamente e, desta maneira, são carreadas até os linfonodos, baço e medula óssea, levando a infecção da pele para outros órgãos internos (MARQUES, 2008; GONÇALVES et al., 2013). É importante lembrar que a transmissão só vai ocorrer enquanto houver o parasitismo na pele ou no sangue periférico do hospedeiro (BRASIL, 2013). O ciclo do parasito está ilustrado na Figura 6 juntamente com as formas de transmissão da doença. 22 Figura 6 – Ciclo de vida da L. infantum. Fonte: Sollano-Gallego et al. (2011a). Outras formas de transmissão ainda são estudadas, embora o seu papel epidemiológico na disseminação da doença hoje seja muito pequeno. Freitas et al. (2006 apud MARQUES, 2008) mostrou que a Leishmania pode ser transmitida através de transfusão sanguínea de sangue total ou frações (com células mononucleares). A transmissão transplacentária apesar de rara, já foi descrita em humanos e em cães (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012). Silva et al. (2009 apud ROCHA, 2012), constatou a transmissão venérea unidirecional da doença, sempre do macho infectado para a fêmea susceptível. Coutinho e Linardi (2007) também comprovaram a presença de promastigotas em pulgas do gênero Ctenocephalides, e Coutinho et al. (2004) e Dantas-Torres et al. (2010) em carrapatos da espécie Rhipicephalus sanguineus coletados de cães infectados. Entretanto, ainda não foi possível provar o seu papel na transmissão natural entre cães. 23 1.6. Patogenia A Leishmaniose é uma doença complexa, podendo se manifestar de várias maneiras, desde ausência de doença até o desenvolvimento de formas graves, com variadas apresentações de quadro clínico, que podem levar à morte dos animais susceptíveis ou até à remissão dos sinais clínicos nos animais resistentes (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012). O grau de infecção e a gravidade da doença podem ser determinados pela virulência e antigenicidade do parasito; constituição genética e resposta imune do hospedeiro; e condições sanitárias e nutricionais do paciente (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012). A infecção do hospedeiro ocorre após a inoculação de formas promastigotas do protozoário pelo mosquito vetor. Imediatamente se inicia uma reação inflamatória no local na picada. As primeiras células a aparecerem são os neutrófilos, que através da fagocitose ativam o sistema complemento, atraindo mais neutrófilos e, após dois ou três dias, macrófagos e monócitos. A partir daí, o parasita, no interior nos macrófagos, se dissemina por todo o organismo por via hemática ou linfática, e apesar da distribuição generalizada, se concentra em fígado, baço, linfonodos, medula óssea, rins e pele (MARQUES, 2008). Uma vez no interior dos macrófagos, o parasito ativa mecanismos com o objetivo de resistir à ação das enzimas microbicidas que estas células possuem. A patogenicidade da doença é determinada, então, pela infecção, sobrevivência e multiplicação do parasito no ambiente intracelular, primeiramente diminuindo sua atividade fagocitária e depois levando a destruição da célula parasitada (MARQUES, 2008). O tipo de resposta imune que o animal irá apresentar é essencial para determinar resistência ou suscetibilidade à infecção (ROCHA, 2012). Animais susceptíveis desenvolvem imunidade humoral (Th2) e animais resistentes produzem resposta celular (Th1) (SILVA, 2007; MARQUES, 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009). 24 Na resposta celular ocorre liberação de IFN-, TNF, IL-2 e IL-12, gerando uma reação inflamatória do tipo proliferativa. Nesse tipo de resposta, acumula-se nos tecidos infiltrado celular composto por macrófagos, linfócitos e células plasmáticas, principalmente nos órgãos linfoides e hematopoiéticos, causando degeneração destes (MARQUES, 2008). Na resposta humoral ocorre a produção de IL-4, 5, 6 e 10, que ativam o sistema complemento e estimulam a produção de IgG e IgM. A produção de anticorpos específicos acontece nas primeiras semanas após infecção e vai aumentando com o tempo. Por volta de oito a 12 semanas após a infecção os títulos de anticorpos já estão acima da positividade (MARQUES, 2008). Segundo Silva (2007), a IL-10 aparece tanto em animais sintomáticos quanto não sintomáticos. Porem, esta citosina pode acentuar a resposta Th2 e bloquear as células Th1. Já a IL-4, estimula os linfócitos B e consequentemente a produção de IgG1 e IgE. Portanto, a detecçãodos níveis de IL-4 pode estar relacionada à gravidade do quadro clínico e à progressão da doença. Também tem se estudado o prognóstico da doença através das dosagens das subclasses de IgG anti-leishmania. Geralmente os anticorpos IgG2 estão associados à infecção assintomática e IgG1 à doença (DEPLAZES et al., 1995 e BOURDOISEAU et al., 1997 apud SOLANO-GALLEGO et al., 2001b; SILVA, 2007; MARQUES, 2008). Solano-Gallego et al. (2001b) constatou também que o tratamento é mais eficaz em cães com altos níveis de IgG1 no inicio da infecção. Muitos dos aspectos patogênicos da Leishmaniose ocorrem por lesões inflamatórias devido à deposição de imunocomplexos nos tecidos. A estimulação policlonal de células B provoca a produção exagerada de anticorpos, que ao se juntarem com antígenos da Leishmania, formam estes complexos imunes circulantes (CIC). Ao se depositarem no endotélio vascular, os CIC originam uma reação de hipersensibilidade do tipo III, que ativam o sistema complemento e células inflamatórias, aumentando a permeabilidade dos vasos sanguíneos e provocando agregação plaquetária e formação de coágulos. Além disso, os polimorfonucleares (PMNs) causam lesão enzimática na parede dos vasos podendo causar vasculite e até necrose (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012). O mecanismo natural de eliminação dos CIC do organismo é através da urina. Assim, o rim é um dos órgãos mais afetados por tais complexos, pois, com a 25 reação inflamatória provocada pela deposição dos complexos imunes, ocorre dilatação da membrana basal e perda de proteínas e hemácias na urina, gerando uma glomerulonefrite aguda. Se a deposição dos imunocomplexos continuar, chegando a se depositarem moléculas maiores, ocorre alteração estrutural da membrana basal comprometendo a filtração glomerular e levando o paciente a glomerulonefrite crônica (MARQUES, 2008). Esta pode ser a principal causa morte de cães com Leishmaniose (SILVA, 2007). Outros órgãos também podem ser afetados pelos complexos imunes. Por exemplo, nos olhos, a deposição destes pode levar a lesões como ceratoconjuntivite, blefarite, edema de córnea, sinéquia e lesões em corpo ciliar e íris (SILVA, 2007). Outro importante mecanismo patogênico da Leishmaniose é a formação de infiltrados inflamatórios linfoplasmocitários que se acumulam nos órgãos gerando lesões. Os principais órgãos atingidos por este mecanismo são os órgãos linfoides, levando à frequente linfoadenomegalia e hipoplasia medular. No SNC, podem ocorrer disfunções neurológicas, como letargia, convulsões, mioclonia, nistagmo, tremores, paralisia de mandíbula, ptose labial, andar em círculos, tetraparesia e rigidez raquial e cervical. O coração pode apresentar miocardite multifocal com necrose e degeneração das fibras cardíacas. Na pele, o infiltrado inflamatório está relacionado à alopecia, descamação, lesões nodulares e ulcerativas. Nos pulmões pode provocar pneumonia intersticial crônica e difusa (SILVA, 2007). 1.7. Sinais Clínicos Os sinais clínicos da Leishmaniose são muito variáveis devido aos diversos mecanismos patogênicos da doença, os diversos órgãos afetados e as diferentes respostas imunes de cada indivíduo (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Classicamente a Leishmaniose é divida em tegumentar e cutânea difusa ou visceral. Além disso, os cães infectados pela doença podem ser classificados quanto às manifestações clínicas como assintomáticos, oligossintomáticos (com até 26 três sinais), e sintomáticos (com mais de três sinais clínicos) (SONODA et al., 2013). Entretanto, hoje há controvérsias quanto ao tipo de classificação clínica e alguns autores também consideram as alterações clínico-patológicas e as disfunções orgânicas sem manifestação clínica aparente. Assim animais sintomáticos são aqueles que apresentam qualquer sinal clínico e/ou clinicopatológico da doença e tiverem infecção confirmada do parasito (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Por se tratar de uma doença crônica, os sinais clínicos podem aparecer de três meses até sete anos após a infecção (MARQUES, 2008), com média de três a sete meses (BRASIL, 2013). A doença se inicia como uma síndrome geral inespecífica com perda de peso progressiva, apatia, anorexia e febre (MARQUES, 2008). Outros sinais muito comuns são linfoadenopatia generalizada, esplenomegalia, lesões na pele, lesões oculares, poliúria e polidipsia, onicogrifose, epistaxe, vômito e diarreia (SOLANO-GALLEGO et al., 2009; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012; ROCHA, 2012; GONÇALVES, et al., 2013). Na Figura 7 podem ser visualizados alguns dos sinais mais frequentes da doença. Figura 7 – Sinais clínicos da Leishmaniose Canina: A) Epistaxe; B) Uveíte bilateral e opacidade corneal; C) Blefarite e conjuntivite purulenta; D) Alopecia esfoliativa e linfoadenomegalia do poplíteo; E) Caquexia e alopecia esfoliativa generalizada. Fonte: Sollano-Gallego et al. (2011a). 