Métodos de avaliação em toxicologia II

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Métodos de avaliação em 
toxicologia II
Prof. Msc. Mauricio S. Bassuino
mauricio.bassuino@fsg.br
Sistema Imune
• Identificar e defender o organismo contra corpos estranhos
• Os corpos estranho podem ser reconhecidos na forma íntegra ou
apenas parte de sua estrutura superficial
Sistema Imune
• Atua de duas formas:
- Detectando
- Inativando
• Leucócitos:
- Linfóide  linfócitos
- Mielóide monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e 
basófilos
Sistema Imune - Linfócitos
• Linfócitos T
- Auxiliares: coordenam a resposta imune, reconhecendo o agente agressivo
e ativando as funções efetoras
- Citotóxicos: destroem as moléculas estranhas
• Células NK
- Reconhecem e destroem inespecificamente as moléculas estranhas
• Linfócitos B
- Diferenciam-se em plasmócitos e produzem anticorpos (Ac) específicos
Sistema Imune – Linfócitos B
• Caracterizados pela presença de imunoglobulinas (Ig) em sua
superfície
• As Ig atuam como receptores específicos para antígenos
• Os plasmócitos são os responsáveis pela produção de Ac para a
resposta imune
Sistema Imune – Antígeno (Ag)
• Toda estrutura capaz de reagir com as células do sistema imune ou
com os anticorpos
- Imunogenicidade: capacidade desta molécula tem de induzir uma
resposta imunológica
- Antigenicidade: capacidade de uma molécula tem de interagir com
o sistema imune
Sistema Imune – Antígeno (Ag)
- Epítopo: sítio de ligação específico que é reconhecido por um
anticorpo ou por receptor de célula T, capaz de gerar uma resposta
imune
• Cada antígeno pode conter um ou mais epítopos
Sistema Imune – Anticorpos (Ac)
• Substâncias com capacidade de se ligar de forma específica
aos Ag´s, para identificar e destruir
• Os Ac apresentam a habilidade e variabilidade de
reconhecimento antigênico e e força de ligação com os Ag
Sistema Imune – Anticorpos (Ac)
Anticorpos Monoclonais
• São Ac que apresentam características iguais entre si, ligando ao 
mesmo epítopo
- Vantagens dos Monoclonais
Alta especificidade e afinidade
Determinação de um só epítopo
Anticorpos Policlonais
• São Ac de diferentes linhagens de linfócitos B
• São misturas de moléculas de Ig secretadas contra um Ag, cada
um reconhecendo um epítopo diferente
Reação cruzada
Principais métodos imunológicos
• Radioimunoensaio (RIA) ou Imunorradiométrico (IRMA)
• Ensaio imunoabsorvente de enzima ligada (ELISA)
• Imunoensaio multiplicado por enzima (EMIT)
• Ensaio imunocromatográfico
• Imunoensaio enzima-doadora clonada (CEDIA)
• Interação cinética de micropartículas em solução (KIMS)
• Enzimaimunoensaio por micropartícula (MEIA)
Radioimunoensaio (RIA)
• 1959  Berson e Yalow – primeiro RIA para quantificação de insulina
• O RIA foi a primeira técnica imunológica padronizada capaz de 
detectar e quantificar uma substância biológica em baixas 
concentrações (nano e picogramas)
• Quantificação de qualquer substância biológica, desde que haja um 
receptor específico para ela
Radioimunoensaio (RIA) - aplicações
• Dosagens de substâncias encontradas em baixa concentração
Esteroides
Catecolaminas
Hormônios tireoidianos
Drogas
Proteínas 
Radioimunoensaio (RIA)
• Um dos métodos mais sensíveis para análises quantitativas com 
reação Ag-Ac
• Permite aferições rápidas e precisas (método automatizado)
• Apresenta limiar de detecção em ɳg e ρg
Radioimunoensaio (RIA)
• Principais limitações
• Custo do teste
• Validade dos reagentes
• Risco operacional
• Principais radioisótopos utilizados
• I125 – vida média 60 dias
• Co56 – vida média 70 dias
Radioimunoensaio (RIA)
• A aferição das ligações é realizada pela quantificação das 
radiações emitidas
Radiações α e β contador de cintilações
Radiações ɣ  contador gama de cristal sólido
Radioimunoensaio (RIA)
• Radioimunoensaio direto de competição com Ag marcado
• Radioimunoensaio de competição com Ac marcado
• Ensaio imunoradiométrico
RIA direto de competição com Ag marcado
• Volume de Ac fixo e limitado é ligado a um suporte fixo (fase 
estacionária)
• É adicionado um volume de Ag marcado , misturado com a 
amostra em teste ou solução padrão
RIA direto de competição com Ag marcado
• Posteriormente à incubação, são removidos os Ag não ligados e
se faz uma leitura da fase estacionária
• O Ag da amostra ou das soluções padrão inibem, por
competição, a ligação do Ag marcado com o Ac da fase
estacionária
RIA direto de competição com Ag marcado
• Interpretação:
Quanto maior a quantidade de Ag na amostra, maior a fração de Ag 
marcado livre
A quantidade de Ag da amostra que se liga depende tanto de sua 
concentração como de sua afinidade pelo Ac
