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5. TEXTOS GERAIS
15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 511
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5.1. Textos gerais sobre esterilidade .............................. 515
5.2. Textos gerais sobre vacinas...................................... 523
5.3. Análise estatística de resultados de ensaios e testes
biológicos ................................................................ 541
5.4. Solventes residuais .................................................. 577
5.5. Tabelas alcoométricas .............................................. 589
5.6. Aferição dos interferões .......................................... 599
5.7. Quadro das características dos radionuclidos 
citados na Farmacopeia Portuguesa ...................... 607
5.8. Harmonização das Farmacopeias............................ 615
5.9. Polimorfismo .......................................................... 619
5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso
farmacêutico ............................................................ 623
5.11. Características nas monografias ............................ 629
513FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
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5.1. TEXTOS GERAIS
SOBRE ESTERILIDADE
5.1. Textos gerais sobre esterilidade ................................ 515
5.1.1. Métodos de preparação de produtos estéreis .... 515
5.1.2. Indicadores biológicos de esterilização .......... 517
5.1.3. Eficácia dos conservantes antimicrobianos ...... 518
5.1.4. Qualidade microbiológica das preparações
farmacêuticas ........................................................ 519
5.1.5. Aplicação do conceito FO à esterilização pelo 
vapor das preparações aquosas .............................. 520
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5.1. TEXTOS GERAIS 
SOBRE ESTERILIDADE
5.1.1. MÉTODOS DE PREPARAÇÃO 
DE PRODUTOS ESTÉREIS
Esterilidade é a ausência de microrganismos vivos. A
realização de ensaios não é suficiente para garantir a
esterilidade de um produto e a garantia da esterilidade passa
igualmente pela aplicação de processos de produção
convenientemente validados. É essencial estudar o efeito do
método de esterilização escolhido sobre o produto (incluindo
o recipiente ou a embalagem final) do ponto de vista da
eficácia e da manutenção da sua integridade e validar esse
método antes de o pôr em prática. Recomenda-se a escolha de
um recipiente que seja compatível com o método de
esterilização aconselhado. A utilização escrupulosa de um
processo validado é condição a respeitar, sob pena de obter
um produto não estéril ou deteriorado. De cada vez que se
fazem mudanças de vulto no processo de esterilização 
faz-se nova validação incluindo no que diz respeito a
inquinação microbiana (carga). É óbvio que as normas de boa
prática de fabrico (descritas, por exemplo, no guia CEE
relativo às boas práticas de fabrico) terão que ser observadas,
nomeadamente no que diz respeito a:
– emprego de pessoal qualificado e convenientemente
treinado, 
– utilização de locais adequados,
– utilização de equipamento de produção adequado,
concebido para poder ser facilmente limpo e esterilizado,
– respeito pelas precauções necessárias para reduzir o risco
de inquinação microbiana (biocarga) antes da esterilização,
– utilização de métodos validados em todas as etapas críticas
da produção,
– vigilância do ambiente e controlos durante a produção.
As precauções a tomar para limitar a carga microbiana antes
da esterilização incluem a utilização de compostos que
apresentem um nível suficientemente baixo de contaminação
microbiana. Pode ser desejável executar controlo
microbiológico e estabelecer limites apropriados para
compostos cuja origem, natureza ou modo de preparação
comportem riscos de contaminação.
Os métodos descritos neste texto aplicam-se principalmente
à inactivação ou eliminação de bactérias, leveduras e fungos.
Entretanto, para os produtos biológicos de origem animal ou
humana, ou quando material de origem animal ou humana
é utilizado na produção, é necessário demonstrar, aquando
da validação, que o processo utilizado permite eliminar ou
inactivar os contaminantes víricos potenciais. Indicações a
este respeito são fornecidas, por exemplo, nas Notas
Explicativas CEE.
Sempre que possível, é conveniente escolher um processo que
permita a esterilização do produto na embalagem definitiva
(esterilização final). Quando se utiliza um processo final (pelo
vapor, pelo calor seco ou por radiações) totalmente validado,
pode admitir-se, sob reserva de aprovação pela Autoridade
Nacional, que se recorra à libertação paramétrica, isto é,
fundamentar a libertação de um lote de unidades esterilizadas
mais nos dados de produção do que nos resultados de um
ensaio de esterilidade efectuado sobre uma amostra desse lote.
515FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.1.1. Métodos de preparação de produtos estéreis
Se a esterilização final não for possível, convém recorrer à
filtração usando um filtro que retenha bactérias, ou à técnica
asséptica; sempre que possível, aplica-se um tratamento
complementar apropriado (por exemplo, aquecimento) ao
produto no seu recipiente definitivo. Em todos os casos, o
recipiente e o sistema de fecho mantêm a esterilidade do
produto durante todo o tempo de validade.
Nível de segurança de esterilidade (NSE)
Nos casos apropriados, nos métodos descritos mais adiante
faz-se referência ao conceito de «nível de segurança de
esterilidade ou NSE». Com efeito, não pode garantir-se nem
verificar em absoluto a esterilidade de todas as unidades
contidas numa população que tenha sido objecto de
esterilização. A inactivação de microrganismos por processos
físicos ou químicos é um fenómeno que se rege por uma lei
exponencial e, por consequência, existe sempre uma certa
probabilidade estatística de um microrganismo sobreviver à
esterilização. Para um determinado processo, esta
probabilidade de sobrevivência é função do número, do tipo e
da resistência dos microrganismos presentes, bem como do
ambiente em que se desenrola a operação. O nível de
segurança de esterilidade (NSE) de um processo de
esterilização indica o grau de segurança com o qual um
conjunto de unidades é tornado estéril pelo processo
utilizado. O NSE para determinada técnica é expresso como a
probabilidade da existência de uma unidade não estéril nessa
população. Um NSE de 10–6, por exemplo, corresponde a uma
probabilidade de existir, no máximo, 1 microrganismo viável
em 106 unidades esterilizadas do produto final. O NSE
associado a um processo, para um determinado produto, é
estabelecido com base em estudos de validação apropriados.
MÉTODOS E CONDIÇÕES DE ESTERILIZAÇÃO
A esterilização pode ser efectuada por um dos métodos
descritos a seguir. É possível utilizar variantes ou
combinações destes métodos, desde que o processo escolhido
seja validado quer no aspecto de eficácia, quer na manutenção
da integridade do produto, incluindo o recipiente ou a
embalagem.
Qualquer que seja o método de esterilização utilizado, os
parâmetros críticos são objecto de controlo para confirmar
que o conjunto do lote é sujeito, durante todo o processo de
tratamento, às condições de esterilização previamente
definidas. Esta exigência é válida em todos os casos, mesmo
quando são utilizadas condições padrão.
Esterilização final
Para a esterilização final, é essencial ter em conta a não
uniformidade das condições físicas ou químicas durante o
ciclo de esterilização. O local menos acessível ao agente de
esterilização é determinado para cada processo de carga e
para cada tipo e forma de recipiente ou de embalagem (por
exemplo, o ponto mais frio de uma autoclave). Convém
igualmente determinar a dose mínima letal resultante do
ciclo de esterilização e a reprodutibilidade deste, para
assegurar que todas as cargas submetidas à esterilização
recebem o tratamento recomendado.
Depois de se estabelecer um processo de esterilização final,
avalia-se a sua eficácia na rotina, sempre que possível, por
verificação e registo apropriados das condiçõesnódulos com sinais de regressão,
sacrifique-os antes que os nódulos não sejam detectáveis à
palpação e proceda a um examine histológico. Observe os
animais que apresentam nódulos em crescimento
progressivo durante 1-2 semanas. Nos animais que não
apresentam formação de nódulos, metade são observados
durante 3 semanas e a outra metade durante 12 semanas,
antes de serem sacrificados para se proceder à observação
histológica.
Efectue uma necrópsia em cada animal, para pesquisa no
local de injecção e em outros órgãos (por exemplo: gânglios
linfáticos, pulmões, cérebro, baço, rins, fígado),
nomeadamente sinais macroscópicos de formação tumoral.
Proceda ao exame histológico de todas as lesões com
aparência tumoral e do local de injecção. Além disso, dado
que algumas linhas celulares podem dar metástases sem
manifestação de crescimento tumoral local, proceda
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação de vacinas para uso humano
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5. Textos gerais
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 528
sistematicamente em todos os animais, ao exame histológico
dos gânglios linfáticos regionais detectáveis e dos pulmões.
O ensaio só é válido se, pelo menos, 9 dos 10 animais
inoculados com células de referência positivas apresentarem
tumores de crescimento progressivo.
5.2.4. CULTURAS CELULARES
UTILIZADAS NA PREPARAÇÃO 
DE VACINAS PARA USO VETERINÁRIO
As culturas celulares utilizadas na preparação de vacinas para
uso veterinário satisfazem às exigências descritas nesta
secção. Pode também ser necessário que as culturas celulares
utilizadas no controlo das vacinas satisfaçam todas ou
algumas destas exigências.
Para a maioria dos vírus dos mamíferos é possível a sua
multiplicação em células de linha celulares, não sendo por
isso aceite a utilização de células primárias.
As células cronicamenie infectadas utilizadas na preparação de
vacinas veterinárias satisfazem às exigências que lhes são
aplicáveis descritas a seguir. Demonstra-se que as células se
encontram infectadas apenas com o agente indicado.
LINHAS CELULARES
As linhas celulares utilizadas na produção são normalmente
obtidas através de um sistema de banco de células. Cada
banco de células primário é identificado com um código
específico. O banco de células primário é conservado em
alíquotas a uma temperatura igual ou inferior a -70°C. Não
são utilizadas na produção de vacinas células que tenham
sido submetidas a um número de passagens superior a 20 a
partir do banco de células primário. Quando se utilizam
culturas de células em suspensão, um aumento do número
de células correspondente a três duplicações da população
equivale aproximadamente a uma passagem. Se as células
utilizadas na produção tiverem sido submetidas a um
número de passagens superior a 20, demonstra-se, por
validação ou através de novos ensaios, que as células de
produção são sensivelmente idênticas às células do banco de
células primário no que diz respeito às características
biológicas e à pureza, e que a sua utilização não tem efeitos
prejudiciais na produção da vacina.
É conhecida com detalhe e registada por escrito a história
da linha celular (por exemplo, origem, número de passagens
e o meio utilizado na multiplicação, condições de
conservação).
Fica registada uma descrição dos métodos de conservação e
de utilização das células, incluindo pormenores que permitam
assegurar que durante a produção o número de passagens
permitidas não é ultrapassado.
Conservam-se, para fins analíticos, quantidades suficientes do
banco de células primário e de cada banco de células de
trabalho.
Os ensaios descritos a seguir são efectuados em culturas do
banco de células primário e do banco de células de trabalho
ou em células do banco de células de trabalho com o número
máximo de passagens admitido para a produção e
provenientes de uma amostra homogénea e representativa.
Demonstra-se a representatividade da amostra.
QUADRO 2 – Fases das culturas celulares em que os ensaios 
são efectuados
Banco de Banco de Células do banco
células células de células de
primário de trabalho trabalho com o
número máximo
de passagens
Microscopia geral + + +
Bactérias e fungos + + –
Micoplasmas + + –
Vírus + + –
Identificação da espécie + – +
Análise cariotípica + – +
Poder tumorígeno + – –
Características das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete
celular antes e depois da coloração histológica. Regista-se, se
possível sob a forma numérica, a informação relativa
especialmente à velocidade e à taxa de crescimento. É
igualmente indicada a presença ou ausência de inibição por
contacto, de células plurinucleadas ou de qualquer outra
anomalia celular.
Análise cariotípica. Efectua-se um exame cromossómico em
pelo menos 50 células em mitose do banco de células
primário e da passagem máxima admitida para a produção.
Qualquer marcador cariotípico presente nas células do banco
de células primário é encontrado nas células com o número
máximo de passagens. O número de cromossomas (valor
modal) nas células da passagem máxima não é superior a 15
por cento do valor obtido no banco de células primário. Os
cariotipos são idênticos. Se o número de cromossomas for
superior ao valor declarado, se alguns marcadores cariotípicos
não forem encontrados nas células do banco de células de
trabalho com o número máximo de passagens utilizado na
produção, ou se os cariotipos forem diferentes, a linha celular
não é utilizada no fabrico de vacinas.
Identificação da espécie. Demonstra-se, por um método
validado, que as células do banco de células primário e do
banco de células de trabalho com o número máximo de
passagens utilizado na produção pertencem à espécie indicada
pelo fabricante.
Quando se efectua um ensaio de imunofluorescência com o
soro específico da espécie de origem das células e se verifica
que todas as células apresentam fluorescência, não é
necessário realizar outros ensaios com reagentes capazes de
detectar contaminação com células de outras espécies.
Contaminação bacteriana e fúngica. As células satisfazem ao
ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de células contém,
pelo menos, o número de células de um tapete celular com
uma área de 70 cm2 e para células em suspensão
aproximadamente o mesmo número de células. Antes de se
realizar e ensaio, as células são mantidas em cultura durante,
pelo menos, 15 dias, sem antibióticos.
Micoplasmas (2.6.7). As células satisfazem ao ensaio dos
micoplasmas. Antes de se realizar a ensaio, as células são
mantidas em cultura durante. pelo menos, 15 dias, sem
antibióticos.
Ausência de vírus contaminantes. Por técnicas apropriadas, e
pelos ensaios descritos a seguir, verifica-se a ausência de
qualquer contaminação par vírus.
Os tapetes celulares examinados têm uma área de, pelo
menos, 70 cm2, são preparados e mantidos em cultura no
529FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparação de vacinas para uso veterinário
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mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condições
que as células utilizadas na preparação da vacina. Os tapetes
celulares são mantidos em cultura, pelo menos durante 28
dias no total. As subculturas realizam-se com intervalos de 7
dias, a não ser que seja impossível manter as células com vida
durante tanto tempo. Neste caso, convém realizar as
subculturas com intervalos inferiores, mas tão longos quanto
possível. O número de células que se obtém na última
subcultura, em recipientes apropriados, é suficiente para se
efectuarem os ensaios descritos a seguir.
Os tapetes celulares são examinados regularmente durante o
período de incubação para se detectar eventuais efeitos
citopatogénicos e, no final do período de observação, são
submetidos aos ensaios para pesquisa de vírus
citopatogénicos, vírus hemadsorventes e vírus específicos,
estes últimos efectuados por imunofluorescência ou por
qualquer outro método apropriado a seguir indicado.
Detecção de vírus citopatogénicos. Efectue, com um corante
apropriado,a coloração citológica a 2 tapetes celulares com,
pelo menos, 6 cm2 cada um. Examine toda a superfície dos
tapetes celulares corados e verifique a presença eventual de
corpos de inclusão, de células gigantes em número
anormalmente elevado ou de qualquer outra lesão indicativa
de anomalias celulares que possam ser atribuídas a um agente
contaminante.
Detecção de vírus hemadsorventes. Lave várias vezes, com
uma solução tampão apropriada, tapetes celulares com uma
área total de 70 cm2. Adicione uma suspensão apropriada de
hemácias em volume suficiente para cobrir uniformemente a
superfície dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos
de incubação, verifique a presença de hemadsorção.
Detecção de vírus específicos. Verifique através de ensaios
apropriados a ausência de contaminantes específicos da
espécie de origem da linha celular e das espécies às quais o
produto se destina. Para poder efectuar os ensaios de detecção
de vírus específicos prepare, em suportes adequados, um
número suficiente de células. É incluído em cada ensaio um
número apropriado de controlos positivos. Os ensaios
realizam-se, por exemplo, com anticorpos conjugados com
fluoresceína ou reagentes similares.
Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha de
tapetes celulares com uma superfície total de, pelo menos,
140 cm2. Congele e descongele as células pelo menos 3 vezes
e a seguir elimine por centrifugação os fragmentos celulares.
Inocule partes alíquotas do líquido obtido, em células com
uma confluência inferior ou igual a 70 por cento, dos
seguintes tipos:
– células primárias da espécie de origem,
– células sensíveis aos vírus patogénicos para as espécies alvo
da vacina,
– células sensíveis aos pestivírus.
Mantenha as células inoculadas em cultura durante, pela
menos, 7 dias, prepare os extractos congelação-descongelação
como se descreveu anteriormente e inocule em culturas
frescas de células do mesmo tipo numa quantidade suficiente
que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube as
células durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas são
examinadas regularmente para se detectar a presença de
qualquer efeito citapatogénico devido a microrganismos vivos.
Ao fim do período de 14 dias, as células inoculadas são
submetidas ao seguinte controlo:
– verificação da ausência de microrganismos citopatogénicos
ou hemadsorventes pelos métodos anteriormente indicados,
– verificação da ausência de pestivírus ou outros
contaminantes específicos por imunofluorescência ou
outros métodos validados («Detecção de vírus
específicos»).
Poder tumorígeno. Se necessário, efectuam-se ensaios para
avaliar o risco potencial da linha celular para as espécies alvo.
CÉLULAS PRIMÁRIAS
A utilização de células primárias como substrato de fabrico de
vacinas destinadas aos mamíferos não é na maior parte dos
casos aceite, uma vez que se podem utilizar linhas celulares.
Na entanto, se não houver alternativa à utilização de células
primárias, estas provêm de explorações ou de bandos isentos
de microrganismos patogénicos específicos, completamente
protegidos contra a introdução de doenças (barreiras
sanitárias. filtros nas entradas de ar, sistema apropriado de
quarentena antes da introdução de animais). No caso de se
tratar de bandos de frangos, estes satisfazem as exigências
prescritas em «Bandos de Frangos isentos de Microrganismos
Patogénicos Específicos para a Produção e o Controlo da
Qualidade de Vacinas» (5.2.2). No caso de se tratar de outros
animais, demonstra-se que a exploração se encontra isenta de
microrganismos patogénicos específicos. Também os
reprodutores da exploração de onde se obtêm as células
primárias destinadas ao fabrico de vacinas são submetidos a
controlos que incluiem, pelo menos, 2 exames serológicos de
rotina por ano e, entre estes, 2 exames serológicos
suplementares em 15 por cento dos reprodutores.
Particularmente no caso de células de mamíferos, é
conveniente utilizar, sempre que possível, um sistema de lote
semente que compreenda, por exemplo, um banco de células
primário submetido a menos de 5 passagens e um banco de
células de trabalho que não tenha sido submetido a mais da
que 5 passagens a partir da suspensão celular inicial obtida
dos tecidos animais.
O banco de células primário, banco de células de trabalho e as
células com o número máximo de passagens utilizado na
produção são submetidos aos ensaios indicados no quadro 3
de acordo com os métodos descritos a seguir. A amostra cobre
todo o tipo de células utilizadas no fabrico da lote. Nenhum
lote de vacina produzida com estas células pode ser libertado
se algum dos ensaios não der resultados satisfatórios.
QUADRO 3 – Fases das culturas de células primárias 
em que os ensaios são efectuados
Banco de Banco de Nível máximo
células células de passagens
primário de trabalho
Microscopia geral + + +
Bactérias e fungos + + –
Micoplasmas + + –
Vírus + + –
Identificação da espécie + – –
Características das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete
celular antes e depois da coloração histológica. Registam-se,
se possível sob a forma numérica, informações relativas
especialmente à velocidade e à taxa de crescimento. Indica-se
igualmente a presença ou ausência de inibição por contacto,
de células plurinucleadas ou de qualquer outra anomalia
celular.
5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparação de vacinas para uso veterinário
530 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 530
Identificação da espécie. Demonstra-se, por um método
validado, que as células do banco de células primário
pertencem à espécie indicada.
Quando se efectua um ensaio de imunofluorescência com o
soro específico da espécie de origem das células e se verifica
que todas as células examinadas apresentam fluorescência, não
é necessário realizar outros ensaios com reagentes capazes de
detectar contaminação com células de outras espécies.
Esterilidade bacteriana e fúngica. As células satisfazem ao
ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de células contém,
pelo menos, o número de células de um tapete celular com
uma área de 70 cm2 ou, para as células em suspensão,
aproximadamente o mesmo número de células. Antes de se
realizar o ensaio, as células são mantidas em cultura durante,
pelo menos, 15 dias, sem antibióticos.
Micoplasmas (2.6.7). As células satisfazem ao ensaio dos
micoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as células são
mantidas em cultura durante, pelo menos, 15 dias, sem
antibióticos.
Ausência de vírus contaminantes. Pelos ensaios descritos a
seguir, verifica-se a ausência de qualquer contaminação por
vírus.
Os tapetes celulares examinados têm uma área de, pelo
menos, 70 cm2 e são preparados e mantidos em cultura no
mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condições
que as células utilizadas na preparação da vacina.
Os tapetes celulares são mantidos em cultura, pelo menos,
durante 28 dias no total ou durante o período mais longo
possível, se 28 dias for impossível. As subculturas realizam-se
com intervalos de 7 dias, a não ser que seja impossível manter
as células com vida durante tanto tempo. Neste caso, convém
realizar as subculturas com intervalos inferiores, mas tão
longos quanto possível. O número de células que se obtém na
última subcultura, em recipientes apropriados, é suficiente
para se efectuarem os ensaios descritos a seguir.
Os tapetes celulares são examinados regularmente durante o
período de incubação para se detectar eventuais efeitos
citopatogénicos e, no final do período de observação, são
submetidos aos ensaio para pesquisa de vírus citopatogénicos,
vírus hemadsorventes e vírus específicos, estes últimos
efectuados por imunofluorescência ou por qualquer outro
método apropriado como se indica a seguir.
Detecção de vírus citopatogénicos. Efectue, com um corante
apropriado, a coloração citológica de 2 tapetes celulares com,
pelo menos, 6 cm2 cada um.
Examine toda a superfície dos tapetes celulares corados e
verifique a presença eventual de corpos de inclusão, de célulasgigantes em número anormalmente elevado ou de qualquer
outra lesão indicativa de anomalias celulares que possam ser
imputadas a um agente contaminante.
Detecção de vírus hemadsorventes. Lave várias vezes, com
uma solução tampão apropriada, tapetes celulares com uma
área total de 70 cm2. Adicione uma suspensão apropriada 
de hemácias em volume suficiente para cobrir
uniformemente a superfície dos tapetes celulares. Decorridos
diferentes tempos de incubação, verifique a presença de
hemadsorção.
Detecção de vírus específicos. Verifique através de ensaios
apropriados a ausência de contaminantes específicos da
espécie de origem da linha celular e das espécies alvo do
produto.
Para poder efectuar os ensaios de detecção de vírus
específicos, prepare, em suportes adequados. um número
suficiente de células É incluído em cada ensaio um número
apropriado de controlos positivos. Os ensaios realizam-se, por
exemplo, com anticorpos conjugados com fluoresceína ou
reagentes similares.
Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha
tapetes celulares com uma superfície total de, pelo menos,
140 cm2. Congele e descongele as células pelo menos 3 vezes
e a seguir elimine por centrifugação os fragmentos celulares
Inocule partes alíquotas do líquido obtido, em células com
uma confluência inferior ou igual a 70 por cento, dos
seguintes tipos:
– células primárias da espécie de origem, 
– células sensíveis aos vírus patogénicos para as espécies alvo
da vacina, 
– células sensíveis aos pestivírus.
Mantenha as células inoculadas em cultura durante, pelo
menos, 7 dias, prepare os extractos congelação-descongelação
como se descreveu anteriormente, e inocule em culturas
frescas de células do mesmo tipo numa quantidade suficiente
que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube as
células durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas são
examinadas regularmente para se detectar a presença de
qualquer efeito citopatogénico devido a microrganismos vivos.
Ao fim do período de 14 dias, as células inoculadas são
submetidas ao seguinte controlo:
– verificação da ausência de microrganismos citopatogénicos
ou hemadsorventes pelos métodos anteriormente
indicados,
– verificação da ausência de pestivírus ou de outros
contaminantes específicos, por imunofluorescência ou outros
métodos validados (ver «Detecção de vírus específicos»).
5.2.5. SUBSTÂNCIAS DE ORIGEM
ANIMAL UTILIZADAS NA PREPARAÇÃO
DE VACINAS PARA USO VETERINÁRIO
No fabrico de medicamentos veterinários imunológicos
podem ser utilizadas substâncias de origem animal (por
exemplo, soro, tripsina e albumina sérica), como ingredientes
dos meios de cultura ou como constituintes das vacinas ou
dos diluentes. Recomenda-se que a sua utilização seja tanto
quanto possível reduzida.
Colocam-se algumas restrições à utilização de substâncias de
origem animal com o objectivo de minimizar o risco
associado à eventual presença de agentes patogénicos nessas
substâncias.
– A utilização de substâncias de origem animal como
constituintes das vacinas ou diluentes não é em geral
aceite, a não ser que sejam esterilizados por um método
validado apropriado. Quando a sua utilização se revelar
indispensável e a esterilização seja impossível, são aplicados
os critérios indicados em «Exigências».
– As substâncias de origem animal utilizadas durante o
fabrico são esterilizadas ou inactivadas por um método
531FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.5. Substâncias de origem animal utilizadas na preparação de vacinas para uso veterinário
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validado apropriado ou submetidas a um ensaio para
detecção de agentes estranhos como se descreve em
«Exigências». No caso de vacinas inactivadas, o método
utilizado para a inactivação da estirpe da vacina é
igualmente validado para a inactivação de eventuais
contaminantes das substâncias de origem animal.
Além das restrições descritas a seguir, os fabricantes aplicam
restrições relativas à manipulação de substâncias de origem
animal nas instalações de fabrico de vacinas.
Pode tornar-se necessário adaptar as restrições impostas nesta
secção em função da evolução da situação zoo-sanitária no
país de origem e na Europa.
EXIGÊNCIAS
As substâncias de origem animal satisfazem às exigências da 
Farmacopeia no caso de existir a correspondente monografia.
Origem. Convém avaliar cuidadosamente as riscos associados
à evolução da situação zoo-sanitária no país de origem da
substância e às doenças infecciosas potencialmente presentes
na espécie animal de origem, tendo em conta as espécies alvo
propostas. Os critérios de selecção são os mais exigentes, em
particular para as substâncias utilizadas nos produtos que se
destinam à mesma espécie e para as substâncias de origem
bovina, caprina, ovina e porcina.
Preparação. As substâncias de origem animal são preparadas a
partir de um granel homogéneo identificado por um número
de lote.
O lote pode conter substâncias provenientes de um sem
número de animais. No entanto, uma vez definido e
identificado por um número, o lote não é de qualquer forma
sujeito a adições ou a contaminações.
Demonstra-se que todos os lotes da substância se encontram
isentos de contaminações como se descreve a seguir, e/ou
foram sujeitos a um processo de inactivação validado.
Inactivação. O processo de inactivação escolhido é capaz de
reduzir o título de pelo menos 106 de certos potenciais
contaminantes na substância considerada. Se não se puder
demonstrar experimentalmente esta redução de título, são
feitos estudos de cinética no processo de inactivação, que dão
resultados satisfatórios tendo em conta o nível mais provável
de contaminação.
A lista dos contaminantes potenciais para os quais se torna
necessário demonstrar a eficácia do método de inactivação é
estabelecida em função da espécie animal de origem da
substância. A demonstração da eficácia do método, que tem
em linha de conta cada situação particular, pode ter a forma
de referências a literatura publicada ou de resultados
experimentais produzidos pelo fabricante.
Ensaio. Quando a amostra se apresenta na forma sólida, con-
vém, para verificar a ausência de contaminantes, dissolvê-la ou
suspendê-la num líquido apropriado de maneira a obter uma
solução ou uma suspensão com uma concentração pelo menos
igual a 300 g/l. Se a amostra for insolúvel, ou tiver uma acção
citotóxica, é utilizada uma concentração mais baixa.
Qualquer lote em que se revele a existência de microrganismos 
vivos de qualquer espécie não satisfaz, sendo rejeitado ou 
novamente processado e demonstrado satisfatório.
Ausência de contaminação vírica. A solução (suspensão) da
substância sólida ou da substância líquida não diluída é
submetida a um ensaio para pesquisa de contaminantes por
métodos suficientemente sensíveis. Os métodos utilizados
compreendem ensaios em culturas de células suficientemente
sensíveis e incluem células primárias provenientes da mesma
espécie da amostra. Uma parte das células é submetida a, pelo
menos, duas passagens.
As células são regularmente observadas durante 
21 dias para detecção de eventuais efeitos citopatogénicos.
Durante este período de observação, todos os 7 dias, uma
parte das células da espécie de origem é examinada para
detecção de efeitos citopatogénicos após fixação e coloração,
uma outra parte é submetida a um ensaio para detecção de
agentes hemoadsorventes e uma outra à pesquisa de agentes
específicos por métodos apropriados de serodiagnóstico.
Contaminação bacteriana e fúngica. Antes da sua utilização,
as substâncias são submetidas ao ensaio de esterilidade
(2.6.1) e ao ensaio dos micoplasmas (2.6.7), ou a um
processo de esterilização que assegure a inactivação de
qualquer contaminante bacteriano, fúngico ou
micoplásmico.
5.2.6. AVALIAÇÃO DA INOCUIDADE 
DAS VACINAS PARA USO VETERINÁRIO
Durante o desenvolvimento de uma vacina são efectuados
ensaios de inocuidade nas espécies alvo com a finalidade de
pôr em evidência os riscos potencialmente associados com a
utilizaçãoda vacina. As vacinas vivas apenas são preparadas
com estirpes cuja inocuidade tenha sido demonstrada.
Nos ensaios, «dose» significa a quantidade de produto
recomendada para utilização e contém o título ou a actividade
máximos susceptíveis de serem obtidos nos lotes de fabrico.
No caso das vacinas vivas, é necessário efectuar os ensaios
com um ou vários lotes da vacina preparada a partir da
passagem menos atenuada utilizada na produção.
No caso de vacinas combinadas, demonstra-se a inocuidade de
cada um dos componentes e da vacina combinada. Nas
vacinas inactivadas, os ensaios de inocuidade efectuados com
a vacina combinada podem ser considerados suficientes para
demonstrar a inocuidade dos componentes individuais.
Os ensaios descritos a seguir, com as modificações ou os
ensaios suplementares indicados na secção «Produção» de
uma monografia específica, podem ser efectuados no quadro
dos ensaios de desenvolvimento necessários para demonstrar
a inocuidade da vacina.
A. ENSAIOS LABORATORIAIS
Inocuidade da administração de uma dose única. Administre,
a um grupo de animais receptivos de cada uma das espécies e
categorias às quais a vacina se destina, 1 dose de vacina por
cada uma das vias de administração recomendadas. Consoante
o caso, este grupo inclui animais com a idade mínima para
vacinação e fêmeas gestantes. Os animais são observados e
examinados regularmente para pesquisa de reacções gerais ou
locais. Quando apropriado, os estudos compreendem um
detalhado exame necrópsico, macroscópico e microscópico do
local da injecção; estes exames não são normalmente
necessários no caso de animais que não se destinam ao
consumo. São igualmente registados outros critérios
objectivos, por exemplo a temperatura rectal dos mamíferos e
o rendimento zootécnico.
5.2.6. Avaliação da inocuidade das vacinas para uso veterinário
532 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 532
A temperatura rectal é registada pelo menos no dia anterior
ao da vacinação, no momento da vacinação, 4 h mais tarde e
nos 4 dias seguintes. Os animais são mantidos em observação
e examinados durante um período de tempo em que se espera
não haver reacções mas, em todos os casos, durante, pelo
menos, 14 dias após a administração da vacina.
Os estudos de inocuidade podem igualmente incluir o exame da
função reprodutora quando os dados sugerem que a origem da
matéria-prima do produto constitui um factor de risco. Se
estiver prescrito na monografia, efectua-se o estudo das funções
reprodutoras dos machos e das fêmeas gestantes e não
gestantes, incluindo a pesquisa de efeitos indesejáveis na
descendência, por exemplo de natureza teratogénica e abortiva.
Inocuidade da administração de uma sobredose. É
administrada uma sobredose por cada uma das vias de
administração recomendadas, aos animais das categorias mais
sensíveis das espécies alvo, incluindo, se for o caso, animais
com a idade mínima para vacinação e fêmeas gestantes. A
sobredosagem consiste normalmente em 10 doses de vacina
viva ou 2 doses de vacina inactivada. Os animais são
observados e examinados regularmente para pesquisa de
reacções gerais ou locais. São igualmente registados outros
critérios objectivos, por exemplo a temperatura rectal dos
mamíferos e o rendimento zootécnico. Os animais são
mantidos em observação e examinados durante, pelo menos,
14 dias após a administração da vacina.
Inocuidade da administração repetida de uma dose única. A
administração repetida de uma dose única pode ser
necessária para revelar quaisquer efeitos indesejáveis
induzidos pela referida administração. Estes ensaios
efectuam-se nas categorias mais sensíveis das espécies alvo,
pela via de administração recomendada. Os animais são
observados e examinados, no mínimo, durante 14 dias após a
última administração para pesquisa de reacções gerais ou
locais. São igualmente registados outros critérios objectivos,
por exemplo a temperatura rectal dos mamíferos e o
rendimento zootécnico.
Resíduos. Normalmente não é necessário efectuar um estudo
de resíduos. Todavia, caso o fabrico de vacinas veterinárias
envolva a utilização de adjuvantes e/ou conservantes, atende-se
à possível persistência de resíduos nos produtos alimentares. Se
necessário investigam-se os efeitos dos referidos resíduos. Além
disso no caso de vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas
pode ser necessário efectuar a pesquisa do microrganismo
vacinal residual no local de injecção, para além dos estudos de
disseminação que se descrevem a seguir.
Efeitos indesejáveis nas funções imunológicas. Caso a vacina
possa afectar negativamente a resposta imunitária do animal
vacinado ou da sua descendência, são efectuados ensaios
adequados das funções imunológicas.
Exigências especiais aplicáveis às vacinas vivas. Efectuam-se
os seguintes ensaios nas vacinas vivas:
(a) Disseminação da estirpe da vacina. Utilizando a via de
administração recomendada mais favorável para a
disseminação, investiga-se a possibilidade de transmissão
da estirpe da vacina de animais vacinados a animais não
vacinados da espécie alvo. Pode também ser necessário
investigar os riscos de transmissão a espécies não alvo
potencialmente muito sensíveis à estirpe da vacina viva.
Convém igualmente avaliar o número possível de
transmissões de animal para animal em circunstâncias
normais, assim como as suas previsíveis consequências.
(b) Disseminação no animal vacinado. Verifica-se a presença
do microrganismo nas fezes, urina, leite, ovos e secreções
orais, nasais ou outras. Além disso, pode ser necessário
estudar a disseminação da estirpe da vacina no corpo do
animal, com especial destaque para os seus locais de
replicação preferenciais. Este estudo é obrigatório para
vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas dos
animais destinados ao consumo.
(c) Reversão à virulência ou aumento da virulência. Para o
caso de vacinas atenuadas utilize a estirpe ao nível da
passagem menos atenuada para a espécie alvo entre o lote
semente primário e o produto acabado. No caso de outras
vacinas vivas, utilize o material proveniente da passagem
que se espera ser a mais virulenta para as espécies alvo. A
primeira vacinação é efectuada pela via de administração
recomendada mais favorável à reversão à virulência.
Efectuam-se, pelo menos, cinco passagens em série em
animais das espécies alvo. Caso tal não seja tecnicamente
possível, em virtude do microrganismo não se replicar de
modo adequado, efectuam-se nas espécies alvo tantas
passagens quantas possível. Se necessário, pode 
proceder-se à propagação do microrganismo in vitro entre
duas passagens in vivo. As passagens efectuam-se pela via
de administração que mais provavelmente conduz à
reversão à virulência. Utilizam-se, pelo menos, duas
espécies receptivas em cada passagem. Comprova-se a
presença de microrganismos vivos provenientes da vacina
no substrato de cada passagem. A inocuidade da estirpe
do nível mais elevado de passagens é comparada com a da
estirpe de origem.
No caso de vírus particulares, a monografia pode exigir
um maior número de passagens, e para cada passagem,
um número de animais mais elevado se se dispuser de
qualquer indicação que revele o seu interesse. A última
passagem é efectuada em animais da categoria mais
apropriada para avaliar o risco potencial.
(d) Propriedades biológicas da estirpe da vacina. Podem ser
necessários mais ensaios por forma a determinar, tão
exactamente quanto possível, as propriedades biológicas
intrínsecas da estirpe utilizada na vacina (por exemplo,
neurotropismo). No caso de vacinas que utilizam
vectores, é necessário fazer uma avaliação do risco de
uma modificação do tropismo ou da virulência da
estirpe e, se necessário, efectuar ensaios específicos.