27 As lesões cutâneas são as mais frequentes nos animais doentes, estando presente em 50 a 90% dos casos (SOLANO-GALLEGO et al., 2001a, 2009; MARQUES, 2008; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). Podem ocorrer isoladamente ou em conjunto com outros sinais (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). A maioria dos animais desenvolvem lesões alopécicas, simétricas e aprurídicas (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012). Solano-Gallego et al. (2009) classificam as lesões dermatológicas em cinco: (1) dermatite esfoliativa aprurídica com ou sem alopecia generalizada ou localizada na face, orelhas e membros; (2) dermatite ulcerativa nas proeminências ósseas, junções mucocutâneas, patas e pinas das orelhas; (3) dermatite nodular focal ou multifocal; (4) dermatite proliferativa mucocutânea; (5) e dermatite papular. Estas alterações podem ser explicadas pela ação direta do parasito sobre o folículo piloso, por uma alteração do metabolismo do acido pantatênico (devido às lesões hepáticas) ou pela deposição de complexos imunes na membrana basal da pele (ROCHA, 2012; SONODA et al., 2013). A Figura 8 mostra algumas imagens de lesões cutâneas da doença. Figura 8 – Diferentes padrões de lesões cutâneas na Leishmaniose Canina: A) Blefarite e alopecia periocular esfoliativa; B) Lesão Mucocutânea nasal ulcerativa; C) Dermatite papular na região inguinal; D) Lesões nodulares ulcerativas com bordos elevados beirando o focinho; E) Lesão eritematosa ulcerativa na superfície plantar da pata e entre os coxins; F) Onicogrifose. Fonte: Sollano-Gallego et al. (2011a). 28 Quanto aos rins, vários estudos mostram lesões histológicas em tecido renal em 100% dos animais, comprovando a alta incidência de doença renal na Leishmaniose Visceral. Apesar da alta prevalência, a azotemia não é um achado frequente, pois só ocorre com a morte da maioria dos néfrons, em um estado já bem avançado da doença (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). O processo se inicia com uma nefrose tubular devido à deposição de complexos imunes, evoluindo para glomerulonefrite membranoproliferativa. Se esta evoluir e atingir mais de 75% dos glomérulos o animal vai apresentar aumento da creatinina sérica e sinais compatíveis com insuficiência renal como poliúria, polidipsia, anorexia, vômito e perda de peso (MARQUES, 2008). A insuficiência renal crônica é a principal causa de morte de cães com Leishmaniose (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Outras formas clínicas menos comuns incluem alterações articulares como edema, dor articular, crepitação, poliatrite, lesões ósseas proliferativas e osteolíticas, claudicação e paresia dos membros; hepatite crônica com ascite e icterícia; colite crônica e diarreia; miocardite, pericardite e vasculite; lesões nos genitaismasculinos como epididimite, balanopostite, orquite (MARQUES, 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009;); e sinais neurológicos com episódios convulsivos, alterações em pares de nervos cranianos e regiões vestibular e cerebelar (SONODA et al., 2013). O Gráfico 1 compara a incidência dos sinais clínicos encontrados em quatro diferentes estudos, Marques (2008) em Lisboa (Portugal), Almeida et al. (2012) em Cuiabá (MT), Sonoda et al. (2013) em São Paulo (SP) e Camplesi et al. (2014) em Bauru (SP). Pode-se concluir, independente da região, que as lesões cutâneas são a manifestação mais comum da doença, juntamente com linfoadenomegalia, seguido de perda de peso e apatia. Os números encontrados por Almeida et al. (2012) diferem bastante dos encontrados pelos outros autores. Isto se deve ao fato de que o estudo realizado em Cuiabá teve uma amostragem populacional aleatória, enquanto os outros analisaram dados de animais doentes atendidos em hospitais. Essa diferença pode ser observada na grande quantidade de animais assintomáticos encontrados, o que acaba também diminuindo a porcentagem de incidência dos outros sinais neste estudo. 29 Gráfico 1 – Comparação da incidência dos sinais clínicos em quatro diferentes estudos e regiões. Fonte: A autora. 1.8. Achados laboratoriais Os achados laboratoriais mais comuns na Leishmaniose são: anemia arregenerativa, leucocitose ou leucopenia, hiperproteinemia com hiperglobulinemia e hipoalbuminemia, aumento das enzimas hepáticas, trombocitopenia, proteinúria e aumento da relação proteína:creatinina urinária (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Segundo Sonoda et al. (2013), a anemia está presente em 57 a 94,2% dos casos, manifestando-se como anemia normocítica normocrômica geralmente arregenerativa. A diminuição do número de hemácias ocorre devido à supressão da medula óssea, sequestro esplênico, doença renal ou hemólise imunomediada. A trombocitopenia também pode ocorrer por sequestro esplênico, supressão medular ou ainda pode ser induzida por imunocomplexos circulantes (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012; SONODA et al., 2013). 0 20 40 60 80 100 120 % d e a n im ai s Incidência de Sinais Clínicos da Leishmaniose Canina Camplesi et al., 2014 (Bauru) Marques, 2008 (Lisboa) Sonoda et al., 2013 (São Paulo) Almeida et al., 2012 (Cuiabá) 30 A presença de hiperproteinemia está presente em 60 a 68% dos casos, essencialmente por hipergamaglobulinemia (SONODA et al., 2013). Segundo Marques (2008) estas são as alterações bioquímicas mais consistentes com a Leishmaniose. 1.9. Diagnóstico O diagnóstico da Leishmaniose é complexo devido à variedade de sinais clínicos inespecíficos e a falta de um teste que tenha 100% de sensibilidade e especificidade (SOLANO-GALLEGO et al., 2009; ROCHA, 2012). Deve-se levar em conta, além do quadro clínico, os dados epidemiológicos da região, o histórico do animal e as alterações bioquímicas séricas como primeira opção para o diagnóstico da doença (MARQUES, 2008). A partir daí, outros exames laboratoriais e/ou parasitológicos são necessários para confirmação da suspeita (ROCHA, 2012). A Figura 9 apresenta um diagrama feito por Sollano-Gallego et al. (2011a) que mostra a conduta diagnóstica através dos diferentes exames. 31 Figura 9 – Diagrama para conduta diagnóstica da Leishmaniose Canina. Fonte: Sollano-Gallego et al. (2011a). O Quadro 3 mostra as vantagens e desvantagens dos diferentes métodos diagnósticos. 32 Quadro 3 – Vantagens e desvantagens dos diferentes métodos diagnósticos de L. infantum em cães. Técnica Diagnóstica Vantagem Desvantagem SOROLOGIA - Determina o nível de anticorpos, o que é essencial para diagnostico e estabelecimento do prognostico. - Não detecta a presença da Leishmania propriamente dita. - Reações cruzadas com trypanossomas. Imunocromatografia - Teste rápido que pode ser realizado na clinica. - Fornece apenas resultados positivos / negativos. - Desempenho e sensibilidade variadas com riscos de falsos negativos. - Em casos positivos necessita de testes sorológicos quantitativos. RIFI, ELISA - Determina o nível de anticorpos. - Altos níveis de anticorpos associados a presença de sinais clínicos ou alterações clinicopatológicas compatíveis são conclusivo de Leishmaniose clínica. - Muitas diferenças entre os laboratórios e sem padronização das técnicas. - Níveis baixos de anticorpos requerem outros testes e acompanhamento. CITOLOGIA/ HISTOLOGIA - Permite a identificação direta do parasito. - Permite a exclusão de outros diagnósticos diferenciais - Rápido e não invasivo (citologia). - Baixa sensibilidade para a detecção da Leishmania em tecidos e fluidos corporais. - Necessita de outros testes como a imunohistoquimica e /ou PCR quando os parasitas não são visualizados. - Não fornece o status imunológico do animal. - Necessita de técnica. PCR - Detecção do DNA da Leishmania. - Alta sensibilidade e especificidade. Quantificação do parasita (realtime- PCR). - Resultados falso positivos por contaminação com DNA. - Diferentes padrões e técnicas usados em diferentes laboratórios. - Não fornece o status imunológico do animal. - Não pode ser utilizado como único método diagnostico pois um resultado positivo confirma a infecção por Leishmania mas não a doença. CULTURA - Permite o isolamento dos parasitas de Leishmania. - Facilita a identificação isoenzimática do parasita. - Técnica trabalhosa e demorada. - Pode levar um mês para o resultado. - Praticado apenas em laboratórios de pesquisa. Fonte: Adaptado de Solano-Gallego et al. (2011a). 