A concentração do Ag em teste é estimada por interpolação na 
curva de calibração
RIA direto de competição com Ag marcado
RIA direto de competição com Ag marcado
RIA direto de competição com Ag marcado
RIA de competição com Ac marcado
• Quantidade fixa de Ag é imobilizada em uma fase estacionária
• Adiciona-se quantidade fixa de Ac marcado, misturado com a
amostra teste
• Após período de incubação, o Ac marcado que não ligou-se à
fase sólida e o Ag solúvel da amostra são removidos por lavagem
RIA de competição com Ac marcado
• A medição é feita com a leitura da radioatividade da fase sólida
• O Ag da amostra inibe, por competição, a ligação do Ac 
específico ao Ag imobilizado na fase sólida
• Interpretação:
Quanto maior a concentração de Ag na amostra em teste, menor 
será a quantidade de Ac marcado ligado à fase sólida
IRMA - Ensaio imunorradiométrico
• Quantidade fixa de Ac é imobilizada em suporte
• Amostra com Ag é adicionada, após incubação, remove-se o Ag não ligado
e adiciona-se Ac marcados específicos para o Ag
• O Ac marcado não ligado é removido por lavagem e realiza-se a medida da
radioatividade da fase sólida
IRMA - Ensaio imunorradiométrico
• Interpretação:
Quanto maior a concentração de Ag na amostra, maior a
quantidade de Ac marcado ligado, consequentemente, maior o
sinal detectado
IRMA - Ensaio imunorradiométrico
RIA
RIA – vantagens e desvantagens
• Vantagens:
Sensível, específico e de alta 
afinidade
Baixo custo
Requer pouca amostra
Rápido 
• Desvantagens:
Instabilidade dos reagentes
Risco operacional
Elevado custo com descarte 
Elisa
• Baseia-se na ligação de Ag-Ac marcado com alguma enzima
• Enzimas mais utilizadas nessa técnica
Peroxidase
Fosfatase alcalina
Glicose oxidase
Elisa
• A enzima associada converte o componente cromógeno em 
produto insolúvel que precipita no sítio da reação
Elisa
• Requisitos para uma boa enzima:
Alta especificidade
Estabilidade do produto da reação enzimática
Estabilidade da enzima
Facilmente obtida em forma purificada
Preço acessível
Elisa
• Procedimento:
• Sensibilização da fase sólida  adição de Ac ou Ag *
• Bloqueio  soro fetal bovino (Leite Molico)
• Adição da amostra *
• Adição do conjugado  anticorpo purificado marcado com a enzima*
* lavagem
Elisa
• Adição do substrato cromogênico
• Interrupção da reação  ácido fraco
• Realizar leitura em comprimento de onda de acordo com as 
características do cromógeno
Elisa
Elisa - etapas
Elisa - etapas
Elisa - etapas
Elisa – vantagens e desvantagens
• Vantagens:
Reagentes mais estáveis que RIA
Pode ser automatizada ou manual
Alta atividade específica
• Desvantagens:
Técnica manual passível de erros
Caso 1
Penitenciária “Fique Mais Um Dia” realiza exames rotineiramente de urina de 5
internos aleatoriamente para verificar se está ocorrendo o tráfico de
entorpecentes. Considerando os dados abaixo, de um teste de Elisa quantitativo
pelo método de competição com Ag marcado, interprete quais indivíduos
sofrerão punição devido ao consumo de cocaína. Dosagens maiores que 50
ng/mL caracteriza consumo recente.
Branco = 0,00 
Padrão 1 = 10 ng/mL 1,44
Padrão 2 = 20 ng/mL 0,72
Padrão 3 = 40 ng/mL 0,36
Padrão 4 = 80 ng/mL 0,18
Padrão 5 = 160 ng/mL0,09
Detento A = 0,17
Detento B = 0,36
Detento C = 0,50
Detento D = 1,20
Detento E = 2,40
Caso 1 - explicação
• Fase sólida sensibilizada com Ac
• Amostra Ag + Ag marcado
• > [ Ag da amostra]
• > ligação aos Ac
• [Ag amostra]
• > ligação Ac marcado
• > densidade da leitura
Resultado da absorção 
diretamente 
proporcional!
MEIA - Enzimaimunoensaio por 
micropartícula 
• Micropartículas recobertas com Ac monoclonal, as quais são
incubadas com a amostra a ser analisada
• Durante incubação ocorre ligação Ag da amostra com as
micropartículas contendo Ac, resultando na formação de complexos
Ag-Ac
• Uma alíquota é transferida para uma matriz de fibra de vidro e as
micropartículas se ligam irreversivelmente a essa matriz
MEIA - Enzimaimunoensaio por 
micropartícula 
• Um conjugado com fosfatase alcalina é adicionado e se liga ao
complexo Ag-Ac
• O substrato (fosfato 4-metilumbeliferil) é adicionado à matriz e o
produto fluorescente é medido
Testes imunocromatográficos
• Aplicação:
Cocaína
Canabinóides
Opiáceos
Anfetamina
Benzodiazepínicos
Barbitúricos
Metadona 
Ecstasy
Testes imunocromatográficos
• COMPETIÇÃO 
COM Ag marcado
> [amostra]
 [amostra]
> formação de cor
Jogos relacionados à toxicologia
• CSI-3 Dimensions of Murder
• http://superdownloads.uol.com.br/flashview.cfm? 
flash=%2Farquivos%2Fflashgames%2F270162 
%5FCSI%5F%5F%5FMind%5FPrison%2Eswf& 
w=512&h=384&software=CSI%3A%20Mind%20 Prison
• http://super.abril.com.br/jogos/crime/