Imunohistoquímica

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Imunologia Veterinária 
Profª Benta Natania Silva Figueiredo – Faculdade Católica do Tocantins
Acadêmicos: Emanuel, Isabella Louly, Jheniffer Alencar, Laura Andrade, Ludyone, Mateus Ramos e Marcela Leopoldino.
IMUNOHISTOQUÍMICA
O QUE É IMUNOHISTOQUÍMICA?
O termo Imunohistoquímica surgiu das palavras: imunologia, histologia e química. 
A imunologia estuda o sistema imunológico, a histologia estuda tecidos e órgãos utilizando-se o microscópio, após a sua coloração. 
IMUNOHISTOQUÍMICA
QUÍMICA
HISTOLOGIA
IMUNOLOGIA
Reações antígeno-anticorpo
Células e tecidos
Reações químicas
É a conjugação de marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com o auxilio de um substrato específico localiza o antígeno tecidual.
O PRINCÍPIO DA TÉCNICA
A utilização da técnica de IHQ já é uma realidade nos Estados Unidos e países da Europa e vem ganhando espaço entre os exames complementares de diagnósticos na rotina oncológica dos animais de companhia. 
IMUNOHISTOQUÍMICA
DEFINIÇÕES
Antígeno: qualquer substância que sob condições apropriadas é capaz de estimular a formação de anticorpos.
Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um antígeno e reage especificamente com esse formando imunocomplexos.
MECANISMO BÁSICO
PREPARO DA AMOSTRA
PREPARO DA AMOSTRA
Processamento do tecido
5. Desidratação: álcool absoluto (3x)
6. Clarificação: Xilol (2x)
7. Inclusão: Parafina (2x). Não se deve ultrapassar a temperatura de 60ºc.
8. Microtomia: Secagem na estufa 60ºC por 24h
PREPARO DA AMOSTRA
Desparafinizacao: Xilol, Etanol absoluto, Etanol 95%, Etanol 70%
Bloqueio da peroxidase endógena: Peróxido de hidrogênio 3% 
Lavar as lâminas em agua corrente e destilada e em seguida com solução salina tamponada com pH de 7,4 à 7,6 por 30 minutos
Pode ocorrer interferências pela ação de enzimas endógenas
Ligação inespecífica de anticorpos com as proteínas do tecido
Principais causas de coloração de fundo sem especificidade e indesejável em IHQ.
Necessárias reações para bloqueio dessas moléculas.
PREPARO DA AMOSTRA
PREPARO DA AMOSTRA
10. Incubação com anticorpo
Aplicação do Ac. Primário (1h a 37ºC)
Aplicação com o Ac. Secundário Biotinilado (30 min a 37ºC)
Aplicação do Reagente Peroxidase (20 min a 37ºC)
PREPARO DA AMOSTRA
O objetivo é evidenciar as células para que se tornem mais visíveis e contrastadas em microscópio. Onde normalmente é usada a hematoxilina. 
Após a coloração, adicionar a lamínula para proteção do tecido já aderido à lâmina.
Coloca-se o cromógeno, DAB, na lâmina
Contra-coloração
HEMATOXILINA
Álcool 95%
Álcool Absoluto
Xilol
Montar as lâminas
11. Contra-coloração 
RESULTADO DA TÉCNICA
RESULTADO DA TÉCNICA
É uma proteína que confere aderência às células e é de grande importância na diferenciação epitelial.
É um potente supressor de invasão nos tumores mamários e a perda da sua expressão tem relação com um prognóstico ruim.
E-caderina
MÉTODOS UTILIZADOS
PARA MARCAR ANTICORPOS:
Conjugação com composto fluorescente
Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispensa elétrons (ouro ou prata)
Conjugação com uma enzima: Peroxidase
Resultando assim na molécula colorida
MÉTODOS UTILIZADOS
Cromógeno mais utilizado é o diaminobenzidina (DAB)
Específico para Peroxidase
Origina um precipitado marrom, visível ao microscópio:
Carcinoma ductal
MÉTODO DIRETO
MÉTODO INDIRETO
MÉTODO PEROXIDASE ANTI-PEROXIDASE
(PAP)
MÉTODO DO COMPLEXO AVIDINA-BIOTINA
(ABC)
MÉTODO FOSFATASE ALCALINA ANTI-FOSFATASE ALCALINA
(APAAP)
APLICAÇÕES DA IMUNOHISTOQUÍMICA
Diferenciar uma proliferação celular maligna e benigna
Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente indiferenciadas
Subtipagem de neoplasia para seleção terapêutica 
Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas (ex: hormônios)
Caracterizar a origem de carcinomas
Identificar micrometástases
Avaliação prognóstica (ex: detecção de receptoras hormonais em neoplasia mamária)
Orientação terapêutica
EM NEOPLASIAS
APLICAÇÕES DA IMUNOHISTOQUÍMICA
Virais: dengue, febre amarela, citomegalovírus, adenovírus, etc.
Bacterianos: micobactérias, leptospiras.
De fungos: Paracoccidioides, Histoplasma, etc.
De protozoários: Toxoplasma, Trypanosoma cruzi, Leishmania sp, Plamodium sp.
De Helmintos: Schistosoma.
PARA DETECÇÃO DE ANTÍGENOS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 
< https://pt.wikipedia.org/wiki/Imuno-histoqu%C3%ADmica >
 
< http://www.vetmol.com.br/Prod_Default.aspx?cat=1010 >
 
< http://www.rpm.fmrp.usp.br/kit/Manual_de_Imuno-histoquimica.pdf >
 https://pathologika.com/imuno-histoquimica/metodos-imunohistoquimicos/ 
< http://www.ageracaociencia.com/2017/09/29/tecnica-de-imuno-histoquimica/ >
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