33 1.9.1. Diagnóstico Parasitológico O diagnóstico definitivo ocorre pela comprovação da presença do parasito no paciente através da observação direta em citologia ou por técnicas moleculares em aspirados principalmente de baço e medula óssea, onde há maior concentração do parasita (ELMAHALLAWY et al., 2014; SONODA et al., 2013). Outros autores relatam ainda a possibilidade de se realizar aspirados dos linfonodos, lesões cutâneas, fígado e menos comumente em outros fluidos biológicos (ROCHA, 2012; SOLANO-GALLEGO et al., 2009; MARQUES, 2008). A citologia aspirativa tem 100% de especificidade e em torno de 80% de sensibilidade. Esta pode variar de acordo com o material analisado, a carga parasitária, quantidade de amostras avaliadas, tempo de leitura de lâmina (MARQUES, 2008; ROCHA, 2012), além da qualidade das lâminas preparadas e técnica do profissional (ELMAHALLAWY et al., 2014). Segundo Camplesi et al. (2014), em um levantamento realizado em Bauru – SP, a citologia aspirativa do linfonodo foi o método diagnóstico mais utilizado. Nos casos positivos, se observam as formas amastigotas, cuja forma pode ser de esférica a ovoide, com núcleo arredondado e cinetoplasto alongado. Contudo, especialmente em animais assintomáticos, deve-se sempre considerar os resultados falso negativos (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). A Figura 10 mostra citologia de aspirados de linfonodos, sendo que na primeira há pouca quantidade de parasitos, além de estarem fora das células, o que exige habilidade para realização do exame; e na segunda há grande quantidade de parasitos em espaço intra e extracelular. 34 Figura 10 – Interpretação de citologia: A) Citologiapor aspiração com agulha fina (CAAF) de linfonodo reativo de cão com Leishmaniose clinica apresentando formas amastigotas de Leishmania extracelulares em pouca quantidade; B) Citologia por aspiração com agulha fina (CAAF) de linfonodo reativo de cão com Leishmaniose clinica apresentando alta quantidade de formas amastigotas de Leishmania intra e extracelulares. Fonte: Sollano-Gallego et al. (2011a). O parasito também pode ser visualizado no exame histopatológico da pele ou outros órgãos infectados. Quando o parasito não é visualizado, encontra-se inflamação piogranulomatosa, granulomatosa ou linfocitária, o que também é comum a outras afecções (SOLANO-GALLEGO et al., 2009; ROCHA, 2012; SONODA et al., 2013). A cultura do parasito pode ser realizada para otimizar a sensibilidade dos testes, porem é trabalhosa, demorada e raramente aplicada à clínica (ELMAHALLAWY et al., 2014). 1.9.2. Diagnóstico Sorológico O objetivo dos testes sorológicos é verificar a existência de anticorpos (IgG) específicos contra Leishmania no soro sanguíneo. Devem ser analisados com cautela, pois, apesar da alta sensibilidade e especificidade que apresentam, podem falhar no período de incubação antes da soroconversão, que pode ocorrer de um 35 mês e meio a três meses após a inoculação do parasito no animal (MARQUES, 2008). Além disso, os títulos de anticorpos podem permanecer detectáveis por muitos meses após a cura do animal e é impossível diferenciar uma infecção anterior curada ou uma doença instalada (ELMAHALLAWY et al., 2014). Portanto, quando os títulos são detectáveis porem baixos, é necessário fazer o acompanhamento e outros exames para confirmar ou excluir a doença (SOLANO- GALLEGO et al., 2009). Podem ocorrer também falso-positivos pelas reações cruzadas com outras doenças como a Erlichiose, Rickettsiose, Toxoplasmose e principalmente a Leishmaniose Cutânea (Leishmania brasiliensis) e a Doença de Chagas (Trypanossoma cruzi) (MARQUES, 2008). Existem muitos testes sorológicos disponíveis, entre eles aglutinação direta (DAT), imunocromatografia (IC), reação de imunofluorescência indireta (RIFI), e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Atualmente a RIFI e ELISA são os testes recomendados pelo Ministério da Saúde para inquérito epidemiológico (ROCHA, 2012). O DAT tem alta sensibilidade e especificidade e baixo custo, porem é um teste demorado. Já a IC é um teste rápido e simples no qual se utiliza o antígeno recombinante da L. infantum rK39. Estudos realizados no Brasil mostram 100% de sensibilidade e 100% de especificidade. Tanto o DAT quanto a IC podem detectar os anticorpos por anos após a recuperação, impossibilitando a diferenciação de um animal curado e um doente, e limitando o seu uso em regiões endêmicas (ELMAHALLAWY et al., 2014). A RIFI é um teste rápido e de baixo custo, sua sensibilidade pode variar de 68% a 100% e especificidade de 74% a 100%. O ELISA é o teste preferido para diagnóstico laboratorial com alta sensibilidade, variando de 71% a 100%, e especificidade de 85% a 100% (MORAIS, 2013). Ferreira et al. (2007 apud GONÇALVES et al., 2013) compararam a eficácia do DAT, ELISA e RIFI em diagnosticar a infecção canina por Leishmaniose e obtiveram valores de sensibilidade iguais a 93%, 96% e 72% respectivamente, e especificidade de 100% para todas. 36 Segundo Solano-Gallego et al. (2009) e Elmahallawy et al. (2014), a sensibilidade e especificidade do ELISA está diretamente relacionada com o tipo de antígeno utilizado no teste, que são basicamente extratos solúveis de promastigotas, proteínas purificadas ou proteínas recombinantes. O antígeno que apresentou mais altos níveis de sensibilidade e especificidade foi o antígeno recombinante chamado rk39, diminuindo potencialmente a probabilidade de reações cruzadas. O Quadro 4 abaixo compara os principais testes sorológicos segundo Elmahallawy et al. (2014). Quadro 4 – Técnicas sorológicas comumente usadas para diagnóstico da Leishmaniose. Método Sensibili- dade (%) Especifici- dade (%) Vantagens Desvantagens RIFI 87 – 100 77 – 100 Positivo na fase inicial da doença e indetectável após seis a nove meses de cura Necessita de equipamentos sofisticados e não se pode aplicar no campo. ELISA Ag extrato de Promasti- gotas Ag rk39 80 –100 75 – 98 84 – 95 79 – 89 Pode ser usado para estudos epidemiológicos em grande escala. Sensibilidade e especificidade é dependente dos antígenos utilizados. Necessita de pessoas qualificadas, equipamentos sofisticados e eletricidade. DAT 85 –100 91 – 100 Teste rápido e aplicável em campo. Uso limitado em regiões endêmicas. Longo período de incubação. Antígeno positivo não é disponível em forma comercial e é muito frágil na forma aquosa. IC com rk39 90 – 100 93 – 100 Barato, rápido, simples e pode ser realizado por pessoas não qualificadas. Fonte: Adaptado de Elmahallawy et al. (2014). 37 1.9.3. Técnicas Moleculares: Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) Várias técnicas de biologia molecular tem sido estudadas para o diagnóstico da Leishmaniose, sendo a PCR a principal e a que tem apresentado os melhores resultados de sensitividade e especificidade para a detecção do parasito (MARQUES, 2008; ELMAHALLAWY et al., 2014). A PCR pode ser realizada a partir de amostras de tecidos, sangue e fluidos. PCR com amostras retiradas do linfonodo, pele, baço e medula óssea tem maior especificidade (SOLANO-GALLEGO et al., 2009), podendo chegar a 100% quando usado baço ou medula óssea (ELMAHALLAWY et al., 2014). Exames realizados com amostras de sangue total, papa de leucócitos e plaquetas ou urina são menos eficientes (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Segundo Elmahallawy et al. (2014), a amostra menos traumática para realização do exame é sangue periférico, devido ao seu caráter não invasivo. Com esta amostra a taxa de sensibilidade varia entre 70 e 100%. Outra amostra não invasiva que tem sido empregada com bons resultados é o swab conjuntival. Segundo Pereira (2013), em um estudo comparando PCR de sangue periférico e PCR de swab conjuntival, este último se mostrou mais efetivo com sensibilidade e especificidade de 58,6% e 94% respectivamente, enquanto com o sangue periférico as taxas foram de 24,1% e 88,5%. A PCR pode ser utilizada como método qualitativo, mas também como método quantitativo, através do real-time PCR (RT-PCR), que permite a quantificação de DNA do parasita. Enquanto a PCR convencional pode detectar a presença do parasita quando há mais de 30 parasitas/mL, o RT-PCR pode mostrar até mesmo um parasita por mL. Esse exame pode ser de grande valia para acompanhamento do tratamento (MARQUES, 2008). 38 1.10. Tratamento O tratamento da LVC é uma questão muito delicada. Os cães são os maiores reservatórios da doença nos meios urbanos e nenhum tratamento pode permitir a cura parasitológica. Os tratamentos disponíveis podem atingir apenas a cura clínica, diminuindo os sintomas, os níveis de anticorpos específicos e o grau de infectividade dos cães para os vetores (PINHÃO, 2009). A eutanásia dos animais positivos era uma prática muito comum no passado, mas ainda acontece em alguns países do mundo. No Brasil o tratamento dos cães não é recomendado pelo Conselho Federal de Medicina Veterinária, que se apoia na portaria Interministerial do Governo Federalde número 1.426, de 11 de julho de 2008 que proíbe os médicos veterinários a tratarem a LVC em cães infectados ou doentes com produtos de uso humano ou não registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). Apesar de não recomendado, muitos veterinários realizam o tratamento no Brasil, visto que a conduta Interministerial de proibir o tratamento vai de encontro às constatações científicas que demonstram que cães tratados e controlados não apresentam riscos à saúde pública. Por isso o tratamento é aprovado nos Estados Unidos e na Europa, onde inclusive existem produtos exclusivos veterinários específicos (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). De qualquer forma, tratar ou não um cão com LV é uma situação que deve ser avaliada com cuidado. Deve-se levar em conta o estado geral do animal e informar muito bem aos proprietários que o tratamento é prolongado, dispendioso e caro, com relativo sucesso terapêutico, pois nem sempre o animal se recupera 100% e ainda pode ter recidivas ao longo da vida. Por isso, o proprietário que optar pelo tratamento deve ser muito comprometido, uma vez que o animal deverá ser avaliado periodicamente, com exames a cada três a seis meses (hemograma completo, perfil bioquímico e urinálise), e deverá tomar medicações leishmaniostáticas para controle por longos períodos, provavelmente por toda a vida do animal (PINHÃO, 2009). 