Estes ensaios são sistematicamente efectuados quando
se incorpora um gene estranho na estirpe como
proteína estrutural.
(e) Recombinação ou rearranjo genómico da estirpe. É
analisada a probabilidade de recombinação ou rearranjo
genómico com a estirpe de campo ou outras.
B. ENSAIOS DECAMPO
Os resultados dos ensaios laboratoriais são normalmente
complementados e confirmados com dados comprovativos
provenientes dos ensaios de campo.
Nos mamíferos destinados ao consumo, os ensaios incluem a
medição da temperatura rectal antes e após a vacinação num
número suficientemente elevado de animais; noutros
mamíferos, essas medições efectuam-se quando os ensaios
laboratoriais indiciem qualquer problema. Registam-se o
tamanho e a persistência de qualquer reacção local e a
proporção de animais que apresentam reacções locais ou
gerais. Se necessário, convém igualmente medir o
rendimento zootécnico.
533FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.6. Avaliação da inocuidade das vacinas para uso veterinário
5.
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15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 533
3. Textos gerais
C. ECOTOXICIDADE
Durante o desenvolvimento da vacina avaliam-se os efeitos
nocivos da vacina para o ambiente e identificam-se as
medidas preventivas necessárias para diminuir os referidos
riscos. O grau de exposição do ambiente à vacina é avaliado
levando em atenção a espécie alvo e modo de administração,
de excreção da vacina e o modo de eliminação do produto não
utilizado. Se estes factores indicarem que haverá um risco
significativo de exposição do ambiente ao produto, a
ecotoxicidade potencial é avaliada levando em linha de conta
as propriedades da vacina determinadas, por exemplo, nos
ensaios descritos nesta secção.
5.2.7. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA 
DAS VACINAS PARA USO VETERINÁRIO
Durante o desenvolvimento da vacina, a sua eficácia é
demonstrada através de ensaios efectuados em cada uma das
espécies e categorias às quais a vacina se destina, utilizando
cada uma das vias de administração recomendadas e o esquema
vacinal proposto. A natureza dos ensaios a efectuar varia consi-
deravelmente consoante o tipo de vacina considerado.
Os ensaios indicados na secção «Produção» numa monografia
especifica podem ser efectuados no quadro dos ensaios de
desenvolvimento necessários para demonstrar a eficácia da
vacina. Convém ter em conta as seguintes considerações.
A dose a utilizar nos ensaios será a quantidade de produto
recomendada para utilização, contendo o título ou a
actividade mínima admitidos no fim do prazo de validade.
No caso de vacinas vivas, é necessário efectuar os ensaios com
a vacina preparada a partir da passagem mais atenuada
utilizada na produção.
Os ensaios de eficácia confirmam todas as indicações
reclamadas para a vacina. Se, por exemplo, se indica que o
produto confere protecção contra doenças respiratórias, pelo
menos demonstra-se que protege contra os sinais clínicos da
doença respiratória. Quando se reclama uma protecção 
anti-infecciosa, este facto é demonstrado por técnicas de 
reisolamento. Se tem várias indicações, a sua eficácia é
demonstrada para cada uma delas.
A influência na eficácia da vacina da presença de anticorpos
adquiridos passivamente ou transmitidos pela mãe é
adequadamente avaliada. Qualquer declaração ou indicação
respeitante ao início e duração da protecção é corroborada
com os resultados obtidos nos ensaios.
A eficácia de cada um dos componentes das vacinas
combinadas é demonstrada utilizando a vacina combinada.
Realizam-se ensaios de compatibilidade imunológica quando
se recomenda a administração simultânea de várias vacinas
ou quando essa compatibilidade faz parte do esquema
habitual de vacinação. Sempre que um produto seja
recomendado como parte do esquema de vacinação,
demonstra-se o seu papel na primo-vacinação e no «rappel»
ou a sua contribuição na eficácia do esquema vacinal.
ENSAIOS LABORATORIAIS
Em princípio, a eficácia é demonstrada através de ensaios, na
espécie alvo, com prova virulenta após administração do
produto de acordo com as condições de utilização
recomendadas. A prova virulenta é efectuada utilizando uma
estirpe diferente daquela que foi utilizada na produção da
vacina, Na medida do possível, as condições em que se efectua a
prova virulenta reproduzem as condições naturais de infecção,
por exemplo no que diz respeito ao número de microrganismos
e à via de administração utilizados.
Se possível, convém determinar qual o tipo de mecanismo
imunitário (celular/humoral, local/geral, classe de
imunoglobulina) que resulta da administração do produto às
espécies alvo.
ENSAIOS DE CAMPO
De uma forma geral, os resultados dos ensaios laboratoriais
são completados por dados obtidos nos ensaios de campo,
efectuados com animais testemunhas não tratados. 
Quando os ensaios laboratoriais não permitam demonstrar 
a eficácia, aceita-se que sejam apenas efectuados ensaios 
de campo.
5.2.8. MINIMIZAÇÃO DO RISCO 
DA TRANSMISSÃO DE AGENTES 
DE ENCEFALOPATIAS
ESPONGIFORMES ANIMAIS 
POR PRODUTOS MEDICAMENTOSOS
PARA USO HUMANO 
E PARA USO VETERINÁRIO
1. OBSERVAÇÕES GERAIS
2. OBJECTIVO DO CAPITULO GERAL
3. MANUFACTURA (INCLUINDO A RECOLHA DE MATÉRIAS-
-PRIMAS)
3.1. Animais utilizados como fonte de matérias-primas
3.2. Partes de animais, líquidos corporais e secreções utilizadas
como matérias-primas
3.3. Validação do procedimento
3.4. Idade dos animais
3.5. Produtos específicos
4. CONCLUSÕES
1. OBSERVAÇÕES GERAIS
As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET)
incluem o scrapie(1) em ovinos e caprinos, a encefalopatia
espongiforme dos cervídeos, a encefalopatia espongiforme
bovina (EEB), e também, no homem, o Kuru e a doença de
Creutzfeldt-Jacob (DCJ). Os agentes transmissíveis
responsáveis por estas doenças replicam-se nos indivíduos
infectados, geralmente sem sinais de infecção detectável pelos
métodos actuais de diagnóstico in vivo. Depois de períodos de
incubação que podem atingir vários anos, os agentes
desenvolvem a doença que conduz à morte do indivíduo. Não
é conhecida nenhuma solução terapêutica.
O diagnóstico é baseado nos sintomas clínicos e a
confirmação post mortem pelas lesões cerebrais
características, por histopatologia ou por detecção das
5.2.7. Avaliação da eficácia das vacinas para uso veterinário
534 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
(1) A designação oficial portuguesa, conforme a denominação
referida na Portaria 713/96 de 9 de Dezembro. é «Tremor epizoótico
dos ovinos e caprinos». No entanto, a designação scrapie é aquela
que está consagrada.
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 534
proteínas fibrilares específicas das encefalopatias
espongiformes. A demonstração da infecciosidade por
inoculação do tecido suspeito a espécies alvo ou a animais
de laboratório pode igualmente ser utilizada para
confirmação, mas o período de incubação varia de vários
meses a vários anos. Foram assinalados casos de transmissão
iatrogénica de encefalopatias espongiformes. Nos ovinos, o
scrapie foi transmitido acidentalmente após utilização de
uma vacina contra o vírus Louping III preparada a partir de
uma mistura de cérebro e baço de ovino tratados com
formol, na qual foram incorporados inadvertidamente
tecidos provenientes de um ovino infectado. No homem.
foram reportados casos de transmissão da DCJ. Nestes
últimos. foi atribuída à administração parenteral repetida de
hormona do crescimento e gonadotropina obtidas de
hipófises de cadáveres humanos. Casos de DCJ foram
igualmente atribuídos à utilização de instrumentos
contaminados em cirurgia cerebral e ao transplante de
meninges e córneas humanas.
Existe pouca informação sobre as características dos seus
agentes infecciosos. São extremamente resistentes à maioria
dos tratamentos químicos ou físicos capazes de inactivar os
vírus convencionais. Não induzem respostas imunitárias
detectáveis. Existem barreiras naturais que limitam a
proliferação da infecção entre as espécies, mas elas podem
ser ultrapassadas em circunstâncias apropriadas que
dependem geralmente da estirpe, da dose, da via de exposição
e da importância da barreira inter-espécies. Estudos em
animais de laboratório demonstraram que a inoculação
intracerebral é a via mais eficaz.
O homem tem estado naturalmente exposto ao agente
infeccioso do scrapie nos últimos 200 anos, mas apesar dos
extensosestudos epidemiológicos realizados nenhum sinal de
transmissão entre ovinos e homem foi detectado. A EEB foi,
pela primeira vez, notificada no Reino Unido em 1986. Um
grande número de bovinos e de herdades foram afectadas. É
claro que a EEB é uma infecção transmitida pela alimentação.
Casos de EEB apareceram noutros países, quer em animais
importados do Reino Unido, quer em animais autóctones. Na
medida em que as propriedades biológicas do agente causal da
EEB é diferente das do agente do scrapie, é concebível que as
barreiras inter-espécies o seja também. Existem indícios
convincentes de que a nova variante da DCJ seja devida ao
agente responsável da EEB em bovinos.
A aparição de uma nova variante da DCJ no homem reforçou
as inquietações relativas à possível transmissão do agente
infeccioso da EEB ao homem. Assim, a devida prudência
continua a aconselhar o máximo rigor nos casos em que os
produtos biológicos provenientes de espécies afectadas por
estas doenças para além da experimentação, especialmente na
espécie bovina, sejam utilizadas para o fabrico de produtos
medicinais.
As recomendações seguintes são, assim, seguidas para reduzir
ao mínimo o risco de contaminação. Apesar deste capítulo
geral, é sublinhado que o potencial risco associado a um
produto medicinal é considerado individualmente à luz das
circunstâncias específicas e do conhecimento actual.
2. OBJECTIVO DO CAPÍTULO GERAL
Este capítulo considera as implicações da EET nos produtos
medicinais e as medidas a tomar para reduzir ao mínimo o risco
de transmissão pela sua utilização. Este capitulo aplica-se, assim,
aos produtos de origem animal, particularmente aos produtos
obtidas a partir de ruminantes, utilizados na preparação de:
– substâncias activas, 
– excipientes,
– produtos base, matérias-primas e reagentes utilizados na
produção (por exemplo; albumina sérica bovina, enzimas,
meios de cultura incluindo aqueles que servem de
preparação a bancos de células de trabalho ou novos
bancos de células-mãe).
Este capítulo geral também se aplica aos produtos que
entrem em contacto directo com os equipamentos utilizados
na produção (e que deste modo são potenciais
contaminantes), por exemplo, os meios de ensaio utilizados
na validação fabril e de equipamentos.
Este capítulo geral está relacionado com os produtos obtidos
de todos os ruminantes. As medidas propostas são sobretudo
aplicáveis aos produtos oriundos de bovinos, e pode ser
necessário adaptá-las aos produtos de origem ovina, caprina e
de outras espécies em que a susceptibilidade às EET, para
além da experimentação, seja estabelecida.
Este capítulo geral é lido em conjunto com as diferentes
decisões da Comissão das Comunidades Europeias
progressivamente implementadas desde 1991.
3. MANUFACTURA E RECOLHA DE MATÉRIAS-PRIMAS
Quando os fabricantes tiverem a opção entre a utilização 
de produtos de origem ruminante ou não, a utilização de
produtos oriundos de animais não ruminantes é preferencial.
A substituição dos produtos base de ruminante por produtos
oriundos de uma outra espécie em que seja estabelecido que
sofra de EET, ou que possa ser infectada experimentalmente
por via oral, não é normalmente aceitável.
No pedido de autorização de introdução no mercado o 
requerente fornece os detalhes da origem dos produtos
(incluindo a origem geográfica do animal) e sobre as medidas
tomadas para reduzir ao mínimo o risco de transmissão dos
agentes da EET. O fabricante farmacêutico audita o
fornecedor destes produtos a fim de garantir uma origem e
uma manipulação conformes ao presente capítulo geral e aos
sistemas apropriados de controlo de qualidade.
O risco de transmissão de agentes infecciosos pode ser
reduzido de modo significativo através do controlo de um
certo número de parâmetros, entre os quais:
– a origem dos animais,
– a natureza do tecido animal utilizado no fabrico,
– o(s) processo(s) de produção.
Nenhuma destas medidas pode necessariamente estabelecer,
por si só, a inocuidade de um produto, podendo ser necessário
recorrer às três medidas complementares mencionadas acima
para reduzir ao mínimo o risco de contaminação.
3.1. Animais utilizados como fontes de matérias-primas
Uma selecção minuciosa dos produtos base constitui o critério
mais importante para a inocuidade dos produtos medicinais.
3.1.1. As matérias-primas de melhor qualidade provêem de
países em que nenhum caso de EEB tenha sido reportado e
nos quais:
– a notificação é obrigatória, e
– a verificação clínica e biológica dos casos suspeitos é
obrigatória.
535FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.8. Minimização do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinário
5.
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3. Textos gerais
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 535
Uma certificação oficial está disponível. Para além disso, é
necessário assegurar a ausência de risco de infecção por EEB
pelos seguintes factores:
– importação de bovinos oriundos de países apresentando
uma incidência elevada de EEB,
– importação de bovinos nascidos de fêmeas afectadas,
– utilização de alimentos à base de carne e ossos para
alimento de ruminantes, e contendo proteínas de
ruminantes tendo como origem países apresentando uma
baixa ou alta incidência de EEB ou em que a situação seja
desconhecida.
3.1.2. As matérias-primas podem igualmente provir de países
em que a incidência de casos autóctones de EEB seja baixa,
se, e para além dos factores descritos no parágrafo 3.1.1.:
– as carcaças de todos os animais infectados são destruídas,
– a progénie (descendência) das fêmeas afectadas não é
utilizada,
– as proteínas de origem mamífera são interditas na
alimentação de ruminantes.
Os animais são nascidos depois da entrada em vigor desta
interdição. Se a data de nascimento dos animais for
desconhecida, a data de aplicação desta interdição e o período
de incubação da EEB são tomadas em consideração para avaliar
a inocuidade da fonte de aprovisionamento.
Os rebanhos no seio dos quais tenham sido declarados casos
de EEB não podem ser utilizados para aprovisionamento.
3.1.3. As matérias-primas provenientes de países com alta
incidência de EEB não podem ser utilizados.
Paralelamente a estas medidas, os pedidos de autorização de
introdução no mercado justificam as suas estratégias de
aprovisionamento relativamente às categorias de produtos, a
quantidade de produtos base e a utilização prevista do
produto medicinal acabado no homem. É possível beneficiar
de uma margem de segurança suplementar fornecendo-se
junto de países nos quais os produtos base sejam oriundos de
rebanhos bem controlados.
3.2. Partes animais, líquidos corporais e secreções utilizadas
como matérias-primas
Num animal infectado por uma EET, os níveis de
infecciosidade variam segundo os órgãos ou as secreções. Com
base nos dados relativos à scrapie natural, os órgãos, tecidos e
secreções foram classificados em quatro grupos principais
apresentando diferentes níveis de risco potencial, conforme
apresentado na tabela 1. Apesar de ser bem conhecido que a
repartição da infecciosidade nos bovinos com EEB seja mais
restrita, a classificação dos tecidos e líquidos corporais na
tabela é sempre utilizada para a selecção dos produtos base. As
categorias contidas na tabela apenas têm um carácter
indicativo e é importante ter em atenção os seguintes pontos:
– a classificação dos tecidos apresentada na tabela l é baseada
na titulação da infecciosidade no murganho por via
intracerebral. Nos modelos experimentais utilizando as
estirpes adaptadas aos animais de laboratório, podem
observar-se títulos mais elevados e uma classificação de
tecidos ligeiramente diferente, 
– em algumas situações, pode produzir-se uma contaminação
cruzada entre tecidos pertencentes a categorias de
infecciosidade diferentes. O risco potencial dependerá das
circunstâncias nas quais os tecidos foram retirados,
nomeadamente do contacto entre os produtos de um grupo
de risco reduzido com os pertencentes a um grupo de risco
elevado. Assim, a contaminação cruzadaentre certos
tecidos corre o risco de ser acrescida se os animais
infectados forem abatidos por trepanação ou se o cérebro
e/ou a medula espinal forem serrados. O risco de
contaminação cruzada é reduzido se os líquidos corporais
forem recolhidos com um mínimo de lesões tissulares, se
os elementos celulares forem retirados e se o sangue fetal
for recolhido evitando qualquer contaminação pelos tecidos
maternos ou fetais como a placenta ou os líquidos
amniótico e alantoideu,
– o risco devido à contaminação cruzada depende de diversos
factores complementares, tais como:
– as precauções tomadas para evitar qualquer
contaminação durante a recolha dos tecidos (ver acima),
– o nível de contaminação (quantidade de tecido
contaminante),
– a quantidade de matéria-prima a utilizar,
– o tratamento a que será submetida a matéria-prima
durante o processo de fabrico.
Os fabricantes apresentam uma estimativa do risco.
TABELA 1 – Títulos infecciosos relativos à scrapie nos tecidos 
e líquidos corporais de ovinos e caprinos naturalmente infectados 
e apresentando scrapie clínica (2)
CATEGORIA I Cérebro, medula espinal, (olho). 
infecciosidade elevada
CATEGORIA II Íleo, gânglios linfáticos, cólon proximal,
infecciosidade média baço, amígdalas, (duramáter, epífise,
cerebral, placenta), líquido céfalo-raquidiano,
hipófise, glândulas supra-renais.
CATEGORIA III Cólon distal, mucosa nasal, nervos 
infecciosidade reduzida periféricos, medula óssea, fígado, pulmões,
pâncreas, timo.
CATEGORIA IV Coágulo sanguíneo, fezes, coração, rins,
infecciosidade glândulas mamárias, leite, ovários, saliva,
indetectável (3) glândulas salivares, vesículas seminais,
soro, músculos esqueléticos, testículos,
tiróide, útero, tecido fetal, (bílis, ossos(4),
tecido cartilagíneo, tecido conjuntivo,
pêlos, pele, urina).
3.3. Validação do procedimento
O controlo do aprovisionamento é o critério mais importante
para atingir uma inocuidade aceitável do produto. devido à
resistência estabelecida documentalmente dos agentes da EET
à maior parte dos processos de inactivação.
Os estudos de validação dos processos de eliminação/inactivação
são de difícil interpretação pois é necessário ter em considera-
ção a natureza do produto contaminado intencionalmente e a
sua relevância face à situação natural, a concepção do estudo
5.2.8. Minimização do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinário
536 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
(2) Os estados de referência não dosearam os tecidos entre
parêntesis, mas a infecciosidade relativa é indicada por outros dados
sobre encefalopatias espongiformes. As matérias-primas não
mencionadas podem ser classificadas por analogia com aquelas que o
são, baseando-se na sua composição.
(3) Nenhuma infecciosidade foi transmitida em roedores após
inoculação intracerebral (até 5 mg).
(4) Para o crânio e vértebras, ver também o ponto 3.2. relativamente
à contaminação cruzada.
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 536
(compreendendo a redução de escala do processo) e o método
de detecção do agente (doseamento in vitro ou in vivo), após
contaminação intencional e após tratamento. São necessárias
pesquisas suplementares para se poder atingir um acordo
relativamente à metodologia mais apropriada para os estudos
de validação. Actualmente, os estudos de validação não são,
assim, geralmente exigidos. No entanto, se a concepção dos
procedimentos que permitam eliminar ou inactivar os
agentes das EET for reivindicada, esta será justificada pelos
estudos de validação apropriados. Os estudos de validação são
específicos do processo.
Para além das restrições particulares que se aplicam aos
estudos de validação sobre as EET e à sua interpretação. O
obstáculo principal é a identificação das etapas que irão
eliminar ou inactivar eficazmente os agentes das EET durante
o fabrico dos produtos medicinais de origem biológica. Os
fabricantes são incitados a prosseguir as suas investigações
sobre os métodos de eliminação ou de inactivação a fim de
identificar as etapas/procedimentos que irão favorecer a
eliminação ou inactivação dos agentes infecciosos das EET.
Em todos os casos, um procedimento de produção é
elaborado, se possível, tendo em conta as informações
disponíveis sobre os métodos presumivelmente eficazes para
a eliminação ou inactivação dos agentes das EET.
Alguns procedimentos de produção podem contribuir
consideravelmente para a redução do risco de contaminação
pela EET, por exemplo, os procedimentos utilizados no
fabrico do sebo e seus derivados (ver adiante).
3.4. Idade dos animais
Estando assumido que a infecciosidade das EET se acumula
durante um período de incubação de vários anos, pode ser
prudente utilizar como fonte de aprovisionamento animais
jovens.
3.5. Produtos específicos
– É pouco provável que o leite e seus derivados possam
apresentar um risco de contaminação.
– É pouco provável que algumas matérias-primas e seus
derivados, tais como os pêlos e a lã utilizados no fabrico de
álcoois de lã e de lanolina, apresentem um risco de
contaminação. se as garantias de recolha e de tratamentos
forem fornecidas.
– O sebo utilizado como matéria-prima no fabrico de
derivados do sebo é produzido segundo um método, pelo
menos tão robusto e rigoroso como os mencionados nos
regulamentos internacionais. Os derivados do sebo, como o
glicerol e os ácidos gordos que são fabricados a partir do
sebo através de procedimentos rigorosos foram objecto de
considerações específicas e é pouco provável que sejam
infecciosos. Exemplos de procedimentos rigorosos são:
– a transesterificação ou hidrólise sob pressão, a uma
temperatura de, pelo menos, 200°C e durante 20 min,
no mínimo (para a produção de glicerol, ácidos gordos e
ésteres de ácidos gordos).
– a saponificação pelo NaOH 12 M (para a produção de
glicerol e sabão):
– produção por lotes: a uma temperatura de pelo menos
95°C e durante 3 h no mínimo,
– produção em continuo: a uma temperatura de, pelo
menos, 140°C, a uma pressão de 2 bares (2000 hPa)
durante 8 min, no mínimo, ou equivalente.
– Gelatina:
– Para a gelatina produzida a partir de ossos de bovinos(5),
o conjunto dos seguintes parâmetros contribui para a
inocuidade deste produto:
– a origem geográfica dos animais,
– os crânios e medulas espinais presentes na matéria- 
-prima(6) são eliminados,
– é geralmente recomendada a exclusão das vértebras,
em função da origem geográfica dos animais,
– o método de fabrico actualmente preferido é a
hidrólise alcalina,
– os sistemas tais como a certificação ISO 9000 e HACCP
(Hazard Analysis and Critical Control Point) são
implementados para a vigilância do processo de
produção e a produção por lotes (definição do lote,
separação dos lotes, limpeza entre lotes, etc.),
– os procedimentos são implementadas para assegurar a
traçabilidade e auditar os fornecedores de matérias- 
-primas.
– Para a gelatina produzida a partir da pele de bovinos:
– toda a contaminação cruzada com as substâncias
potencialmente infecciosas é evitada.
Os fabricantes apresentam uma estimativa do risco.
4. CONCLUSÕES
A estimativa do risco associado à EET necessita que todos os
parâmetros citados sejam minuciosamente tomados em
consideração, e a opção prioritária consiste em evitar a
utilização das matérias-primas derivadas de animais em que a
susceptibilidade às EET esteja estabelecida (de outro modo
que não a prova experimental) nos produtos fabricados pela
indústria farmacêutica. A aceitabilidade de um produto
medicinal, em particular, contendo tais matérias-primas ou
podendo, em resultado do fabrico, contê-las, depende de um
certo número de factores, entre os quais:
– os documentos e os registos atestando a origem dos animais,
– a natureza do tecido animal utilizado durante o fabrico,
– o(s) procedimento(s) de fabrico,
– a via de administração,
– a quantidade de tecido utilizado nos produtos medicinais,
– a posologia terapêutica máxima (dose diária e duração do
tratamento),
– a utilização previstado produto.
537FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.8. Minimização do risco EST por produtos medicamentosos para uso humano e para uso veterinário
5.
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(5) São aqui considerados como produto base, os ossos antes do
desengorduramento
(6) A futura distribuição geográfica das EEB/EET não pode ser
prevista. Qualquer modificação da distribuição geográfica das
EEB/EET pode conduzir na pior das situações, a retirada de produtos
medicinais contendo gelatina. Devido ao elevado número de produtos
medicinais que contêm gelatina como excipiente e o prazo de
validade elevado da gelatina a partir da sua produção até à data limite
de conservação de produtos farmacêuticos, qualquer retirada terá
consequências dramáticas em termos de aprovisionamento de
produtos medicinais essenciais. O crânio e a medula espinal são, por
isso, retirados dos produtos-base da gelatina derivada de ossos de
bovino qualquer que seja a origem geográfica dos animais utilizados.
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 537
Os fabricantes farmacêuticos e os produtores de produtos
medicinais de origem animal são responsáveis pela selecção e
justificação das medidas adequadas. O estado da ciência e das
tecnologias são tomados em consideração.
Apesar deste capítulo geral, é de sublinhar que o risco
potencial associado a um produto medicinal específico é
considerado individualmente à luz das circunstâncias
específicas e dos conhecimentos do momento.
Estas indicações são igualmente utilizadas na avaliação da
relação risco-benefício de cada produto.
5.2.9. AVALIAÇÃO DA INOCUIDADE 
DE CADA LOTE DE VACINAS 
E SOROS PARA USO VETERINÁRIO
O termo «produto» utilizado neste texto, tanto se aplica a uma
vacina como a um soro.
Definição das reacções anormais. Durante os estudos de
desenvolvimento, o tipo e o tamanho das reacções esperadas
após administração do produto, são definidas à luz dos
estudos de inocuidade. No quadro dos ensaios de inocuidade
efectuados em cada lote, esta definição das reacções locais e
gerais normais ou anormais é depois utilizada para se avaliar
as reacções aceitáveis e não aceitáveis.
Quantidade administrada durante o ensaio. Para um produto
apresentando o título ou a actividade pretendidos dentro dos
limites especificados para os lotes de produção, o termo
«dose» nos ensaios, designa a dose recomendada. A
quantidade a ser administrada no ensaio é geralmente
definida em número de doses. No caso de vacinas vivas
liofilizadas, as 10 doses são reconstituídas num volume
apropriado de solvente para o ensaio. No caso de produtos que
se apresentam na forma de 2 recipientes contendo
respectivamente 1 ou vários componentes vivos liofilizados e
um ou vários componentes inactivados a utilizar como
diluente, pode ser necessário utilizar líquido suplementar
para reconstituir o(s) componente(s) liofilizado(s). Quando
necessário e justificado convém injectar num local o
conteúdo de 2 recipientes do componente inactivado
misturado no conteúdo de um número máximo de recipientes
do componente vivo liofilizado e os restantes componentes
vivos liofilizados reconstituídos num solvente apropriado,
podem ser inoculados num local separado. No caso de vacinas
combinadas, os ensaios efectuados na vacina combinada
consideram-se como suficientes para estabelecer a inocuidade
dos componentes individuais.
Via de administração. O produto administra-se por uma das
vias recomendadas. Em princípio, convém preferencialmente
utilizar a via de administração mais favorável em permitir a
detecção de reacções.
Quando se sabe que existe um risco particular, por exemplo
na sequência dos estudos de desenvolvimento, efectua-se uma
2ª administração com a dose apropriada após um intervalo
apropriado como se determinou durante a fase de
desenvolvimento.
Espécies animais e categorias alvo. Salvo excepção justificada
e autorizada, convém utilizar animais com idade mínima
recomendada e da espécie mais sensível para a vacinação ou
administração do produto.
Número de animais. Nas monografias indicam-se o numero
de animais a utilizar. Regra geral, é de 2 para os mamíferos e
de 10 para as aves e os peixes.
Identificação dos animais. Salvo excepção justificada, todos
os animais são objecto de uma marcação que permita o
registo individual dos dados respeitantes ao período total de
observação.
Período de observação. Quando se registam critérios
objectivos como se descreve a seguir, tal como a temperatura
corporal, os animais são examinados e observados durante,
pelo menos, 3 dias antes da administração do produto. Após
administração do produto, os animais São mantidos em
observação e examinados, pelo menos, 1 vez por dia, durante,
no mínimo, 14 dias, para se detectar reacções locais e gerais.
No dia da administração do produto, é necessário efectuar,
pelo menos, 1 inspecção suplementar após 4 h, ou nos
intervalos de tempo especificados nas monografias. Nos casos
de 2ª administração do produto, o período de observação
termina 14 dias após a administração.
Reacções locais e gerais. Os animais que apresentam
reacções locais ou gerais anormais graves são abatidos. Em
todos os animais mortos efectua-se um exame necrópsico
macroscópico. Podem ser indicados exames microscópicos e
microbiológicos complementares.
Os animais mantidos em observação são examinados com
vista a serem detectadas reacções locais ou gerais.
Quando constituam indicadores de utilidade reconhecida, são
também registados outros critérios, por exemplo a
temperatura corporal, a massa corporal, outros índices de
rendimento e consumo de alimentos.
Reacções locais. Na medida em que for apropriado e
possível, registam-se o tamanho e a persistência de qualquer
reacção local (incluindo a aparecimento de reacções
dolorosas) e também o numero de animais que manifestam
as reacções locais.
Reacções gerais. A temperatura, e se apropriado, a massa
corporal são anotados como indicadores gerais dos efeitos
sistémicos da administração do produto. Todos os sinais
clínicos são igualmente registados.
Temperatura corporal. Nos mamíferos, os estudos incluem a
medição da temperatura corporal durante o período de
observação. A temperatura corporal é registada, pelo menos, 
3 dias antes da administração do produto, na altura da
administração e depois, decorridas 4 h e em intervalos
regulares. A temperatura corporal antes da administração do
produto encontra-se entre os valores fisiológicos. Pelo menos
nos produtos em que é previsível um aumento significativo da
temperatura (por exemplo nos produtos que contêm
endotoxinas e várias vacinas víricas vivas) ou nos quais a
monografia correspondente especifica um aumento da
temperatura (por exemplo, no máximo, 2°C nas vacinas
contra a actinobacilose do porco), recomenda-se a utilização
da temperatura média dos dias anteriores à administração do
produto (por exemplo, -3 dias ao dia 0) como linha base de
temperatura, para se dispor de um critério claro para a
avaliação do ensaio.
Massa corporal e consumo de alimento. Quando constitui um
indicador de inocuidade com uma fiabilidade e uma utilidade
reconhecidas, por exemplo nos animais jovens em fase de
crescimento ou nos peixes, a massa corporal é medida e
documentada pouco tempo antes da administração do
produto e durante o período de observação. Controla-se o
5.2.9. Avaliação da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinário
538 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 538
consumo de alimentos e documenta-se como indicador do
efeito da administração do produto. Na maior parte dos casos,
é suficiente registar a ração diária consumida ou a que é
parcial ou totalmente rejeitada, mas, em alguns casos, pode
ser necessário registar o peso efectivo da alimentação
consumida, quando se trata de um indicador apropriado da
inocuidade do produto.
Sinais clínicos. Anotam-se todos os sinais clínicos de natureza
geral, esperados ou não, nomeadamente as modificações do
estado de saúde e as alterações de comportamento.
Fichas de avaliação.Em função dos sinais esperados,
preparam-se as fichas de avaliação para cada produto. Todos os
parâmetros e todos os dados são registados nestas fichas. As
fichas incluem parâmetros gerais mas também são adaptadas a
cada tipo de produto e incluem a lista de sinais clínicos que
podem ser mais marcantes para um dado produto.
Critérios para a repetição do ensaio. Se surge um sinal
anormal, com base se necessário de um exame necrópsico, o
veterinário responsável determina se esse sinal é devido ao
produto. Se a causa do sinal clínico não for claro ou quando
um animal é retirado do ensaio por motivos independentes do
produto, o ensaio pode ser repetido. Se, no 2º ensaio,
reaparece o mesmo sinal anormal, o produto não satisfaz ao
ensaio. Regista-se qualquer tratamento administrado aos
animais durante o período de observação. Se o tratamento
puder interferir com o ensaio, o ensaio não é válido.
539FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.9. Avaliação da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinário
5.
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541FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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5.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA
DE RESULTADOS 
DE ENSAIOS E TESTES
BIOLÓGICOS
1. Introdução ...................................................................... 543
2. Aleatoriedade e independência de tratamentos 
individuais ...................................................................... 543
3. Ensaios dependentes de respostas quantitativas .......... 544
4. Ensaios dependentes de respostas qualitativas ............ 553
5. Exemplos ........................................................................ 555
6. Combinação de resultados de ensaios .......................... 567
7. Para além desta monografia ........................................ 569
8. Tabelas e métodos de cálculo........................................ 570
9. Glossário de símbolos e termos.................................... 573
10. Bibliografia recomendada ............................................ 575
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 541
A segunda versão desta monografia aparece agora 
restruturada, mantendo-se os conceitos definidos na 
introdução feita na tradução portuguesa para a Farmacopeia 
Portuguesa VI. Aconselhamos a consulta daquela monografia, 
pois alguns conceitos não estão aqui contemplados; por outro 
lado, e mantendo o princípio já consignado, apresenta-se em 
suplemento um glossário de termos estatísticos nas versões 
portuguesa e inglesa, uma vez que a terminologia estatística 
está muito ligada à língua inglesa. 
1. INTRODUÇÃO
Este capítulo contém indicações relativas à concepção de
ensaios biológicos prescritos na Farmacopeia e à análise dos
seus resultados. Foi redigido para uso dos utilizadores de que
nem a formação nem as funções principais sejam de estatís-
tica, mas que, pelas suas funções devem analisar ou interpre-
tar os resultados daqueles ensaios, muitas vezes sem o auxílio
ou orientação de um especialista. Os métodos de cálculo
descritos aqui não têm um carácter obrigatório para interpre-
tação dos doseamentos que constituem parte integrante da
Farmacopeia. Podem ser utilizados métodos alternativos, sob
a condição de serem tão fiáveis como os aqui descritos. Há
uma grande escolha de programas de cálculo à disposição do
analista, e podem ser mais ou menos úteis de acordo com as
facilidades disponíveis e as competências do analista.
Há situações onde a orientação de um especialista é necessária: 
tratamento global da organização e análise de ensaios no 
âmbito da investigação ou do desenvolvimento de novos 
produtos; as restrições impostas ao desenho do ensaio neste 
capítulo não sejam satisfeitas, por exemplo restrições 
laboratoriais específicas podem requerer desenhos de ensaios 
particulares, ou quando o uso de doses em número igual e 
equidistantes não é apropriado; análise de curvas dose-resposta 
não lineares de grande extensão, como por exemplo nos ensaios 
imunológicos. Um esboço pormenorizado de análises de curva 
dose-resposta para um conjunto alargado de modelos é incluído 
na secção 3.4 e um exemplo simples é dado na secção 5.4.
1.1. DESENHO GERAL E PRECISÃO
A Farmacopeia descreve métodos biológicos destinados ao
doseamento de substâncias e preparações em que a actividade 
não pode ser correctamente determinada por métodos
químicos ou físicos. Na medida do possível, o princípio
aplicado nos doseamentos é a comparação com a preparação
padrão de modo a determinar a quantidade da amostra que
produz o mesmo efeito biológico que uma quantidade deter-
minada da substância padrão, a Unidade. Uma das condições
essenciais à aplicação destes métodos de titulação é que os
ensaios são efectuados simultaneamente com as preparações
padrão e as amostras, e em condições idênticas. Para certos
ensaios (por exemplo, determinação de títulos de vírus), a
actividade da amostra não é expressa em termos relativos em
relação ao padrão. A secção 4.5 refere-se a este tipo de ensaio.
Qualquer avaliação da actividade derivada do ensaio biológico
é sujeita a erro aleatório devido à variabilidade inerente das
respostas biológicas e devem ser feitos os cálculos dos erros,
se possível, a partir dos resultados dos ensaios, mesmo
quando são utilizados os métodos oficiais. Os métodos para o
desenho dos ensaios e cálculos dos respectivos erros são,
assim, descritos a seguir. Em cada caso, antes da adopção de
um método estatístico, devem ser realizados ensaios
preliminares em número apropriado de modo a certificar a
aplicabilidade do método.
Os limites de confiança para uma determinada actividade dão
uma indicação da precisão com a qual a actividade foi
calculada no ensaio. São calculados tendo em atenção o
desenho experimental e o tamanho da amostra. O limite de
confiança para 95 por cento é habitualmente escolhido para
os ensaios biológicos. Os métodos matemáticos são utilizados
para calcular aqueles limites e para garantir que existe a
probabilidade de 95 por cento de que estes limites incluam a
actividade real. A aceitação desta precisão pela Farmacopeia
depende dos requisitos estipulados na monografia da
preparação em causa.