39 Atualmente o protocolo mais recomendado para tratamento da LVC é a associação de Antimoniato de Meglumina e Alopurinol. O Quadro 5 mostra os principais protocolos utilizados. Quadro 5 – Protocolos atuais para o tratamento da LVC. Protocolo Medicamento Dose Duração Efeitos Adversos 1ª. Linha Antimoniato de Meglumina¹ + Alopurinol 75-100 mg/kg/ SID ; SC 10 mg/kg/ BID; VO 4-8 semanas 6-12 meses mínimo Nefrotoxicidade e abscessos cutâneos Urolitíase por xantina 2ª. Linha Miltefosina¹ + Alopurinol 2 mg/kg/ SID; VO 10 mg/kg/ BID ; VO 4 semanas 6-12 meses mínimo Vômito e diarreia Urolitíase por xantina Alopurinol 10 mg/kg/ BID ; VO 6-12 meses mínimo Urolitíase por xantina 3ª. Linha Anfotericina B² 0.5-0.8 mg/kg/ SID; IV 2x por semana durante 2 meses Nefrotoxicidade Anfotericina B Lipossomal² 3 mg/kg/ SID; IV 5 dias Nefrotoxicidade transitória Metronidazol + Espiramicina 25 mg/kg/ SID; 150.000UI/kg/ SID; VO 3 meses Não descrito Marbofloxacina 2 mg/kg/ SID;VO 1 mês Não descrito ¹ Registrado para uso veterinário na Europa ² 1ª. Linha para tratamento da LV humana na Europa; não recomendado pela OMS para uso veterinário para evitar resistência do parasita à droga. Fonte: Adaptado de Solano-Gallego et al., 2009. 40 1.10.1. Antimoniais Pentavalentes Atualmente estes fármacos são os de primeira escolha no tratamento da Leishmaniose canina e humana. Estes são leishmanicidas e atuam na inibição das enzimas fosfofrutoquinase e fosfofenolpiruvato carboxiquinase, responsáveis pela glicólise e oxidação de ácidos graxos, bloqueando seu metabolismo e levando a morte (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). Dos dois compostos existentes, o Estibugluconato de Sódio e o Antimoniato de Meglumina, o segundo é o mais utilizado (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009). No Brasil este fármaco é distribuído exclusivamente pelo Ministério da Saúde (MS) e seu uso é proibido em cães. Na Europa é utilizado como primeira opção de tratamento com formulação veterinária específica de nome comercial Glucantime®, Merial (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). A apresentação do Glucantime® é em solução injetável e pode ser aplicado via endovenosa, intramuscular ou subcutânea. A via subcutânea é a mais utilizada pela facilidade de aplicação e menor ocorrência de reações locais (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). O tratamento com esta droga tem mostrado bons resultados com relação a diminuição dos sinais clínicos e redução da carga parasitária. Porem, não se pode considerar a cura parasitológica. Recidivas são frequentes e muitas vezes os animais precisam ser submetidos a outros ciclos de tratamento. Contudo, estes ciclos de tratamento devem ser evitados o máximo possível, pois podem acabar selecionando cepas resistentes do parasita (PINHÃO, 2009). É contraindicado para pacientes nefropatas uma vez que é nefrotóxico e possui excreção renal. Além disso, a morte dos parasitos leva ao aumento de imunocomplexos circulantes podendo agravar a condição renal ou ocular pré- existente (PINHÃO, 2009). Os principais efeitos colaterais são anorexia, distúrbios gastrointestinais, apatia, febre, tosse e alterações hepáticas e renais (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). Existem diferentes protocolos de administração e dosagens de acordo com diferentes autores. Estão descritos abaixo. 41 Quadro 6 – Diferentes protocolos terapêuticos com o Antimoniato de Meglumina. Dose Via de Aplicação Duração Taxa de remissão dos sinais Taxa de recidiva Referencia 150 mg/kg SID SC ou IM 10 dias Pausa de 7 a 10 dias Repete mais 10 dias Não determinada 75% Fayet, 2000 apud Pinhão, 2009 100 mg/kg SID SC 3 a 4 semanas 50 a 100% 70% Bourdoiseau, 2006 apud Pinhão, 2009 50 mg/kg BID SC Séries de 10 dias ou por 30 dias Não determinada Não determinada Valladares, Alberola, Esteban e Arboix, 1996, Denerolle e Bourdoiseau, 1999, Ciaramella e Corona, 2003 apud Pinhão, 2009 75 mg/kg BID SC 21 a 30 dias podendo prolongar por mais 30 dias Não determinada Não determinada Baneth e Shaw, 2002 e López, 2007 apud Pinhão, 2009; Ribeiro e Michalik, 2001 apud SCHIMMING; Pinto e Silva, 2012 Fonte: A autora. 1.10.2. Miltefosina A Miltefosina é um fármaco leishmanicida que age provocando alterações no metabolismo lipídico e inibição da função mitocondrial dos parasitos, ainda estimula a resposta dos macrófagos e induz a apoptose (THE MEDICAL LETTER, 2014). A medicação já é utilizada em humanos a mais tempo (Impavido ®, Zentaris) e desde 2007, existe uma formulação especifica veterinária (Milteforan ®, Virbac) (PINHÃO, 2009). Tem uma eficácia muito similar ao Antimoniato de Meglumina tanto em humanos (PINHÃO, 2009) como em cães (MARQUES, 2008). Sua grande vantagem 42 é de ser administrada via oral, portanto pode ser ministrado pelos proprietários com os devidos cuidados de usar luvas à manipulação, evitar contato com mucosas e mulheres grávidas (PINHÃO, 2009). A excreção da Miltefosina não é renal, por isso pode ser utilizada nos pacientes nefropatas. A droga tem alto potencial teratogênico, portanto não deve ser administrada em cadelas prenhes ou lactantes. Os principais efeitos colaterais são gastrointestinais, como vômito, diarreia e anorexia, por isso deve ser administrado junto às refeições na dose de 2 a 3 mg/kg/dia por 28 dias consecutivos (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009). 1.10.3. Anfotericina B A Anfotericina B é uma droga antifúngica com ação contra alguns protozoários inclusive a Leishmania sp.. Ela age alterando a permeabilidade da membrana dos parasitos e leva a morte celular por plasmólise (MARQUES, 2008; PINHÃO,2009). A droga é raramente utilizada em cães e mais usada em humanos como segunda opção, pois é extremamente nefrotóxica e tem como efeitos anafilaxia, trombocitopenia, anemia, dor generalizada, febre e convulsões (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009). Deve ser administrada por via endovenosa lenta (5 a 10 minutos) diluída em soro glicosado (10 a 20 mL) na dose de 0,5 a 0,8 mg/kg a cada três dias até atingir uma dose total de 8 a 10 mg/kg (MARQUES, 2008). 43 1.10.4. Anfotericina B Lipossomal Com o objetivo de reduzir os efeitos secundários da Anfotericina B, a droga foi reformulada e incorporada a lipossomas. O componente lipídico do composto permite um melhor direcionamento do medicamento para o local da infecção e diminui seus efeitos tóxicos (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009). A Anfotericina B Lipossomal é a primeira droga de escolha para o tratamento da Leishmaniose Visceral humana na Europa (PINHÃO, 2009) e nos Estados Unidos (THE MEDICAL LETTER, 2014). Devido ao alto custo, seu uso é praticamente restrito a humanos (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009). 1.10.5. Alopurinol O Alopurinol é um fármaco análogo das purinas com ação leishmaniostática. Ele tem a capacidade de se ligar ao RNA do parasito impedindo sua multiplicação (MARQUES, 2008; PINHÃO, 2009). É uma medicação de fácil acesso e barata, administrada por via oral na dose entre 10 a 30 mg/kg, uma a duas vezes ao dia com duração indeterminada (MARQUES, 2008). Segundo Ciaramella e Corona (2003 apud PINHÃO, 2009), estudos demonstram que o Alopurinol não é eficaz quando usado como droga única, devendo ser usado em associação com outros fármacos. O Alopurinol é muito utilizado para conter as recidivas, por isso deve ser mantido por pelo menos seis a 12 meses após o término do tratamento com Antimonial ou Miltefosina (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Segundo Solano- Gallego et al. (2009), os critérios para se interromper o tratamento com o Alopurinol são: recuperação total do paciente avaliado por exame físico completo, hemograma, painel bioquímico e urinálise; e diminuição considerável nos níveis de anticorpos chegando a estar negativos ou positivos border line em uma avaliação quantitativa. 44 O autor ainda ressalta que alguns animais muito susceptíveis nunca chegam ao ponto de parar com o Alopurinol, porem outros não necessitam de um tratamento tão prolongado. Embora de baixa toxicidade, alguns efeitos podem ser observados, como hipertermia, leucopenia, distúrbios cutâneos e leve aumento da ALT (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). Também pode ocasionar xantinúria e formação de urólitos de xantina, por isso a função renal e hepática devem ser sempre avaliadas (PINHÃO, 2009). 1.10.6. Outros Fármacos Entre outras medicações utilizadas para a Leishmaniose ainda estão listadas a Pentamidina, Aminosidina, Marbofloxacina e Metronidazol associado à Espiramicina. A Pentamidina é uma droga utilizada para, além da Leishmaniose, Pneumocitose, Babesiose e Tripanossomíase (MARQUES, 2008). É muito eficaz, mas tem diversos efeitos adversos como edema e inflamação no local de aplicação, hipotensão, hipoglicemia, destruição hepática irreversível e nefrotoxicidade (PINHÃO, 2009). A via de aplicação é intramuscular e, segundo Ferrer (2008 apud MARQUES, 2008), a dose recomendada é de 4 mg/kg a cada 12 horas por uma semana. Já Pinhão (2009) recomenda a dose de 4 mg/kg uma a três vezes por semana por no mínimo seis semanas. A Aminosidina é um aminoglicosídeo que atua no bloqueio da síntese proteica e altera a permeabilidade da membrana celular do parasito. Apresenta nefro e ototoxicidade e para uma dosagem eficaz recomenda-se 40 mg/kg/dia via intramuscular com um período de remissão dos sintomas por até quatro anos (PINHÃO, 2009). A Marbofloxacina é uma fluorquinolona com ação antibacteriana, anticancerígena e antiparasitária. Sua eficácia foi comprovada em formas 45 promastigotas e em macrófagos com formas amastigotas intracelulares in vitro. É uma droga muito promissora para o tratamento da Leishmaniose, visto que é administrada por via oral uma vez ao dia. Porem mais estudos são necessários para comprovar sua ação em animais naturalmente infectados (MARQUES, 2008). O uso da associação Metronidazol e Espiramicina (Stomorgyl ®, Merial) tem demonstrado bons resultados nos estudos realizados. A dose recomendada é de 25 mg/kg de Metronidazol e 150.000 UI/kg de Espiramicina ao dia por via oral por três meses. Pode ser uma boa opção terapêutica para animais intolerantes ao tratamento convencional (PINHÃO, 2009). 1.10.7. Imunoterapia A imunoterapia é uma alternativa extremamente atraente para o tratamento da LVC. Atualmente as drogas disponíveis para tratamento são tóxicas, de alto custo e não promovem a cura total da doença. Além disso, pode haver resistência primária aos fármacos ou indução de resistência posterior para o tratamento da doença em humanos, por isso a OMS não recomenda o uso de drogas humanas para o tratamento de cães (TRIGO et al., 2010; ROATT et al., 2014). Novas estratégias de tratamento vêm sendo estudadas juntamente com o desenvolvimento de vacinas. Em 2002, Guarga et al. (2002 apud ROATT et al., 2014) avaliaram a eficácia de um protocolo de imunoquimioterapia para o tratamento de cães naturalmente infectados com L. infantum. Foi utilizado protocolo com Antimoniato de Meglumina associado à aplicação de solução antigênica de L. infantum. Os resultados foram favoráveis e demonstraram aumento na proporção de linfócitos T e redução da infecção do mosquito Phlebotomus perniciosus após o tratamento. Vários estudos têm sido realizados com a vacina feita a partir de um antígeno de fucose mannose ligan (FML) + saponina (Leishmune®, Zoetis) como imunoterápico. Borja-Cabrera et al. (2004, 2010) e Santos et al. (2007) utilizaram em 46 seus estudos 1,5 mg de FML associado à 1 mg de saponina (ao invés de 0,5 mg de saponina, como o produto é fabricado) sob o nome de Leishmune® enriquecida. A vacina foi administrada em três doses com intervalos de 20 a 30 dias entre elas. Borja-Cabrera et al. (2004) aplicaram as vacinas nos cães soropositivos para FML porem ainda assintomáticos. Os cães foram acompanhados por 22 meses e durante esse período não houveram óbitos (em contraste de 37% de óbito no grupo não tratado) e 90% dos animais permaneceram assintomáticos e livres do parasito. Já Santos et al. (2007) trabalharam com animais experimentalmente infectados e só iniciaram a aplicação das vacinas seis meses após a infecção, quando já haviam sinais clínicos. Nos resultados, os animais tratados apresentaram maiores níveis de IgG anti-FML, menores escores de sintomas clínicos e maiores níveis de linfócitos TCD4+ quando comparado ao grupo controle. Borja-Cabrera et al. (2010) compararam um grupo de cães com Leishmaniose tratados somente com Leishmune® enriquecida e outro com a associação de Alopurinol ou Anfotericina B e Alopurinol. Os resultados mostraram que a imunoterapia promoveu a redução dos sinais clínicos e da carga parasitária. Contudo, a imunoquimioterapia não apenas diminuiu estas taxas como negativou a PCR de aspirado de linfonodos em 80% dos animais, mostrando-se ainda mais eficaz. Miret et al. (2008 apud ROATT et al., 2014) realizaram outro estudo com imunoquimioterapia utilizando a vacina Leish-110f® + MPL-SE® (emulsão estável de monofosforil lipídio A) em associação com Glucantime® (Antimoniato de Meglumina) e mostrou que nos cães sintomáticos houve melhora dos parâmetros clínicos, redução do númerode animais parasita-positivos e redução do número de mortes quando comparado ao grupo controle, no qual foi utilizado somente adjuvante ou placebo. Trigo et al. (2010) fez um experimento com a vacina Leish-111f® + MPL- SE® comparando a imunoterapia com aplicações semanais por quatro semanas, o tratamento quimioterápico com Glucantime® (Antimoniato de Meglumina) por 30 dias, e a imunoquimioterapia, somando-se os dois primeiros protocolos. Após 36 meses de acompanhamento, obteve-se a cura clínica em 75% dos animais do grupo tratado somente com as vacinas, comparado a 64% e 50% de cura no grupo vacinas associado ao Glucantime® e somente Glucantime®, respectivamente. 47 Além das vacinas, onde o próprio antígeno é inoculado no animal, imunomoduladores vem sendo estudados e também podem ser utilizados. Santiago et al. (2013) testaram um imunomodulador chamado fosfolinoleato-palmitoleato de magnésio e amônio proteico (P-MAPA). Este é um composto obtido através da fermentação do fungo Aspergillus oryzae. Estudos já comprovaram que o composto não é tóxico em roedores, cães e humanos, e que em murinos, induz a proliferação de linfócitos T, aumenta a produção de citosinas e a atividade das células natural killers. No estudo realizado com cães com Leishmaniose sintomática, o grupo tratado com o P-MAPA apresentou aumento dos linfócitos TCD8+, IL-2 e IFN- e diminuição dos níveis de IL-10, resultando em melhora dos sinais clínicos e redução do parasitismo da pele. Diante dos resultados apresentados deve-se considerar o tratamento dos cães com Leishmaniose com imuno/imunoquimioterapia, pois através da diminuição do parasitismo é possível bloquear o ciclo de transmissão da doença (ROATT et al. 2014). 1.11. Controle e Profilaxia Segundo Pinhão (2009) a única maneira de prevenir a Leishmaniose é evitar a picada do mosquito vetor da doença. Para tal, é necessário adotar métodos químicos e de manejo, que em conjunto irão diminuir o risco de transmissão da doença. 1.11.1. Direcionado ao vetor O controle do mosquito flebótomo pode ser laborioso. É indicada a aplicação de inseticidas com ação residual nas áreas peridomésticas e canis, como 48 a deltametrina e cipermetrina, a cada seis meses. Cuidados de limpeza do ambiente também devem ser tomados, evitando o acúmulo de matéria orgânica e diminuindo o micro-habitat favorável ao mosquito (SCHIMMING; PINTO e SILVA, 2012). A colocação de telas finas nas casas e nos canis também é uma medida que deve ser tomada nas áreas endêmicas (MARQUES, 2008; GONÇALVES et al., 2013). 1.11.2. Direcionado aos cães As ações preventivas que podem ser realizadas com relação aos canídeos incluem a imunoprofilaxia, detalhada mais à frente; a utilização de inseticidas tópicos em formas de coleiras, pipetas ou sprays; e a erradicação (eutanásia) de animais soropositivos (MARQUES, 2008). A eutanásia dos cães soropositivos, apesar de ser recomendada pela OMS, é uma medida controversa no meio científico. Inúmeros estudos publicados demonstram que a erradicação dos cães infectados tem um baixo impacto no controle da Leishmaniose humana (MARQUES, 2008; BARRICHELO, 2010; SCHIMMING; PINTO e SILVA, 2012; PALATNIK-DE-SOUZA, 2012; FERNANDES, 2013; GONÇALVES et al., 2013). A ineficiência desta medida de controle deve-se a reposição dos animais: os cães eutanasiados são prontamente substituídos por outros susceptíveis, contribuindo para a manutenção da doença (BARRICHELO, 2010; FERNANDES, 2013). A utilização de coleiras impregnadas com deltametrina (Scalibor ®) tem demonstrado bons resultados. Pinhão (2009) alega que além de reduzir a taxa de alimentação do flebótomo, reduz também o seu tempo de vida. Marques (2008) afirma que a incidência de Leishmaniose em cães que usaram a coleira é de 2,5% com redução do risco de infecção em 84%. David et al. (2001 apud GONÇALVES et al., 2003) analisaram o impacto do encoleiramento dos cães em Fortaleza (CE) e obteve resultados muito satisfatórios, atingindo 90 a 100% de redução do repasto dos mosquitos por até 36 semanas. 49 O encoleiramento em massa pode ser de grande importância no controle desta doença, pois produz o efeito rebanho e reduz a força de infecção da doença (SCHIMMING; PINTO e SILVA, 2012). Através de simulações matemáticas, autores constataram que o uso da coleira em grande escala é mais efetivo no controle da doença quando comparado a eutanásia dos cães positivos em áreas endêmicas e menos efetivo em locais com menos casos (PALATNIK-DE-SOUZA, 2012; GONÇALVES, et al., 2013). O uso da Permetrina em associação ao Imidaclopride a 10% (Advantage®, Bayer), em pipeta spot on, também se mostrou muito eficaz no controle da Leishmaniose. Otranto et al. (2007 apud MARQUES, 2008) realizaram estudos com este produto, que demonstrou 90,36% de proteção dos cães contra o flebotomídeo se aplicado mensalmente e entre 90,73 e 100% quando aplicado quinzenalmente. Além dos inseticidas tópicos, é recomendado nas áreas endêmicas que os animais não fiquem expostos e evitar passeios ao entardecer e a noite, pois são os horários de maior atividade dos flebotomídeos (SOLANO-GALLEGO, 2009; SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012). 