Os termos «média» e «desvio padrão» são usados aqui tal 
como definidos nos manuais de bioestatística mais divulgados.
Os termos «actividade declarada» ou «actividade rotulada»,
«actividade atribuída», «actividade assumida», «relação de
actividade» e «actividade estimada» são usados neste capítulo
para os conceitos seguintes:
– «actividade declarada» ou «actividade rotulada»: no caso de
um produto preparado, é um valor nominal atribuído a
partir do conhecimento existente da actividade da matéria
prima; no caso da matéria prima, consiste na actividade
prevista pelo fabricante,
– «actividade atribuída»: a actividade da substância padrão,
– «actividade assumida»: actividade provisória de uma
amostra que forma a base de cálculo da dose que irá ter
uma actividade equivalente à dose da preparação com o
padrão a utilizar,
– «relação de actividade « de uma amostra: relação entre as
doses da preparação padrão e da amostra com uma activi-
dade equivalente nas condições do ensaio,
– «actividade estimada»: actividade calculada a partir dos
dados do ensaio.
A secção 9 (Glossário de símbolos e termos) contém uma
tabela com os símbolos mais usados neste anexo. Quando o
texto se referir a um símbolo inexistente naquela secção ou
usar um símbolo para um conceito diferente, ele será definido
na respectiva parte do texto.
2. ALEATORIEDADE E
INDEPENDÊNCIA DE TRATAMENTOS
INDIVIDUAIS
A distribuição de diferentes tratamentos a diferentes unidades
experimentais (animais, tubos, etc.) deve ser realizada estrita-
mente por processos aleatórios. Qualquer outra escolha de
condições experimentais, que não sejam contempladas no
desenho experimental, deve igualmente ser aleatória.
Exemplos disso são a escolha da posição das jaulas num
laboratório e a ordem de administração dos tratamentos. Em
particular, um grupo de animais que recebaa mesma dose de
qualquer preparação não deve ser tratado em conjunto (ao
mesmo tempo ou na mesma posição), a não ser que exista
uma forte evidência que a fonte de variação relevante (por
exemplo, entre tempos ou entre posições) seja negligenciável.
A distribuição aleatória pode ser obtida a partir de computa-
dores usando a função aleatória pré-definida. O experimenta-
dor deve verificar que são produzidas séries de números
diferentes cada vez que a função é activada.
As preparações atribuídas a cada unidade experimental devem
ser tão independentes quanto possível. Dentro de cada grupo
experimental, as diluições atribuídas a cada tratamento não
543FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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5.3. Análises estatísticas
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 543
devem ser apenas divisões da mesma dose, mas preparadas
individualmente. Sem esta precaução indispensável, a variabi-
lidade inerente à preparação não estará completamente repre-
sentada na variância do erro experimental. O resultado será
uma subestimação do erro residual conduzindo a:
1) um aumento injustificado do rigor dos testes da análise de
variância (ver secções 3.2.3 e 3.2.4),
2) uma subestimativa dos verdadeiros limites de confiança
para o teste, que são calculados a partir da estimativa de s2
(média quadrática do erro residual), tal como é mostrado
na secção 3.2.5.
3. ENSAIOS DEPENDENTES 
DE RESPOSTAS QUANTITATIVAS
3.1. MODELOS ESTATÍSTICOS
3.1.1. PRINCÍPIOS GERAIS
Os ensaios biológicos incluídos na Farmacopeia foram
concebidos como «ensaios de diluição», o que significa que é
suposto que as amostras a serem ensaiadas tenham a mesma
substância activa que as preparações padrão, mas em propor-
ções diferentes de substância activa e substâncias inertes. Em
tal caso, as amostras podem, em teoria, ser derivadas das
preparações padrão por diluição com substâncias inertes. Para
verificar se um ensaio em especial pode ser considerado um
ensaio de diluição, é necessário observar os efeitos da diluição
dos padrões na relação dose-resposta da substância activa.
Quando a diferença entre a relação dose-resposta das prepara-
ções padrão e da amostra num ensaio se desvia marcadamente 
do efeito da diluição da substância activa na diluição teórica do
ensaio, este modelo não é validado para este ensaio específico.
Diferenças significativas nas relações dose-resposta do padrão 
e da amostra podem sugerir que uma das preparações contém, 
para além da substância activa, outras componentes que não 
são inertes mas que podem influenciar as respostas medidas.
Para realizar o efeito da diluição no modelo teórico aparente,
é útil transformar a relação dose-resposta numa função linear
na maior latitude possível de doses. Dois modelos estatísticos
são de interesse para os ensaios biológicos prescritos: o
modelo de linhas paralelas e o modelo de relação de declives.
A aplicação de qualquer um deles é dependente do preenchi-
mento das seguintes condições:
1) os diferentes tratamentos foram atribuídos aleatoriamente
às unidades experimentais,
2) as respostas de cada tratamento estão normalmente
distribuídas,
3) os desvios padrões da resposta dentro de cada grupo tratado
do padrão e da amostra não diferem significativamente uns
dos outros.
Quando um ensaio é desenvolvido, o analista deve determinar
que os dados recolhidos em múltiplos ensaios obedecem às
seguintes condições teóricas:
– a condição 1 pode ser preenchida através de um uso
eficiente da secção 2,
– a condição 2 é um requisito que na prática é sempre
cumprido. Desvios menores deste requisito geralmente não
introduzem defeitos nas análises, desde que as diferentes
réplicas por tratamento sejam incluídas. Em caso de
dúvida, pode ser feito um teste para desvio à normalidade
(p. ex. o teste de Shapiro-Wilk(1)),
– a condição 3 pode ser verificada com um teste de homoge-
neidade de variâncias (p. ex. o teste de Bartlett(2) ou o teste
de Cochran(3)). A inspecção das representações gráficas dos
dados pode igualmente ser elucidativa deste objectivo (ver
exemplos na secção 5).
Quando as condições 2 e/ou 3 não forem satisfeitas, a trans-
formação das respostas podem originar um melhor preenchi-
mento daquelas condições. Exemplos são ln y, �y� ou y2:
– a transformação logarítmica das respostas y em ln y pode
ser útil quando a homogeneidade das variâncias não é
satisfatória. Pode igualmente melhorar a normalidade da
distribuição quando ela está desvia para a direita,
– a transformação de y em �y� é útil quando as observações
seguem a distribuição de Poisson, isto é, quando são
obtidas por contagem,
– a transformação quadrática de y em y2 é útil quando, por
exemplo, é mais provável que a dose seja proporcional à área
de uma zona de inibição do que à medida do diâmetro da zona.
Para alguns ensaios dependentes de respostas quantitativas,
tal como os imunoensaios ou ensaios in vitro em células, deve
ser usado um grande número de doses. Estas doses dão
respostas que abarcam toda a latitude de respostas e
produzem uma curva não linear prolongada da dose-resposta. 
Tais curvas são típicas de todos os bioensaios, mas para
muitos ensaios o uso de um largo número de doses não é
ético (por exemplo, ensaios in vivo) ou prático, e os objectivos
do ensaio podem ser atingidos com um número limitado de
doses. É, deste modo, habitual restringir as doses à parte
linear da curva dose-resposta obtida por uma transformação
apropriada, de modo a que os métodos descritos nas secções
3.2 ou 3.3 sejam aplicáveis. Contudo, em alguns casos a
análise de toda a curva dose-resposta é desejável. Um esboço
de um modelo aplicável para tais análises é dado na secção 3.4
e um exemplo simplificado é apresentado na secção 5.4.
Uma categoria separada é constituída pelos ensaios em que a
resposta não pode ser mensurada em cada unidade
experimental, mas em que apenas a fracção das unidades
respondendo a cada tratamento podem ser contadas. Esta
categoria é abordada na secção 4.
3.1.2. ENSAIOS DE ROTINA
Quando um ensaio é de utilização em rotina, é normalmente
possível verificar sistematicamente o cumprimento das
condições 1 a 3, porque o número limitado de observações
por ensaio pode influenciar a sensibilidade dos testes estatís-
ticos. Felizmente, foi demonstrado que, em ensaios balancea-
dos simetricamente, pequenos desvios à homogeneidade da
variância e da normalidade não afectam seriamente os
resultados do ensaio. A aplicabilidade do modelo estatístico
deve ser questionada apenas quando uma série de ensaios
demonstrar uma validação duvidosa. Pode então ser necessá-
rio desenvolver uma série de investigações preliminares como
discutido na secção 3.1.1.
5.3. Análises estatísticas
544 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
(1) Wilk, M. B. e Shapiro, S. S. (1968). «The joint assessment of nor-
mality of several independent samples», Technometrics, 10: 825-839.
(2) Bartlett, M. S. (1937). «Properties of sufficiency and statistical
tests», Proc. Roy. Soc. London, Series A, 160: 280-282.
(3) Cochran, W. G. (1951). «Testing a linear regression amoung
variances», Biometrics 7, 17-32.
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 544
Duas outras condições necessárias condicionam do modelo
estatístico a ser usado:
– para o modelo de linhas paralelas
4A. A relação entre o logaritmo da dose e a resposta pode ser 
representada por uma linha recta no intervalo das doses
usadas,
5A. Para qualquer amostra no ensaio, a linha recta é paralela
à obtida com o padrão.
– para o modelo de relação de declives
4B. A relação entre a dose e a resposta pode ser representada 
por uma linha recta para cada preparação no ensaio acima
do intervalo de doses utilizadas,
5B. Para cada amostra no ensaio, a linha recta intersecta o
eixo y (na dose zero) no mesmo ponto que a linha recta da
preparação padrão (isto é, as funções de resposta de todas
as preparações do ensaio devem ter o mesmo ponto de
intercepção da resposta da função padrão).
As condições 4A e 4B apenas podem ser verificadas em ensaiosfísicas ou
químicas atingidas pela carga, durante toda a duração do ciclo
de esterilização.
Esterilização pelo vapor (em autoclave). Quando é aplicável,
a esterilização pelo vapor saturado sob pressão é o método
15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 515
recomendado, nomeadamente para as soluções aquosas. Para
este método de esterilização final, as condições padrão
aplicáveis às preparações aquosas são de 121°C, durante, pelo
menos, 15 min. Podem utilizar-se outras combinações de
temperatura e tempo desde que se demonstre que o processo
escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada e
reprodutível quando aplicado como rotina dentro dos limites
de tolerância estabelecidos. Os métodos e precauções
utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 10–6. As
informações relativas à validação por meio do conceito F0 são
dadas mais adiante (5.1.5).
Os parâmetros físicos (temperatura e pressão) existentes
dentro da autoclave durante o processo de esterilização são
conhecidos. A temperatura é geralmente determinada por
meio de sondas instaladas no interior de vários recipientes
representativos bem como em pontos da autoclave
previamente identificados como os mais frios do conjunto da
carga. Os parâmetros físicos são registados durante todo o
decorrer do ciclo, por exemplo na forma de diagrama
temperatura/tempo ou qualquer outra apropriada.
Quando se procede a um ensaio biológico de verificação, é
conveniente utilizar um indicador biológico apropriado (5.1.2).
Esterilização pelo calor seco. Para este método de
esterilização final as condições padrão são de 160°C durante,
pelo menos, 2 h. Podem utilizar-se outras combinações de
temperatura e tempo desde que se demonstre que o
processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada
e reprodutível quando aplicado como rotina dentro dos
limites de tolerância estabelecidos. Os métodos e precauções
utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 10–6.
A esterilização pelo calor seco realiza-se em estufas de
ventilação forçada ou noutros dispositivos especialmente
preparados para o efeito. A carga é cotocada de tal modo que a
temperatura seja uniforme em todo o conjunto. Obtêm-se
dados relativos à temperatura no interior do esterilizador
durante o processo de esterilização, recorrendo geralmente a
sondas instaladas no interior de vários recipientes
representativos bem como em pontos do esterilizador
previamente identificados como os mais frios do conjunto da
carga. A temperatura é registada durante todo o decorrer do
ciclo, de forma apropriada.
Quando se procede a um ensaio biológico de verificação, é
conveniente utilizar um indicador biológico apropriado (5.1.2).
O calor seco a mais de 220°C é frequentemente utilizado para
esterilizar e despirogenar material de vidro. Neste caso, em
lugar de utilizar indicadores biológicos de esterilização
(5.1.2), é possível demonstrar a existência de uma redução de
3 log das endotoxinas resistentes ao calor.
Esterilização por radiações ionizantes. Este método de esterili-
zação efectua-se por exposição do produto a uma radiação ioni-
zante que pode ser uma radiação gama proveniente de um
radioisótopo apropriado (cobalto 60, por exemplo) ou um feixe
de electrões acelerados por meio de um acelerador apropriado.
Em certos países existem regulamentações especiais para a
utilização das radiações ionizantes para fins de esterilização
(ver, por exemplo, as Notas Explicativas CEE).
Para este método de esterilização final, a dose padrão (dose
absorvida) é de 25 kGy. Podem utilizar-se outros valores desde
que se demonstre que a dose escolhida assegura uma taxa de
letalidade adequada e reprodutível quando aplicado como
rotina dentro dos limites de tolerância estabelecidos. Os
métodos e precauções utilizados permitem obter um NSE de,
pelo menos, 10–6.
Durante o processo de esterilização, a radiação absorvida pelo
produto é objecto de verificações regulares, efectuadas por
processos dosimétricos que são independentes da taxa de
radiação. Os aparelhos são calibrados em relação a uma fonte
padrão numa instalação de referência quando da recepção e
depois com intervalos de tempo apropriados que não
ultrapassam 1 ano.
Quando se procede a um ensaio biológico de verificação, é
conveniente utilizar um indicador biológico apropriado (5.1.2).
Esterilização por gases. Este método só é utilizado quando
não é possível aplicar qualquer um dos outros processos. É
essencial assegurar a penetração do gás e da humidade no
produto a esterilizar e utilizar depois um processo de
eliminação do gás em condições que se verificou previamente
permitirem que no produto esterilizado os resíduos ou
produtos de transformação do gás se reduzem a uma
concentração inferior à que pode provocar efeitos tóxicos
quando da utilização. A este respeito, as notas explicativas da
CEE fornecem indicações quanto ao emprego do óxido de
etileno.
Convém, sempre que possível, determinar e registar a
concentração do gás, a humidade relativa, a temperatura e o
tempo de esterilização. As determinações são efectuadas nos
locais mais desfavoráveis do ponto de vista da realização das
condições de esterilização, locais estes que foram
determinados quando da validação.
A eficácia do processo é verificada, para cada carga
esterilizada, com indicadores biológicos apropriados (5.1.2).
Um amostra apropriada de cada lote é submetida a um ensaio
de esterilidade (2.6.1) antes da sua libertação.
Filtração
Certas substâncias activas ou produtos não susceptíveis de
serem submetidos a uma esterilização final podem ser
esterilizados por filtração usando um tipo de filtro que
satisfaça a uma prova microbiana realizada com um
microrganismo de ensaio apropriado. Pode servir uma
suspensão de Pseudomonas diminuta (ATCC 19146 NCIMB
11091 ou CIP 103020). Recomenda-se aplicar uma carga de
prova de, pelo menos, 107 ufc por cm2 de área activa de
filtração e preparar a suspensão num meio de cultura de
triptano-soja que, após passagem através do filtro, é
recolhido em condições assépticas e incubado em aerobiose a
32°C. Estes produtos necessitam de precauções especiais. O
processo e o ambiente de produção são escolhidos de modo a
limitar os riscos de contaminação microbiana e são objecto
de verificação regular por métodos apropriados. O
equipamento, os recipientes e fechos e, se possível, os
componentes do produto são submetidos a um processo de
esterilização conveniente. Efectua-se a filtração esterilizante
tão próximo quanto possível do ponto de enchimento. As
operações que se seguem à filtração são realizadas em
condições assépticas.
As soluções são filtradas por uma membrana antibacteriana
de porosidade nominal inferior ou igual a 0,22 µm ou por
outro tipo de filtro que possua propriedades equivalentes de
retenção de bactérias. São tomadas precauções para evitar as
perdas de soluto por adsorção no filtro e a libertação de
contaminantes pelo filtro. Tem-se em conta a contaminação
microbiana antes da filtração, a capacidade do filtro, o
tamanho dos lotes e o tempo de filtração. Um mesmo filtro
não é utilizado durante um espaço de tempo superior àquele
que foi definido como adequado quando da validação do
conjunto filtro-produto.
5.1.1. Métodos de preparação de produtos estéreis
516 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 516
A integridade dos filtros esterilizantes é verificada antes e
depois do seu uso por meio de ensaios adaptados ao tipo de
filtro e à etapa em que é efectuada a verificação (por exemplo,
ponto de bolha, resistência à pressão ou taxa de difusão).
Dados os riscos suplementares que comporta a filtração, em
relação aos outros métodos de esterilização, pode ser
desejável proceder a uma pré-filtração com um filtro
antibacteriano quando é impossível limitar a contaminação
microbiana por outros meios.
Preparação asséptica
O objectivo da preparação asséptica é manter a esterilidade de
um produto obtido a partir de componentes previamente
esterilizados por um dos métodos antes descritos. O processoem que, pelo menos, 3 diluições de cada preparação foram
testadas. O uso de um ensaio com apenas 1 ou 2 diluições
pode ser justificado quando a experiência demonstrou que a 
linearidade e o paralelismo ou igual intercepção são regular-
mente realizadas.
Depois de recolher os resultados de um ensaio, e antes de
calcular a sua actividade relativa de cada amostra, deve ser 
feita uma análise de variância de modo a verificar se as condi-
ções 4A e 5A (ou 4B e 5B) são cumpridas. Para tal, o total da
soma dos quadrados é subdividido num certo número de
somas de quadrados correspondentes a cada condição que foi
realizada. O restante da soma dos quadrados representa o erro
experimental residual para a qual a ausência ou presença de
causas relevantes de variação pode ser comparada pelas séries
de rácios-F.
Quando a validação está estabelecida, a actividade de cada
amostra relativamente ao padrão pode ser calculada e
expressa como uma relação de actividade ou convertida numa
qualquer unidade relevante para a amostra em teste, por
exemplo em Unidades Internacionais. Os limites de confiança
podem ser calculados para cada conjunto de dados do ensaio.
Se alguma das cinco condições (1, 2, 3, 4A e 5A ou 1, 2, 3, 4B 
e 5B) não for preenchida, os métodos de calculo aqui descritos 
não são válidos e deve ser realizado um estudo especial do
ensaio técnico.
O analista não deve usar mais nenhuma transformação a não 
ser que seja demonstrado que o incumprimento dos requisitos 
não é acidental mas é devido a uma modificação sistemática
das condições experimentais. Neste caso, os ensaios, tal como 
descrito na secção 3.1.1., devem ser repetidos antes de adoptar
uma nova transformação nos ensaios de rotina.
Um número excessivo de ensaios inválidos devido à ausência
de paralelismo ou de linearidade, num ensaio de rotina
realizado para comparar materiais similares, indica desenhos
experimentais com replicação inadequada. Esta inadequação
resulta normalmente do reconhecimento incompleto de todas
as causas de variação que podem afectar o ensaio, o que pode
originar na subavaliação do erro residual conducente a
grandes rácios-F.
Nem sempre é possível ter em atenção todas as causas
possíveis de variação num único ensaio (por exemplo,
variação diária). Nestes casos, os limites de confiança de
ensaios repetidos da mesma amostra podem não se sobrepor
satisfatoriamente, e deve ter-se cuidado na interpretação dos
limites de confiança individuais.. De modo a obter uma
avaliação mais correcta do limite de confiança pode ser
necessário realizar vários ensaios independentes e combiná-
-los numa única actividade estimada e num único intervalo
de confiança (ver secção 6).
Com o objectivo fazer o controlo de qualidade de ensaios de
rotina é recomendado manter o registo das previsões do
declive da regressão e da previsão do erro residual nos mapas
de controlo.
– Um erro residual excepcionalmente elevado pode indicar
um problema técnico. Este facto deve ser investigado e, se
for demonstrado que algo correu mal durante o processo, o
ensaio deve ser repetido. Um erro residual invulgarmente
elevado pode igualmente indicar a presença de uma resposta
fora de contexto (outlying) ou de uma observação aberrante.
Uma resposta questionável devido à falha de cumprimento
do procedimento durante um ensaio é rejeitada. Se for
descoberto um valor aberrante após o registo das respostas,
mas puder ser relacionado com irregularidades do ensaio,
pode ser justificada a sua omissão. A rejeição ou retenção
arbitrária de uma resposta aparentemente aberrante pode
ser uma forte causa de interferência. Em geral, desenco-
raja-se a rejeição de observações apenas devido à significân-
cia de um teste de contexto.
– Um erro residual excepcionalmente baixo pode verificar-se
esporadicamente e dá origem a rácios-F que excedem os
valores críticos. Em tal caso, pode justificar-se a substitui-
ção do erro residual estimado a partir do ensaio individual
pelo erro residual médio baseado nos dados históricos
registados nos mapas de controlo.
3.1.3. CÁLCULOS E RESTRIÇÕES
De acordo com os princípios gerais de um bom desenho
experimental as seguintes 3 restrições são normalmente
impostas no desenho dos ensaios. Elas têm vantagens quer na
facilidade de cálculo quer na precisão.
a) Cada preparação no ensaio deve ser testada com o mesmo
número de diluições.
b) No modelo de linhas paralelas, o rácio de doses adjacentes
deve ser constante para todos os tratamentos do ensaio; no
modelo de relação de declives, o intervalo entre doses
adjacentes deve ser constante para todos os tratamentos
do ensaio.
c) Deve existir um número igual de unidades experimentais
em cada tratamento.
Se for usado um desenho experimental que satisfaça estas 
condições os cálculos são simples. As fórmulas são apresentadas
nas secções 3.2 e 3.3. É recomendado o uso de programas
informáticos (software) que tenha sido desenvolvido expressa-
mente para este objectivo. Existem vários programas que
podem facilmente ser utilizados para todos os desenhos expe-
rimentais descritos nas monografias. Nem todos os programas 
usam as mesmas fórmulas e algoritmos, mas todos eles devem
chegar aos mesmos resultados.
Desenhos experimentais que não cumpram as restrições
acima mencionadas podem ser realizáveis e correctos, mas as
fórmulas necessárias são demasiado complicadas para serem
descritas neste texto. Uma breve descrição dos métodos de
cálculo é apresentada na secção 7.1. Estes métodos podem
igualmente ser usados em desenhos restringidos, mas nesse
caso eles são equivalentes com as fórmulas simples. As
fórmulas para os desenhos restringidos apresentadas neste
545FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 545
texto podem ser usadas, por exemplo, para criar programas
específicos numa folha de cálculo. Os exemplos na secção 5
podem ser usados para clarificar o especialista e para verificar
se um dado programa fornece os resultados correctos.
3.2. MODELO DE LINHAS PARALELAS
3.2.1. INTRODUÇÃO
O modelo de linhas paralelas é ilustrado na figura 3.2.1.-I. O
logaritmo das doses está representado no eixo horizontal com
a menor concentração à esquerda a com a maior à direita. As
respostas estão indicadas no eixo vertical. As respostas indivi-
duais de cada tratamento estão indicadas com pontos negros.
As 2 linhas representam as relações ln(dose)-resposta do
padrão e da amostra.
FIGURA 3.2.1.-I – Modelo de linhas paralelas para um ensaio 3 + 3.
Nota: o logaritmo natural (ln ou loge) é usado extensivamente
neste texto. O termo «antilogaritmo» é usado para designar
ex. No entanto, é igualmente possível utilizar os logaritmos
decimais ou de Briggs (log ou log10); neste caso, o antiloga-
ritmo correspondente é 10x.
Para a existência de um ensaio satisfatório a actividade
assumida das amostras do teste deve ser próxima da
actividade real. Com base nesta actividade assumida e na
actividade atribuída do padrão, são preparadas diluições
equivalentes (se possível), isto é, doses correspondentes do
padrão e da amostra devem dar a mesma resposta. Se não
existir informação sobre a actividade assumida, devem ser
realizados ensaios preliminares num grande amplitude de
doses para determinar a amplitude onde a curva é linear.
Quanto mais próximo da actividade assumida correcta da
amostra, mais próximas estarão as 2 linhas, uma vez que
devem existir respostas iguais para doses iguais. A distância
horizontal entre as linhas representa a «verdadeira»
actividade da amostra, relativamente à sua actividade
assumida. Quanto maior a distância entre as 2 linhas, pior a
actividade assumida da amostra. Se a linha da amostra está
situada à direita da do padrão, a actividade assumida foi
sobrestimada, e os cálculos indicam uma actividade estimada
menor do que a actividade assumida. Igualmente, se a linha
da amostra está situada à esquerda da do padrão, a actividade
assumida foi subestimada, e os cálculos indicam uma
actividade estimada superiorà actividade assumida.
3.2.2. DESENHO EXPERIMENTAL
As seguintes condições são úteis na optimização da precisão
do desenho experimental:
1) o rácio entre o declive e o erro residual deve ser o maior
possível,
2) a amplitude das doses deve ser a maior possível,
3) as linhas devem estar tão próximas quanto possível, isto é,
a actividade assumida deve ser um bom cálculo da
verdadeira actividade.
A alocação de unidades experimentais (animais, tubos, etc.) a
diferentes tratamentos pode ser feita de várias maneiras.
3.2.2.1. Desenho completamente aleatório
Se a totalidade das unidades experimentais parecer ser razoa-
velmente homogénea sem indicação de que a variabilidade da
resposta é menor dentro de certos subgrupos reconhecidos, a
distribuição das unidades a diferentes tratamentos deve ser
efectuada aleatoriamente.
Se unidades dentro de subgrupos, tais como posições físicas
ou dias de experimentação, tiverem tendências a serem mais
homogéneos do que a totalidade das unidades, a precisão do
ensaio pode ser aumentada através da introdução de uma ou
mais restrições no desenho. Uma escolha cuidadosa do
balanço sobre estas restrições permite a eliminação de fontes
de variação irrelevantes.
3.2.2.2. Desenho de bloco aleatório
Neste desenho é possível segregar uma fonte de variação
identificável, tal como a variação sensível entre ninhadas de
animais de experimentação ou a variação entre caixas de Petri
nos ensaios de difusão microbiológica. O desenho requer que
cada tratamento seja aplicado em igual número de vezes em
cada bloco (ninhada ou caixa de Petri) e só é adequado
quando o bloco for suficientemente grande para acomodar
todos os tratamentos.
Isto está ilustrado na secção 5.1.3. É igualmente possível usar
um desenho aleatório com replicação. Os tratamentos devem
atribuídos aleatoriamente a cada bloco. Na secção 8.5 é
apresentado um algoritmo para obter permutações aleatórias.
3.2.2.3. Desenho do quadrado latino
Este desenho é apropriado quando a resposta pode ser
afectada por duas fontes de variação diferentes, cada uma das
quais assume k diferentes níveis ou posições. Por exemplo,
num ensaio de um antibiótico em placa os tratamentos
podem ser arranjados numa ordenação de k × k numa placa
grande, cada tratamento ocorrendo uma vez em cada linha de
cada coluna. O desenho é apropriado quando o número de
linhas, o número de colunas e o número de tratamentos for
igual. As respostas são registadas num quadrado de formato
conhecido por quadrado latino. As variações devidas às
diferenças nas respostas entre as k linhas e entre as k colunas
podem ser segregadas, deste modo reduzindo o erro. Na
secção 5.1.2 apresenta-se um exemplo de desenho de
quadrado latino, e na secção 8.6 é fornecido um algoritmo
para obter quadrados latinos.
5.3. Análises estatísticas
546 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
Padrão
Amostra
In dose (x)
R
es
po
st
a 
(V
)
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 546
3.2.2.4. Desenho de permutação
Este desenho é útil quando a experiência pode ser subdividida 
em blocos mas é possível aplicar apenas dois tratamentos a
cada bloco, por exemplo um bloco pode ser uma unidade
singular que pode ser testada em duas ocasiões. O desenho
pretende incrementar a precisão eliminando os efeitos das
diferenças entre unidades ao mesmo tempo que balança o
efeito de qualquer diferença entre níveis gerais de resposta
nas duas etapas do teste. Se forem testadas duas doses de um
padrão e de uma amostra é designado como um teste de
permutação duplo.
A experiência é dividida em duas partes separadas por um
intervalo de tempo apropriado. As unidades são divididas em 
quatro grupos e cada grupo recebe um dos quatro tratamentos
na primeira parte do teste. As unidades que receberam uma
preparação na primeira parte do teste recebem a outra pre-
paração na segunda parte, e unidades recebendo pequenas
doses numa parte do teste recebem as grandes doses na
outra. O arranjo das doses é mostrado na tabela 3.2.2.-I. Na
secção 5.1.5 pode ser encontrado um exemplo.
TABELA 3.2.2.-I – Ordenação das doses num ensaio cruzado
Grupo de unidades Tempo I Tempo II
1 S1 T2
2 S2 T1
3 T1 S2
4 T2 S1
3.2.3. ANÁLISE DE VARIÂNCIA
Esta secção fornece as fórmulas requeridas para desenvolver
a análise de variância e será mais facilmente percebida refe-
renciando com os exemplos práticos da secção 5.1. Igual-
mente deve ser consultado o glossário de símbolos (secção 9).
As fórmulas são indicadas para ensaios simétricos onde uma
ou mais amostras (T, U, etc.) são comparadas com o padrão
(P). Deve ser realçado que as fórmulas apenas podem ser usa-
das se as doses forem igualmente espaçadas, se forem aplica-
dos números iguais de tratamentos por amostra e a cada tra-
tamento é aplicado um número igual de vezes. Não se devem
usar estas fórmulas em quaisquer outras circunstâncias.
Para além de alguns ajustamentos ao termo de erro, a análise 
básica dos dados resultantes de um ensaio é a mesma para
os desenhos completamente aleatório, de bloco aleatório e
de quadrado latino. As fórmulas de testes de bloco aleatório
não se adaptam completamente a este esquema, pelo que são
incorporadas no Exemplo 5.5.5.
Tendo considerado os pontos discutidos na secção 3.1. e
transformado as respostas, se necessário, devem ser calcula-
das as médias dos valores em cada tratamento e em cada 
preparação, como mostrado nas tabelas 3.2.3.-I. Os contrastes 
lineares, que relacionam os declives das rectas de ln(dose)-
-resposta, devem igualmente ser formados. Na tabela 
3.2.3.-II são apresentadas 3 fórmulas adicionais, necessárias
para a construção da análise de variância.
A variação total na resposta causada por diferentes 
tratamentos é agora dividida, como mostrado na tabela 
3.2.3.-III., sendo as somas dos quadrados derivadas dos valores 
obtidos nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II. A soma dos quadrados 
devidos à ausência de linearidade apenas pode ser calculada se 
pelo menos 3 doses por preparação forem incluídas no ensaio.
O erro residual do ensaio obtém-se pela subtracção das 
variações permitidas no desenho à variação total da resposta 
(tabela 3.2.3.-IV). Nesta tabela representa a média de todas as 
respostas registadas no ensaio. Deve ter-se em atenção que 
para um quadrado latino, o número de respostas replicadas 
(n) é igual ao número de linhas, colunas ou tratamentos (dh).
A análise de variância é agora completada do seguinte modo.
Cada soma de quadrados é dividida pelo número de graus de
liberdade correspondentes para dar origem às médias
quadráticas. A média quadrática para cada variável em teste
é expressa como o rácio do erro residual (s2) e a
significância destes valores (conhecidos como rácios-F) são
verificadas pelo uso da tabela 8.1 ou uma subrotina
apropriada de um programa informático.
3.2.4. TESTES DE VALIDAÇÃO
Os resultados dos ensaios são considerados «estatisticamente
válidos» se o resultado desses testes for o seguinte.
1) O termo da regressão linear é significativo, isto é, a
probabilidade calculada é inferior a 0,05. Se este critério
547FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 3.2.3.-I – Fórmulas para os ensaios de linhas paralelas com d doses de cada preparação
Padrão (S) 1ª amostra (T) 2ª amostra (U, etc.)
Resposta média à dose mais baixa S1 T1 U1
Resposta média à 2ª dose S2 T2 U2
... ... ... ...
Resposta média à dose mais elevada Sd Td Ud
Total da amostra PS � S1 � S2 �... � Sd PT � T1 � T2 � ... � Td PU � ... etc.
Contraste linear LS � 1S1 � 2S2 � ... LT � 1T1 � 2T2 � ... LU � ... etc.
�dSd �� (d � 1)PS �dTd �� (d � 1)PT
TABELA 3.2.3.-II – Fórmulas complementares para a construção da análise de variância
HP � HL � K �
n(PS � PT � ...)2
��
hd
12n
�
d3 � d
n
�
d
1
�
2
1
�
2
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 547
não for satisfeito, não é possível calcular os limites de
confiança para 95 por cento,
2) o termo de não-paralelismo não é significativo, isto é, a
probabilidade calculada não é inferiora 0,05. Isto indica
que a condição 5A, da secção 3.1 é satisfeita,
3) o termo de não-linearidade não é significativo, isto é, a
probabilidade calculada não é inferior a 0,05. Isto indica
que a condição 4A, da secção 3.1 é satisfeita.
Um desvio significativo ao paralelismo num ensaio múltiplo
pode ser devido à inclusão no ensaio de uma amostra que dá
uma recta ln(dose)-resposta com um declive diferente do das
outras preparações. Em vez de declarar a invalidação do
ensaio, pode ser decidido eliminar todos os dados relaciona-
dos com aquela preparação e recomeçar a análise do princípio.
Quando a validação estatística é estabelecida, podem ser
calculadas as actividades e os limites de confiança pelos
métodos descritos na secção seguinte.
3.2.5. CÁLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE
CONFIANÇA
Sendo I o ln do rácio entre doses adjacentes de uma
preparação, o declive comum (b) de ensaios com d doses de
cada preparação obtém-se a partir de:
b � (3.2.5.-1)
e o logaritmo da relação de actividade de uma amostra, por
exemplo T, é:
HL (LS � LT � ...)
���Inh
M ’T � (3.2.5.-2)
A actividade calculada é uma estimativa da «verdadeira
actividade» de cada desconhecido. Os limites de confiança
podem ser calculados como os antilogaritmos de:
CM ’T � �(C� �� 1�)�(C�M�’2
T� �� 2�V�)�
onde C � e V � (3.2.5.-3)
O valor de t pode ser obtido na tabela 8.2 para p = 0,05 e
com os graus de liberdade iguais ao número de graus de
liberdade do erro residual. A actividade estimada (RT) e os
limites de confiança associados obtêm-se multiplicando os
valores obtidos por AT depois da obtenção dos
antilogaritmos. Se as soluções de armazenamento não são
exactamente equivalentes, com base nas actividades
atribuídas e assumidas, é necessário introduzir um factor de
correcção (ver Exemplos 5.1.2 e 5.1.3).
3.2.6. VALORES EM FALTA
Num ensaio balanceado, um acidente totalmente desligado
dos tratamentos aplicados pode conduzir à perda de uma ou
mais respostas, por exemplo devido à morte de um animal.
Se se considerar que o acidente não está ligado à composi-
ção da preparação administrada, os cálculos exactos podem
ser realizados mas as fórmulas são mais complicadas e
podem apenas ser dadas dentro do contexto dos modelos
SSreg�b2dn
SSreg��SSreg � s2t2
PT � PS�db
5.3. Análises estatísticas
548 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
TABELA 3.2.3.-III – Fórmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade
Origem da variação Graus de liberdade (f) Soma dos quadrados
Amostras h � 1 SSprep � HP (P
2
S�P2
T � ...) � K
Regressão linear 1 SSreg � HL (LS � LT � ...)2
Não paralelismo h � 1 SSpar � HL (L �L � ...) � SSreg
Nãolinearidade (*) h (d � 2) SSlin � SStreat � SSprep � SSreg � SSpar
Tratamentos hd � 1 SStreat � n(S2
1 � ... � S2
d � T 2
1 � ... � T 2
d � ...) � K
(*) Não calculado para as titulações de 2 doses.
TABELA 3.2.3.-IV – Cálculo do erro residual
Origem da variação Graus de liberdade Soma dos quadrados
blocos (linhas) (*) n � 1 SSblock � hd (R2
1 � ... �R2
n ) � K
colunas (**) n � 1 SScol � hd (C2
1 � ... � C2
n ) � K
total aleatório hd (n � 1) SSres � SStot � SStreat
erro residual (***) blocos completos (hd � 1) (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock
quadrado latino (hd � 2) (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock � SScol
total nhd � 1 SStot � � (y � y� )2
(*) (*) Não calculado para os ensaios totalmente aleatórios.
(**) Só calculado para os quadrados latinos.
(***) Depende do tipo de ensaio utilizado.
1
�
h





16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 548
lineares gerais (ver secção 7.1). Contudo, existe um método 
aproximado que mantém a simplicidade do desenho balan-
ceado substituindo a resposta em falta por um valor calculado.
A perda de informação é tomada em consideração diminuindo
os graus de liberdade do total da soma dos quadrados e para o
erro residual pelo número de valores em falta e usando uma
das fórmulas a seguir fornecidas para o valor em falta. Deve
ter-se em atenção que este método é apenas aproximativo, e
que o uso de um método exacto é preferencial.
Se mais do que uma observação estiver em falta pode usar-se
a mesma fórmula. O procedimento consiste em fazer uma
estimativa aproximada de todos os valores em falta, excepto
de um, e usar a fórmula apropriada para esse valor e usar
todos os restantes valores incluindo os estimados por aproxi-
mação. Preencha o valor calculado. Continue de modo
semelhante calculando o valor da primeira estimativa
grosseira. Depois de calcular todos os valores em falta deste
modo, todo o ciclo deve ser repetido desde o princípio, e em
cada cálculo utilize o valor mais recente, calculado ou
estimado, para cada resposta à qual a fórmula tenha sido
aplicada. Este procedimento deve ser repetido até que 2
ciclos consecutivos dêem os mesmos valores; a convergência
é normalmente rápida.
Considerando que o número de valores substituídos é
pequeno relativamente ao número total de observações na
experiência completa (digamos, inferior a 5 por cento), a
aproximação implícita nesta substituição e redução dos
graus de liberdade pelo número de valores em falta substi-
tuídos deste modo é normalmente satisfatória. Contudo, a
análise deve ser interpretada com grande cuidado, especial-
mente se existir uma preponderância de valores em falta
num tratamento ou bloco; se forem encontrados aspectos
invulgares deve consultar-se um especialista. A substituição
de valores em falta num teste sem réplicas é uma operação
particularmente delicada.
Desenho completamente aleatório
Num ensaio completamente aleatório o valor em falta pode
ser substituído pela média aritmética das outras respostas do
mesmo tratamento.
Desenho de bloco aleatório
O valor em falta obtém-se aplicando a equação:
y’ � (3.2.6.-1)
em que B’ é a soma das respostas do bloco contendo o valor
em falta, T’ o total do tratamento correspondente e G’ a
soma de todas as respostas registadas no ensaio.
Desenho do quadrado latino
O valor em falta obtém-se de:
y’ � (3.2.6.-2)
onde B’ e C’ são as somas das respostas na linha e coluna
contendo o valor em falta. Neste caso k = n.
Desenho de permutação
Se ocorrer um acidente conduzindo à perda de valores num
desenho de permutação, deve ser consultado um livro de
estatística (por exemplo, D. J. Finney, ver secção 10), pois a 
aplicação das fórmulas apropriadas depende das combinações
de tratamentos efectuados.
k(B � C’ � T’) � 2G’
���
(k � 1) (k � 2)
nB’ � kT’ � G’
��
(n � 1) (k � 1)
3.3. MODELO DE RELAÇÃO DE DECLIVES
3.3.1. INTRODUÇÃO
Este modelo é adequado, por exemplo, para alguns ensaios
microbiológicos quando a variável independente é a
concentração de um factor de crescimento essencial inferior
à concentração óptima do meio. O modelo de relação de
declives é ilustrado na figura 3.3.1.-I.
FIGURA 3.3.1.-I – Modelo de relação de declives para um ensaio
2 � 3 � 1
As doses estão representadas no eixo horizontal com a con-
centração zero à esquerda e a maior concentração à direita.
As respostas estão indicadas no eixo vertical. As respostas
individuais de cada tratamento estão indicadas com pontos
negros. As 2 linhas são as relações dose-resposta calculadas
para o padrão e para a amostra, na condição que se inter-
ceptam na dose zero. Ao contrário do modelo de linhas para-
lelas, as doses não são transformadas logaritmicamente.
Tal como no caso de um ensaio baseado no modelo de linhas
paralelas, é importante que a actividade assumida esteja
próxima da actividade real, e preparar diluições equivalentes
das amostras e do padrão (se possível). Quanto mais correcta
for a actividade assumida mais juntas estarão as 2 linhas. O
rácio dos declives representa a «verdadeira» actividade da
amostra relativamente à actividade assumida. Se o declive da
amostra for mais íngreme que o do padrão, a actividade foi
subestimada e os cálculos indicam uma actividade estimada
maior que a actividade assumida. De igual modo, se o
declive da amostra for menos íngreme que o do padrão, a
actividade foi sobrestimada eos cálculos indicam uma
actividade estimada inferior à actividade assumida.
Na preparação de uma experiência, todas as respostas devem
ser examinadas quanto ao cumprimento das condições 1, 2 e
3 da secção 3.1. A análise de variância a realizar em ensaios
de rotina é descrita na secção 3.3.3 de modo a que o
cumprimento das condições 4B e 5B da secção 3.1 possa ser
examinado.
3.3.2. DESENHO DO ENSAIO
A utilização da análise estatística apresentada a seguir impõe
as seguintes restrições ao ensaio:
549FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
Padrão
Amostra
R
es
po
st
a 
(V
)
dose (x)
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 549
a) o padrão e as amostras devem ser testadas com o mesmo
número de diluições igualmente espaçadas,
b) um grupo extra de unidades experimentais que não esteja
sujeito ao tratamento deve ser testado (os brancos),
c) deve existir um número igual de unidades experimentais
em cada tratamento.
Tal como já foi referido na secção 3.1.3, os desenhos experi-
mentais que não cumpram estas restrições podem ser possí-
veis e correctos, mas as análises estatísticas simples aqui
apresentadas não são aplicáveis e deve ser obtido aconselha-
mento especializado ou ser utilizada programação apropriada.
O desenho com 2 doses por preparação e 1 branco, o
«desenho (2h+1) com zero comum» é preferível, uma vez
que permite a maior precisão combinada com a possibilidade 
de verificar a validação dentro das restrições atrás mencionadas.
No entanto, nem sempre pode ser assumida como válida
uma relação linear abaixo da dose zero. Com uma ligeira
perda de precisão um desenho sem brancos pode ser usado.
Neste caso, 3 doses por preparação, o «desenho (3h) com 
zero comum», é preferível a 2 doses por preparação. As doses
devem ser como se segue:
1) o padrão é dado numa dose alta, perto mas não
excedendo a mais alta dose com uma resposta média na
parte rectilínea da curva dose-resposta,
2) as outras doses devem estar uniformemente distribuídas
entre a dose mais alta e a dose zero,
3) as amostras devem ser dadas em doses correspondentes
baseadas na actividade assumida do material.
Um desenho completamente aleatório, de blocos aleatórios
ou de quadrado latino pode ser usado, tal como descrito na
secção 3.2.2. O uso de qualquer um dos desenhos necessita
de ajustamentos ao erro da soma dos quadrados tal como
descrito para os ensaios baseados no modelo de linhas
paralelas. A análise de um ensaio de uma ou mais amostras
contra um padrão é descrita a seguir.
3.3.3. ANÁLISE DE VARIÂNCIA
3.3.3.1. O desenho (hd � 1)
As respostas são verificadas tal como descrito na secção 3.1
e, se necessário, transformadas. É então calculada a média
das respostas para cada tratamento e cada preparação como
mostrado na tabela 3.3.3.1.-I. Adicionalmente calcula-se a
resposta média dos brancos (B).
A soma dos quadrados nas análises de variância são
calculadas como se mostra nas tabelas 3.3.3.1.-I até 
3.3.3.1.-III. A soma dos quadrados devidos à não linearidade
pode apenas ser calculada se, pelo menos 3 doses de cada
preparação tiverem sido incluídas no ensaio. O erro residual
é obtido subtraindo as variações permitidas no desenho à
variação total da resposta (tabela 3.3.3.1.-IV).
A análise de variância é completada como se segue. Cada
soma de quadrados é divido pelo correspondente número de
graus de liberdade para obter médias quadráticas. A média
quadrática de cada variável a ser testada é expressa como o
rácio do erro residual (s2) e a significância destes valores
(rácios-F) é avaliada através da tabela 8.1 ou de uma
subrotina adequada de um programa informático.
3.3.3.2. O desenho (hd)
As fórmulas são basicamente as mesmas do desenho (hd + 1),
mas existem algumas pequenas diferenças.
– B é retirado de todas as fórmulas.
– k �
– SSblank é removido da análise de variância.
n(PS � PT � ...)2
��hd
5.3. Análises estatísticas
550 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
TABELA 3.3.3.1.-I – Fórmulas para os ensaios de relação de declive com d doses de cada preparação e 1 branco
Padrão (S) 1ª amostra a analisar (T) 2ª amostra a analisar (U, etc.)
Resposta média à menor dose S1 T1 U1
Resposta média à 2ª dose S2 T2 U2
... ... ... ...
Resposta média à maior dose Sd Td Ud
Total da amostra PS � S1 � S2 � ... � Sd PT � T1 � T2 � ... � Td Pu � ...
Produto linear LS � 1S1 � 2S2 � ... � dSd LT � 1T1 � 2T2 � ... � dTd Lu � ...
Ordenada na origem aS � (4d � 2)PS � 6LS aT � (4d � 2) PT � 6LT au � ...
Declive bS � 2LS � (d � 1)PS bT � 2LT � (d � 1) PT bu � ...
Tratamentos GS � S2
1 � ... � S2
d GT � T 2
1 � ... � T 2
d Gu � ...
Não linearidade (*) JS � GS� � JR � GT� � Ju � ...
(*) Não calculado para as titulações de 2 doses.
3d3
T�
d3 � d
P2
T�d
3b2
S�
d3
S � d
P2
S�d
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 550
– O número de graus de liberdade para os tratamentos
torna-se hd � 1.
– O número de graus de liberdade do erro residual e da
variância total é calculado como descrito para o modelo
de linhas paralelas (ver tabela 3.2.3.-IV).
As validações do ensaio, da actividade e dos intervalos de
confiança são descritas nas secções 3.3.4. e 3.3.5.
3.3.4. TESTES DE VALIDAÇÃO
Os resultados dos ensaios são considerados «estatisticamente
válidos» se o resultado das análises de variância forem os
seguintes:
1) a variação devida aos brancos nos desenhos (hd+1) não é
significativa, isto é, a probabilidade calculada não é
menor que 0,05. Isto indica que as respostas dos brancos
não diferem significativamente da intercepção comum e
a relação linear é válida abaixo da dose zero,
2) a variação devida à intercepção não é significativa, isto é,
a probabilidade calculada não é menor que 0,05. Isto
indica que a condição 5B, secção 3.1 é satisfeita,
3) em ensaios incluindo pelo menos 3 doses por preparação,
a variação devida à não-linearidade não é significativa,
isto é, a probabilidade calculada não é menor que 0,05.
Isto indica que a condição 4B, secção 3.1 é satisfeita.
A variação significativa devida aos brancos indica que a
hipótese da linearidade não é válida perto da dose zero. Se
isto for sistemático e não acidental para o tipo de ensaio, o
desenho hd é mais apropriado. Qualquer resposta dos
brancos deve ser rejeitada.
Quando estes testes indicam que o ensaio é válido, a
actividade é calculada com os seus limites de confiança tal
como descrito na secção 3.3.5.
3.3.5. CÁLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE CONFIANÇA
3.3.5.1. O desenho (hd+1)
A intercepção comum a’ das preparações pode ser calculada
a partir de:
a’ � (3.3.5.1.-1)(2d � 1) B � (2d � 3)ha
���
h(2d � 3) � 2d � 1
551FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 3.3.3.1.-II – Fórmulas complementares para a construção da análise de variância
HB � HI � K �
n(B � PS � PT � ...)2
��hd � 1
a � aS � aT � ...
��
h(d2 � d)
n
��
4d3 � 2d2 � 2d
nhd2 � nhd
��
hd2 � hd � 4d � 2
TABELA 3.3.3.1-III – Fórmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade
Origem da variação Graus de liberdade (f) Soma dos quadrados
Regressão n � 1 SSreg � SStreat � SSblanck � SSint � SSlin
Brancos n � 1 SSblanck � HB (B � a)2
intersecção h � 1 SSint � HI ((a
2
S � a2
T � ...) � h (d2 � d)2 a2
ausência de linearidade (*) h (d � 2) SSlin � (JS � JT � ...)
Tratamentos hd SStreat � n(B2 � GS � GT ...) � K
(*) Não calculado para as titulações de 2 doses.
TABELA 3.3.3.1.-IV – Cálculo do erro residual
Origem da variação Graus de liberdade Soma dos quadrados
blocos (linhas) (*) n � 1 SSblock � hd (R2
1 � ... �R2
n ) � K
colunas (**) n � 1 SScol � hd (C2
1 � ... � C2
n ) � K
total aleatório (hd � 1) (n � 1) SSres � SStot � SStreat
erro residual (***) blocos completos hd (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock
quadrado latino (hd � 1) (n � 1) SSres � SStot � SStreat � SSblock � SScol
total nhd � n � 1 SStot � � (y � y� )2
(*) (*) Não calculado para os ensaios totalmente aleatórios.
(**) Só calculadopara os quadrados latinos.
(***) Depende do tipo de ensaio utilizado.





16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 551
O declive do padrão, e de modo idêntico para cada uma das
preparações, é calculado a partir de:
b’S � (3.3.5.1.-2)
A relação de actividade de cada amostra pode agora ser
calculada a partir de:
R ’T � (3.3.5.1.-3)
que deve multiplicado por AT, a actividade assumida da
amostra, de modo a determinar a actividade estimada RT. Se
o intervalo entre doses adjacentes não for idêntico para o
padrão e amostra, a actividade deve ser multiplicada por
IS /IT. Note que, ao contrário da análise de linhas paralelas,
não são calculados os antilogaritmos.
O intervalo de confiança para R’T é calculado a partir de:
CR ’T � K’ ± �(C� �� 1�)�(C�R�’2T� �� 1�)��� K�’�(K�’ �� 2�C�R�’T)� (3.3.5.1.-4)
onde C = e K’ � (C � 1)V2
V1 e V2 estão relacionados com a variância e covariância do
numerador e denominador de RT . Eles podem ser calculados
a partir de:
V1 � � � � (3.3.5.1.-5)
V2 � (3.3.5.1.-6)
Os limites de confiança são multiplicados por AT, e se
necessário por IS/IT.
3.3.5.2. O desenho (hd)
As formulas são as mesmas do que no desenho (hd+1), com
as seguintes modificações:
a’ � a (3.3.5.2.-1)
V1 � � � � (3.3.5.2.-2)
V2 � (3.3.5.2.-3)
3.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS
Este modelo é aconselhado, por exemplo, para alguns
imunoensaios quando a análise é requerida para curvas
dose-resposta sigmoides prolongadas. Este modelo é
ilustrado na figura 3.4.-I.
Os logaritmos das doses estão representados no eixo horizon-
tal com a menor concentração à esquerda e a maior à direita. 
As respostas estão indicadas no eixo vertical. As respostas
individuais de cada tratamento estão indicadas com pontos
negros. As 2 curvas são as relações ln(dose)-resposta calcula-
das para o padrão e amostras.
3(d � 1)
��
3(d � 1) � h(d � 1)
3
�
h(d � 1)
1
��
d � 1
6
��
nd(2d � 1)
3d(d � 1)
����
(3d � 1) (d � 2) � hd(d � 1)
3
���
2(2d � 1) � hd (d � 1)
1
��
d(d � 1)
6
�
n(2d � 1)
b’2S��b’2S � s2t2V1
b ’T�b ’S
6LS � 3d(d � 1)a’
���
2d3 � 3d2 � d
A forma geral das curvas pode usualmente ser descrita pela 
função logística, mas outras formas são igualmente possíveis. 
Cada curva pode ser caracterizada por 4 parâmetros: a
assímptota superior (α), a assímptota inferior (δ), o factor de
declive (β) e a locação horizontal (γ). Este modelo é assim
habitualmente referido como o modelo dos 4 parâmetros. A
representação matemática da curva ln(dose)-resposta é:
u � � �
Para um ensaio válido é necessário que as curvas do padrão
e das amostras tenham o mesmo factor de declive, e o
mesmo nível de respostas máximas e mínimas nos extremos. 
Apenas a locação horizontal (γ) das curvas pode ser diferente. 
A distância horizontal entre as curvas está relacionada com a
actividade «verdadeira» da amostra. Se o ensaio é usado em
rotina, pode ser suficiente testar as condições de igualdade
de resposta dos níveis superior e inferior quando o ensaio é
desenvolvido e então voltar a testar esta condição directa-
mente apenas em intervalos apropriados ou quando existirem
alterações dos materiais ou das condições de ensaio.
Os cálculos de semelhanças máximas dos parâmetros e dos
seus intervalos de confiança podem ser obtidos através de
programas informáticos apropriados. Estes programas
informáticos podem incluir alguns testes de validação. Por
exemplo, se os cálculos de semelhanças máximas mostrarem
desvios significativos aos modelos ajustados nas condições
assumidas de igualdade superior e inferir das assímptotas e
declives, então uma ou todas as condições podem não estar
satisfeitas.
O modelo logístico levanta um número de problemas
estatísticos que podem requerer soluções diferentes para
diferentes tipos de ensaios, e não é possível fazer um resumo
simples. Uma grande variedade de aproximações é descrita
na literatura relevante. Para este tipo de análises é
recomendado aconselhamento profissional. De qualquer
maneira, é incluído um exemplo simples na secção 5.4 de
modo a ilustrar uma via «possível» para analisar os dados
apresentados. Na secção 7.5 é apresentada uma pequena
� � �
��
1 � e�	 (x � 
)
5.3. Análises estatísticas
552 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
FIGURA 3.4.-I – Modelo de curva logística de 4 parâmetros
Padrão
Amostra
In dose (x)
R
es
po
st
a 
(V
)
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 552
discussão de métodos alternativos juntamente com outras
considerações estatísticas.
Se não for possível nem o aconselhamento profissional nem
o recurso a programas apropriados, é possível o uso de
métodos alternativos: 1) se existirem estimativas «razoáveis»
dos limites superior (α) e inferior (δ), seleccionar para todas
as amostras as doses com médias de respostas (u) compreen-
didas entre 20 por cento e 80 por cento dos limites, trans-
forme as respostas das doses seleccionadas para e use o
modelo de linhas paralelas (secção 3.2) para a análise; 2)
seleccione a amplitude de doses para as quais as respostas
(u) ou as respostas apropriadamente transformadas, por
exemplo ln(u), sejam aproximadamente lineares quando
graficadas contra o ln(dose); o modelo de linhas paralelas
(secção 3.2) podem então ser usado para a análise.
4. ENSAIOS DEPENDENTES DE
RESPOSTAS QUALITATIVAS
4.1. INTRODUÇÃO
Em certos ensaios é impossível, ou excessivamente traba-
lhoso, medir o efeito de cada unidade experimental numa
escala quantitativa. Em alternativa, um efeito tal como a
morte ou sintomas de hipoglicémia podem ser observados
quer ocorrendo ou não em cada unidade, e o resultado
depende do número de unidades em que ocorreu. Tais
ensaios são designados qualitativos ou tudo-ou-nada.
A situação é muito semelhante à descrita para os ensaios
quantitativos na secção 3.1, mas em vez de n repostas
separadas para cada tratamento um único valor é registado, 
isto é, a percentagem de unidades em cada grupo de trata-
mento mostrando um efeito positivo. Quando estas percen-
tagens são graficadas em função do logaritmo das doses a
curva resultante tende a ser sigmoide (forma de S) em vez
de ser linear.
O cálculo da curva dose-resposta é feito através de uma
função matemática que representa esta curvatura sigmoide.
A função mais utilizada é a função da distribuição normal
cumulativa. Esta função tem algum mérito teórico, e é
talvez a melhor escolha quando a resposta é um reflexo da
tolerância das unidades. Se a resposta mais provavelmente
depende de um processo de crescimento, o modelo de
distribuição logística é preferível, embora o resultado da
diferença entre os 2 modelos seja muito pequeno.
As estimativas das semelhanças máximas do declive e locali-
zação das curvas apenas podem ser encontradas aplicando
um procedimento iterativo. Há muitos procedimentos que
conduzem aos mesmos resultados, mas eles diferem em
eficácia devido à velocidade de convergência. Um dos
métodos mais rápidos consiste na optimização directa da
função das semelhanças máximas (ver secção 7.1), que pode
ser facilmente realizado com programas informáticos que
tenham uma subrotina interna para este objectivo.
Infelizmente, a maior parte destes procedimentos não fazem
a estimativa dos limites de confiança, e a técnica para os
obter é demasiado complica para ser aqui descrita. A técnica
a seguir descrita não é a mais rápida, mas foi escolhida
devido à sua simplicidade comparativamente com outras
técnicas alternativas. Pode ser usada para ensaios em que
uma ou mais amostras são comparadas com um padrão.
Para além disso, devem estar preenchidas as seguintes
condições:
1) a relação entre o logaritmo da dose e a resposta pode ser
representada pela curva da distribuição normal
cumulativa,
2) as curvas do padrão e da amostra são paralelas, isto é,
têm forma idêntica e apenas podem diferir pela sua
localização horizontal,
3) em teoria, não existe uma resposta natural a doses
extremamente baixas nem uma ausência de resposta a
doses extremamente altas.
4.2. MÉTODO DA PROBABILIDADE ITERATIVA (4)
A curva sigmoidepode ser linearizada substituindo cada
resposta, isto é, a fracção de resposta positiva do grupo, pelo
valor correspondente da distribuição normal padronizada
cumulativa. Este valor, muitas vezes referido como
«normit», distribui-se teoricamente entre � ∞ e � ∞. No
passado, foi proposto acrescentar 5 a cada «normit» para
obter o «probit». Este facto facilita os cálculos manuais
porque os valores negativos são evitados. Com a chegada dos
computadores, a necessidade de adicionar 5 aos «normits»
desapareceu. O termo «método normit» é mais adequado
para o método descrito a seguir. No entanto, e uma vez que
a designação «análise probit» está tão divulgada, neste texto
ir-se-á manter aquela designação.
Uma vez linearizadas as respostas é possível aplicar a análise 
de linhas paralelas, como descrito na secção 3.2. Infelizmente, 
a condição de validação da homogeneidade da variância para
cada dose não é cumprida. A variância é mínima para o
normit = 0 e aumenta para valores positivos e negativos do
normit. É, por isso, necessário dar maior peso à resposta na
parte média da curva, e menor peso nas zonas extremas da
curva. Este método, a análise de variância, e a estimativa da
actividade e dos intervalos de confiança é descrito a seguir.
4.2.1. TABULAÇÃO DE RESULTADOS
A tabela 4.2.1.-I é utilizada para introduzir os dados nas
colunas indicadas por números:
(1) a dose do padrão ou da amostra,
(2) o número de n unidades submetidas a tratamento,
(3) o número de unidades r com resposta positiva ao
tratamento,
(4) o logaritmo x da dose,
(5) a fracção p = r/n das respostas positivas do grupo.
O primeiro ciclo começa aqui.
(6) a coluna Y é preenchida com zeros na primeira iteracção,
(7) o valor Φ = Φ (Y) da função da distribuição normal
padronizada cumulativa (ver igualmente a tabela 8.4). As
colunas (8) a (10) são calculadas usando as seguintes
equações:
(8) Z � (4.2.1.-1)
(9) y � Y � (4.2.1.-2)P � Φ
�
Z
e�y2/2
��2���
553FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
(4) Embora na maioria dos textos de estatística publicados em
português se mantenha o termo probit, entendeu-se traduzir pelo
seu real significado – probabilidade iterativa.
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 553
(10) w � (4.2.1.-3)
As colunas (11) a (15) podem ser facilmente calculadas a
partir das colunas (9) e (10) como wx, wx2 e wxy, respectiva-
mente, e o somatório (Σ) de cada uma das colunas (10) a (15)
é calculada separadamente para cada uma das preparações.
Os somatórios calculados na tabela 4.2.1.-I são transferidos
para as colunas (1) a (6) da tabela 4.2.1.-II e as 6 colunas
adicionais (7) a (12) são calculadas como se segue:
(7) Sxx � � wy2 � (4.2.1.-4)
(8) Sxy � � wxy � (4.2.1.-5)
(9) Syy � � wy2 � (4.2.1.-6)
(10) x� � (4.2.1.-7)
(11) y� � (4.2.1.-8)
O declive comum b pode agora ser obtido
b � (4.2.1.-9)
e a intercepção a do padrão, e igualmente para as amostras,
obtém-se
(12) a � y� � bx� (4.2.1.-10)
� Sxy
��Sxx
� wy
��w
� wx
� �w
��wy�
2
��w
��wx� ��wy�
�� �w
��wx�2
��w
nZ2
�Φ � Φ2
A coluna (6) da primeira tabela de trabalho pode agora ser 
substituída por Y = a + bx e o ciclo repete-se até que a 
diferença entre 2 ciclos seja pequena (por exemplo, a máxima 
diferença de Y entre dois ciclos consecutivos é menor que 10-8).
4.2.2. TESTES DE VALIDAÇÃO
A validade dos ensaios deve ser avaliada antes de calcular a
actividade e os intervalos de confiança. Os desvios à lineari-
dade podem ser medidos como se segue, se pelos menos 3
doses de cada preparação forem incluídas: adicione uma 13ª
coluna à tabela 4.2.1.-II e preencha-a com:
Syy � (4.2.2.-1)
O somatório da coluna é a medida dos desvios à linearidade
e segue aproximadamente uma distribuição χ2 com N-2h
graus de liberdade. A significância deste valor pode ser
avaliada com a ajuda da tabela 8.3 ou com uma subrotina
apropriada de um programa informático. Se o valor for
significativo para o nível de probabilidade 0,05, o ensaio deve
provavelmente ser rejeitado (ver secção 4.2.4). Quando o
teste acima não der uma indicação de desvios significativos à
regressão linear, os desvios ao paralelismo são testados para
o nível de significância 0,05 com:
�2 � � � (4.2.2.-2)
com h-1 graus de liberdade.
4.2.3. CÁLCULO DA ACTIVIDADE E SEUS LIMITES DE
CONFIANÇA
Quando não existirem indicações de um desvio significativo
do paralelismo e linearidade o ln(relação de actividade) M’T é
calculado com:
M ’T � (4.2.3.-1)
aT � as�b
�� Sxy�2
��
� Sxx
S2
xy�Sxx
S2
xy�Sxx
5.3. Análises estatísticas
554 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)
dose n r x p Y ΦΦ Z y w wx wy wx2 wy2 wxy
S . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
� � � � � � � � � � � �
T . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
� � � � � � � � � � � �
etc.
TABELA 4.2.1.-I. – Primeira tabela de trabalho
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)
� w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy Sxx Sxy Syy x� y� a
S . . . . . . . . . . . .
T . . . . . . . . . . . .
etc. . . . . . . � � � �
TABELA 4.2.1.-II. – Segunda tabela de trabalho
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 554
e o antilogaritmo retido. Faça t = 1,96 e s = 1. Os limites de
confiança são calculados como os antilogaritmos de:
CM ’T �(C � 1) (x�S � x�T) � �(C� �� 1�)��V� �� S�xx� �� C�(M�’T��� x�S�� x�T)�2��
(4.2.3.-2)
onde C � e V � �
4.2.4. RESULTADOS INVÁLIDOS
Se o teste de desvio à linearidade descrito na secção 4.2.2 for
significativo, o ensaio deve normalmente ser rejeitado. Se
existirem razões para conservar o ensaio, as fórmulas são
ligeiramente modificadas. t transforma-se no valor-t
(p = 0,05) com o mesmo número de graus de liberdade
usado para verificar a linearidade e s2 transforma-se no valor
de χ2 dividido pelo mesmo número de graus de liberdade (e
assim tipicamente é maior que 1).
O teste para paralelismo é também ligeiramente modificado.
O valor de χ2 para não-paralelismo é dividido pelo seu
número de graus de liberdade. O valor obtido é dividido pelo
valor de s2 anteriormente calculado de modo a obter o rácio-
-F com h-1 e N-2h graus de liberdade, que é avaliado do
modo habitual para o nível de significância 0,05.
4.3. O MÉTODO LOGIT
Tal como indicado na secção 4.1 o método logit pode, por
vezes, ser o mais apropriado. O nome do método é derivado
da função logit que é o inverso da distribuição logística. O
procedimento é idêntico ao descrito para o método probit
com as seguintes modificações nas fórmulas Φ e Z.
Φ � (4.3.-1)
Z � (4.3.-2)
4.4. OUTRAS FORMAS DA CURVA
Os métodos probit e logit são quase sempre adequados para 
as análises de respostas qualitativas exigidas na Farmacopeia. 
No entanto, deve ser referido que a curva ln(dose)-resposta
tem outras formas para além das 2 curvas descritas, podendo
ser adoptada uma outra curva Φ.
Por exemplo, se for demonstrado que a curva não é simétrica, 
pode ser apropriado aplicar a distribuição de Gompertz (mé-
todo gompit) sendo nesse caso e Φ � 1 � e –e Y e Z � eY – eY.
4.5. A DOSE EFECTIVA MEDIANA
Em alguns tipos de ensaios é desejável determinar a dose
efectiva mediana que é a dose que produz uma resposta em
50 por cento das unidades. O método probit pode ser usado
para determinar a dose efectiva mediana (ED50), mas uma
vez que não há necessidade de exprimir esta dose relativa-
mente a um padrão, as fórmulas são ligeiramente diferentes.
Nota: pode opcionalmente ser incluído um padrão de modo
a validar um ensaio. Habitualmente o ensaio é considerado
válido se o valor calculado de ED50 para o padrão for
suficientemente próximo da ED50 assumida. O significado de
«suficientemente próximo» neste contexto depende dos
requisitos especificados na monografia.
e�Y
�
(1 � e�Y)
1
�
1 � e�Y
1
��
T
w
1
��
S
w
b2 � Sxx
��
b2 � Sxx � s2t2
A tabulação das respostas das amostras, e opcionalmente do
padrão, é realizada deacordo com o descrito na secção 4.2.1.
O teste para a linearidade é realizado tal como descrito na
secção 4.2.2. Para este tipo de ensaio não há necessidade de
fazer o teste de paralelismo. A ED50 da amostra T, e de igual
modo para as outras amostras, é obtido tal como descrito na
secção 4.2.3, com as seguintes modificações nas fórmulas
4.2.3.-1 e 4.2.3.-2).
M ’T � (5.5.-1)
e
CM ’T �(C � 1) x�T � �(C� �� 1�)��V� �� S�xx� �� C� (�M�’T �� x��T)�2�
Onde V � e C não muda (4.5.-2)
5. EXEMPLOS
Esta secção é composta por exemplos trabalhados para ilustrar 
a aplicação das fórmulas. Os exemplos foram seleccionados 
com o objectivo principal de ilustrar os métodos estatísticos de 
cálculo. Não têm por objectivo reflectir o método mais 
adequado para o ensaio, caso as monografias individuais 
permitam a possibilidade de usar alternativas. Para aumentar 
o seu valor para a validação de programas, são apresentados 
mais números decimais do que o necessário. Deve igualmente 
ser notado que existem outros métodos de cálculo equiva-
lentes. Esses métodos devem conduzir exactamente aos 
mesmos resultados do que os apresentados nos exemplos.
5.1. MODELO DE LINHAS PARALELAS
5.1.1. ENSAIO MÚLTIPLO DE DUAS DOSES COM DESENHO
COMPLETAMENTE ALEATÓRIO
Ensaio de corticotrofina por injecção subcutânea em rato
O padrão é administrado nas doses de 0,25 e 1,0 unidade por
100 g de peso corporal. Assumiu-se que as 2 amostras têm
uma actividade de 1 unidade por miligrama e são adminis-
tradas nas mesmas quantidades que o padrão. As respostas
individuais e as médias de cada grupo tratado são apresenta-
das na tabela 5.1.1.-I. A representação gráfica não sugere
qualquer dúvida quanto à homogeneidade da variância e à
normalidade dos dados, mas sugere problemas quanto ao
paralelismo da preparação U.
1
�
�
T
w
�aT�b
555FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 5.1.1.-I – Resposta instrumental y – massa de ácido
ascórbico (mg) por 100 g de glândula supra-renal
Padrão S Amostra T Amostra U
S1 S2 T1 T2 U1 U2
300 289 310 230 250 236
310 221 290 210 268 213
330 267 360 280 273 283
290 236 341 261 240 269
364 250 321 241 307 251
328 231 370 290 270 294
390 229 303 223 317 223
360 269 334 254 312 250
342 233 295 216 320 216
306 259 315 235 265 265
média 332,0 248,4 323,9 244,0 282,2 250,0
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 555
As fórmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos
resultados:
PS � 580,4 LS � 41,8
PT � 567,9 LT � �39,95
PU � 532,2 LU � �16,1
HP � 10/2 � 5 HL � � 20 
A análise de variância pode agora ser completada com as
fórmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.1.-II
apresenta os resultados.
120
�
6
A análise sem a amostra U conclui que os resultados estão de 
acordo com os requisitos quanto à regressão e ao paralelismo, 
e em consequência a actividade pode ser calculada. As
fórmulas na secção 3.2.5 dão:
– para o declive comum:
b � � �58,970
– o ln(actividade) é:
M’T � � �0,1060
C � � 1,0476
V � � �0,9609
– e ln(limites de confiança) são:
1,0476 � 0,1060 � �0�,0�4�7�6� �� (�1�,0�4�7�6� �� 0�,1�0�6�0�2��� 2� �� 0�,9�6�0�9�)�
� 0,1110 � 0,3034
Tomando os antilogaritmos encontramos a relação de
actividade de 1,11 com os limites de confiança para 95 por
cento entre 0,82 e 1,51.
Multiplicando pela actividade assumida da amostra T conduz
a uma actividade de 1,11 unidades/mg com os limites de
confiança para 95 por cento entre 0,82 e ,.51 unidades/mg.
5.1.2. DESENHO DE QUADRADO LATINO COM 3 DOSES
Ensaio de difusão de um antibiótico usando um tabuleiro
rectangular
O padrão tem uma actividade atribuída de 4855 UI/mg. A
amostra tem uma actividade assumida de 5600 UI/mg. Para
as soluções de armazenamento dissolva 25,2 mg de padrão
em 24,5 ml de solvente, e 21,4 mg de amostra em 23,95 ml
de solvente. As soluções finais são preparadas diluindo
inicialmente as soluções de armazenamento a 1/20 e de
seguida usando uma razão de diluição de 1,5.
O quadrado latino é gerado com o método descrito na secção
8.6 (ver tabela 5.1.2.-I). As respostas deste ensaio de rotina são
mostradas na tabela 5.1.2.-II (halos de inibição em 
mm � 10). Os valores médios dos tratamentos são mostrados 
na tabela 5.1.2.-III. A representação gráfica dos dados (ver
figura 5.1.2.-I) não coloca dúvidas quanto à normalidade e
homogeneidade da variância dos dados.
66830,6
���
(�58,970)2 � 2 � 10
66830,6
����
66830,6 � 738,64 � 2,0282
567,9�580,4
���
2 � (�58,970)
20(�41,8 � 39,95)
���
ln 4 � 10 � 2
5.3. Análises estatísticas
556 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
FIGURA 5.1.1.-I. 
TABELA 5.1.1.-II – Análise de variância
Amostas 2 6256,6 3128,3
Regressão 1 63830,8 63830,8 83,38 0,000
Não paralelismo 2 8218,2 4109,1 5,37 0,007
Tratamentos 5 78305,7
Erro residual 54 41340,9 765,57
Total 59 119646,6
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
A análise confirma a existência de uma regressão linear
altamente significativa. O desvio ao paralelismo, no entanto,
é também significativo (p = 0,0075) o que era esperado da
observação do gráfico onde a amostra U não é paralela ao
padrão. Esta amostra é por isso rejeitada e a análise repetida
usando apenas a amostra T e o padrão.