1.11.3. Imunoprofilaxia O desenvolvimento de vacinas eficientes no controle da Leishmaniose torna-se cada vez mais importante no contexto da doença, no qual o tratamento não é efetivo e em alguns países, como no Brasil, ainda se realiza a eutanásia em grande escala de cães soropositivos (SCHIMMING; PINTO E SILVA, 2012; FERNANDES, 2013). Após décadas de tentativas de produzir uma vacina segura e eficaz, hoje existem inúmeros relatos sendo reportados de vacinas caninas em testes no mundo todo (SOLANO-GALLEGO et al., 2009; FERNANDES; 2013). 50 As vacinas podem ser de primeira geração, com vírus morto ou vivo inativado; segunda geração, feitas a partir de antígenos purificados ou recombinantes; ou de terceira geração feitas com DNA (MARQUES, 2008; BARRICHELO, 2010; FERNANDES, 2013). Atualmente as vacinas para humanos estão todas em testes, e para os cães, as vacinas que são comercializadas são as de segunda geração. Para o desenvolvimento de uma vacina devem-se cumprir algumas fases de experimentação recomendadas pela OMS. Na fase I são feitos testes quanto à segurança da vacina; na fase II é determinada a imunogenicidade e os indivíduos são submetidos a um desafio experimental; na fase III realizam-se estudos a campo, randomizados, mascarados e controlados, a fim de comprovar a eficácia vacinal; e na fase IV faz-se a vigilância e pesquisa pós-registro do produto (BARRICHELO, 2010; FERNANDES, 2013). Das muitas vacinas em estudo, apenas duas vacinas concluíram o estudo da fase III: a FML, desenvolvida no Rio de Janeiro, e a LiESAp, desenvolvida no sul da França (BARRICHELO, 2010; PALATNIK-DE-SOUZA, 2012). Atualmente nenhuma destas vacinas está disponível comercialmente. O Brasil foi o primeiro país do mundo a comercializar vacinas contra Leishmaniose. A vacina composta por uma fração purificada denominada fucose mannose ligan (FML) e pelo adjuvante saponina QS21, sob o nome de Leishmune® (Zoetis) foi registrada no Ministério da Agricultura e Abastecimento (MAPA) em 2003 e obteve sua licença definitiva em 2011 (BARRICHELO, 2010; PALATNIK-DE- SOUZA, 2012; FERNANDES, 2013). Utilizada no país por veterinários desde 2004, a vacina teve sua fabricação e comercialização temporariamente suspensa pelo MAPA em novembro de 2014 (MAPA, 2014). A Leishmune® provou ser uma vacina segura e altamente imunogênicapara os cães. Em seus estudos da fase III demonstrou eficácia de 80% e proteção de 95% com duração de até três anos e meio. Ao mesmo tempo, demonstrou redução na incidência de Leishmaniose humana na área de estudo (BORJA- CABRERA et al., 2008). Esta vacina também demonstrou uma capacidade de bloquear a transmissão da doença, pois inibe as formas amastigotas de se ligarem ao sistema 51 digestivo do mosquito vetor, impedindo que se complete o seu ciclo (SARAIVA et al., 2006 apud FERNANDES, 2013). A outra vacina que atingiu a fase III foi a LiESAp, composta por proteína excretada 54-kDa de L. infantum e muramil dipeptídeo (MDP) como adjuvante. Ela alcançou uma taxa de 92% em eficácia vacinal, porem não está comercialmente disponível nesta formulação. Outra fórmula relacionada à esta foi registrada e licenciada na Europa em 2011 sob o nome de CaniLeish® (Virbac), composta por proteínas excretadas-secretadas da L. infantum (LiESP) e saponina QA21como adjuvante, diferente dos estudos publicados com MDP (PALATNIK-DE-SOUZA, 2012; FERNANDES, 2013). Por fim, ainda há uma vacina disponível comercialmente no Brasil, a Leish-Tec® (Hertape-Calier), que foi registrada no MAPA em 2008. É uma vacina recombinante constituída pelo antígeno da proteína A2 e tem como adjuvante a saponina. A vacina foi desenvolvida em parceria com a Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e ainda está em estudo, não tendo a fase III publicada (PALATNIK-DE-SOUZA, 2012; FERNANDES, 2013). Fernandes (2013) cita um estudo duplo cego com esta vacina com 1.650 cães vacinados e acompanhados por um ano, sendo que 90% permaneceram não infectados, demonstrando uma eficácia vacinal de 71%. Deve-se levar em consideração que a eficácia vacinal também pode variar de acordo o ambiente, idade do indivíduo, condições sanitárias da população, densidade populacional, prevalência de infecções e principalmente abrangência da vacinação, que deve ser maior de 95% para um bom resultado (BARRICHELO, 2010). Para a vacinação, é recomendado realizar o exame sorológico antes para comprovação da negatividade e então realizar três aplicações com intervalo de 21 dias entre elas, e revacinação anual. Atualmente há uma grande resistência por parte do governo em utilizar as vacinas como método de controle da doença. A pesar de comprovada a eficácia das vacinas, o seu uso não é indicado pelo Ministério da Saúde, pois, segundo o órgão, são necessários mais estudos que comprovem a segurança e benefício para a saúde pública (BRASIL, 2013). 52 O alto custo das vacinas e a falsa ideia de que não é possível a diferenciação sorológica entre cães vacinados e cães infectados talvez sejam os principais motivos pelos quais a vacina não é utilizada em larga escala. Grecco, Madi e Alegretti (2009) demonstraram negatividade sorológica em 87,1% e 97,4% de cães vacinados com Leishmune® nos testes ELISA e RIFI L. major like, respectivamente. Apenas o teste ELISA FML, que utiliza a mesma proteína da vacina, é que não foi capaz de diferenciar os vacinados dos infectados, porem este não é um teste padrão. Conclui-se assim, que a vacinação tem alto poder imunogênico protegendo o animal da doença, diminui a transmissibilidade e infectividade e pode- se diferenciar sorologicamente cães vacinados de cães infectados, mostrando-se uma ótima ferramenta para controle da doença. 53 2. RELATO DE CASO 2.1. Anamnese e Exame Clínico Na cidade de Curitiba (PR), um cão de nome Nina, daschund, fêmea, 10 meses de idade, pesando 4,1 kg foi levado ao consultório particular com queixa de apatia leve, hiporexia e rarefação pilosa generalizada. Seis meses antes o animal havia sido diagnosticado e tratado com sucesso para demodiciose (Figura 11). Figura 11 – Cão, daschund, fêmea, 4 meses de nome Nina diagnosticada com Demodiciose. Fonte Arquivo pessoal (2012). Na anamnese, o proprietário relatou que viajou com o animal para Araguaína (Tocantins) e lá permaneceu por dois meses. Foi no final deste período 54 que o animal entrou em cio e apresentou falta de apetite e lesões na pele. A consulta foi realizada dois dias após o retorno da viagem e 13 dias após o início do cio, segundo o proprietário. Ao exame clínico observou-se mucosas hipocoradas, TPC três segundos, temperatura retal de 38,5ºC, desidratação leve, pulso forte e baixo escore corporal. Os linfonodos encontravam-se normais à palpação, nível de consciência alerta e postura e marcha normais. À inspeção direta da pele foi evidenciada rarefação pilosa e descamação furfurácea generalizada (Figura 12). Figura 12 – Cão, daschund, fêmea, 10 meses, de nome Nina, diagnosticada com Leishmaniose, apresentando rarefação pilosa generalizada e baixo escore corporal. Fonte Arquivo pessoal (2013). 55 2.2. Exames Complementares 2.2.1. Pesquisa direta de ectoparasitos Cinco raspados cutâneos foram realizados para a pesquisa de ectoparasitas, todos com resultado negativo. 2.2.2. Hemograma No eritrograma foi evidenciado moderada anemia microcítica normocrômica e no leucograma foi observada leucopenia por neutropenia eosinopenia e monocitopenia associado a hiperproteinemia. As plaquetas estavam no limite inferior. Os valores são mostrados na Tabela 1. 56 Tabela 1 – Valores obtidos no hemograma da paciente Nina, canina, fêmea, 10 meses, diagnosticada com Leishmaniose. Parâmetros Resultados Referências ERITROGRAMA Eritrócitos (milhões/µL) 4,83 5,5 a 8,5 Hemoglobina (g/dL) 9,3 12 a 18 Hematócrito (%) 28 37 a 55 VCM (u³) 57,97 60 a 77 CHCM (%) 33,21 32 a 36 OBS. Rouleaux eritrocitário + LEUCOGRAMA Leucócitos (/mm³) 5.340 6.000 a 17.000 Neutrófilos (/mm³) 2.830,20 3.000 a 11.800 Metamielócitos (/mm³) 0 0 Bastonetes (/mm³) 0 0 a 300 Segmentados (/mm³) 2.830,20 3.000 a 11.500 Eosinófilos (/mm³) 53,4 100 a 1.250 Basófilos (/mm³) 0 Raros Linfócitos (/mm³) 2.456,40 100 a 4.800 Monócitos (/mm³) 0 100 a 1.250 OBS. Leucócitos degenerados Plaquetas (/mm³) 154.430 150.000 a 400.000 Proteína Plasmática (g/dL) 12,0 5,8 a 7,8 Fonte: Jain (1993), Kaneko, Harvey e Bruss (1997). 2.2.3. Avaliação bioquímica sérica A Tabela 2 mostra os exames bioquímicos realizados. Todos os resultados encontravam-se dentro da normalidade. 57 Tabela 2 – Valores obtidos na avaliação bioquímica sérica da paciente Nina, canina, fêmea, 10 meses, diagnosticada com Leishmaniose. Parâmetros Resultados Referências ALT (UI/L) 10,3 0 a 102 Creatinina (mg/dL) 0,8 0,5 a 1,5 Fosfatase Alcalina (UI/L) 54,6 0 a 156 Glicose (mg/dL) 104 65 a 118 Uréia (mg/dL) 30,5 21 a 60 Fonte: Jain (1993), Kaneko, Harvey e Bruss (1997). 