TABELA 5.1.1.-III – Análise de variância sem a amostra U
Amostras 1 390,6 390,6
Regressão 1 66830,6 66830,6 90,5 0,000
Não lineariadade 1 34,2 34,2 0,05 0,831
Tratamentos 3 67255,5
Erro residual 36 26587,3 738,54
Total 39 93842,8
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
R
es
po
st
a 
in
st
ru
m
en
ta
l y
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:35 PM Page 556
As fórmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos
resultados:
PS � 529,667 LS � 35,833
PT � 526,333 LT � 39,333 
HP � 6/3 � 2 HL � � 3 
A análise de variância pode agora ser completada com as
fórmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.2.-IV
apresenta os resultados
72
�
24
557FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 5.1.2.-I – Distribuição dos tratamentos na placa
1 2 3 4 5 6
1 S1 T1 T2 S3 S2 T3
2 T1 T3 S1 S2 T2 S3
3 T2 S3 S2 S1 T3 T1
4 S3 S2 T3 T1 S1 T2
5 S2 T2 S3 T3 T1 S1
6 T3 S1 T1 T2 S3 S2
FIGURA 5.1.2.-I. 
TABELA 5.1.2.-II – Medidas das zonas de inibição (mm � 10)
1 2 3 4 5 6 média de linha
1 161 160 178 187 171 194 175,2 � R1
2 151 192 150 172 170 192 171,2 � R2
3 162 195 174 161 193 151 172,7 � R3
4 194 184 199 160 163 171 178,5 � R4
5 176 181 201 202 154 151 177,5 � R5
6 193 166 161 186 198 182 181,0 � R6
média 
de 172,8 179,7 177,2 178,0 174,8 173,5
coluna � C1 � C2 � C3 � C4 � C5 � C6
TABELA 5.1.2.-III – Média dos tratamentos
Padrão S Amostra T
S1 S2 S3 T1 T2 T3
média 158,67 176,50 194,50 156,17 174,67 195,50
TABELA 5.1.2.-IV – Análise de variância
Amostas 1 11,1111 11,1111
Regressão 1 8475,0417 8475,0417 408,1 0,000
Não paralelismo 1 18,3750 18,3750 0,885 0,358
Não lineariadade 2 5,4722 2,7361 0,132 0,877
Tratamentos 5 8510
Blocos 5 412 82,40 3,968 0,012
Colunas 5 218,6667 43,73 2,106 0,107
Erro residual 20 415,3333 20,7667
Total 35 9556
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
A análise mostra diferenças significativas entre as linhas.
Isto indica o aumento de precisão adquirido pela utilização
desenho do quadrado latino em vez de um desenho comple-
tamente aleatório. Uma regressão altamente significativa e
uma origem sem significância das linhas individuais da
regressão para o paralelismo e linearidade confirmam que o
ensaio satisfaz as actividades calculadas.
As fórmulas na secção 3.2.5 dão:
– para o declive comum:
b � � 46,346
– o ln(actividade) é:
M’T � � �0,02397
C � � 1,0108
V � � 0,2192
– e ln(limites de confiança) são:
1,0108 � (�0,0240) �
�0�,0�1�0�8� �� (�1�,0�1�0�8� �� (���0�,0�2�4�0�)2� �� 2� �� 0�,2�1�9�2�)�
� �0,02423 � 0,06878
Arelação de actividade é encontrada tomando os antiloga-
ritmos, resultando em 0,9763 com os limites de confiança
para 95 por cento de 0,9112 a 1,0456.
8475,0417
���
46,3462 � 3 � 6
8475,0417
����
8475,0417 � 20,7667 � 2,0862
526,333�529,667
����
3 � (46,346)
3 (35,833 � 39,333
����
ln 1,5 � 6 � 2
Z
on
a 
de
 in
ib
iç
ão
 (
nm
 x
 1
0)
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 557
É necessário aplicar o factor de correcção de 
� 0,00700 porque as soluções não 
exactamente equivalentes com base na sua actividade 
assumida. Multiplicando por este factor a potência assumida
de 5 600 UI/mg obtém-se a potência de 5 456 UI/mg com
limites de confiança para 95 por cento entre 5 092 e 
5 843 UI/mg.
5.1.3. DESENHO DE UM BLOCO ALEATÓRIO DE 4 DOSES
Titulação de um antibiótico por turbidimetria
O objectivo desta titulação é a atribuição de uma actividade
em unidades internacionais por ampola. A actividade
atribuída do padrão é de 670 UI/ml, a actividade assumida da
amostra é de 20 000 UI/ampola. Com base nestes dados, são
preparadas as soluções-mãe como se segue: dissolver 16,7
mg do padrão em 25 ml de solvente, e o conteúdo de uma
ampola da amostra em 40 ml de solvente. As soluções finais
são obtidas através de uma primeira diluição a 1/40 das 2
soluções-mãe, seguidas de uma série de diluições na razão
de 1,5. Os tubos são colocados em banho de água segundo
uma repartição em blocos completos (ver secção 8.5). As
respostas obtidas são registadas na tabela 5.1.3.-I.
A análise da figura 5.1.3.-I não põe em dúvida a validação das
hipóteses da normalidade dos dados e da homogeneidade da
variância. O desvio padrão de S3 é um pouco elevado mas
sem apresente razões para preocupação. A aplicação das
fórmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduz aos seguintes
resultados:
PS � 719,4 LS � �229,1
PT � 687,6 LT � �222 
HP � 5/4 � 1,25 HL � � 1 
A análise de variância é efectuada com a ajuda das fórmulas
apresentadas nas tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados
obtidos são apresentados na tabela 5.1.3.-II.
60
�
60
4855 � 25,2/24,5 
����
5600 � 21,4 / 23,93
Existe uma diferença significativa entre os blocos, o que 
demonstra que um ensaio de blocos completos permite obter 
uma fidelidade superior. O carácter altamente significativo
da regressão e a ausência de desvios de paralelismo e de
linearidade significativos confirmam que a titulação permite
calcular as actividades. As fórmulas da secção 3.2.5 dão:
– para o declive comum
b � � �111,255
– para ln(relação de actividade):
M’T � � 0,071457
C � � 1,00223
V � � 0,4110
– e para o ln(limites de confiança):
1,00223 � 0,0715 �
�0�,0�0�2�2�3� �� 1�,0�0�2�2�3� �� 0�,0�7�1�5�2��� 2� �� 0�,4�1�1�0�)�
� 0,07162 � 0,04293
101745,6
���
(�111,255)2 � 4 � 5
101745,6
����
101745,6 � 53,916 � 2,0482
687,6 � 719,4
����
4 � (�111,255)
1 � (�229,1 � 222)
���
ln (1,5) � 5 � 2
5.3. Análises estatísticas
558 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
TABELA 5.1.3.-I – Absorvência das suspensões ( � 1000)
Padrão S Amostra T
Bloco S1 S2 S3 S4 T1 T2 T3 T4 Média
1 252 207 168 113 242 206 146 115 181,1
2 249 201 187 107 236 197 153 102 179,0
3 247 193 162 111 246 197 148 104 176,0
4 250 207 155 108 231 191 159 106 175,9
5 235 207 140 98 232 186 146 95 167,4
média 246,6 203,0 162,4 107,4 237,4 195,4 150,4 104,4
FIGURA 5.1.3.-I. 
TABELA 5.1.3.-II – Análise de variância
Amostas 1 632,025 632,025
Regressão 1 101745,6 101745,6 1887,1 0,000
Não paralelismo 1 25,205 25,205 0,467 0,500
Não lineariadade 4 259,14 64,785 1,202 0,332
Tratamentos 7 102662
Linhas 4 876,75 219,188 4,065 0,010
Erro residual 28 1509,65 53,916
Total 39 105048,4
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
A
bs
or
vê
nc
ia
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 558
Tomando o antilogaritmo destes últimos valores, obtemos
uma relação de actividade de 1,0741 com um intervalo de
confiança para 95 por cento de 1,0291 a 1,1214. A aplicação 
de um factor de correcção de � 0,89512
é necessária porque, tendo em conta a actividade prevista da 
amostra, as doses utilizadas não são exactamente equiva-
lentes. Multiplicando a relação de actividade por este factor 
de correcção e pela actividade assumida de 20 000 UI/ampola, 
obtemos uma actividade estimada de 19 228 UI/ampola, com
um intervalo de confiança para 95 por cento de 18 423 a 
20 075 UI/ampola.
5.1.4. ENSAIO MÚLTIPLO DE 5 DOSES COMPLETAMENTE
ALEATÓRIAS
Titulação in vitro de 3 vacinas da hepatite B por
comparação com um padrão
Três séries independentes de 5 diluições a 0,5 são preparadas
a partir de cada vacina. Após alguns passos adicionais
inerentes ao ensaio, a absorvência foi medida. Os resultados
obtidos são apresentados na tabela 5.1.4.-I.
670 � 6,7 / 25
���
20000 � 1 / 40
A aplicação das fórmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II
conduz aos seguintes resultados:
PS � 9,108 LS � 6,109 
PT � �5,586 LT � 6,264 
PU � 6,544 LU � 6,431 
PV � 6,027 LV � 6,384
HP � � 0,6 HL � � 0,3 
A análise de variância é completada com as fórmulas das
tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados obtidos são
apresentados na tabela 5.1.4.-III.
36
�
120
3
�
5
559FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 5.1.4.-I – Absorvência
TABELA 5.1.4.-II – Média das transformadas logarítmicas 
de absorvência
Diluição Padrão S Amostra T
1:16000 0,043 0,045 0,051 0,097 0,097 0,094
1:8000 0,093 0,099 0,082 0,167 0,157 0,178
1:4000 0,159 0,154 0,166 0,327 0,355 0,345
1:2000 0,283 0,295 0,362 0,501 0,665 0,576
1:1000 0,514 0,531 0,545 1,140 1,386 1,051
Diluição Padrão U Amostra V
1:16000 0,086 0,071 0,073 0,082 0,082 0,086
1:8000 0,127 0,146 0,133 0,145 0,144 0,173
1:4000 0,277 0,268 0,269 0,318 0,306 0,316
1:2000 0,586 0,489 0,546 0,552 0,551 0,624
1:1000 0,957 0,866 1,045 1,037 1,039 1,068
Os logaritmos da densidade óptica têm uma relação linear
com os logaritmos das doses. As médias das transformadas
logarítmicas dos valores da densidade óptica são
apresentadas na tabela 5.1.4.-II. A representação gráfica dos
dados não demonstra nenhuma anomalia.
S1 � 3,075 T1 �2,344 U1 �2,572 V1 �2,485
S2 � 2,396 T2 �1,789 U2 �2,002 V2 �1,874
S3 � 1,835 T3 �1,073 U3 �1,305 V3 �1,161
S4 � 1,166 T4 0,550 U4 0,618 V4 0,554
S5 � 0,635 T5 0,169 U5 �0,048 V5 0,047
FIGURA 5.1.4.-I.
TABELA 5.1.4.-III – Análise de variância
Amostas 3 4,475 1,492
Regressão 1 47,58 47,58 7126 0,000
Não paralelismo 3 0,0187 0,006 0,933 0,434
Não lineariadade 12 0,0742 0,006 0,926 0,531
Tratamentos 19 52,152
Erro residual 40 0,267 0,0067
Total 59 52,42
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
Uma regressão altamente significativa e a ausência de desvios 
do paralelismo e de linearidade confirmam que a actividade 
pode ser calculada com segurança. As fórmulas da secção 
3.2.5 dão:
– para o declive comum
b � � 0,90848
1 � 0,3 � (6,109 � 6,264 � 6,431 � 6,384)
�������
ln 2 � 3 � 4
In
 A
bs
or
vê
nc
ia
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 559
– para ln(relação de actividade) da amostra T:
M’T � � 0,7752
C � � 1,00057
V � � 3,8436
– e para o ln(limites de confiança) da amostra T:
1,00057 � 0,7752 �
�0�,0�0�0�5�7� �� (�1�,0�0�0�5�7� �� 0�,7�7�5�2�2��� 2� �� 3�,8�4�3�6�)�
� 0,7756 � 0,0689
Tomando o antilogaritmo destes últimos valores, obtemos
uma relação de actividade de 2,171 com um intervalo de
confiança para 95 por cento de 2,027 a 2,327.
Como todas as preparações têm uma actividade assumida de
20 µg de proteína por mililitro, o cálculo dá para a mostra T
uma actividade de 43,3 µg de proteína por mililitro com um
intervalo de confiança para 95 por cento de 40,5 a 46,5 µg de
proteína por mililitro.
O mesmo procedimento é usado para calcular a actividade
das outras amostras e dos intervalos de confiança associados.
Os resultados obtidos são apresentados na tabela 5.1.4.-IV.
47,58
���
0,90852 � 5 � 3
47,68����
47,58 � 0,0067 � 2,0212
�5,586 � (�9,108)
����
5 � 0,90848
A análise de variância é mais complicada neste ensaio do que
nos outros porque, na soma dos quadrados, a componente
devida ao paralelismo não é independente da devida às
diferenças entre animais. Para verificar o paralelismo das
rectas de regressão, é necessário calcular um segundo termo
de erro obtido subtraindo a componente do paralelismo e
duas componentes de interacção à componente devida às
diferenças entre animais.
A análise de variância usa 3 componentes de interacção resul-
tantes da repetição dos tratamentos no interior de cada grupo:
dias � preparação; dias � regressão; dias � paralelismo.
Estes termos reflectem a tendência que têm os factores
considerados (preparações, regressão e paralelismo) para
variar de dia para dia. Os rácio-F correspondentes permitem
verificar a validade do ensaio neste aspecto. Se os valores de
F são significativamente elevados, convém interpretar os
resultados do ensaio com circunspecção e mesmo, se
possível, de o reiniciar.
A análise de variância é realizada aplicando as fórmulas das
tabelas 3.2.3.-I a 3.2.3.-III separadamente para cada um dos
2 dias e ao conjunto de todos os dados. As fórmulas das
tabelas 3.2.3.I e 3.2.3.-II dão:
5.3. Análises estatísticas
560 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
TABELA 5.1.4.-IV – Cálculos finais da actividade das vacinas 
a examinar e limites de confiança para 95 por cento 
(em µg de proteína por mililitro)
Limite inferior Estimativa Limite superior
Vacina T 40,5 43,4 46,5
Vacina U 32,9 35,2 37,6
Vacina V 36,8 39,4 42,2
5.1.5. DUPLO ENSAIO CRUZADO
Titulação de insulina por injecção subcutânea em coelhos
O padrão é administrado a 1 unidade e 2 unidades por
mililitro. A amostra é administrada em doses equivalentes
determinadas com base na actividade assumida do produto
que é de 40 unidades por mililitro. Cada animal recebe por
via subcutânea 0,5 ml das soluções apropriadas, de acordo
com o plano representado na tabela 5.1.5.-I. As respostas
obtidas são apresentadas na tabela 5.1.5.-II. A grande
variância constatada reflecte a variabilidade dos resultados
entre os animais e mostra a utilidade de aplicar um ensaio
cruzado.
TABELA 5.1.5.-I – Ordem dos tratamentos
Grupo de coelhos
1 2 3 4
dia 1 S1 S2 T1 T2
dia 2 T2 T1 S2 S1
FIGURA 5.1.5.-I.
TABELA 5.1.5.-II – Resposta y: soma dos valores da glicémia
(mg/100ml) após 1 hora e 2,5 horas
grupo 1 grupo 2 grupo 3 grupo 4
S1 T2 S2 T1 T1 S2 T2 S1
112 104 65 72 105 91 118 144
126 112 116 160 83 67 119 149
62 58 73 72 125 67 42 51
86 63 47 93 56 45 64 107
52 53 88 113 92 84 93 117
110 113 63 71 101 56 73 128
116 91 50 65 66 55 39 87
101 68 55 100 91 68 31 71
média 95,6 82,8 69,6 93,3 89,9 66,6 72,4 106,8
R
es
po
st
a 
(m
g 
/ 
10
0 
m
l)
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 560
Dia 1 PS �165,25 LS � 13
PT �162,25 LT � �8,75 
HP � � 4 HL � � 16 
Dia 2 PS �173,38 LS � 20,06
PT �176,99 LT � �5,25 
HP � � 4 HL � � 16 
conjunto PS �169,31 LS � 16,53
PT �169,13 LT � 7,00 
HP � � 8 HL � � 32 
e as fórmulas da tabela 3.2.3.-III permitem calcular:
192
�
6
16
�
2
96
�
6
8
�
2
96
�
6
8
�
2
As fórmulas da secção 3.2.5. dão:
– para o declive comum
b � � �33,95
– para ln(relação de actividade):
M’T � � 0,00276
C � � 1,0695
V � � 0,2402
– e para o ln(limites de confiança):
1,0695 � 0,00276 � �0�,0�6�9�5� �� (�1�,0�6�9�5� �� 0�,0�0�2�7�6�2��� 2� �� 0�,2�4�0�2�)�
� 0,00295 � 0,18279
Tomando o antilogaritmo destes últimos valores, obtemos
uma relação de actividade de 1,003 com um intervalo de
confiança para 95 por cento de 0,835 a 1,204. Estes resulta-
dos multiplicados por AT = 40 dão uma actividade de 40,1
unidades por mililitro com um intervalo de confiança para
95 por cento de 33,4 a 48,2 unidades por mililitro.
5.2. MODELO DE RELAÇÃO DE DECLIVES
5.2.1. DESENHO COMPLETAMENTE ALEATÓRIO (0,3,3)
Ensaio do factor VIII
Um laboratório desenvolve um ensaio colorimétrico do
factor VIII em soluções concentradas. O laboratório não tem
experiência deste tipo de titulações mas tenta torná-lo
operacional. São preparadas 3 diluições equivalentes para o
padrão e para a amostra. É igualmente preparado um branco
embora não seja esperada uma relação dose-resposta linear
para as doses mais baixas. Cada diluição é observada com 8
réplicas, um número superior ao que será utilizado nos
ensaios de rotina.
A representação gráfica dos dados mostra claramente que a
relação dose-resposta efectivamente não é linear para as
doses baixas. As respostas obtidas para o branco não são
usadas nos cálculos (são necessários novos ensaios para
justificar esta decisão). As fórmulas das tabelas 3.3.3.2.-I e
3.3.3.1-II dão:
PS = 0,6524 PT = 0,5651 
LS = 1,4693 LT = 1,2656 
aS = 0,318 aT = 0,318 
bS = 0,329 bT = 0,271 
GS = 0,1554 GT = 0,1156 
JS = 4,17 
 10-8 JT = 2,84 
 10-6
e
HI = 0,09524 a’= 0,05298 K = 1,9764 
E a análise de variância é realizada com a ajuda das fórmulas
das tabelas 3.3.3.1.-III e 3.3.3.1.-IV.
A existência de uma regressão muitíssimo significativa e a
ausência de desvio da linearidade e intersecção indicam que
a actividade pode ser calculada.
8859,5
���
(-33,95)2 � 2 � 16
8859,5
����
8859,5 � 137,3 � 2,0482
169,13 � 169,31
����
2 � (�33,95)
32 � (�16,53 � 7)
�������
ln 2 � 16 � 2
561FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
Dia 1 Dia 2 Conjunto
SSprep � 18,000 SSprep � 13,781 SSprep � 0,141
SSreg � 3784,5 SSreg � 5125,8 SSreg � 8859,5
SSpar � 144,5 SSpar � 1755,2 SSpar � 1453,5
Os termos da interacção obtêm-se pela operação: 
dia 1 � dia 2 – conjunto:
SSdias � prep � 31,64
SSdias � reg � 50,77
SSdias � par � 446,27
Calcula-se também a soma dos quadrados devidos à
variabilidade diária:
SSdias � N (D2
1 � D2
2) � K � 478,52
e a soma dos quadrados devidos aos blocos (variabilidade
entre animais):
SSblocos � 2 � B2
i � K � 39794,7
onde Bi é a resposta média por animal.
A análise de variância pode ser completada conforme
descrito na tabela 5.1.5.-III.
1
�
2
TABELA 5.1.5.-III – Análise de variância
Não paralelismo 1 1453,5 1453,5 1,064 0,311
Dias � amostra 1 31,6 31,6 0,023 0,880
Dias � reg. 1 50,8 50,8 0,037 0,849
Erro residual 
entre coelhos 28 38258,8 1366,4
Coelhos 31 39794,7 1283,7
Amostras 1 0,14 0,14 0,001 0,975
Regressão 1 8859,5 8859,5 64,532 0,000
Dias 1 478,5 478,5 3,485 0,072
Dias � não para 1 446,3 446,3 3,251 0,082
Erro residual 
inter-coelhos 28 3844,1 137,3
Total 63 53423,2
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 561
Declive da curva do padrão:
b’s � � 0,0822
Declive da curva da amostra
b’r � � 0,0677
A aplicação da fórmula 3.3.5.1.-3 dá:
R � � 0,823
C � � 1,000083
K � 0,000083 � 0,75 � 0,000062
e os limites de confiança para 95 por cento são:
0,823 � �0�,0�0�0�0�8�3� �� 1�,6�7�8� �� 0�,0�0�0�0�6�2� �� (���1�,6�4�6�)�
� 0,823 � 0,006
A relação de actividade estimada é de 0,823 com um
intervalo de confiança para 95 por cento entre 0,817 e 0,829.
0,08222
�����
0,08222 � 3,86 
 10�6 � 2,1882 � 0,0357
0,0677
��
0,0822
6 � 1,266 � 36 � 0,0530
����
84
6 � 1,469 � 36 � 0,0530
����
84
5.2.2. ENSAIO TOTALMENTE ALEATÓRIO (0,4,4,4)
Ensaio in vitro de vacinas da gripe
O teor em antigéneo da hemaglutinina (AH) de 2 vacinas
gripais é determinado por imunodifusão radial simples. As 2
vacinas possuem uma actividade declarada de 15 µg de AH
por dose, equivalente a um teor em AH de 30 µg/ml. O teor
em AH atribuído ao padrão é de 39 µg/ml.
O padrão e as vacinas a titular são examinadas em 4
concentrações, preparadas em duplicado com base nos
respectivos teores (atribuído ou declarado). Quando é obtido
o equilíbrio entre o reagente interno e o reagente externo,
mede-se a superfície da zona anular da preparação. Os
resultados obtidos são apresentados na tabela 5.2.2.-I.
A representação gráfica dos dados não apresenta nenhum
aspectofora do habitual. A aplicação das fórmulas das
tabelas 3.3.3.1.-I e 3.3.3.1-II dão:
PS = 108,2 PT = 103,85 PU = 85,8
LS = 301,0 LT = 292,1 LU = 234,1 
aS = 141,0 aT = 116,7 aU = 139,8 
bS = 61,2 bT = 64,95 bU = 39,2 
GS = 3114,3 GT = 2909,4 GU = 1917,3 
JS = 0,223 JT = 2,227 JU = 0,083 
e
HI = 0,0093 a’ = 11,04 K = 14785,8
E a análise de variância é realizada com a ajuda das fórmulas
das tabelas 3.3.3.1.III e 3.3.3.1.-IV. Os resultados obtidos são
apresentados na tabela 5.2.2.-II.
A existência de uma regressão muitíssimo significativa e a
ausência de desvio da linearidade e intersecção indicam que
a actividade pode ser calculada.
Declive da curva do padrão:
b’s � � 6,356
Declive da curva da vacina T:
b’r � � 6,056
Declive da curva da vacina U:
b’U � � 4,123
6 � 234,1 � 60 � 11,04
����
180
6 � 292,1 � 60 � 11,04
����
180
6 � 301,1 � 60 � 11,04
����
180
5.3. Análises estatísticas
562 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
TABELA 5.2.1.-I – Absorvências
branco padrão S (em UI/ml) amostra T (em UI/ml)
Conc. B S1 S2 S3 T1 T2 T3
0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03
0,022 0,133 0,215 0,299 0,120 0,188 0,254
0,024 0,133 0,215 0,299 0,119 0,188 0,253
0,024 0,131 0,216 0,299 0,118 0,190 0,255
0,026 0,136 0,218 0,297 0,120 0,190 0,258
0,023 0,137 0,220 0,297 0,120 0,190 0,257
0,022 0,136 0,220 0,305 0,121 0,191 0,257
0,022 0,138 0,219 0,299 0,121 0,191 0,255
0,023 0,137 0,218 0,302 0,121 0,190 0,254
média 0,0235 0,1351 0,2176 0,2996 0,1200 0,1898 0,2554
FIGURA 5.2.1.-I.
TABELA 5.2.1.-II – Análise de variância
Regressão 2 0,1917 0,0958 24850 0,000
Intersecção 1 3.10�9 3.10�9 7.10�4 0,978
Não linear 2 2.10�5 1.10�5 2,984 0,061
Tratamentos 5 0,1917
Erro residual 42 1,62.10�4 3,86.10�6
Total 47 0,1919
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
A
bs
or
vê
nc
ia
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 562
A relação de actividade estimada é de 6,056/6,356 = 0.953
para a vacina T e de 4,123/6,356 = 0,649 para a vacina U.
C � �1,0056
K’ � 0,0056 � 0,625 � 0,0035
Os limites de confiança são dados pela fórmula 3.3.5.1.-4.
Para a vacina T:
0,955 � �0�,0�0�5�6� �� 1�,9�1�3� �� 0�,0�0�3�5� �� (���1�,9�1�3�)� � 0,955 � 0,063
Para a vacina U:
0,649 � �0�,0�0�5�6� �� 1�,4�2�3� �� 0�,0�0�3�5� �� (���1�,3�0�1�)� � 0,649 � 0,058
O teor em AH, expresso em µg/ml, é calculado multiplicando
as relações de actividade e os limites de confiança pela acti-
vidade assumida (30 µg/ml). Os resultados obtidos figuram
na tabela 5.2.2.-III.
6,3562
�����
6,3562 � 1,068 � 2,1792 � 0,0444
5.3. RESPOSTAS QUALITATIVAS
5.3.1. TITULAÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO RELATIVAMENTE
A UM PADRÃO PELO MÉTODO DA PROPABILIDADE
ITERACTIVA (PROBIT)
Ensaio in vivo de uma vacina diftérica
Uma vacina diftérica, com a actividade assumida de 140
UI/ampola, é titulada por comparação com um padrão com a
actividade atribuída de 132 UI/ampola. Com bases nestas
actividades, preparam-se doses equivalentes destas prepara-
ções, que são administradas de modo aleatório a um grupo
de cobaios. Após determinado intervalo de tempo, os animais
são submetidos a uma prova de virulência através da toxina
diftérica. Os resultados obtidos, expressos em número de
animais sobreviventes, são apresentados na tabela 5.3.1.-I.
Os valores são transpostos para a primeira tabela de
trabalho, onde são calculadas as colunas seguintes como
descrito na secção 4.2.1. A tabela 5.3.1.-II representa o
primeiro ciclo de cálculo.
563FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 5.2.2.-I – Superfície de precipitação (mm2)
Padrão S Amostra T Amostra T
I II I II I II
7,5 18,0 18,0 15,1 16,8 15,4 15,7
15,0 22,8 24,5 23,1 24,2 20,2 18,6
22,5 30,4 30,4 28,9 27,4 24,2 23,1
30,0 35,7 36,6 34,4 37,8 27,4 27,0
Conc.
(µg/ml)
FIGURA 5.2.2.-I.
TABELA 5.2.2.-II – Análise de variância
Regressão 3 1087,7 362,6 339,5 0,000
Intersecção 2 3,474 1,737 1,626 0,237
Não linear 6 5,066 0,844 0,791 0,594
Tratamentos 11 1096,2
Erro residual 12 12,815 1,068
Total 23 1109,0
Origem 
da variação
Graus 
de 
liberdade
Soma 
dos
quadrados
Quadrado
médio
Rácio 
F
Probabilidade
TABELA 5.2.2.-III – Estimativa da quantidade de AH (µg/dose)
Limite inferior Estimativa Limite superior
Vacina T 13,4 14,3 15,3
Vacina U 8,9 9,7 10,6
TABELA 5.3.1.-I – Dados brutos do ensaio 
em cobaios da vacina diftérica
1,0 12 0 1,0 11 0
1,6 12 3 1,6 12 4
2,5 12 6 2,5 11 8
4,0 11 10 4,0 11 10
Padrão (S) 
actividade atribuída 
132 UI/ampola
dose
(UI/ml)
submetidos
a prova
protegidos
dose
(UI/ml)
submetidos
a prova
protegidos
Amostra (T) 
actividade assumida 
140 UI/ampola
FIGURA 5.3.1.-I.
S
up
er
fíc
ie
 d
a 
zo
na
 a
ne
la
r
P
ro
ba
bi
lid
ad
e
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 563
A soma das 6 últimas colunas desta tabela é realizada de
seguida para cada uma das preparações, e os resultados são
transportados para a segunda tabela de trabalho (ver tabela
5.3.1.-III), onde as outras colunas são calculadas com a
ajuda das fórmulas 4.2.1.-4 a 4.2.1.-10. O declive comum b
resultante é de 1,655.
De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na
primeira tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o
segundo ciclo de cálculo (tabela 5.3.1.-IV).
Procede-se assim por ciclos de cálculos iteractivos até à
obtenção de uma diferença mínima entre 2 ciclos
consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se
então sob a forma indicada na tabela 5.3.1.-V.
O teste de linearidade é feito conforme descrito na secção
4.2.2. O valor de χ2 com 4 graus de liberdade é de 
0,851 � 1,070 � 1,921, ou seja, um valor de p de 0,750 o
que não é significativo.
Uma vez que não há desvio significativo da linearidade, o
teste de paralelismo pode ser efectuado como descrito na
mesma secção. O valor de χ2 com 1 grau de liberdade é de 
(16,71 � 17,27) � � 0,001, ou seja um valor de p
de 0,974 o que não é significativo.
Procedendo como indicado na secção 4.2.3, obtemos as
seguintes estimativas:
– para ln(relação de actividade):
M’T � � 0,137
C � � 1,127
V � � � 0,110
1
�
17,96
1
�
18,37
2,4012 � 5,893
����
2,4012 � 5,893 � 12 � 1,9602
�1,721 � (�2,050)
����
2,401
14,152
��
5,89
5.3. Análises estatísticas
564 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
Vacina Dose n r x p Y ΦΦ Z y w wx wy wx2 wy2 wxy
S 1,0 12 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 �1,253 7,64 0,00 �9,57 0,00 12,00 0,00
1,6 12 3 0,470 0,250 0 0,5 0,399 �0,627 7,64 3,59 �4,79 1,69 3,00 �2,25
2,5 12 6 0,916 0,500 0 0,5 0,399 0,000 7,64 7,00 0,00 6,41 0,00 0,00
4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95
T 1,0 11 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 �1,253 7,00 0,00 �8,78 0,00 11,0 0,00
1,6 12 4 0,470 0,333 0 0,5 0,399 �0,418 7,64 3,59 �3,19 1,69 1,33 �1,50
2,5 11 8 0,916 0,727 0 0,5 0,399 0,570 7,00 6,42 3,99 5,88 2,27 3,66
4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95
TABELA 5.3.1.-II. – Primeira tabela de trabalho no primeiro ciclo
vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy2 Sxx Sxy Syy x� y� a
S 29,92 20,30 �7,18 21,56 22,36 7,70 7,79 12,58 20,64 0,68 �0,24 �1,36
T 28,65 19,72 �0,80 21,03 21,97 12,11 7,46 12,66 21,95 0,69 �0,03 �1,17
TABELA 5.3.1.-III. – Segunda tabela de trabalho no primeiro ciclo
Vacina Dose n r x p Y ΦΦ Z y w wx wy wx2 wy2 wxy
S 1,0 12 0 0,000 0,000 �1,36 0,086 0,158 �1,911 3,77 0,00 �7,21 0,00 13,79 0,00
1,6 12 3 0,470 0,250 �0,58 0,279 0,336 �0,672 6,74 3,17 �4,53 1,49 3,04 �2,13
2,5 12 6 0,916 0,500 0,15 0,561 0,394 �0,001 7,57 6,94 �0,01 6,36 0,00 �0,01
4,0 11 10 1,386 0,909 0,93 0,824 0,258 1,260 5,07 7,03 6,39 9,75 8,05 8,86
T 1,0 11 0 0,000 0,000 �1,17 0,122 0,202 �1,769 4,20 0,00 �7,43 0,00 13,14 0,00
1,6 12 4 0,470 0,333 �0,39 0,349 0,370 �0,430 7,23 3,40 �3,11 1,60 1,34 �1,46
2,5 11 8 0,916 0,727 0,35 0,637 0,375 0,591 6,70 6,14 3,96 5,62 2,34 3,63
4,0 11 10 1,386 0,909 1,13 0,870 0,211 1,311 4,35 6,03 5,70 8,36 7,48 7,90
TABELA 5.3.1.-IV. – Primeira tabela de trabalho no segundode atingir este objectivo é operar em condições e em
instalações concebidas para impedir a contaminação
microbiana. A preparação asséptica pode compreender o
enchimento e o fecho asséptico dos recipientes, a mistura
asséptica dos componentes da fórmula seguida do
enchimento e do acondicionamento assépticos.
Para manter a esterilidade dos componentes e do produto
durante a preparação é conveniente dispensar atenção
especial aos seguintes aspectos:
– meio ambiente,
– pessoal laborante,
– áreas críticas,
– esterilização dos recipientes/fechos e operações de
transferência de produtos,
– duração máxima da armazenagem antes da embalagem final.
A validação do processo de preparação compreende
verificações adequadas sobre o conjunto dos parâmetros
referidos e o próprio processo é objecto de verificações
regulares por simulação com meios de crescimento
microbiano que são postos a incubar e examinados com vista
à detecção de uma eventual contaminação microbiana. Além
disso, dos produtos esterilizados por filtração ou preparados
em condições assépticas é submetida ao ensaio de esterilidade
(2.6.1) uma amostra apropriada antes da libertação do lote.
5.1.2. INDICADORES BIOLÓGICOS 
DE ESTERILIZAÇÃO
Os indicadores biológicos são preparações aferidas de
microrganismos seleccionados, utilizados para avaliar a
eficácia de um procedimento de esterilização. São geralmente
constituídos por uma população de esporos bacterianos
depositados num suporte inerte, por exemplo uma tira de
papel de filtro, uma lâmina de vidro ou um tubo de material
plástico. O suporte semeado é embalado de modo a que o
conjunto fique protegido de qualquer alteração ou
contaminação, permitindo no entanto que o agente
esterilizante entre em contacto com os microrganismos. As
suspensões bacterianas podem apresentar-se em ampolas
seladas. Os indicadores biológicos são preparados de modo a
poderem ser conservados em condições definidas. 
Determina-se um prazo de validade.
Microrganismos da mesma espécie bacteriana que as bactérias
utilizadas para fabricar os indicadores biológicos podem ser
inoculados directamente num produto líquido a esterilizar, ou
num produto líquido similar ao produto a esterilizar. Neste
caso, demonstra-se que o líquido utilizado não tem efeito
inibidor para os esporos utilizados, em particular quanto à
sua germinação.
Os indicadores biológicos são caracterizados pelo nome da
espécie bacteriana do microrganismo indicador, número da
estirpe na colecção de origem, número de esporos viáveis por
suporte e pelo valor D. O valor D é o valor de um parâmetro
de esterilização (duração ou dose absorvida) necessário para
reduzir em 10 por cento do valor inicial, o número de
microrganismos viáveis. Só tem significado em condições
experimentais bem definidas. Estão presentes apenas os
microrganismos indicados. Podem ser utilizados como
indicadores biológicos suportes com mais do que uma espécie
bacteriana. São fornecidas informações sobre o meio de
cultura e condições de incubação.
Recomenda-se que os indicadores biológicos sejam colocados
em locais considerados menos acessíveis ao agente
esterilizante, ou identificados como tais por prévias
determinações físicas. Após exposição ao agente esterilizante,
utiliza-se uma técnica asséptica para transferir o suporte
carregado de esporos para o meio de cultura, afim de evitar
qualquer risco de contaminação na altura do exame. Podem
ser utilizados indicadores biológicos que incluam uma
ampola com meio de cultura directamente colocada na
embalagem de protecção do suporte semeado.
A escolha dos microrganismos indicadores é efectuada com
base nos seguintes critérios:
a) a resistência da estirpe indicadora ao método de
esterilização considerado é, quando comparada, superior à
de todos os microrganismos patogénicos e à dos
microrganismos potencialmente presentes no produto, 
b) a estirpe indicadora não é patogénica,
c) a estirpe indicadora desenvolve-se facilmente,
O desenvolvimento após incubação dos microrganismos
indicadores submetidos ao processo de esterilização
demonstra que o processo foi insuficiente.