2.2.4. Pesquisa de hemoparasitas Diante do resultado apresentado no hemograma, foi realizado esfregaço sanguíneo de sangue periférico coletado de borda de orelha para a pesquisa de hemoparasitas. O resultado foi negativo. 2.2.5. Sorologia para Leishmaniose (RIFI/ELISA) A sorologia para Leishmaniose foi realizada através dos testes padrão ELISA e RIFI. Os dois testes não foram reagentes neste primeiro momento, indicando a ausência de anticorposanti-leishmania. 58 2.3. Evolução do caso Foi instituído tratamento com Doxiciclina via oral (50 mg/Kg) a cada 12 horas e complexo vitamínico aminoácido suplementar (Glicopan®). O animal foi acompanhado e novos hemogramas foram realizados com intervalo de sete e 45 dias do primeiro, sem grandes alterações, como pode se visualizar na Tabela 3. Tabela 3 – Valores obtidos no hemograma da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose após 7 e 45 dias do seu primeiro atendimento. Parâmetros 7 dias 45 dias Referências ERITROGRAMA Eritrócitos (milhões/µL) 4,64 5.64 5,5 a 8,5 Hemoglobina (g/dL) 8,3 9.3 12 a 18 Hematócrito (%) 26 31 37 a 55 VCM (u³) 56,03 54.96 60 a 77 CHCM (%) 31,92 30 32 a 36 OBS. Poiquilocitose + Poiquilocitose + Rouleaux eritrocitário ++ LEUCOGRAMA Leucócitos (/mm³) 5.090 5.800 6.000 a 17.000 Neutrófilos (/mm³) 3.563 4.060 3.000 a 11.800 Metamielócitos (/mm³) 0 0 0 Bastonetes (/mm³) 50,9 0 0 a 300 Segmentados (/mm³) 3512,1 4.060 3.000 a 11.500 Eosinófilos (/mm³) 0 0 100 a 1.250 Basófilos (/mm³) 0 0 Raros Linfócitos (/mm³) 1.527 1.682 100 a 4.800 Monócitos (/mm³) 0 58 100 a 1.250 Plaquetas (/mm³) 180.000 250.000 150.000 a 400.000 Proteína Plasmática (g/dL) 11,6 11 5,8 a 7,8 Fonte: Jain (1993), Kaneko, Harvey e Bruss (1997). Durante o período de 60 dias após o primeiro atendimento, o quadro clínico sofreu algumas alterações. As áreas alopécicas e rarefeitas aumentaram, 59 especialmente na região da cabeça, cauda e patas. O animal ficou menos hiporético e mais ativo, mesmo apresentando hipertermia (que variou de 39,5ºC a 40,5ºC) e linfoadenomegalia. Também houve um episodio de diarreia com sangue vivo, blefarite e conjuntivite. Optou-se pela realização de uma biópsia de pele e outros exames para diagnóstico. 2.4. Exames diagnósticos 2.4.1. Histopatológico de pele A análise histopatológica da pele revelou hiperplasia regular discreta na epiderme com dilatação de óstios foliculares. Havia presença de infiltrado inflamatório rico em plasmócitos, linfócitos e histiócitos na derme superficial e média, assim como alguns focos de infiltração piogranulomatosa (neutrófilos e macrófagos). Os folículos pilosos se apresentaram com hiperqueratose leve a moderada. Não foram evidenciados parasitos foliculares ou sinais de displasia folicular ou pigmentar. Foram visualizados alguns raros organismos morfologicamente compatíveis com a forma amastigota da Leishmania sp. em espaço extracelular e intracelular em macrófagos. A conclusão do histopatológico foi Dermatite Linfohistioplasmocitária em padrão perivascular e perianexal com obliteração das glândulas sebáceas e presença de organismos morfologicamente compatíveis com a forma amastigota da Leishmania sp. (Leishmaniose). 60 2.4.2. Sorologia para Leishmaniose (RIFI/ELISA) Uma segunda sorologia para Leishmaniose foi realizada três meses após a primeira. Os exames padrão ELISA e RIFI foram utilizados e neste segundo momento foram reagentes indicando a presença de anticorpos anti-leishmania. 2.4.3. PCR para Leishmaniose Um exame de PCR de amostra de sangue foi solicitado juntamente com a sorologia e foi positivo, indicando a presença do parasita na corrente sanguínea. 2.4.4. Citologia de linfonodo Foi realizada punção aspirativa de linfonodo poplíteo para citologia, porem o resultado foi inconclusivo devido à baixa celularidade de material de linfonodo coletado e a alta quantidade de gordura observada na lâmina. 61 2.5. Tratamento instituído Foi instituído um protocolo imunoterápico com três doses duplas da vacina Leishmune® aplicadas a cada 21 dias e com reforço semestral e quatro meses depois foi associado o Alopurinol 20 mg/kg a cada 12 horas. Além disso, foram dadas instruções aos proprietários sobre a importância da doença e o seu controle, orientando para que o animal não viaje para áreas endêmicas e sempre utilize a coleira de deltametrina e pour on repelentes de mosquito. 2.6. Monitoramento da paciente O animal evoluiu lenta e satisfatoriamente com o tratamento instituído. Após o quarto mês de tratamento a paciente já havia repilado boa parte do corpo permanecendo apenas com alopecia na cauda, na região periocular e blefarite (Figura 13). Neste mesmo período o animal já havia recuperado o apetite, porem os linfonodos permaneciam levemente aumentados, temperatura retal em torno de 39,8ºC e mucosas hipocoradas. 62 Figura 13 – Cão, daschund, fêmea, 10 meses, de nome Nina, diagnosticada com Leishmaniose, apresentando rarefação pilosa periocular e blefarite. Fonte: Arquivo pessoal (2013). No oitavo mês de tratamento o animal estava totalmente repilado, porem todos os sinais desapareceram somente após um ano. Foram realizados exames de hemograma, bioquímicos e citologia da medula para monitoramento da paciente. 2.6.1. Exames laboratoriais Nos primeiros seis meses foi realizado hemograma mensalmente. Todos os exames apontaram anemia (microcítica variando de hipocrômica a normocrômica), plaquetas no limite inferior e aumento das proteínas plasmáticas. Neste período o hematócrito variou entre 22% e 33%, os leucócitos totais de 2.200/mm³ a 9.500/mm³, as plaquetas de 125.000/mm³, a 278.000/mm³ e a proteína plasmática de 7,6 g/dL a 12,2 g/dL (Tabela 4). 63 Tabela 4 – Valores dos exames de hemograma mensais realizados no ano de 2013 após confirmação do diagnóstico de Leishmaniose na paciente Nina, canina, fêmea. Os parâmetros eu se encontram abaixo das referencias se encontram em negrito. Parâmetros Resultados em: Referências Jul/13 Ago/13 Set/13 Out/13 Nov/13 ERITROGRAMA Eritrócitos (milhões/µL) 4,45 4,75 3,33 4,00 5,54 5,5 a 8,5 Hemoglobina (g/dL) 8,1 9,2 6,8 7,0 10,7 12 a 18 Hematócrito (%) 25 27 23 22 33 37 a 55 VCM (u³) 56,18 56,84 69,69 55,00 59,57 60 a 77 CHCM (%) 32,4 34,07 29,56 31,82 32,42 32 a 36 LEUCOGRAMA Leucócitos (/mm³) 8.600 7.000 6.300 2.200 9.500 6.000 a 17.000 Neutrófilos (/mm³) 6.622 4.900 3.843 1.584 6.935 3.000 a 11.800 Metamielócitos (/mm³) 0 0 0 0 0 0 Bastonetes (/mm³) 0 0 441 66 0 0 a 300 Segmentados (/mm³) 6.622 4.900 3.402 1.518 6.935 3.000 a 11.500 Eosinófilos (/mm³) 172 120 0 22 95 100 a 1.250 Basófilos (/mm³) 0 0 0 0 0 Raros Linfócitos (/mm³) 1.806 1.960 2.142 594 2.470 100 a 4.800 Monócitos (/mm³) 0 0 315 0 0 100 a 1.250 Plaquetas (/mm³) 200.100 168.400 125.000 188.000 278.000 150.000 a 400.000 Prot. Plasmática (g/dL) 7,6 12,2 9,8 12,0 10,2 5,5 a 7,8 Fonte: Jain (1993), Kaneko, Harvey e Bruss (1997). Após seis meses de tratamento, o hemograma passou a ser realizado a cada três/quatro meses. Neste segundo momento observou-se leve aumento geral dos leucócitos, que variaram de 4.300/mm³ a 13.670/mm³. A anemia, agora normocítica normocrômica persistiu nestes exames, assim como a alta proteína plasmática e plaquetas no limite inferior. Os valores podem ser observados na Tabela 5. 64 Tabela 5 – Valores dos exames de hemograma realizados no ano de 2014 após confirmação do diagnóstico de Leishmaniose na paciente Nina, canina, fêmea. Parâmetros Resultados em: Referências Jan/14 Mar/14 Jun/14Jul/14 Dez/14 ERITROGRAMA Eritrócitos (milhões/µL) 6,88 4,52 3,59 3,48 5,99 5,5 a 8,5 Hemoglobina (g/dL) 16,0 10,7 8,2 7,8 12,4 12 a 18 Hematócrito (%) 46 27 23 27 36 37 a 55 VCM (u³) 67,65 59,73 64,07 79,41 59,93 60 a 77 CHCM (%) 34,68 39,63 35,65 28,89 34,54 32 a 36 LEUCOGRAMA Leucócitos (/mm³) 4.300 5.090 13.670 8.100 5.100 6.000 a 17.000 Neutrófilos (/mm³) 2.322 3.716 10.526 4.374 2.499 3.000 a 11.800 Metamielócitos (/mm³) 0 0 0 0 0 0 Bastonetes (/mm³) 172 0 0 162 153 0 a 300 Segmentados (/mm³) 2.150 3.716 10.526 4.212 2.346 3.000 a 11.500 Eosinófilos (/mm³) 0 0 136,7 0 0 100 a 1.250 Basófilos (/mm³) 0 0 0 0 0 Raros Linfócitos (/mm³) 1.677 1.323 3.007 3.159 2.601 100 a 4.800 Monócitos (/mm³) 301 50,9 0 567 0 100 a 1.250 Plaquetas (/mm³) 160.000 204.000 192.000 x 152.000 150.000 a 400.000 Prot. Plasmática (g/dL) 8,6 10,0 11,0 11,8 9,0 5,8 a 7.8 Fonte: Jain (1993), Kaneko, Harvey e Brass (1997). Os Gráficos 2, 3, 4 e 5 mostram a variação do eritrograma, leucograma, plaquetas e proteínas plasmáticas, respectivamente, de acordo com o tempo (meses após a infecção). 65 Gráfico 2 – Valores do hematócrito da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção). Fonte: A autora. Gráfico 3 – Valores dos leucócitos da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção). Fonte: A autora. 0 10 20 30 40 50 60 2 2,5 4 7 8 9,5 10 10,5 12 13,5 16 18,5 19 24 H e m at ó cr it o ( % ) Meses após infecção Hematócrito após infecção com Leishmania Hematócrito (%) Valores referenciais mín. e máx. Início do tratamento com imunoterapia Início do tratamento com Alopurinol 0 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000 16.000 18.000 2 2,5 4 7 8 9,5 10 10,5 12 13,5 16 18,5 19 24 Le u có ci to s/ m m ³ Meses após infecção Leucócitos após infecção com Leishmania Leucócitos (/mm³) Valores referenciais mín. e máx. Início do tratamento com Alopurinol Início do tratamento com imunoterapia 66 Gráfico 4 – Valores das plaquetas da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção). Fonte: A autora. Gráfico 5 – Valores das proteínas plasmáticas da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose, através do tempo (meses após a infecção). Fonte: A autora. 