1. Esterilização pelo vapor. Recomenda-se a utilização de
indicadores biológicos na esterilização pelo vapor para a
validação dos ciclos de esterilização. Recomenda-se a
utilização de esporos de Bacillus stearothermophilus (por
exemplo ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157 ou CIP
52.81). O número de esporos viáveis por suporte é superior
a 5 � 105 e o valor D a 121°C superior a 1,5 min. 
Verifica-se se a exposição dos indicadores biológicos ao
vapor durante 6 min a 121 � 1°C mantém os esporos
revivificáveis, e que não há desenvolvimento dos
microrganismos indicadores após exposição ao vapor
durante 15 min a 121 � 1°C.
2. Esterilização pelo calor seco. Recomenda-se a utilização de
Bacillus subtilis (por exemplo a var. niger ATCC 9372,
NCIMB 8058 ou CIP 77.18) na preparação de indicadores
biológicos. O número de esporos viáveis por suporte é
superior a 1 � 105 e o valor D a 160°C é da ordem de 1 a
3 min. O calor seco a temperaturas superiores a 220°C é
utilizado frequentemente na esterilização e eliminação de
pirogénios no material de vidro. Neste caso, a
demonstração da existência de uma redução de 3 log de
endotoxinas bacterianas resistentes ao calor substitui a
utilização de indicadores biológicos.
3. Esterilização por radiações. Podem ser utilizados
indicadores biológicos para monitorizar as operações de
rotina, como meio suplementar para avaliar a eficácia da
dose de radiação escolhida, especialmente no caso de
esterilização com electrões acelerados. Recomenda-se a
517FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.1.2. Indicadores biológicos de esterilização
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 517
utilização de esporos de Bacilius pumilus (por exemplo,
ATCC 27.142, NCTC 10327, NCIMB 10692 ou CIP 77.25). O
número de esporos viáveis por suporte é superior a 1 � 107.
O valor D é superior a 1,9 kGy. Verifica-se que não existe
desenvolvimento de microrganismos indicadores após
exposição a 25 kGy (dose mínima absorvida)
4. Esterilização por gases. A utilização de indicadores
biológicos é necessária para todos os procedimentos de
esterilização por gases, tanto na validação dos ciclos como
nas operações de rotina. A esterilização por gases é
correctamente utilizada para os dispositivos médicos, os
isoladores, os locais, etc. A utilização dos gases neste
contexto não faz parte das actividades da Farmacopeia. A
utilização de esporos de Bacillus subtilis (por exemplo a
variedade niger ATCC 9372, NCIMB 8058 ou CIP 77.18) é
recomendado para o óxido de etileno. O número de
esporos viáveis por suporte é superior a 5 � 105. Os
parâmetros de resistência são conhecidos para o procedi-
mento utilizado: por exemplo, para o óxido de etileno, o
valor D é superior a 2,5 min para um ciclo de ensaio
envolvendo 600 mg/l de óxido de etileno a 54°C com 60
por cento de humidade relativa. Verifica-se a ausência de
desenvolvimento dos microrganismos indicadores após
exposição durante 60 min no ciclo do ensaio atrás
descrito, e que a sua exposição durante 15 min num ciclo
com temperatura reduzida (600 mg/l, 30°C e 60 por cento
de humidade relativa) deixa os esporos revivificáveis. A
exposição dos indicadores a 600 mg/l de óxido de etileno,
durante 60 min, a 54°C e sem humidificação deve deixar
esporos revivificáveis para assegurar que o indicador
biológico é capaz de revelar a existência de uma humidifi-
cação insuficiente.
5.1.3. EFICÁCIA DOS CONSERVANTES
ANTIMICROBIANOS
Quando as preparações farmacêuticas não possuam elas
próprias propriedades conservantes adequadas, podem
adicionar-se-lhes agentes de conservação antimicrobianos,
particularmente em preparações aquosas, com o fim de
evitar ou limitar a proliferação microbiana que pode ocorrer
nas condições normais de conservação e de emprego e assim
apresentar um risco de infecção para o doente e deterioração
da preparação, nomeadamente nos recipientes multidose. 
Os agentes de conservação antimicrobianos nãociclo
vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy Sxx Sxy Syy x� y� a
S 18,37 14,80 �2,14 14,85 17,81 5,28 2,93 7,00 17,56 0,81 �0,12 �2,05
T 17,96 12,64 �0,55 11,86 18,35 6,76 2,96 7,15 18,34 0,70 �0,03 �1,72
TABELA 5.3.1.-V. – Segunda tabela de trabalho depois do último ciclo
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 564
– e para ln(limites de confiança):
0,155 � 0,013 � �0�,1�2�7� (�0�,6�4�9� �� 1�,1�2�7� �� 0�,0�3�6�2)�
� 0,142 � 0,288
A actividade e os limites de confiança podem agora ser
obtidos multiplicando os antilogaritmos pela actividade
assumida (149 UI/ampola). A estimativa assim obtida é de
160,6 UI/ampola com um intervalo de confiança para 95 por
cento entre 121,0 e 215,2 UI/ampola.
5.3.2. MÉTODO LOGIT E OUTROS MÉTODOS DE ANÁLISE
DA TITULAÇÃO DE UMA AMOSTRA RELATIVAMENTE A UM
PADRÃO
Os resultados serão fornecidos para a situação onde o
método logit e outros métodos «clássicos» desta família
são aplicados para os dados da secção 5.3.1. Este exemplo
deve ser considerado como um exercício ilustrativo, e não
como uma alternativa ao método da probabilidade 
iteractiva (probit) no caso particular. Só poderá ser
utilizada outra função com base em justificações
experimentais ou teóricas.
5.3.3. DETERMINAÇÃO DA DE50 DE UMA SUBSTÂNCIA
PELO MÉTODO DA PROBABILIDADE ITERACTIVA (PROBIT)
Ensaio in vitro de uma vacina oral da poliomielite
A titulação de uma vacina oral da poliomielite é efectuada 
pela determinação de DE50 em placas ELISA com 10 diluições 
diferentes e 8 réplicas de 50 µl. Os resultados obtidos são
apresentados na tabela 5.3.3.-I.
565FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 5.3.2.-I – Resultados obtidos 
com diferentes análises de funções
Logit Gompit Ângulo(*)
Φ 1 � e�eY
sin Y �
Z eY�eY
cos Y
Declive b 4,101 2,590 1,717
�2 lin 2,15 3,56 1,50
�2 par. 0,0066 0,168 0,0010
Actividade 162,9 158,3 155,8
Limite inf. 121,1 118,7 122,6
Limite sup. 221,1 213,3 200,7
se Y � � � então Φ = 0 e Z = 0
(*) 
se Y � � � então Φ = 1 e Z = 0
1
�
2
1
�
2
1
�
2
e�Y
��
(1 � e�Y )2
1
�
2
1
�
2
1
�
1 � e�Y
Vacina Dose n r x p Y ΦΦ Z y w wx wy wx2 wy2 wxy
T 10�3,5 8 0 �8,06 0,000 0,00 0,5 0,399 �1,253 5,09 �41,04 �6,38 330,8 8,00 51,4
10�4,0 8 0 �9,21 0,000 0,00 0,5 0,399 �1,253 5,09 �46,91 �6,38 432,0 8,00 58,8
10�4,5 8 1 �10,36 0,125 0,00 0,5 0,399 �0,940 5,09 �52,77 �4,79 546,8 4,50 49,6
10�5,0 8 2 �11,51 0,250 0,00 0,5 0,399 �0,627 5,09 �58,63 �3,19 675,1 2,00 36,7
10�5,5 8 6 �12,66 0,750 0,00 0,5 0,399 0,627 5,09 �64,50 3,19 816,8 2,00 �40,4
10�6,0 8 7 �13,82 0,875 0,00 0,5 0,399 0,940 5,09 �70,36 4,79 972,1 4,50 �66,1
10�6,5 8 7 �14,97 0,875 0,00 0,5 0,399 0,940 5,09 �76,23 4,79 1140,8 4,50 �71,7
10�7,0 8 8 �16,12 1,000 0,00 0,5 0,399 1,253 5,09 �82,09 6,38 1323,1 8,00 �102,9
10�7,5 8 8 �17,27 1,000 0,00 0,5 0,399 1,253 5,09 �87,95 6,38 1518,9 8,00 �110,2
10�8,0 8 8 �18,42 1,000 0,00 0,5 0,399 1,253 5,09 �93,82 6,38 1728,2 8,00 �117,6
TABELA 5.3.3.-II. – Primeira tabela de trabalho do primeiro ciclo
TABELA 5.3.3.-I – Diluições (10x µl de vacina não diluída)
�3,5 �4,0 �4,5 �5,0 �5,5 �6,0 �6,5 �7,0 �7,5 �8,0
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
� � � � � � � � � �
FIGURA 5.3.3.-I.





P
ro
ba
bi
lid
ad
e
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 565
Estes valores são transpostos para a primeira tabela de
trabalho, onde são calculadas as colunas seguintes como
descrito na secção 4.2.1. A tabela 5.3.3.-II representa o
primeiro ciclo deste método de cálculo.
A soma das 6 últimas colunas desta tabela é realizada de
seguida e os resultados são transportados para a segunda
tabela de trabalho (ver tabela 5.3.3.-III), onde as outras
colunas são calculadas com a ajuda das fórmulas 4.2.1.-4 a
4.2.1.-10. O declive comum b resultante é de -0,295.
De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na
primeira tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o
segundo ciclo de cálculo. Procede-se assim por ciclos de
cálculos iteractivos até à obtenção de uma diferença mínima
entre 2 ciclos consecutivos. A segunda tabela de trabalho
apresenta-se então sob a forma indicada na tabela 5.3.3.-IV.
O teste de linearidade é feito conforme descrito na secção
4.2.2. O valor de χ2 com 8 graus de liberdade é de 2,711, ou
seja, um valor de p de 0,951 o que não é significativo.
Procedendo como indicado na secção 4.5, obtemos as
seguintes estimativas:
– para ln(relação de actividade):
M’T � � 0,137
C � � 1,197
V � � 0,052
– e para ln(limites de confiança):
�14,692 � (�2,420) � �0�,1�9�7� �� (�2�,8�8�2� �� 1�,1�9�7� �� 0�,0�0�9�2)�
� �12,272 � 0,754
Esta estimativa é expressa em termos de ln(diluição).
Para converter esta expressão em ln(DE50)/ml é necessário 
efectuar a transformação M’T � ln� �.
Como a actividade deste tipo de vacina é expresso em termos
de log10(DE50)/ml, é necessário dividir os resultados por
ln(10). A actividade estimada assim obtida é igual a 6,63
log10(DE50)/ml, com um intervalo de confiança para 95 por
cento entre 6,30 e 6,96 log10(DE50)/ml.
1000
�
50
1
���
19,39
(�0,646)2 � 55,883
����
(�0,646)2 � 55,883 � 12 � 1,9602
�1,721 � (�2,050)
����
2,401
5.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS
5.4.1. ANÁLISE DE UMA CURVA LOGÍSTICA DE 4
PARÂMETROS
Titulação serológica de imunosoros tetânicos
Como já foi previamente indicado na secção 3.4, este
exemplo tem por objectivo ilustrar um modo «possível» de
análise dos dados apresentados, mas não necessariamente
reflectir o «único» modo de análise ou o «mais apropriado».
Muitas outras aproximações estão descritas na literatura,
mas elas não conduzem, na maior parte das situações, a
resultados muito diferentes. Encontramos na secção 7.5
uma breve discussão destas aproximações alternativas bem
como de outras considerações estatísticas.
5.3. Análises estatísticas
566 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy Sxx Sxy Syy x� y� a
T 50,93 �674,3 11,17 9484,6 57,50 �312,32 556,92 �164,43 55,05 �13,24 0,219 �3,690
TABELA 5.3.3.-III. – Segunda tabela de trabalho do segundo ciclo
vacina � w � wx � wy � wx2 � wy2 � wxy2 Sxx Sxy Syy x� y� a
T 19,39 �238,2 0,11 2981,1 26,05 �37,35 55,88 �36,11 26,05 �12,28 0,006 �7,931
TABELA 5.3.3.-IV. – Segunda tabela de trabalho do último ciclo
TABELA 5.4.1.-I – Respostas observadas
Padrão S Amostra T
Dil. Obs. 1 Obs. 2 Dil. Obs. 1 Obs. 2
1/10 2,912 2,917 1/10 3,017 2,987
1/20 2,579 2,654 1/20 2,801 2,808
1/40 2,130 2,212 1/40 2,401 2,450
1/80 1,651 1,638 1/80 1,918 1,963
1/160 1,073 0,973 1/160 1,364 1,299
1/320 0,585 0,666 1/320 0,861 0,854
1/640 0,463 0,356 1/640 0,497 0,496
1/1280 0,266 0,234 1/1280 0,340 0,344
1/2560 0,228 0,197 1/2560 0,242 0,217
1/5120 0,176 0,215 1/5120 0,178 0,125
Um imunosoro de cobaio é doseado por comparação com
um imunosoro de referência (0,4 UI/ml) com uma técnica
de imunoadsorção por enzima conjugado (ELISA) Aplicam-
-se 10 diluições a ? de cada preparação numa placa ELISA
com 96 pocilhos. Cada diluição é aplicada 2 vezes. Os resul-
tados observados são apresentados na tabela 5.4.1.-I.
Para este exemplo assume-se que o laboratório validou as
condições 1 a 3 especificadas na secção 3.1.1, quando o
ensaio foi desenvolvido em condições de rotina. Para além
disso, o laboratório validou também as condições de igual-
dade do limite superior e do limite inferior das amostras.
A representação gráfica não demonstra aspectos anormais.
Procede-se ao ajustamento dos parâmetros da função
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 566
logística pelo método dos mínimos quadrados, utilizando
um programa informático apropriado, supondo que os
termos de erro residual são variáveis aleatórias normais
independentes e identicamente distribuídas. Neste caso são
necessários 3 parâmetros (α, β e δ) para descrever o factor
de declive comum e as assímptotas comuns inferior e
superior, mais 2 parâmetroscomplementares (γS e γT) para
descrever a posição horizontal das 2 curvas. O programa
fornece as estimativas para os diferentes parâmetros:
α = 3,196 γS = �4,307
β = 1,112 γT = �4684
δ = 0,145
Além disso, fornece para a variância residual s2 uma
estimativa de 0,001429 com 20 graus de liberdade (variação
intra-tratamentos).
Para obter os limites de confiança, e verificar o paralelismo e
a linearidade, linearisam-se as respostas u observadas, antes
de as submeter a uma análise de linhas paralelas ponderada
através do programa. Este procedimento é muito
semelhante ao descrito na secção 4.2 pelo método da
probabilidade iteractiva (probit), introduzindo-se as
seguintes modificações:
Y = β (x � 
) y � Y �
� � � Φ
Z
Φ = w = 
Z = 
Obtém-se assim, uma análise de variância ponderada das
respostas transformadas y com as ponderações w:
e�Y
��
(1 � e�Y)2
Z2 (� � �)2
��
s2
1
�
1 � e�Y
u � �
�
� � �
uma actividade estimada de 1,459 � 0,4 � 0,584 UI/ml. A
fórmula 4.2.3.-2 dá, para os limites de confiança para 95 por
cento, os valores de 0,557 e 0,612 UI/ml.
6. COMBINAÇÃO DE RESULTADOS 
DE ENSAIOS
6.1. INTRODUÇÃO
Para satisfazer as exigências da Farmacopeia é muitas vezes
necessário realizar vários ensaios independentes e combinar
os seus resultados. A questão coloca-se quanto à admissibi-
lidade da combinação dos resultados dos ensaios, e em caso
afirmativo, de que modo.
Dois ensaios podem ser considerados como independentes
quando a execução de um deles não afecta as probabilidades
associadas aos resultados dos outros. Isto implica que o
conjunto dos erros aleatórios ligados aos principais factores
de influência de um dos ensaios (por exemplo, diluições do
padrão e da amostra, sensibilidade do indicador biológico)
devem ser independentes dos erros aleatórios corresponden-
tes ao outro ensaio. Os ensaios realizados em vários dias
consecutivos a partir de diluições do padrão preparadas no
mesmo momento não são considerados ensaios independentes.
Existem vários métodos para combinar os resultados de
ensaios independentes, sendo o mais aceitável do ponto de
vista teórico o que apresenta maior dificuldade de aplicação. 
A seguir são descritos 3 métodos de aproximação simplificada; 
outros podem ser usados desde que as condições necessárias
sejam satisfeitas.
Antes de combinar as actividades obtidas a partir dos ensaios
baseados no modelo de linhas paralelas ou no modelo da
probabilidade iteractiva (probit) devem ser transformados
em logaritmos; pelo contrário, as actividades obtidas a partir
de ensaios baseados no modelo de relação de declives são
utilizadas tal qual. Como os 2 primeiros modelos são de
utilização mais corrente que o da relação de declives, é o
símbolo M (representando o logaritmo da actividade) que é
usado nas fórmulas desta secção. Lendo R (relação de
declive) em vez de M, o experimentador pode aplicar as
mesmas fórmulas para calcular os resultados dos ensaios
baseados no modelo de relação de declives. Antes de serem
combinados, todas as estimativas de actividade devem ser
corrigidas relativamente à actividade atribuída para
preparação.
6.2. COMBINAÇÃO PONDERADA DE RESULTADOS DE
ENSAIOS
Este método pode ser utilizado se as seguintes condições
forem satisfeitas:
1) As estimativas de actividade resultam de ensaios
independentes,
2) para cada ensaio, C está perto de 1 (digamos inferior a 1,1),
3) o número de graus de liberdade dos erros residuais
individuais é superior ou igual a 6 e de preferência
superior a 15,
4) as estimativas individuais de actividade formam uma
série homogénea (ver secção 6.2.2).
Se as condições não forem satisfeitas, este método não pode
ser aplicado. O método descrito na secção 6.3 pode então ser
567FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
TABELA 5.4.1.-II. – Análise de variância ponderada
Amostras 1 0,529653 0,467
Regressão 1 6599,51 0,000
Não paralelismo 1 0,0458738 0,830
Não linearidade 16 8,89337 0,918
Tratamentos 19 6608,98
Erro residual 20 20,0000
Total 39 6628,98
Origem 
da variação
graus de
liberdade
Chi-quadrado Probabilidade
Não se observam desvios significativos de paralelismo e de
linearidade; o método de doseamento é satisfatório para os 
cálculos da actividade. Se a condição de igualdade das
assímptotas superior e inferior não for satisfeita, é provável
que se observem desvios significativos de linearidade e/ou
paralelismo, uma vez que os testes de paralelismo e de
linearidade reflectem a justeza do ajustamento do modelo 
de 4 parâmetros na sua totalidade. O erro residual na análise 
de variância é sempre igual a 1 em resultado da transforma-
ção. É, no entanto, possível calcular um factor de heteroge-
neidade (análogo ao utilizado no método dos probits).
A actividade relativa da amostra pode ser obtida pelo cálculo
do antilogaritmo de γS � γT. Multiplicando este valor pela
actividade atribuída da preparação de referência, obtemos
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 567
utilizado para obter a melhor estimativa da actividade média,
podendo ser adoptado para os ensaios ulteriores como
actividade assumida.
6.2.1. CÁLCULO DOS FACTORES DE PONDERAÇÃO
É presumido que os resultados de cada um dos n’ ensaios
foram analisados para dar origem a n’ valores de M com os
limites de confiança associados. Para cada ensaio, o intervalo
de confiança logarítmico L é obtido por subtracção ao limite
superior o inferior. O factor de ponderação W é calculado
para cada valor de M com a ajuda da fórmula 6.2.1.-1, onde t
toma o mesmo valor que o utilizado no cálculo dos limites
de confiança.
W � (6.2.1.-1.)
6.2.2. HOMOGENEIDADE DAS ESTIMATIVAS DE
ACTIVIDADE
Elevando ao quadrado o desvio de cada valor de M
relativamente à média ponderada, e depois multiplicando
cada um dos desvios pelo factor de ponderação apropriado e
efectuando a sua soma no conjunto dos ensaios, obtemos
uma variável estatística em que a distribuição segue
aproximadamente uma lei de χ2 (ver tabela 8.3) e que pode
ser utilizado para verificar a homogeneidade de uma série de
estimativas do logaritmo da actividade:
�2 � �
n’
W (M � M�)2 onde M� � (6.2.2.-1.)
Se o valor de χ2 assim calculado é inferior ao valor da tabela
que corresponde a (n’�1) graus de liberdade, as actividades
são homogéneas e os valores obtidos na secção 6.2.3 para a
actividade média e os limites associados terão significado.
Se o valor de χ2 calculado é superior ao valor da tabela, as
actividades são heterogéneas. Isto significa que as variações
entre as estimativas individuais de M são superiores ao que
seria previsível pelas estimativas dos limites de confiança,
quer dizer que existe uma variabilidade significativa entre os
ensaios. Nestas circunstâncias, a condição 4 não é satisfeita e
as equações da secção 6.2.3 não são aplicáveis, mas elas
podem ser substituídas pelas da secção 6.2.4.
6.2.3. CÁLCULO DA MÉDIA PONDERADA E DOS LIMITES
DE CONFIANÇA
Os produtos WM são formados para cada ensaio e a sua soma
é dividida pela soma dos factores de ponderação de todos os 
ensaios, para dar a média logarítmica ponderada da actividade.
M� � (6.2.3.-1.)
O erro tipo de ln(actividade média) é a raiz quadrada do
inverso da soma dos factores de ponderação:
SM� � �� (6.2.3.-2.)
e os limites de confiança aproximados são obtidos tomando
o antilogaritmo do valor dado pela equação:
M� � t � sM� (6.2.3.-3.)
onde o número de graus de liberdade associado a t é igual à
soma do número de graus de liberdade para os quadrados
médios do erro nos ensaios individuais.
1
�
�W
�WM
�
�W
�WM
�W
4t2
�
L2
6.2.4. CÁLCULO DA MÉDIA PONDERADA E DOS LIMITES
DE CONFIANÇA BASEADO NAS VARIAÇÕES INTRA- E
INTER-ENSAIOS
Quando os resultados de vários ensaios repetidos são combi-
nados, o valor de χ2 pode ser significativo. Considera-se
então que a variabilidade observada tem duas componentes:
– a variabilidade intra-ensaio s2
M = 1/W,
– a variabilidade interensaios s2
M� �
onde M� é a média não ponderada. A primeira varia de um
ensaio para outro, enquanto quea segunda é comum a todos
os valores M.
Calculamos então, para cada valor M, um factor de ponderação:
W’ �
que substitui W na secção 6.2.3, onde t toma aproximada-
mente o valor 2.
6.3. COMBINAÇÃO NÃO PONDERADA DE RESULTADOS DE
ENSAIOS
Para combinar da maneira mais simples as n’ estimativas de
M obtidas a partir de n’ ensaios, determinamos a sua média
seguida do cálculo do desvio padrão segundo a fórmula:
S2
M� � (6.3.-1.)
e os limites de confiança são dados por
M� � tsM� (6.3.-2.)
onde t possui (n’�1) graus de liberdade. O número n’ de
estimativas de M é normalmente pequeno, e em consequên-
cia o valor de t é relativamente grande.
6.4. EXEMPLO DE ACTIVIDADE MÉDIA PONDERADA E DOS
SEUS LIMITES DE CONFIANÇA
Na tabela 6.4.-I estão representadas 6 estimativas indepen-
dentes da actividade da mesma preparação, com os limites
de confiança para 95 por cento e os números de graus de
liberdade correspondentes. As condições 1, 2 e 3 da secção
6.2 são satisfeitas. Os valores ln(actividade) e os factores de
ponderação são calculados como descrito na secção 6.2.
��M � M��2
��
n’�n’ � 1�
1
��
s2
M � s2
M�
��M � M��2
��
n’�n’ � 1�
5.3. Análises estatísticas
568 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
TABELA 6.4.-I. – Análise de variância ponderada
18367 17755 19002 20 9,8183 3777,7
18003 17415 18610 20 9,7983 3951,5
18064 17319 18838 20 9,8017 2462,5
17832 17253 18429 20 9,7887 4003,0
18635 17959 19339 20 9,8328 3175,6
18269 17722 18834 20 9,8130 4699,5
actividade
estimada
(UI/amp.)
Limite
inferior
(UI/amp.)
Limite 
superior
(UI/amp.)
Graus 
de
liberdade
ln
actividade
M
Ponderação
W
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 568
A homogeneidade das estimativas de actividade é avaliada
por meio da fórmula 6.2.2.-1, que dá um valor de χ2 de 4,42
com 5 graus de liberdade. Este resultado não é significativo
(p � 0,49) e portanto todas as condições são satisfeitas.
O cálculo da actividade média ponderada para a fórmula
6.2.3.-1 dá um valor de 9,8085.
A fórmula 6.2.3.-2 dá um desvio padrão de 0,00673 e os
limites de confiança para 95 por cento aproximados
calculados pela fórmula 6.2.3.-3, onde t possui 120 graus de
liberdade, são de 9,7951 e 9,8218.
Tomando o antilogaritmo destes valores, obtemos uma acti-
vidade de 18 187 UI/ampola com um intervalo de confiança
para 95 por cento entre 17 946 e 18 431 UI/ampola.
7. PARA ALÉM DESTA MONOGRAFIA
É impossível apresentar uma exposição completa de métodos
estatísticos num texto da Farmacopeia, mas os métodos
anteriormente descritos devem ser normalmente suficientes
para a maior parte dos ensaios da farmacopeia. O objectivo
desta secção é a de tentar trazer uma visão mais global sobre
os métodos alternativos ou mais gerais que foram
desenvolvidos. O leitor que estiver interessado é convidado a
aprofundar o assunto explorando a literatura existente. De
qualquer modo, a aplicação de métodos estatísticos mais
especializados deverá ser deixada ao cuidado de especialistas.
7.1 MODELOS LINEARES GERAIS
Os métodos descritos neste anexo podem, globalmente, ser
descritos como modelos lineares gerais (ou «generalistas»
para poder incluir os métodos de probits e de logits). O prin-
cípio geral consiste na definição de uma matriz de estrutura
linear X (ou matriz de planificação) em que cada linha
representa uma observação e cada coluna um efeito linear
(preparação, bloco, coluna, dose). Por exemplo, o ensaio de
quadrado latino do exemplo 5.1.2 poderá ser representado
por uma matriz de 36 linhas e 13 colunas: 1 coluna para
cada preparação, 1 coluna para as 5 doses, 5 colunas para os
blocos com excepção do primeiro e 5 colunas para as linhas
com excepção da primeira. Todas as colunas, com excepção
daquela contendo as doses são preenchidas com o valor 0 ou
1 dependendo da observação corresponder ou não ao efeito
considerado. Um vector Y é construído com as observações
(transformadas). As actividades são estimadas com auxílio da
fórmula (XtX)-1XtY, e é fácil de deduzir a estimativa da
actividade m através do rácio dos efeitos relevantes. O inter-
valo de confiança é calculado pelo teorema de Fieller:
onde g �
e v11, v22, v12 representam respectivamente os multiplicado-
res da variância para o numerador e denominador e o multi-
plicador da covariância. Eles são obtidos directamente a
partir de (XtX)�1 ou indirectamente fazendo:
Var(a1�a2) � Var(a1) � Var(a2) – 2Cov(a1,a2)
e Cov(a1�a2,b) � Cov(a1,b) – Cov(a2,b)
t2s2v22�b2
Uma análise de variância completa implicando a partição de
todas as componentes é ligeiramente mais complexa porque
ela implica uma redefinição de X, com mais colunas, para
verificar as hipóteses de paralelismo e de linearidade, depois
do qual as hipóteses lineares podem ser testadas. Para as
titulações baseadas em respostas qualitativas, os efeitos
lineares (ordenadas na origem aS, aT, etc e declive comum
b) são determinadas maximizando a soma dos tratamentos
nlnΦ(ai � bx) � (n � r)ln(1 � Φ(ai � bx)), onde x é 
ln(dose), Φ representa a forma da distribuição e i ∈ {S, T, ...}.
7.2. HETEROGENEIDADE DA VARIÂNCIA
Nem sempre é possível resolver o problema da heterogenei-
dade da variância pela simples transformação das respostas.
Uma aproximação possível consiste na utilização de uma
regressão linear ponderada. Para obter uma estimativa sem
distorção (bias) aplica-se às observações um factor de ponde-
ração proporcional ao inverso do erro das variâncias. Como
o verdadeiro erro das variâncias nem sempre é conhecido,
pode-se proceder através da determinação iteractiva das
ponderações. No entanto, o cálculo do intervalo de confiança
coloca ainda novos problemas.
7.3. VALORES ABERRANTES E ROBUSTEZ DOS MÉTODOS
O método dos mínimos quadrados descrito neste anexo
apresenta o inconveniente de ser extremamente sensível a
resultados aberrantes. Um resultado nitidamente aberrante
pode falsear totalmente os resultados. Resolve-se esse
problema normalmente, rejeitando esses resultados dos
dados do ensaio. Esta pratica pode conduzir à rejeição
arbitrária de dados, e não é isenta de perigos. Não é fácil
propor regras gerais sobre o modo de decidir se uma obser-
vação específica constitui ou não um resultado aberrante, e
por isso métodos mais robustos foram desenvolvidos, que
são menos sensíveis à presença de resultados aberrantes
porque atribuem menor peso às observações que se afastam
muito do valor presumido. Estes métodos colocam, no
entanto, outros problemas ligados ao cálculo dos intervalos
de confiança ou à definição de uma função de ajustamento
satisfatória.
7.4. ERROS CORRELACIONADOS
A aleatoriedade absoluta nem sempre é realizável ou verda-
deiramente sustentável do ponto de vista prático. É, por isso,
frequente que as doses sucessivas de uma série de diluições
apresentem erros correlacionados e que, em consequência,
os limites de confiança sejam demasiado aproximados.
Foram desenvolvidos métodos que permitem ter em atenção
este efeito de autocorrelação.
7.5. CURVAS DOSE-RESPOSTA NÃO LINEARES
PROLONGADAS
A análise das curvas dose-resposta não lineares prolongadas
coloca um conjunto de problemas estatísticos que é
indispensável ter em consideração, e por causa dos quais é
recomendada a consulta a um especialista. Alguns desses
problemas são apresentados sucintamente a seguir.
1) Um exemplo utilizando a função logística de 4 parâmetros
é descrito anteriormente. No entanto, é igualmente possí-
vel utilizar modelos baseados em função que dêem outras
curvas sigmoides. Foi sugerido o emprego de modelos
comportando parâmetros suplementares de assimetria.
569FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
mL, mU �
	m � � �v1�1��� 2�m�v1�2��� m�2v�22� �� g���v1�1�����
(1 � g)
v2
12
�v22
ts
�
b
gv12
�v22
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 569
2) A heterogeneidade da variância é corrente quando as
respostas se distribuem numa grande intervalo. Se a
análise ignora esta heterogeneidade, a interpretação dos
resultados corre o risco de ser incorrecta e as estimativasdistorcidas (biased). Perante um número de réplicas
limitado o recurso a factores de ponderação proporcio-
nais ao inverso das variâncias de erro tem poucas oportu-
nidades de ser fiável. Uma aproximação satisfatória pode
ser o cálculo de uma função que exprima uma relação
entre a variância e a resposta média.
3) Os procedimentos estatísticos de ajustamento das curvas
podem originar estimativas diferentes dependendo das
hipóteses colocadas quanto à homogeneidade da variân-
cia e ao intervalo das respostas utilizado.
4) Em princípio, a igualdade das respostas máxima e
mínima, obtidas com as diferentes preparações incluídas
numa dosagem, pode ser directamente verificada em cada
ensaio. No entanto, a interpretação dos resultados destes
testes estatísticos pode não ser evidente. Os testes de
linearidade e de paralelismo descritos no método de
análise simplificada (exemplo 5.4.1) incluem indirecta-
mente as verificações de igualdade e de precisão dos
limites inferior e superior.
5) Muitos doseamentos incluem os «controlos» que servem
para identificar as respostas limite (inferior e/ou
superior), mas estes valores podem não ser coincidir com
os limites superior e inferior obtidos pelo ajustamento
estatístico a partir da curva dose-resposta prolongada.
6) O método de análise simplificado descrito no exemplo
5.4.1 fornece intervalos de confiança aproximados.
Outros métodos podem igualmente ser utilizados para o
cálculo, como por exemplo o método baseado na ausência
de ajustamento do modelo completamente especificado.
Para dados de doseamentos típicos, com respostas
cobrindo o conjunto do intervalo para cada preparação
testada, todos os métodos dão resultados similares.
8. TABELAS E MÉTODOS DE CÁLCULO
As tabelas contidas nesta secção apresentam os valores
críticos correspondentes aos números de graus de liberdade
mais usuais. Se determinado valor crítico não figurar, devem
ser consultadas tabelas mais detalhadas. Numerosos progra-
mas informáticos contêm funções estatísticas, e o seu
emprego é preferível ao uso das tabelas aqui apresentadas.
Uma outra aproximação possível consiste na utilização dos
métodos de cálculo descritos a seguir a cada tabela, para
determinar a probabilidade correspondente a uma variável
estatística e a um número de graus de liberdade dados.
8.1 DISTRIBUIÇÃO DE F
Se o valor observado é superior ao valor indicado na tabela,
ele é considerado como significativo (linhas superiores, 
p = 0,05) ou muito significativo (linhas inferiores, p = 0,01).
df1 é o número de graus de liberdade do numerador e df2 o
número de graus de liberdade do denominador.
Método de cálculo: seja F o rácio-F e df1 e df2 como descrito 
acima. Seja pi � � � p � 3,14159265358979... O método
seguinte permite o cálculo do valor p.
5.3. Análises estatísticas
570 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
df1 → 1 2 3 4 5 6 8 10 12 15 20 ∞
df2 ↓
10 4,965 4,103 3,708 3,478 3,326 3,217 3,072 2,978 2,913 2,845 2,774 2,538
10,044 7,559 6,552 5,994 5,636 5,386 5,057 4,849 4,706 4,558 4,405 3,909
12 4,747 3,885 3,490 3,259 3,106 2,996 2,849 2,753 2,687 2,617 2,544 2,296
9,330 6,927 5,953 5,412 5,064 4,821 4,499 4,296 4,155 4,010 3,858 3,361
15 4,543 3,682 3,287 3,056 2,901 2,790 2,641 2,544 2,475 2,403 2,328 2,066
8,683 6,359 5,417 4,893 4,556 4,318 4,004 3,805 3,666 3,522 3,372 2,868
20 4,351 3,493 3,098 2,866 2,711 2,599 2,447 2,348 2,278 2,203 2,124 1,843
8,096 5,849 4,938 4,431 4,103 3,871 3,564 3,368 3,231 3,088 2,938 2,421
25 4,242 3,385 2,991 2,759 2,603 2,490 2,337 2,236 2,165 2,089 2,007 1,711
7,770 5,568 4,675 4,177 3,855 3,627 3,324 3,129 2,993 2,850 2,699 2,169
30 4,171 3,316 2,922 2,690 2,534 2,421 2,266 2,165 2,092 2,015 1,932 1,622
7,562 5,390 4,510 4,018 3,699 3,473 3,173 2,979 2,843 2,700 2,549 2,006
50 4,034 3,183 2,790 2,557 2,400 2,286 2,130 2,026 1,952 1,871 1,784 1,438
7,171 5,057 4,199 3,720 3,408 3,186 2,890 2,698 2,563 2,419 2,265 1,683
∞ 3,841 2,996 2,605 2,372 2,214 2,099 1,938 1,831 1,752 1,666 1,571 1,000
6,635 4,605 3,782 3,319 3,017 2,802 2,511 2,321 2,185 2,039 1,878 1,000
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 570
8.2. DISTRIBUIÇÃO DE T
Se o valor observado é superior ao valor indicado na tabela,
ele é considerado significativo (p � 0,05) ou muito significa-
tivo (p � 0,01).
O valor t (p = 0,05) para um dado número de graus de
liberdade df é obtido pelo método seguinte, que é exacto até
6 casas decimais.
571FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
df p � 0,05 p � 0,01 df p � 0,05 p � 0,01
1 12,706 63,656 22 2,074 2,819
2 4,303 9,925 24 2,064 2,797
3 3,182 5,841 26 2,056 2,779
4 2,776 4,604 28 2,048 2,763
5 2,571 4,032 30 2,042 2,750
6 2,447 3,707 35 2,030 2,724
7 2,365 3,499 40 2,021 2,704
8 2,306 3,355 45 2,014 2,690
9 2,262 3,250 50 2,009 2,678
10 2,228 3,169 60 2,000 2,660
12 2,179 3,055 70 1,994 2,648
14 2,145 2,977 80 1,990 2,639
16 2,120 2,921 90 1,987 2,632
18 2,101 2,878 100 1,984 2,626
20 2,086 2,845 ∞ 1,960 2,576
Métodos de cálculo: o valor p para determinado t com df
graus de liberdade é obtido pelos métodos descritos na
secção 8.1 com F = t2, df1 = 1 e df2 = df.
t = 1.959964 1
2.37228 / df +
2.82202 / df ^ 2 +
2.56449 / df ^ 3 +
1.51956 / df ^ 4 +
1.02579 / df ^ 5 +
0.44210 / df ^ 7
SSee ddff11 ffoorr ppaarr SSee ddff11 ffoorr iimmppaarr ee ddff22 ppaarr SSee ddff11 ee ddff22 ffoorreemm íímmppaarreess
x = df1 / (df1 + df2/F) x = df2 / (df2 + df1 * F) x = atn (sqr (df1 * F / df2))
s = 1 s = 1 cs = cos (x)
t = 1 t = 1 sn = sin (x)
for i = 2 to (df1 - 2) step 2 for i = 2 to (df2 - 2) step 2 x = x /2
t = t*x* (df2 + i - 2) /i t = t*x* (df1 + i - 2) /i s = 0
s = s + t s = s + t t = sn * cs / 2
next i next i v = 0
p = s*(1 - x) ^ (df2 /2) p = 1 - s* (1 - x) ^ (df1 /2) w = 1
for i = 2 to (df2 - 1) step 2
s =s + t
t = t * i /(i + 1) * cs * cs
next i
for i = 1 to (df1 - 2) step 2
v = v + w
w = w*(df2 + i) / (i + 2) sn * sn
next i
p = 1 + (t * df2 * v-x-s) / pi * 4
8.3. DISTRIBUIÇÃO DE � 2
df p � 0,05 p � 0,01 df p � 0,05 p � 0,01
1 3,841 6,635 11 19,675 24,725
2 5,991 9,210 12 21,026 26,217
3 7,815 11,345 13 22,362 27,688
4 9,488 13,277 14 23,685 29,141
5 11,070 15,086 15 24,996 30,578
6 12,592 16,812 16 26,296 32,000
7 14,067 18,475 20 31,410 37,566
8 15,507 20,090 25 37,652 44,314
9 16,919 21,666 30 43,773 50,892
10 18,307 23,209 40 55,758 63,691
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 571
Se um valor observado é superior ao valor indicado na
tabela, ele é considerado significativo (p = 0,05) ou muito
significativo (p = 0,01).
Método de cálculo: seja x2 o valor da variável χ2 e df tal
como descrito acima. O método seguinte permite calcular o
valor de p.
x é negativo, pode-se utilizar a fórmula indicada acima. Este
método assume que o computador pode apresentar cerca de
15 casas decimais. Se o número de dígitos for inferior ou
superior a 15, este método necessita de alguns ajustamentos
simples.
5.3. Análises estatísticas
572 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
SSee éé ddff ffoorr ppaarr SSee ddff éé íímmppaarr
s = 0 : x = sqr (x2) : 
t = exp (-x2 / 2) s = 0
for i = 2 to df step 2 t = x* exp (- x2/2) / sqr (pi / 2)
s = s + t for i = 3 to df step 2
t = t* x2 / i s = s + t
next i t = t* x2 / i
p = 1 - s next i
p = 1 - s - 2* phi (x)
Neste método phi é a distribuição normal reduzida cumulativa
Φ (ver secção 8.4).
8.4. DISTRIBUIÇÃO DE ? (DISTRIBUIÇÃO NORMAL
REDUZIDA CUMULATIVA)
x ΦΦ x ΦΦ x ΦΦ
0,00 0,500 1,00 0,841 2,00 0,977
0,05 0,520 1,05 0,853 2,05 0,980
0,10 0,540 1,10 0,864 2,10 0,982
0,15 0,560 1,15 0,875 2,15 0,984
0,20 0,579 1,20 0,885 2,20 0,986
0,25 0,599 1,25 0,894 2,25 0,988
0,30 0,618 1,30 0,903 2,30 0,989
0,35 0,637 1,35 0,911 2,35 0,991
0,40 0,655 1,40 0,919 2,40 0,992
0,45 0,674 1,45 0,926 2,45 0,993
0,50 0,691 1,50 0,933 2,50 0,994
0,55 0,709 1,55 0,939 2,55 0,995
0,60 0,726 1,60 0,945 2,60 0,995
0,65 0,742 1,65 0,951 2,65 0,996
0,70 0,758 1,700,955 2,70 0,997
0,75 0,773 1,75 0,960 2,75 0,997
0,80 0,788 1,80 0,964 2,80 0,997
0,85 0,802 1,85 0,968 2,85 0,998
0,90 0,816 1,90 0,971 2,90 0,998
0,95 0,829 1,95 0,974 2,95 0,998
Para os valores de x negativos, o valor de Φ obtém-se a partir
da tabela tomando 1-Φ(-x).
Método de cálculo: Seja x o valor da variável x. O método
seguinte permite obter o valor de Φ correspondente se 0 �
x � 8,15. Se x � 8,15 o valor de Φ pode ser igualado a 1. Se
s = 0
t = x 
i = 1
repeat
s = s + t
i = i + 2
t = t*x*x/i
until tgerais 
1
�
1 � g
(5) Esta sub secção é aqui introduzida para facilidade de consulta,
pelo leitor, da bibliografia em inglês e compreensão da terminologia
adoptada nesta área pela Comissão da Farmacopeia Portuguesa, a
partir da 6ª edição. Em estatística está muito consagrada a termino-
logia em inglês, e foi nossa intenção proceder à adequação à termi-
nologia portuguesa, pelo que apresenta aqui um glossário de termos
com a correspondência à versão inglesa da Farmacopeia Europeia.
Símbolo Definição
Z A primeira derivada de Φ
α Assímptota superior da curva ln(dose)-resposta na
análise de quatro parâmetros 
β Factor de declive da curva ln(dose)-resposta na
análise de quatro parâmetros 
γ O ln(dose) correspondente a 50 por cento de resposta
no modelo de quatro parâmetros 
δ Assímptota inferior da curva ln(dose)-resposta na
análise de quatro parâmetros 
π 3,141592653589793238... 
Φ Distribuição normal reduzida cumulativa (tabela 8.4) 
χ2 Estatística chi-quadrado (tabela 8.3) 
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 574
575FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.3. Análises estatísticas
5.
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Finney, D. J. (1978). Statistical method in biological assay,
3a Ed. Griffin, London.
Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and
Practice of Statistics in Biological Research, 2ª Ed. W. H.
Freeman & Co, New York.
Peace, K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug
Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.
Bowerman, B. L. & O’Connell (1990). Linear Statistical
Models an Applied Approach, 2ª Ed. PWS-KENT Publishing
Company, Boston.
Govindarajulu, Z. (2001). Statistical Techniques in Bioassay,
2ª Ed, Karger, New York.
10. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
Esta secção contém uma lista de referências bibliográficas
de leitura recomendada para um estudo mais aprofundado
do assunto.
Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3a Ed. Cambridge
University Press, Cambridge.
Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized
linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series
A 135, 370-384.
DeLean, A., Munson, P. J. e Rodbard, D. (1978).
Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves:
Application to bioassay, radioligand assay and physiological
dose-response curves, Am J. Physiol. 235 (2): E97-E102.
16. Ponto 5.3(541-576) 11/18/05 12:36 PM Page 575
577FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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5.4. SOLVENTES
RESIDUAIS
1. Introdução .................................................................. 579
2. Âmbito da presente nota explicativa .......................... 580
3. Princípios gerais.......................................................... 580
3.1. Classificação dos solventes residuais em 
função da avaliação do risco .............................. 580
3.2. Métodos que permitem estabelecer os limites 
de exposição ........................................................ 580
3.3. Opções que permitem descrever os limites dos
solventes da classe 2 .......................................... 580
3.4. Procedimentos analíticos .................................. 581
3.5. Declaração de conformidade dos limites em
solventes residuais .............................................. 581
4. Limites de solventes residuais .................................... 581
4.1. Solventes a evitar................................................ 581
4.2. Solventes de utilização limitada ........................ 582
4.3. Solventes com baixo potencial tóxico................ 582
4.4. Solventes para os quais não foram encontrados
dados toxicológicos adequados .......................... 582
Glossário
Anexo 1: lista de solventes incluídos nesta nota
explicativa .................................................... 583
Anexo 2: informações complementares...................... 585
A2.1: regulamentação ambiental para os 
solventes orgânicos voláteis .............. 585
A2.2: solventes residuais nos produtos
farmacêuticos .................................... 585
Anexo 3: métodos relativos ao estabelecimento 
de limites de exposição ................................ 585
17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 577
5.4. SOLVENTES RESIDUAIS
LIMITAÇÃO DOS TEORES 
DE SOLVENTES RESIDUAIS 
NAS SUBSTÂNCIAS ACTIVAS, 
NOS EXCIPIENTES E NOS
MEDICAMENTOS
A Conferência Internacional para a Harmonização (ICH)
(International Conference on Harmonization of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human
Use) adoptou um documento intitulado «Impurezas: Nota
explicativa relativa aos solventes residuais», que prescreve os
limites do teor de solventes que podem permanecer nas
substâncias activas, nos excipientes e nos medicamentos após
fabrico. Esta nota explicativa, cujo texto é reproduzido a
seguir, exclui os produtos já comercializados. Contudo, a
Farmacopeia Portuguesa aplica às substâncias activas, aos
excipientes e aos medicamentos existentes os princípios
enunciados na nota explicativa, tenham estes sido objecto, ou
não, de uma monografia na Farmacopeia. É conveniente
pesquisar, no conjunto das substâncias e produtos, eventuais
vestígios de solventes que tenham subsistido após fabrico.
Quando os limites a aplicar estão conformes aos a seguir
fornecidos, os ensaios de solventes residuais não são, regra
geral, mencionados nas monografias específicas, uma vez que
os solventes utilizados podem diferir de fabricante para
fabricante e os requisitos deste capítulo geral são postos em
prática pela aplicação da monografia geral «Substâncias para
uso farmacêutico». Por consequência, a Autoridade compe-
tente deve estar informada dos solventes utilizados durante o
processo de fabrico. Estas informações devem figurar
igualmente no processo apresentado para pedido de obtenção
de um certificado de conformidade às monografias da
Farmacopeia Portuguesa e são mencionadas no certificado.
Quando se utilizam solventes da classe 3, a substância pode
ser submetida a um ensaio de perda por secagem ou pode ser
efectuada uma determinação específica. Se um solvente da
classe 3 apresenta um limite justificado e autorizado superior
a 0,5 por cento, é necessário proceder à determinação
específica desse solvente. 
Em caso de utilização de solventes residuais das classes 1 e 2
(ou solventes da classe 3 cujo teor seja superior a 0,5 por
cento), deve ser aplicada, sempre que possível, a metodologia
descrita no método geral (2.4.24.). Nos restantes casos, deve
recorrer-se a um método validado apropriado.
Quando é efectuada a determinação quantitativa de um
solvente residual, esta é tida em conta para o cálculo do teor
da substância, a não ser que também se efectue um ensaio de
perda por secagem.
IMPUREZAS: NOTA EXPLICATIVA 
RELATIVA AOS SOLVENTES RESIDUAIS
(CSP/ICH/283/95)
1. INTRODUÇÃO
2. ÂMBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA
3. PRINCÍPIOS GERAIS
3.1. Classificação dos solventes residuais em função da avaliação
do risco
3.2. Métodos que permitem estabelecer os limites de exposição
3.3. Opções que permitem descrever os limites dos solventes da
classe 2
3.4. Procedimentos analíticos
3.5. Declaração de conformidade dos limites em solventes residuais
4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS
4.1. Solventes a evitar
4.2. Solventes de utilização limitada
4.3. Solventes com baixo potencial tóxico
4.4. Solventes para os quais não foram encontrados dados toxicoló-
gicos adequados
GLOSSÁRIO
ANEXO 1. Lista dos solventes incluídos nesta nota explicativa
ANEXO 2. Informações complementares
A2.1. Regulamentação ambiental para os solventes
orgânicos voláteis
A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacêuticos
ANEXO 3. Métodos relativos ao estabelecimento de limites de exposição
1. INTRODUÇÃO
A presente nota explicativa tem por objectivo recomendar as
quantidades de solventes residuais admissíveis nos produtos de
utilização farmacêutica por forma a excluir qualquer risco para
a saúde do paciente. Preconiza a utilização de solventes de menor 
toxicidade e descreve, para alguns solventes, as taxas residuais
consideradas aceitáveis sob um pontode vista toxicológico.
Os solventes residuais nos produtos de utilização farmacêutica
são aqui definidos como produtos químicos orgânicos voláteis
utilizados ou produzidos no fabrico de substâncias activas e
excipientes ou entrando na preparação de medicamentos. Os
processos de fabrico correntes não permitem a eliminação
completa dos solventes. A escolha apropriada do solvente para
a síntese da substância activa pode melhorar o rendimento ou
determinar características como a forma cristalina, a pureza e
a solubilidade. Assim, o solvente pode, por vezes, constituir
um elemento crítico do processo de síntese. A presente nota
explicativa não se refere aos solventes exclusivamente utili-
zados como excipientes nem aos solvatos. É, contudo, conve-
niente avaliar e justificar o teor em solventes de tais produtos.
Sabendo que os solventes residuais não apresentam qualquer
vantagem terapêutica, é conveniente eliminá-los, sempre que
possível, para satisfazer às exigências da qualidade (especifica-
ções, Boas Práticas de Fabrico de Medicamentos). Os medica-
mentos não devem apresentar teores de solventes residuais
superiores aos previstos nos dados de segurança.
Os solventes da classe 1 (quadro 1), pela elevada toxicidade
que possuem, não devem ser utilizados na fabrico de subs-
tâncias activas, de excipientes, ou de medicamentos, a não ser
que se justifique claramente após uma avaliação risco/benefício.
Os solventes da classe 2 (quadro 2), cuja toxicidade é menor,
devem ter utilização limitada, tendo em vista a protecção dos
pacientes de reacções adversas. Idealmente, devem ser utili-
zados sempre que possível os solventes da classe 3 (quadro 3),
menos tóxicos. A lista completa dos solventes figura no Anexo
1 da presente nota explicativa.
579FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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5.4. Solventes residuais
17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 579
As listas apresentadas neste documento não são exaustivas,
podendo outros solventes em uso actualmente vir a ser acres-
centados às diferentes listas. Os limites recomendados para os
solventes das classes 1 e 2, ou a classificação dos solventes,
podem variar em função do aparecimento de novos dados de
segurança. Os dados de segurança que permitem suportar o
pedido de colocação no mercado de um novo medicamento,
contendo um novo solvente, podem-se inspirar nas informa-
ções apresentadas neste documento ou nas Guideline ICH-
-Q3A («Impurezas nas novas substâncias activas») Guideline
ICH-Q3B («Impurezas nos novos medicamentos»), ou, ainda,
no conjunto dos três documentos.
2. ÂMBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA
Esta nota faz o inventário dos solventes residuais presentes
nas substâncias activas, nos excipientes e nos medicamentos.
Por consequência, deve ser realizado um ensaio dos Solventes
residuais sempre que os processos de fabrico ou de purifica-
ção decorrem na presença de tais solventes. A pesquisa
incidirá apenas sobre os solventes utilizados ou produzidos
durante o processo de fabrico ou na purificação das substân-
cias activas, dos excipientes ou dos medicamentos. Mesmo
que os fabricantes possam escolher efectuar a determinação
sobre o medicamento, é possível utilizar um método cumula-
tivo que permite calcular os teores de solventes residuais no
medicamento a partir dos teores existentes nos diferentes
elementos constitutivos. Se este cálculo der um resultado
inferior ou igual ao nível de solvente indicado nesta nota
explicativa, a determinação dos solventes residuais no
medicamento não é exigida. Pelo contrário, se o teor de
solventes residuais for superior ao nível recomendado, o
ensaio deve ser efectuado no medicamento para assegurar que
o teor de solventes residuais foi conduzido a valores
admissíveis durante a formulação. Os medicamentos devem
igualmente ser submetidos a este ensaio sempre que um
solvente for utilizado durante o fabrico.
A presente nota explicativa não se aplica às novas substâncias
activas, excipientes ou medicamentos potenciais utilizados
nos estádios de desenvolvimento de pesquisa clínica, nem aos
medicamentos já comercializados.
A presente nota explicativa aplica-se a todas as formas farma-
cêuticas e a todas as vias de administração. Teores elevados de
solventes residuais são admissíveis em certos casos, por
exemplo em tratamentos de curta duração (30 dias ou menos)
ou em aplicações tópicas. Estes teores devem ser objecto de
uma justificação caso a caso.
Para complementar as informações relativas aos solventes
residuais ver o anexo 2.
3. PRINCÍPIOS GERAIS
3.1. CLASSIFICAÇÃO DOS SOLVENTES RESIDUAIS EM
FUNÇÃO DA AVALIAÇÃO DO RISCO
O International Program on Chemical Safety (IPCS) utiliza a
expressão «dose diária tolerável» (DDT) (em inglês TDI =
tolerable daily intake) para descrever os limites de exposição
aos produtos químicos tóxicos. Para este mesmo conceito, a
OMS e outras autoridades ou institutos (nacionais ou
internacionais) de saúde pública utilizam a expressão «dose
diária admissível» (DDA) (em inglês ADI = acceptable daily
intake). A «exposição diária admissível» (EDA) (em inglês
PDE = Permitted daily intake) é a nova expressão consagrada
para o presente documento, a qual permite evitar qualquer
confusão entre os diferentes valores de DDA para uma mesma
substância.
Os solventes residuais referidos neste documento estão
listados no anexo 1 por nomes e estrutura, e foram avaliados
em função do risco que apresentam para a saúde humana.
Subdividem-se em três classes:
Classe 1: Solventes a evitar.
Carcinogénios humanos conhecidos ou fortemente suspeitos,
perigosos para o ambiente.
Classe 2: Solventes cuja utilização está submetida a
limitações.
Carcinogénios animais não genotóxicos ou
eventuais agentes causadores de outros efeitos
tóxicos irreversíveis como a neurotoxicidade ou a
teratogenicidade.
Solventes suspeitos de estarem na origem de outros
efeitos tóxicos importantes mas reversíveis.
Classe 3: Solventes com baixo potencial tóxico.
Solventes com baixo potencial tóxico para o homem
não sendo exigido qualquer limite em relação à
exposição. Os solventes da classe 3 apresentam
valores de EDA iguais ou superiores a 50 mg.
3.2. MÉTODOS QUE PERMITEM ESTABELECER OS
LIMITES DE EXPOSIÇÃO
O método utilizado para estabelecer os valores de EDA aos
solventes residuais está apresentado no Anexo 3. Os resumos
dos dados de toxicidade que serviram para estabelecer estes
valores estão publicados em Pharmeuropa, Vol. 9, nº 1, suple-
mento do mês de Abril de 1997.
3.3. OPÇÕES QUE PERMITEM DESCREVER OS LIMITES
DOS SOLVENTES DA CLASSE 2
Duas opções permitem fixar os limites que se aplicam aos
solventes da classe 2.
Opção 1: Podem ser utilizados os limites de concentração
(em ppm) indicados no quadro 2. Estes limites foram deter-
minados com ajuda da expressão (1) a seguir apresentada e 
tomam como referência uma dose de 10 g administrada quoti-
dianamente.
Concentração (ppm) = (1)
Neste caso o valor da EDA é indicado em mg/dia e a dose em
g/dia.
Estes limites são considerados aceitáveis para todas as
substâncias, excipientes ou medicamentos. Em consequência,
esta opção pode ser aplicada quando a dose diária é
desconhecida ou variável. Se o conjunto dos excipientes e das
substâncias activas de uma formulação satisfizerem aos
limites da opção 1 estes componentes podem ser utilizados
em quaisquer proporções. Não é necessário qualquer outro
cálculo desde que a dose diária não ultrapasse 10 g. Os
medicamentos administrados em doses superiores a 10 g por
dia devem ser considerados na opção 2.
Opção 2: Não se considera necessário que cada componente
do medicamento satisfaça aos limites indicados na opção 1. O
valor da EDA, expresso em mg/dia, tal como se mostra no
quadro 2, pode ser utilizado com a dose diária máxima conhe-
cida e a equação (1), atrás apresentada, pode ser usada para
determinar a concentração de solvente residual autorizada
num medicamento. Tais limites são considerados aceitáveis se
ficar demonstrado que a presença de solvente residual foi
1000 � EDA
��
dose
5.4. Solventesresiduais
580 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 580
reduzida ao mínimo possível. Os limites devem ser realistas
em relação à precisão analítica, à capabilidade no decurso do
fabrico e a uma variação razoável no processo de fabrico. Em
suma, os limites devem reflectir os padrões de fabrico actuais.
É possível utilizar a opção 2 adicionando as quantidades de sol-
ventes residuais presentes em cada um dos componentes do
medicamento. A soma das quantidades de solventes admissíveis
por dia deve ser inferior à indicada pelo valor de EDA.
A título de exemplo, consideremos a aplicação das opções 1 e 2
ao acetonitrilo contido num medicamento. A exposição diária
admissível ao acetonitrilo é de 4,1 mg/dia, por consequência o
limite preconizado pela opção 1 é de 410 ppm. A quantidade
máxima de medicamento administrada por dia é de 5,0 g e
este medicamento contém dois excipientes. A composição do
medicamento e o cálculo do teor máximo em acetonitrilo
residual estão apresentados no quadro seguinte:
Componente Quantidade na Teor em Exposição
Formulação acetonitrilo diária
Substância activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mg
Excipiente 1 0,9 g 400 ppm 0,36 mg
Excipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mg
Medicamento 5,0 g 728 ppm 3,64 mg
O excipiente 1 satisfaz ao limite imposto pela opção 1, mas a
substância activa, o excipiente 2 e o medicamento não
correspondem às exigências deste limite. No entanto, o
medicamento satisfaz ao limite da opção 2 (4,1 mg por dia) e,
consequentemente, às recomendações desta nota explicativa.
Consideremos um segundo exemplo de acetonitrilo residual.
A quantidade máxima de um medicamento administrada diaria-
mente é de 5,0 g e este medicamento contém dois excipientes.
A composição do medicamento e o cálculo do teor de
acetonitrilo residual estão indicadas no quadro seguinte:
Componente Quantidade na Teor em Exposição
Formulação acetonitrilo diária
Substância activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mg
Excipiente 1 0,9 g 2000 ppm 1,80 mg
Excipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mg
Medicamento 5,0 g 1016 ppm 5,08 mg
Neste caso, acontece que pela soma dos teores de cada consti-
tuinte, o medicamento não respeita nem o limite da opção 1,
nem o da opção 2. O fabricante pode então analisar o medica-
mento com vista a saber se o processo de fabrico permitiu redu-
zir o teor de acetonitrilo. Se o teor de acetonitrilo não foi redu-
zido para o limite autorizado durante a formulação, o fabricante
deve tomar outras medidas para reduzir a quantidade de aceto-
nitrilo no medicamento. Se todos estes procedimentos não
permitirem a redução do teor de solvente residual, o fabricante
pode, a título excepcional, relatar as medidas tomadas para
reduzir o teor de solvente para o limite preconizado e apresen-
tar uma análise avaliadora dos riscos e dos benefícios que justi-
fiquem a utilização do medicamento com um teor de solvente
residual superior ao limite autorizado.
3.4. PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS
Os teores de solventes residuais são habitualmente determina-
dos por técnicas cromatográficas, como, por exemplo, a
cromatografia em fase gasosa. Para determinar os teores de
solventes residuais é conveniente aplicar, na medida do possível,
os procedimentos harmonizados descritos nas farmacopeias.
Em caso de impossibilidade, os fabricantes podem escolher um
procedimento analítico validado e apropriado a uma aplicação
particular. Em presença de solventes exclusivamente da classe 
3, pode utilizar-se um método não específico, como por exemplo
a perda por secagem. A validação dos métodos de determinação 
dos níveis de solventes residuais deve obedecer às normas ICH
seguintes: Text of Analytical Procedures e Extension on
Validation of Analytical Procedures.
3.5. DECLARAÇÃO DE CONFORMIDADE DOS LIMITES EM
SOLVENTES RESIDUAIS
A fim de respeitar os critérios descritos nesta nota explicativa,
os fabricantes de produtos farmacêuticos necessitam de infor-
mações sobre os teores de solventes residuais contidos nos
excipientes e substâncias activas. As seguintes afirmações são
dadas como exemplos aceitáveis da informação que deve ser
facultada pelos fornecedores de excipientes ou de substâncias
activas aos fabricantes de produtos farmacêuticos. Conforme o
caso, o fornecedor deve escolher uma das seguintes:
– provavelmente só estão presentes solventes da classe 3. A
perda por secagem é inferior a 0,5 por cento,
– provavelmente só estão presentes os solventes X, Y, … da
classe 2. Todos se encontram abaixo dos limites preconi-
zados na opção 1. (Neste caso o fornecedor deve indicar o
nome dos solventes da classe 2 representados por X, Y, …),
– provavelmente só estão presentes os solventes X, Y, … da
classe 2 e solventes da classe 3. Os teores de solventes resi-
duais da classe 2 encontram-se abaixo dos limites preconi-
zados na opção 1 e os teores dos solventes residuais da
classe 3 são inferiores a 0,5 por cento.
Se solventes da classe 1 estiverem provavelmente presentes,
devem ser identificados e quantificados. «Provavelmente
presente» refere-se simultaneamente ao solvente utilizado no
passo final do fabrico e aos solventes que são usados no decurso
das etapas precedentes do fabrico e que não são removidos
sistematicamente recorrendo a um processo validado.
Se solventes da classe 2 ou classe 3 estiverem presentes em
quantidade, respectivamente, superior ao limite da opção 1 ou 
superior a 0,5 por cento, devem ser identificados e quantificados.
4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS
4.1. SOLVENTES A EVITAR
Os solventes da classe 1 não devem ser utilizados no fabrico de
substâncias activas, excipientes e medicamentos devido à sua
toxicidade inaceitável ou ao seu efeito nocivo no ambiente.
Contudo, se a utilização destes solventes for incontornável
para a produção de um medicamento que corresponda a um
avanço terapêutico importante, os seus teores não devem
ultrapassar os valores apresentados no quadro 1, salvo excep-
ção justificada.
O 1,1,1-tricloroetano está incluído no quadro 1 devido ao seu
efeito nocivo sobre o ambiente. O limite assinalado de 1500 ppm
está fundamentado na avaliação dos dados de segurança.
QUADRO 1 – Solventes da classe 1 em produtos farmacêuticos
(solventes que devem ser evitados)
Solvente
Concentração
Nocividadelimite (ppm)
Benzeno 2 Carcinogénico
Tetracloreto de carbono 4 Tóxico e nocivo 
para o ambiente
1,2-Dicloroetano 5 Tóxico
1,1-Dicloroetano 8 Tóxico
1,1,1-Tricloroetano 1500 Nocivo para o ambiente
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4.2. SOLVENTES DE UTILIZAÇÃO LIMITADA
Os solventes apresentados no quadro 2 devem estar limitados
nos produtos farmacêuticos, devido à sua toxicidade intrínseca.
Os valores das EDA são apresentados com a aproximação de 
0,1 mg/dia e as concentrações são apresentadas com a aproxi-
mação de 10 ppm. Os valores apresentados não reflectem neces-
sariamente a precisão analítica da determinação. A precisão deve
ser calculada e fazer parte da validação do método.
QUADRO 2 – Solventes da classe 2 em produtos farmacêuticos
Solvente EDA (mg/dia) Concentração limite (ppm)
Acetonitrilo 4,1 410
Ciclo-hexano 38,8 3880
Clorobenzeno 3,6 360
Clorofórmio 0,6 60
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870
Diclorometano 6,0 600
N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090
N,N-Dimetilformamida 8,8 880
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
1,4-Dioxano 3,8 380
Etilenoglicol 6,2 620
2-Etoxietanol 1,6 160
Formamida 2,2 220
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000
Metilbutilcetona 0,5 50
Metilciclo-hexano 11,8 1180
N-Metilpirrolidona 5,3 530
2-Metoxietanol 0,5 50
Nitrometano 0,5 50
Piridina 2,0 200
Sulfolano 1,6 160
Tetra-hidrofurano 7,2 720
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890
1,1,2-Tricloroetano 0,8 80
Xileno* 21,7 2170
* Habitualmente 60 por cento de m-xileno, 14 por cento de p-xileno, 9 por
cento de o-xileno com 17 por cento de etilbenzeno.
4.3. SOLVENTES COM BAIXO POTENCIAL TÓXICO
Os solventes da classe 3 (apresentados no quadro 3) podem
ser considerados como os de menor toxicidadee de menor
risco para a saúde humana. A classe 3 não inclui qualquer
solvente que se saiba ser nocivo para a saúde humana nos
limites autorizados para os produtos farmacêuticos. Contudo,
não existem estudos de toxicidade a longo prazo nem estudos
de carcinogenicidade para muitos dos solventes da classe 3.
Os dados disponíveis indicam que eles apresentam baixa
toxicidade em estudos de toxicidade aguda ou de curta
duração e resultados negativos nos estudos de genotoxicidade.
O limite admissível, sem justificação particular, para os
solventes desta classe é inferior ou igual a 50 mg/dia
(correspondendo a 5000 ppm ou a 0,5 por cento de acordo
com a opção 1). Quantidades superiores à referida podem
também ser aceites desde que sejam realistas em relação à
capabilidade de fabrico e às boas práticas de fabrico.
QUADRO 3 – Solventes da classe 3 que devem ser limitados 
pelas BPF ou outros requisitos de qualidade
Acetato de butilo Etanol
Acetato de etilo Éter etílico
Acetato de isobutilo terc-butilmetiléter
QUADRO 3 – Solventes da classe 3 que devem ser limitados 
pelas BPF ou outros requisitos de qualidade (continuação)
Acetato de isopropilo Etilmetilcetona
Acetato de metilo Formato de etilo
Acetato de propilo Heptano
Acetona Isobutilmetilcetona
Ácido acético 3-Metil-l-butanol
Ácido fórmico 2-Metil-l-propanol
Anisol Pentano
1-Butanol 1-Pentanol
2-Butanol 1-Propanol
Cumeno 2-Propanol
Dimetilsulfóxido
4.4. SOLVENTES PARA OS QUAIS NÃO FORAM ENCON-
TRADOS DADOS TOXICOLÓGICOS ADEQUADOS
Os solventes seguintes (quadro 4) podem também ter interesse
para os fabricantes de excipientes, substâncias activas ou de
medicamentos. Contudo, não foram ainda encontrados dados
toxicológicos adequados que permitam determinar uma EDA.
Os fabricantes devem fornecer uma justificação relativa aos
níveis residuais destes solventes nos produtos farmacêuticos.
QUADRO 4 – Solventes para os quais não foram encontrados dados
toxicológicos adequados
Ácido tricloracético Éter de petróleo
Ácido trifluoracético Éter isopropílico
1,1-Dietoxipropano Isoctano
1,1-Dimetoxietano Isopropilmetilcetona
2,2-Dimetoxipropano Metiltetra-hidrofurano
GLOSSÁRIO
Carcinogénios genotóxicos: Carcinogénios que produzem
cancro por afectarem genes ou cromossomas.
LOEL: Abreviatura de «lowest-observed effect level».
Lowest-observed effect level: A menor dose de substância que,
num estudo ou grupo de estudos, produz aumentos biologica-
mente significativos na frequência ou gravidade de qualquer
efeito nos animais ou humanos expostos.
Factor de modificação: Um factor determinado por um
toxicologista profissional e aplicado aos resultados de um
bioensaio para obter a relação com os dados humanos nas
condições de segurança satisfatórias.
Neurotoxicidade: A capacidade de uma substância para
provocar efeitos indesejáveis sobre o sistema nervoso.
NOEL: Abreviação de «no-observed-effect level»
No-observed-effect level: A dose mais elevada de substância
para a qual não se verificam aumentos biologicamente
significativos da frequência ou da gravidade de qualquer efeito
no homem ou nos animais expostos.
EDA: Abreviatura de exposição diária admissível (em inglês
PDE = «permitted daily exposure»).
Exposição diária admissível: a dose máxima diária de solvente
residual admitida num produto farmacêutico.
Toxicidade reversível: Ocorrência de efeitos nocivos causados
por uma substância e que desaparecem uma vez que cesse a
exposição à substância.
Carcinogénio humano fortemente suspeito: Uma substância
5.4. Solventes residuais
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5. Textos gerais
17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 582
para a qual as provas epidemiológicas de carcinogénese não
puderam ser estabelecidas, ainda que existam dados genotóxicos
positivos e provas evidentes de carcinogénese em roedores.
Teratogenicidade: Aparecimento de malformações estruturais
no decurso do desenvolvimento fetal quando se administra
uma substância durante a gravidez.
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5.4. Solventes residuais
5.
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ANEXO 1. LISTA DOS SOLVENTES INCLUÍDOS NESTA NOTA EXPLICATIVA
Solvente Outras Designações Fórmula Química Classe
acetato de etilo éster etílico do ácido acético CH3COOCH2 CH3 Classe 3
acetona 2-propanona CH3COCH3 Classe 3
acetonitrilo CH3CN Classe 2
ácido acético ácido etanóico CH3COOH Classe 3
ácido fórmico HCOOH Classe 3
acetato de butilo éster butílico do ácido acético CH3COO(CH2)3 CH3 Classe 3
acetato de isobutilo éster isobutílico do ácido acético CH3COOCH2CH(CH3)2 Classe 3
acetato de isopropilo éster isopropílico do ácido acético CH3COOCH(CH3)2 Classe 3
acetato de metilo éster metílico do ácido acético CH3COOCH3 Classe 3
acetato de propilo éster propílico do ácido acético CH3COOCH2CH2CH3 Classe 3
anisol metoxibenzeno Classe 3
benzeno benzol Classe 1
1-butanol álcool n-butílico ou butan-1-ol CH3(CH2)3OH Classe 3
2-butanol álcool sec-butílico ou butan-2-ol CH3CH2CH(OH)CH3 Classe 3
terc-butilmetiléter 2-metoxi-2-metilpropano (CH3)3COCH3 Classe 3
ciclo-hexano hexametileno Classe 2
clorobenzeno Classe 2
clorofórmio triclorometano CHCI3 Classe 2
cumeno isopropilbenzeno 
(1-metiletil)benzeno Classe 3
1,2-dicloroetano sim-dicloroetano, dicloreto de etileno, CH2CICH2Cl Classe 1
cloreto de etileno
1,1-dicloroeteno 1,1-dicloroetileno, cloreto de vinilideno H2C = CCl2 Classe 1
1,2-dicloroeteno 1,2-dicloroetileno, dicloreto de acetileno CIHC = CHCl Classe 2
Diclorometano cloreto de metileno CH2Cl2 Classe 2
N,N-dimetilacetamida DMA CH3CON(CH3)2 Classe 2
N,N-dimetilformamida DMF HCON(CH3)2 Classe 2
dimetilsulfóxido Metilsulfinilmetano, sulfóxido de metilo (CH3)2SO Classe 3
DMSO
1,2-dimetoxietano Éter dimetílico do etilenoglicol H3COCH2CH2OCH3 Classe 2
monoglima
dimetilcelossolve
1,4-dioxano p-dioxano
1,4-dioxano Classe 2
etanol álcool etílico CH3CH2OH Classe 3
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5.4. Solventes residuais
584 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
ANEXO 1. LISTA DOS SOLVENTES INCLUÍDOS NESTA NOTA EXPLICATIVA (continuação)
Solvente Outras Designações Fórmula Química Classe
éter etílico éter dietílico ou etoxietano ou 1,1’-oxibisetano CH3CH2OCH2CH3 Classe 3
etilenoglicol 1,2-di-hidroxietano ou 1,2-etanodiol HOCH2CH2OH Classe 2
2-etoxietanol celossolve CH3CH2OCH2CH2OH Classe 2
formamida metanamida HCONH2 Classe 2
formato de etilo éster etílico do ácido fórmico HCOOCH2CH3 Classe 3
heptano n-heptano CH3(CH2)5CH3 Classe 3
hexano n-hexano CH3(CH2)4CH3 Classe 3
metanol álcool metílico CH3OH Classe 2
3-metil-1-butanol álcool isoamílico (CH3)2CHCH2CH2OH Classe 3
álcool isopentílico
3-metilbutan-1-ol
metilbutilcetona 2-hexanona CH3(CH2)3COCH3 Classe 2
hexan-2-ona
metilciclo-hexano ciclo-bexilmetano Classe 2
metiletilcetona 2-butanona CH3CH2COCH3 Classe 3
MEK
butan-2-ona
metilisobutilcetona 4-metilpentan-2-ona CH3COCH2CH(CH3)2
4-metil-2-pentanona
MIBK
2-metil-1-propanol álcool isobutílico (CH3)2CHCH2OH Classe 3
2-metilpropan-1-ol
N-metilpirrolidona 1-metil-2-pirrolidona Classe 2
1-metilpirrolidin-2-dona
2-metoxietanol metilcelossolve CH3OCH2CH2OH Classe 2
nitrometano CH3NO2 Classe 2
pentano n-pentano CH3(CH2)3CH3 Classe 3
1 -pentanol álcool amílico CH3(CH2)3CH2OH Classe 3
pentan-1-ol
álcool pentílico
piridina Classe 2
1-propanol álcool propílico CH3CH2CH2OH Classe 3
propan-1-ol
2-propanol álcool isopropílico (CH3)2CHOH Classe 3
propan-2-ol
sulfolano 1,1-dióxido de tetra-hidrotiofeno Classe 2
tetracloreto de carbono tetraclorometano CCl4 Classe 1
tetra-hidrofurano óxido de tetrametileno Classe 2
oxaciclopentano
tetralina 1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno Classe 2
tolueno metilbenzeno Classe 2
1,1,1-tricloroetano metilclorofórmio CH3CCl3 Classe 1
1,1,2-tricloroeteno tricloroeteno HClC = CCl2 Classe 2
xileno(*) dimetilbenzeno
xilol Classe 2
(*) Habitualmente 60% m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno com 17% de etilbenzeno.