0 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 450.000 2 2,5 4 7 8 9,5 10 10,5 12 13,5 16 18,5 19 24 P la q u e ta s/ m m ³ Meses após infecção Plaquetas após infecção com Leishmania Plaquetas (/mm³) Valores referenciais mín. e máx. Início do tratamento com imunoterapia Início do tratamento com Alopurinol 0 2 4 6 8 10 12 14 2 2,5 4 7 8 9,5 10 10,5 12 13,5 16 18,5 19 24 P ro te ín a P la sm át ic a (g /d L) Meses após infecção Proteína Plasmática após infecção com Leishmania Proteína Plasmática (g/dL) Valores referenciais mín. e máx. Início do tratamento com imunoterapia Início do tratamento com Alopurinol 67 Os exames bioquímicos realizados neste período não apresentaram anormalidades (Tabela 6). Tabela 6: Valores dos parâmetros bioquímicos realizados para acompanhamento após confirmação do diagnóstico de Leishmaniose na paciente Nina, canina, fêmea. DATA Abr/13 Out/13 Out/13 Jan/14 Jun/14 Dez/14 REFERÊNCIAS Albumina (g/dL) - 2,1 2,2 - - 2,4 2,6 a 3,3 ALT (UI/L) 17,3 17,3 17,8 35 - 24,3 0 a 102 Creatinina (mg/dL) 0,8 0,7 0,6 0,8 0,6 0,7 0,5 a 1,5 Colesterol (mg/dL) - - - 148 - 110 135 a 270 Fosfatase Alcalina (UI/L) - 90,7 - 93 - 24,6 0 a 156 Globulinas (g/dL) - 9,9 9,8 - - 7 2,3 a 5,2 Triglicerídeos (mg/dL) - - - 38 - 65,1 < 150 Uréia (mg/dL) 38,4 30,9 - - 17,4 32,6 21 a 60 Fonte: Jain (1993), Kaneko, Harvey e Bruss (1997). 2.6.2. Citologia de medula óssea Foram realizadas três citologias de medula óssea da paciente (setembro de 2013, janeiro de 2014 e julho de 2014) para analisar as funções hematopoiéticas e verificar a presença ou ausência do parasita. Em todas elas o parasita estava presente intracelularmente, como mostra a Figura 14. 68 Figura 14 – Citologia da medula óssea da paciente Nina, canina, fêmea, Daschund, realizada em setembro de 2013, mostrando macrófago contendo duas Leishmania spp. intracitoplasmáticas e uma no espaço extracelular. Fonte: Ana Laura D’Amico Fam (2014). Nas três análises citológicas, o valor dos metarubrócitos foi superior ao de rubrócitos, o que não é o convencional. Esta alteração leva o nome de desvio à direita e ocorre em fases de recuperação da medula óssea ou no início de hipoplasia eritróide. Outra alteração encontrada foi ausência ou diminuição de megacariócitos (células precursoras das plaquetas), levando à trombocitopenia circulante. Os valores da contagem celular dos três mielogramas estão na Tabela 7. 69 Tabela 7 – Valores obtidos na contagem celular de medula óssea da paciente Nina, canina, fêmea, diagnosticada com Leishmaniose. TIPO CELULAR Set./2013 Jan./2014 Jul./2014 Referência (%) Cão n=6 Mieloblasto 4,4 1 2,8 0,4 a 1,1 Promielócito 5,6 1,4 2 1,1 a 2,3 Neutrófilo Mielócito 5,6 3,2 3,6 3,1 a 6,1 Neutrófilo Metamielócito 5,8 5,8 6 5,3 a 8,8 Neutrófilo Bastonete 23,6 12,8 10,8 12,7 a 17,2 Neutrófilo Segmentado 11,2 16,4 16,4 13,8 a 24,2 Eosinófilos – total de células 2,8 0,4 1,2 0,8 a 3,2 Basófilos – total de células 0 0 0 0 a 0,8 Rubroblasto 0,8 0,8 1,2 0,2 a 1,1 Prorubrócito 2,6 1,4 2 0,9 a 2,2 Rubrócito Basofílico 4,8 4,8 4,4 3,7 a 10,0 Rubrócito Policromático 10 15,8 14 15,5 a 25,1 Metarubrócito 15,8 32,4 10 9,2 a 16,4 Relação M:E 1,73:1 0,74:1 1,35 0,5:1 a 3:1 Linfócitos 1,6 0,8 5,6 1,7 a 4,9 Plasmócitos 0,2 1 5,2 0,6 a 2,4 Macrófagos 2,8 0,8 14 0 a 0,4 Outras células – mitose 2 1 0,8 0 Megacariócitos 0 0,2 raros 1/campo 4x Fonte: Laboratório Veterinário PróVita 70 3. DISCUSSÃO A Leishmaniose é uma doença de ampla distribuição mundial e no Brasil já há casos em todos os estados. O Paraná é considerado uma área indene onde somente casos alóctones são relatados, o que torna o diagnóstico mais improvável nesta área (SILVA et al., 2012; THOMAZ-SOCCOL et al., 2009). No presente caso, o fato do animal ter viajado para área endêmica e lá ter apresentado os primeiros sinais da doença facilitou incluir a Leishmaniose como diagnóstico diferencial. Em contrapartida, o diagnóstico definitivo foi complexo, pois o primeiro exame realizado de sorologia resultou não reagente. Segundo Elmahallawy et al. (2014), baixos níveis de anticorpos podem não ser detectáveis pelos testes sorológicos. Porem, neste caso, é possível que no momento do primeiro teste ainda não houvesse ocorrido a soroconversão, que, segundo Marques (2008), pode levar de um mês e meio à três meses após a infecção. Os sinais clínicos da Leishmaniose VisceralCanina, assim como os exames laboratoriais, são inespecíficos e semelhantes aos de outras doenças, como a Erlichiose, Babesiose e Toxoplasmose, o que dificulta o seu diagnostico (SILVA et al., 2012). O diagnóstico definitivo do caso ocorreu quando formas amastigotas de Leishmania foram visualizadas no histopatológico da pele, que também é uma forma de diagnóstico porem, menos comum (SONODA et al., 2013). Outros testes de sorologia foram então realizados, juntamente com PCR, e resultaram positivos. No presente relato, o animal apresentou emagrecimento, hipertermia, dermatite esfoliativa aprurídica com alopecia generalizada, linfoadenomegalia, blefarite e conjuntivite, todos sinais comuns segundo a literatura (SONODA et al., 2013; SOLANO-GALLEGO et al., 2009; MARQUES, 2008). As alterações laboratoriais encontradas, como anemia, leucopenia, trombocitopenia e hiperproteinemia com hiperglobulinemia, são achados hematológicos frequentes da doença (MARQUES, 2008). Segundo Ribeiro et al. (2013) anemia, disproteinemia e azotemia são as alterações laboratoriais mais comuns em pacientes com Leishmaniose, sendo que 71 as duas primeiras estavam presentes no caso. Este autor constatou que a provável causa da anemia esteja relacionada a função hematopoiética da medula óssea e a as alterações que a infecção gera nela, além do fato da medula óssea ser o principal alojamento do parasita. É provável que seja o mecanismo envolvido como causador da anemia e trombocitopenia no presente relato, visto que foi constatada hipoplasia da linhagem plaquetária na citologia de medula óssea. O protocolo de imunoterapia instituído foi descrito como eficaz em vários trabalhos (BORJA-CABRERA, et al., 2010 e 2004; SANTOS et al., 2007). Apesar do Alopurinol não ser eficaz quando utilizado como droga única (CIARAMELLA; CORONA, 2003 apud PINHÃO, 2009), ele foi usado como medicação leishmaniostática neste caso, uma vez que no Brasil não é permitido o tratamento de cães com medicações utilizadas para tratamento humano (Anfotericina B). Até a presente data, o tratamento realizado neste animal, apesar de não ter atingido a cura clínica, se demonstrou favorável, pois melhorou a qualidade de vida da paciente com remissão dos sinais clínicos, embora sem normalizar as alterações laboratoriais. 72 CONCLUSÃO Apesar da Leishmaniose ser uma doença em expansão e estar presente em quase todos os estados brasileiros, o Paraná é uma região indene, onde apenas casos alóctones já foram relatados e o principal gênero do mosquito transmissor (Lu. longipalpis) foi identificado apenas na cidade de Foz do Iguaçu. O diagnóstico definitivo da doença é complexo, pois há grande variedade sinais clínicos inespecíficos como lesões cutâneas, linfoadenomegalia, anorexia, apatia e perda de peso. O longo período de soroconversão e a inexistência de um teste padrão ouro para diagnóstico também são fatores que dificultam. Muitas vezes é necessário realizar mais de dois tipos de testes como ELISA, RIFI, PCR, citologia e histopatológico para confirmar a Leishmaniose Canina. O tratamento deve ser realizado com responsabilidade, uma vez que o animal infectado é um importante reservatório e representa perigo para saúde pública. Embora a principal política de controle brasileira seja a exterminação de cães soropositivos, atualmente ações já foram julgadas em favor do tratamento e contra tal posicionamento. Ressalta-se a importância de realizar exames laboratoriais sequenciais de pacientes acometidos pela doença, uma vez que podem mostrar extensão do dano medular. O tratamento realizado na paciente com a vacina Leishmune® e Alopurinol se mostrou efetivo até certo ponto, já que houve remissão total dos sinais clínicos, embora não dos parâmetros eritro e leucocitários. A qualidade de vida da paciente pode ser garantida com tratamento imunoterápico e leishmaniostático, comprovando que a eutanásia não seria uma opção válida neste caso. 73 REFERÊNCIAS ALMEIDA, Arleana do Bom Parto Ferreira de et al. Canine visceral leishmaniasis: seroprevalence and risk factors in Cuiabá, Mato Grosso, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Jaboticabal, v. 21, n. 4, p. 359-365, out. - dez. 2012. ANDRADE, Cynthia Rayol de et al. Leishmanioses: manual online. Disponível em: https://www.ufpe.br/biolmol/Leishmanioses-Apostila_on_line/index.htm. Acesso em: 10 de jan. 2015. BANETH, G.; SHAW, S.E. Chemotherapy of canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology, v. 106, n. 4, p. 315-324, 2002. BARRICHELLO, Fabiana Farinello Grecco. 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