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ANEXO 2. INFORMAÇÕES COMPLEMENTARES
A2.1. REGULAMENTAÇÃO AMBIENTAL PARA OS
SOLVENTESORGÂNICOS VOLÁTEIS
Um certo número de solventes residuais, correntemente
utilizados no fabrico de produtos farmacêuticos, é
considerado como substâncias tóxicas nas monografias EHC
(Environmental Health Criteria) relativas aos critérios de
saúde e de ambiente e no sistema IRIS (Integrated Risk
Information System). Faz parte dos objectivos dos organis-
mos como o International Programme on Chemical Safety
(IPCS), o United States Environmental Protection Agency
(USEPA) e o United States Food and Drug Administration
(USFDA), a determinação dos teores de exposição admissíveis.
O objectivo desta determinação é proteger a saúde pública e
preservar o ambiente contra os eventuais efeitos nocivos
resultantes de uma exposição prolongada a estas substâncias.
Os métodos utilizados para a avaliação dos limites máximos
de exposição sem causar efeitos nocivos assentam geralmente
em estudos conduzidos a longo prazo. Se não se dispuser de
resultados de estudos a longo prazo, podem utilizar-se os
resultados obtidos em estudos de curto prazo, com a condição
de certos parâmetros serem modificados (por exemplo, a
utilização de factores de segurança mais elevados). A
contribuição aqui descrita baseia-se numa exposição a longo
prazo ou à exposição durante o tempo de vida da população
no seu meio ambiente, ou seja, ao ar ambiente, à
alimentação, à água potável e a outros meios.
A2.2. SOLVENTES RESIDUAIS NOS PRODUTOS FAR-
MACÊUTICOS
Os limites de exposição contidos nesta nota explicativa são
definidos a partir de métodos e dados de toxicidade
apresentados nas monografias ECH e IRIS. Contudo, ao
estabelecer estes limites, deve ter-se em conta alguns
postulados relativos aos resíduos dos solventes utilizados na
síntese e no fabrico de produtos farmacêuticos. Os postulados
são os seguintes:
1) Apenas os pacientes (e não a população em geral) utilizam
produtos farmacêuticos com o objectivo de se tratarem ou
prevenir as infecções e doenças.
2) Para a maior parte dos produtos farmacêuticos, o princípio
de uma exposição durante toda a vida não é necessária, mas
pode servir de hipótese de trabalho com vista à redução de
riscos para a saúde.
3) Os solventes residuais entram inevitavelmente na fabricação
dos produtos farmacêuticos e fazem frequentemente parte
integrante dos medicamentos.
4) Excepção feita para casos muito particulares, o teor em
solventes residuais não deve ultrapassar os limites prescritos.
5) Os resultados dos estudos toxicológicos utilizados para
determinar os teores aceitáveis de solventes residuais devem
ter origem em protocolos experimentais apropriados, tais
como os descritos pela OCDE e pelo «Red Book» da FDA.
ANEXO 3. MÉTODOS RELATIVOS AO ESTABELECIMENTO
DE LIMITES DE EXPOSIÇÃO
O método de Gaylor-Kodell, relativo à avaliação do risco
(Gaylor, D. W. and Kodell, R. L.: Linear Interpolation algo-
rithm for low dose assessmerzt of toxic substance, J. Environ.
Pathology, 4,305,1980), está apropriado para os solventes
carcinogénicos da classe 1. No estabelecimento de limites de
exposição, apenas os dados de carcinogenicidade fiáveis
podem justificar uma extrapolação por aplicação de modelos
matemáticos. Os limites de exposição dos solventes da classe
1 podem ser determinados combinando factores de segurança
elevados (ex. 10 000 a 1000 000) e os dados de no-observed-
-effect level (NOEL). A detecção e quantificação destes
solventes deve responder aos últimos desenvolvimentos em
matéria de técnicas analíticas.
Os teores de exposição aceitáveis apresentados nesta nota
explicativa para os solventes da classe 2 foram estabelecidos
após calcular os valores de EDA, de acordo com os procedi-
mentos que permitem estabelecer os limites aplicáveis aos
produtos farmacêuticos (Pharmacopeia Forum, Nov-Dez
1989) e o método adoptado pela IPCS para avaliação do risco
apresentado pelas substâncias químicas (Assessing Human
Health Risk of Chemicals-Environmental Health Criteria
170, WHO, Geneve, 1994). Estes métodos são semelhantes aos
utilizados pela EPA (ÍRIS), FDA (Red Book) e por outros
organismos. O método é aqui apresentado para permitir uma
melhor compreensão da origem dos valores de EDA. Não é
necessário efectuar estes cálculos para utilizar os valores de
EDA indicados no ponto 4 do presente documento. A EDA é
calculada a partir do no-observed-effect level (NOEL), ou
ainda do lowest-observed-effect level (LOEL), obtidos no
estudo mais relevante realizado com animais, com a ajuda da
expressão:
EDA � (1)
Preferencialmente a EDA deve ser derivada do NOEL. Se o
NOEL não puder ser obtido, deve utilizar-se o LOEL. Os
factores de modificação aqui propostas, que permitem aplicar
aos seres humanos as dados obtidos, assemelham-se aos
«factores de incerteza» utilizados nas EHC (Environmental
Health Criteria 170, WHO, Geneve, 1994), e aos «factores de
modificação» ao «factores de segurança» mencionados no
Pharmacopeial Forum. A hipótese de uma exposição sistémica
de 100% é utilizada em todos as cálculos, sem distinção das
diferentes vias de administração.
Os factores de modificação são as seguintes:
F1 = um factor que permite a extrapolação entre as espécies:
F1 = 2 para extrapolar do cão para o homem
F1 = 2,5 para extrapolar do coelho para a homem
F1 = 3 para extrapolar da macaco para a homem
F1 = 5 para extrapolar da rato para a homem
F1 = 10 para extrapolar dos outros animais para o homem
F1 = 12 para extrapolar do ratinho para o homem.
F1 permite ter em conta as relações comparativas superfície/
/massa corporal para as espécies em questão e para o homem.
A superfície (S) é calculada com ajuda da expressão seguinte:
S = k M0,67 (2)
em que M corresponde à massa corporal e k é uma constante
cujo valor está fixado em 10. As massas corporais utilizadas
na equação estão no quadro A3.1, apresentado mais à frente.
F2 = 10 e representa o factor que tem em conta a variabilidade entre
os indivíduos. Em regra, um factor de 10 está indicado para o
conjunto dos solventes orgânicos. Este valor é aplicado siste-
maticamente na presente nota.
F3 = um factor variável que corresponde aos estudos de toxicidade
relativos a uma exposição a curto prazo:
F3 = 1, para os estudos cuja duração corresponde pelo menos a
um tempo de semi-vida (1 ano para os roedores ou
coelhos; 7 anos para os gatos, cães e macacos)
NOEL � Ajuste ponderal
���
F1 � F2 � F3 � F4 � F5
585FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.4. Solventes residuais
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F3 = 1, para os estudos relativos à reprodução, no decurso dos
quais está coberto todo o período da organogénese
F3 = 2, para um estudo de 6 meses com roedores ou de 3,5
anos com não roedores
F3 = 5, para um estudo de 3 meses com roedores ou de 2 anos
com não roedores
F3 = 10, para os estudos de curta duração.
Quando os estudos têm uma duração que se situa entre o
início e o fim de períodos acima determinados, utiliza-se o
factor mais elevado, por exemplo, um factor de 2 para um
estudo de 9 meses com roedores.
F4 = um factor que pode ser utilizado em todos os casos de toxici-
dade elevada, por exemplo carcinogenicidade não genotóxica,
neurotoxicidade ou teratogenicidade. Nos estudos de toxicidade
ligada à reprodução devem utilizar-se os factores indicados a
seguir:
F4 = 1, para a toxicidade associada ao feto ou à mãe
F4 = 5, para a toxicidade associada ao feto sem a mãe
F4 = 5, para um efeito teratogénico com efeito tóxico para a mãe
F4 = 10, para um efeito teratogénico sem efeito tóxico para a mãe.
F5 = um factor variável que pode ser utilizado se a dose não efectiva
não foi estabelecida.
Quando apenas se conhece o valor LOEL, pode utilizar-se um
factor que pode ir até 10, em função do grau de toxicidade.
O ajustamento do peso é efectuado assumindo o valor
arbitrário de 50 Kg para a massa corporal de um adulto do
sexo masculino ou feminino. Este valor, relativamente baixo,
oferece uma margem de segurança acrescida em relação ao
peso padrão, 60 ou 70 kg, frequentemente utilizado neste
tipo de cálculo. Para os adultos comsão
utilizados para substituir o cumprimento das boas práticas
de fabrico.
A eficácia de um agente de conservação antimicrobiano pode
ser aumentada ou diminuída pelo composto activo da
preparação, pela composição da preparação na qual é
incorporado ou pelo recipiente e modo de fecho adoptado. A
actividade antimicrobiana da preparação no recipiente
definitivo é avaliada para o seu período de validade com o
objectivo de assegurar que aquela actividade não sofre
alteração durante o período de conservação. Estes exames
são efectuados em amostras colhidas do recipiente definitivo
imediatamente antes do ensaio.
Durante a fase de desenvolvimento de uma preparação
farmacêutica, verifica-se a actividade antimicrobiana própria
da preparação ou, se necessário, demonstra-se que, quando
adicionada de 1 ou mais conservantes apropriados, assegura
uma protecção adequada contra os efeitos nocivos que podem
resultar da contaminação ou da proliferação microbiana
durante o período de conservação e emprego da preparação.
A eficácia da actividade antimicrobiana demonstra-se através
do ensaio abaixo descrito, que não se destina ao controlo de
rotina.
ENSAIO DE EFICÁCIA DOS CONSERVANTES
ANTIMICROBIANOS
O ensaio consiste na contaminação artificial da preparação, se
possível no recipiente definitivo, através da inoculação de
microrganismos apropriados, conservando a preparação
semeada a uma temperatura adequada, colhendo amostras do
recipiente em determinados intervalos de tempo e efectuando
nelas uma contagem dos microrganismos.
Consideram-se adequadas as propriedades conservantes da
preparação quando, nas condições do ensaio e após intervalos
de tempo e temperaturas prescritos, se produzir, conforme os
casos, uma diminuição importante ou uma ausência de
aumento do número de microrganismos na preparação
inoculada. Os critérios de aceitação, em termos de diminuição
do número de microrganismos em função do tempo, variam
para as diversas categorias de preparações de acordo com o
grau de protecção pretendido (ver quadros)
Microrganismos de ensaio
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82.118.
Staphylococcus aureus ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518; 
CIP 4.83.
Candida albicans ATCC 10231; NCPF 3 179; IP 48.72.
Aspergillus niger ATCC 16404; IMI 149007; IP 1431.83.
Os ensaios efectuam-se com 1 estirpe de cada vez.
Complementam-se os microrganismos especificados com
estirpes ou espécies que constituem contaminantes potenciais
da preparação. Por exemplo, a Escherichia coli (ATCC 8739;
NCIMB 8545; CIP 53.126) utiliza-se em todas as preparações
orais e a Zygosaccharomyces rouxii (NCY 381; IP 2021.92)
nas preparações orais com elevada concentração de açúcar.
Preparação do inóculo
Antes do ensaio, semeie à superfície de um meio gelosado B
(2.6.12) para bactérias ou um meio gelosado C sem
antibióticos (2.6.12) para fungos uma cultura-mãe recente
obtida de cada um dos microrganismos especificados. Incube
as culturas bacterianas a uma temperatura entre 30-35°C,
durante 18-24 h, a cultura de C. albicans entre 20-25°C,
durante 48 h, e a cultura de A. niger entre 20-25°C, durante 
1 semana ou até à obtenção de uma esporulação satisfatória.
Podem ser necessárias subculturas depois de revitalização dos
microrganismos, até que estes atinjam um desenvolvimento
óptimo, sendo recomendável que se mantenha um número
mínimo de repicagens.
Para a colheita das culturas bacterianas e de C. albicans
utilize um líquido de suspensão estéril contendo 9 g/l de
cloreto de sódio R. Disperse e transfira a cultura desenvolvida
em superfície para um recipiente apropriado. Junte uma
quantidade adequada de líquido de suspensão para reduzir o
número de microrganismos para cerca de 108 por mililitro.
Para recolher a cultura de A. niger utilize um líquido de
suspensão estéril contendo 9 g/l de cloreto de sódio R e 0,5 g/l
de polissorbato 80 R e ajuste o número de esporos para cerca
de 108 por mililitro com a mesma solução. Colha
imediatamente uma amostra apropriada de cada suspensão e
determine o número de unidades formadoras de colónias por
mililitro em cada suspensão, através da sementeira em placas
ou filtração por membrana (2.6.12). Este valor serve para
5.1.3. Eficácia dos conservantes antimicrobianos
518 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 518
determinar o inóculo e a linha de base a ser utilizada no
ensaio. As suspensões são usadas imediatamente.
MÉTODO
Para se efectuar a contagem de microrganismos viáveis nas
preparações inoculadas, use o mesmo meio gelosado que foi
empregue na cultura inicial do microrganismo correspondente.
Semeie vários recipientes da amostra com uma suspensão de
um dos microrganismos de ensaio de modo a que se obtenha
um inóculo com 105 a 106 microrganismos por mililitro ou
por grama da preparação. O volume da suspensão do inóculo
não ultrapassa 1 por cento do volume do produto. Misture
cuidadosamente para assegurar uma distribuição homogénea.
Mantenha o produto semeado a uma temperatura entre 20°C e
25°C, ao abrigo da luz. Colha amostras apropriadas de cada
recipiente, por exemplo 1 ml ou 1 g, no tempo 0 e nos
intervalos de tempo apropriados, consoante o tipo de
preparação, e calcule o número de microrganismos viáveis
através da sementeira em placas ou filtração por membrana
(2.6.12), assegurando que toda a actividade antimicrobiana
residual da preparação tenha sido eliminada pela diluição, por
filtração ou através da utilização de um desactivador específico.
No caso de se utilizar o método das diluições, leva-se em linha
de conta a redução da sensibilidade na detecção de pequeno
número de microrganismos viáveis. No caso de se utilizar um
desactivador específico, confirma-se, através de controlos
apropriados, a capacidade do sistema de permitir o crescimento
dos microrganismos de ensaio.
O método é validado com o objectivo de se verificar a
capacidade para pôr em evidência a redução na contagem do
número de microrganismos viáveis.
CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO
Os critérios para avaliação da actividade antimicrobiana
apresentam-se na tabela em termos de redução logarítmica do
número de microrganismos viáveis relativamente ao valor
obtido no inóculo.
Preparações parentéricas e oftálmicas
Redução logarítmica
6 h 24 h 7 dias 14 dias 28 dias
Bactérias A 2 3 – – NE
B – 1 3 – SA
Fungos A – – 2 – SA
B – – – 1 SA
SA: sem aumento
NE: não encontrado
Os critérios A representam a eficácia que se recomenda seja
atingida. Quando justificados, se os critérios A não puderem
ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem
reacções indesejáveis, aplicam-se os critérios B.
Preparações tópicas e locais
Redução logarítmica
2 dias 7 dias 14 dias 28 dias
Bactérias A 2 3 – SA 
B – – 3 SA
Fungos A – – 2 SA 
B – – 1 SA
Os critérios A representam a eficácia que se recomenda seja
atingida. Quando justificados, se os critérios A não puderem
ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem
reacções indesejáveis, aplicam-se os critérios B.
Preparações orais
Redução logarítmica
14 dias 28 dias
Bactérias 3 SA
Fungos 1 SA
Estes critérios representam a eficácia que se recomenda seja
atingida.
5.1.4. QUALIDADE MICROBIOLÓGICA
DAS PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS
O presente capítulo é publicado a título de informação.
O fabrico, o acondicionamento, a conservação e a
distribuição das preparações farmacêuticas são conduzidas
de modo a assegurar uma qualidade microbiológica
satisfatória. As preparações farmacêuticas satisfazem às
seguintes exigências:
Categoria 1
Preparações obrigatoriamente estéreis de acordo com a
monografia da forma farmacêutica correspondente e outras
preparações rotuladas de estéreis.
– Ensaio de esterilidade (2.6.1)
Categoria 2
Preparações para aplicação local ou para administração nas
vias respiratórias, com excepção das preparações
obrigatoriamente estéreis, e dispositivos transdérmicos.
– Contagem dos germes aeróbios viáveis totais (2.6.12). No
máximo, 102 bactérias, fungos e leveduras por grama, por
mililitromenos de 50 kg, consi-
dera-se que estão protegidos pela acumulação dos factores de
segurança utilizados na determinação da EDA. Se o solvente
estiver presente num medicamento exclusivamente para uso
pediátrico, deve proceder-se à correcção do peso, ajustando-o
para o valor inferior adequado.
Para ilustrar a aplicação desta equação, tomemos, a título de
exemplo, um estudo de toxicidade do acetonitrilo no rato, que
é apresentado no suplemento de Abril de 1997 de Pharmeuropa,
vol. 9, nº 1, página S24 (versão inglesa). O valor de NOEL é
estimado 50,7 mg kg–1 dia–1. Neste caso concreto, o valor da
EDA é calculado como se segue:
EDA = 50,7 mg kg–1 dia–1 � 50 kg/12 � 10 � 5 � 1 � 1
EDA = 4,22 mg dia–1
Neste exemplo,
F1 = 12, para ter em conta a extrapolação do rato para o homem
F2 = 10, para ter em conta as diferenças entre os indivíduos
F3 = 5, uma vez que a duração do estudo está limitada a apenas 
13 semanas
F4 = 1, porque não se verifica qualquer toxicidade grave
F5 = 1, porque foi determinada a dose não efectiva
QUADRO A3.1 Valores utilizados para os cálculos apresentados
neste documento
Massa corporal do rato 425 g
Massa corporal de uma rata em gestação 330 g
Massa corporal do ratinho 28 g
Massa corporal de uma ratinha em gestação 30 g
Massa corporal do cobaio 500 g
Massa corporal do macaco Rhesus 2,5 kg
Massa corporal do coelho (em gestação ou não) 4 kg
Massa corporal do cão beagle 11,5 kg
Volume respiratório do rato 290 1/dia
Volume respiratório do ratinho 43 1/dia
Volume respiratório do coelho 1440 1/dia
Volume respiratório do cobaia 430 1/dia
Volume respiratório do homem 28800 1/dia
Volume respiratório do cão 9000 1/dia
Volume respiratório do macaco 1150 1/dia
Consumo de água do ratinho 5 ml/dia
Consumo de água do rato 30 ml/dia
Consumo alimentar do rato 30 g/dia
No que se refere às concentrações de gás utilizadas nos
estudos de inalação, a equação dos gases perfeitos, PV = nRT,
permite converter ppm em mg/l ou mg/m3. A título de
exemplo, o estudo de toxicidade reprodutiva do rato por
inalação de tetracloreto de carbono (massa molecular 153,84)
é apresentado no Suplemento de Abril de 1997 de
Pharmaeuropa, vol. 9, nº 1, página S9.
n/V = P/RT = 300 � 10–6 atm � 153840 mg mol–1/0,082 atm K–1
mol–1 � 298K = 46,15 mg/24,45 1 = 1,89 mg/l
Foi utilizada a correspondência 1 000 1 = 1 m3, para converter
o resultado em mg/m3.
5.4. Solventes residuais
586 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
17 Ponto 5.4 (577-586) 11/21/05 10:01 AM Page 586
587FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
 T
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is
5.5. TABELAS
ALCOOMÉTRICAS
5.5. Tabelas alcoométricas ................................................ 589
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 587
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
5.5. TABELAS ALCOOMÉTRICAS
A fórmula geral fixada pelo Conselho das Comunidades
Europeias nas suas Directivas de 27 de Julho de 1976 sobre a
alcoometria serviu de base para estabelecer as tabelas
seguintes.
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
0,0 0,0 998,20
0,1 0,08 998,05
0,2 0,16 997,90
0,3 0,24 997,75
0,4 0,32 997,59
0,5 0,40 997,44
0,6 0,47 997,29
0,7 0,55 997,14
0,8 0,63 996,99
0,9 0,71 996,85
1,0 0,79 996,70
1,1 0,87 996,55
1,2 0,95 996,40
1,3 1,03 996,25
1,4 1,11 996,11
1,5 1,19 995,96
1,6 1,27 995,81
1,7 1,35 995,67
1,8 1,43 995,52
1,9 1,51 995,38
2,0 1,59 995,23
2,1 1,67 995,09
2,2 1,75 994,94
2,3 1,82 994,80
2,4 1,90 994,66
2,5 1,98 994,51
2,6 2,06 994,37
2,7 2,14 994,23
2,8 2,22 994,09
2,9 2,30 993,95
3,0 2,38 993,81
3,1 2,46 993,66
3,2 2,54 993,52
3,3 2,62 993,38
3,4 2,70 993,24
3,5 2,78 993,11
3,6 2,86 992,97
3,7 2,94 992,83
3,8 3,02 992,69
3,9 3,10 992,55
4,0 3,18 992,41
4,1 3,26 992,28
4,2 3,34 992,14
4,3 3,42 992,00
4,4 3,50 991,87
4,5 3,58 991,73
4,6 3,66 991,59
4,7 3,74 991,46
4,8 3,82 991,32
4,9 3,90 991,19
5,0 3,98 991,06
5,1 4,06 990,92
5,2 4,14 990,79
589FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.5. Tabelas alcoométricas
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
5,3 4,22 990,65
5,4 4,30 990,52
5,5 4,38 990,39
5,6 4,46 990,26
5,7 4,54 990,12
5,8 4,62 989,99
5,9 4,70 989,86
6,0 4,78 989,73
6,1 4,86 989,60
6,2 4,95 989,47
6,3 5,03 989,34
6,4 5,11 989,21
6,5 5,19 989,08
6,6 5,27 988,95
6,7 5,35 988,82
6,8 5,43 988,69
6,9 5,51 988,56
7,0 5,59 988,43
7,1 5,67 988,30
7,2 5,75 988,18
7,3 5,83 988,05
7,4 5,91 987,92
7,5 5,99 987,79
7,6 6,07 987,67
7,7 6,15 987,54
7,8 6,23 987,42
7,9 6,32 987,29
8,0 6,40 987,16
8,1 6,48 987,04
8,2 6,56 986,91
8,3 6,64 986,79
8,4 6,72 986,66
8,5 6,80 986,54
8,6 6,88 986,42
8,7 6,96 986,29
8,8 7,04 986,17
8,9 7,12 986,05
9,0 7,20 985,92
9,1 7,29 985,80
9,2 7,37 985,68
9,3 7,45 985,56
9,4 7,53 985,44
9,5 7,61 985,31
9,6 7,69 985,19
9,7 7,77 985,07
9,8 7,85 984,95
9,9 7,93 984,83
10,0 8,01 984,71
10,1 8,10 984,59
10,2 8,18 984,47
10,3 8,26 984,35
10,4 8,34 984,23
10,5 8,42 984,11
10,6 8,50 983,99
10,7 8,58 983,88
10,8 8,66 983,76
10,9 8,75 983,64
11,0 8,83 983,52
11,1 8,91 983,40
11,2 8,99 983,29
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 589
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
11,3 9,07 983,17
11,4 9,15 983,05
11,5 9,23 982,94
11,6 9,32 982,82
11,7 9,40 982,70
11,8 9,48 982,59
11,9 9,56 982,47
12,0 9,64 982,35
12,1 9,72 982,24
12,2 9,80 982,12
12,3 9,89 982,01
12,4 9,97 981,89
12,5 10,05 981,78
12,6 10,13 981,67
12,7 10,21 981,55
12,8 10,29 981,44
12,9 10,37 981,32
13,0 10,46 981,21
13,1 10,54 981,10
13,2 10,62 980,98
13,3 10,70 980,87
13,4 10,78 980,76
13,5 10,87 980,64
13,6 10,95 980,53
13,7 11,03 980,42
13,8 11,11 980,31
13,9 11,19 980,19
14,0 11,27 980,08
14,1 11,36 979,97
14,2 11,44 979,86
14,3 11,52 979,75
14,4 11,60 979,64
14,5 11,68 979,52
14,6 11,77 979,41
14,7 11,85 979,30
14,8 11,93 979,19
14,9 12,01 979,08
15,0 12,09 978,97
15,1 12,17 978,86
15,2 12,26 978,75
15,3 12,34 978,64
15,4 12,42 978,53
15,5 12,50 978,42
15,6 12,59 978,31
15,7 12,67 978,20
15,8 12,75 978,09
15,9 12,83 977,98
16,0 12,91 977,87
16,1 13,00 977,76
16,2 13,08 977,65
16,3 13,16 977,55
16,4 13,24 977,44
16,5 13,32 977,33
16,6 13,41 977,22
16,7 13,49 977,11
16,8 13,57 977,00
16,9 13,65 976,89
17,0 13,74 976,79
17,1 13,82 976,68
17,2 13,90 976,57
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
17,3 13,98 976,46
17,4 14,07 976,35
17,5 14,15 976,25
17,6 14,23 976,14
17,7 14,31 976,03
17,8 14,40 975,92
17,9 14,48 975,81
18,0 14,56 975,71
18,1 14,64 975,60
18,2 14,73 975,49
18,3 14,81 975,38
18,4 14,89 975,28
18,5 14,97 975,17
18,6 15,06 975,06
18,7 15,14 974,95
18,8 15,22 974,85
18,9 15,30 974,74
19,0 15,39 974,63
19,1 15,47 974,52
19,2 15,55 974,42
19,3 15,63 974,31
19,4 15,72 974,20
19,5 15,80 974,09
19,6 15,88 973,99
19,7 15,97 973,88
19,8 16,05 973,77
19,9 16,13 973,66
20,0 16,21 973,56
20,1 16,30 973,45
20,2 16,38 973,34
20,3 16,46 973,24
20,4 16,55 973,13
20,5 16,63 973,02
20,6 16,71 972,91
20,7 16,79 972,80
20,8 16,88 972,70
20,9 16,96 972,59
21,0 17,04 972,48
21,1 17,13 972,37
21,2 17,21 972,27
21,3 17,29 972,16
21,4 17,38 972,05
21,5 17,46 971,94
21,6 17,54 971,83
21,7 17,62 971,73
21,8 17,71 971,62
21,9 17,79 971,51
22,0 17,87 971,40
22,1 17,96 971,29
22,2 18,04 971,18
22,3 18,12 971,08
22,4 18,21 970,97
22,5 18,29 970,86
22,6 18,37 970,75
22,7 18,46 970,64
22,8 18,54 970,53
22,9 18,62 970,42
23,0 18,71 970,31
23,1 18,79 970,20
23,2 18,87 970,09
5.5. Tabelas alcoométricas
590 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 590
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
23,3 18,96 969,98
23,4 19,04 969,87
23,5 19,13 969,76
23,6 19,21 969,65
23,7 19,29 969,54
23,8 19,38 969,43
23,9 19,46 969,32
24,0 19,54 969,21
24,1 19,63 969,10
24,2 19,71 968,99
24,3 19,79 968,88
24,4 19,88 968,77
24,5 19,96 968,66
24,6 20,05 968,55
24,7 20,13 968,43
24,8 20,21 968,32
24,9 20,30 968,21
25,0 20,38 968,10
25,1 20,47 967,99
25,2 20,55 967,87
25,3 20,63 967,76
25,4 20,72 967,65
25,5 20,80 967,53
25,6 20,88 967,42
25,7 20,97 967,31
25,8 21,05 967,19
25,9 21,14 967,08
26,0 21,22 966,97
26,1 21,31 966,85
26,2 21,39 966,74
26,3 21,47 966,62
26,4 21,56 966,51
26,5 21,64 966,39
26,6 21,73 966,28
26,7 21,81 966,16
26,8 21,90 966,05
26,9 21,98 965,93
27,0 22,06 965,81
27,1 22,15 965,70
27,222,23 965,58
27,3 22,32 965,46
27,4 22,40 965,35
27,5 22,49 965,23
27,6 22,57 965,11
27,7 22,65 964,99
27,8 22,74 964,88
27,9 22,82 964,76
28,0 22,91 964,64
28,1 22,99 964,52
28,2 23,08 964,40
28,3 23,16 964,28
28,4 23,25 964,16
28,5 23,33 964,04
28,6 23,42 963,92
28,7 23,50 963,80
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28,9 23,67 963,56
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29,1 23,84 963,32
29,2 23,93 963,20
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
29,3 24,01 963,07
29,4 24,10 962,95
29,5 24,18 962,83
29,6 24,27 962,71
29,7 24,35 962,58
29,8 24,44 962,46
29,9 24,52 962,33
30,0 24,61 962,21
30,l 24,69 962,09
30,2 24,78 961,96
30,3 24,86 961,84
30,4 24,95 961,71
30,5 25,03 961,59
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31,1 25,55 960,82
31,2 25,63 960,70
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31,5 25,89 960,31
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35,2 29,08 955,30
591FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.5. Tabelas alcoométricas
5.
 T
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ge
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is
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 591
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
35,3 29,17 955,16
35,4 29,26 955,02
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35,6 29,43 954,73
35,7 29,52 954,59
35,8 29,60 954,44
35,9 29,69 954,30
36,0 29,78 954,15
36,1 29,87 954,01
36,2 29,95 953,86
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40,7 33,92 946,91
40,8 34,01 946,75
40,9 34,10 946,58
41,0 34,19 946,42
41,1 34,28 946,26
41,2 34,37 946,09
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
41,3 34,46 945,93
41,4 34,55 945,76
41,5 34,64 945,59
41,6 34,73 945,43
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42,5 35,54 943,91
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42,8 35,81 943,40
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43,2 36,17 942,71
43,3 36,26 942,54
43,4 36,35 942,37
43,5 36,44 942,19
43,6 36,53 942,02
43,7 36,62 941,84
43,8 36,71 941,67
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44,2 37,07 940,97
44,3 37,16 940,79
44,4 37,25 940,61
44,5 37,35 940,43
44,6 37,44 940,26
44,7 37,53 940,08
44,8 37,62 939,90
44,9 37,71 939,72
45,0 37,80 939,54
45,1 37,89 939,36
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45,3 38,08 939,00
45,4 38,17 938,82
45,5 38,26 938,64
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45,8 38,53 938,10
45,9 38,62 937,91
46,0 38,72 937,73
46,1 38,81 937,55
46,2 38,90 937,36
46,3 38,99 937,18
46,4 39,08 937,00
46,5 39,18 936,81
46,6 39,27 936,63
46,7 39,36 936,44
46,8 39,45 936,26
46,9 39,54 936,07
47,0 39,64 935,88
47,1 39,73 935,70
47,2 39,82 935,51
5.5. Tabelas alcoométricas
592 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 592
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
47,3 39,91 935,32
47,4 40,00 935,14
47,5 40,10 934,95
47,6 40,19 934,76
47,7 40,28 934,57
47,8 40,37 934,38
47,9 40,47 934,19
48,0 40,56 934,00
48,1 40,65 933,81
48,2 40,75 933,62
48,3 40,84 933,43
48,4 40,93 933,24
48,5 41,02 933,05
48,6 41,12 932,86
48,7 41,21 932,67
48,8 41,30 932,47
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50,0 42,43 930,14
50,1 42,52 929,95
50,2 42,61 929,75
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53,2 45,46 923,71
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
53,3 45,55 923,50
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59,1 51,19 911,11
59,2 51,29 910,89
593FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.5. Tabelas alcoométricas
5.
 T
ex
to
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18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 593
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
59,3 51,39 910,67
59,4 51,49 910,45
59,5 51,59 910,23
59,6 51,69 910,01
59,7 51,79 909,78
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% V/V % m/m �20 (kg/m3)
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65,8 57,98 895,76
65,9 58,08 895,52
66,0 58,18 895,28
66,1 58,29 895,05
66,2 58,39 894,81
66,3 58,49 894,57
66,4 58,60 894,33
66,5 58,70 894,09
66,6 58,81 893,85
66,7 58,91 893,61
66,8 59,01 893,37
66,9 59,12 893,13
67,0 59,22 892,89
67,1 59,33 892,65
67,2 59,43 892,41
67,3 59,54 892,17
67,4 59,64 891,93
67,5 59,74 891,69
67,6 59,85 891,45
67,7 59,95 891,20
67,8 60,06 890,96
67,9 60,16 890,72
68,0 60,27 890,48
68,1 60,37 890,23
68,2 60,48 889,99
68,3 60,58889,75
68,4 60,69 889,50
68,5 60,80 889,26
68,6 60,90 889,01
68,7 61,01 888,77
68,8 61,11 888,52
68,9 61,22 888,28
69,0 61,32 888,03
69,1 61,43 887,79
69,2 61,54 887,54
69,3 61,64 887,29
69,4 61,75 887,05
69,5 61,85 886,80
69,6 61,96 886,55
69,7 62,07 886,31
69,8 62,17 886,06
69,9 62,28 885,81
70,0 62,39 885,56
70,1 62,49 885,31
70,2 62,60 885,06
70,3 62,71 884,82
70,4 62,81 884,57
70,5 62,92 884,32
70,6 63,03 884,07
70,7 63,13 883,82
70,8 63,24 883,57
70,9 63,35 883,32
71,0 63,46 883,06
71,1 63,56 882,81
71,2 63,67 882,56
5.5. Tabelas alcoométricas
594 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 594
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
71,3 63,78 882,31
71,4 63,89 882,06
71,5 63,99 881,81
71,6 64,10 881,55
71,7 64,21 881,30
71,8 64,32 881,05
71,9 64,43 880,79
72,0 64,53 880,54
72,1 64,64 880,29
72,2 64,75 880,03
72,3 64,86 879,78
72,4 64,97 879,52
72,5 65,08 879,27
72,6 65,19 879,01
72,7 65,29 878,75
72,8 65,40 878,50
72,9 65,51 878,24
73,0 65,62 877,99
73,1 65,73 877,73
73,2 65,84 877,47
73,3 65,95 877,21
73,4 66,06 876,96
73,5 66,17 876,70
73,6 66,28 876,44
73,7 66,39 876,18
73,8 66,50 875,92
73,9 66,61 875,66
74,0 66,72 875,40
74,1 66,83 875,14
74,2 66,94 874,88
74,3 67,05 874,62
74,4 67,16 874,36
74,5 67,27 874,10
74,6 67,38 873,84
74,7 67,49 873,58
74,8 67,60 873,32
74,9 67,71 873,06
75,0 67,82 872,79
75,1 67,93 872,53
75,2 68,04 872,27
75,3 68,15 872,00
75,4 68,26 871,74
75,5 68,38 871,48
75,6 68,49 871,21
75,7 68,60 870,95
75,8 68,71 870,68
75,9 68,82 870,42
76,0 68,93 870,15
76,1 69,04 869,89
76,2 69,16 869,62
76,3 69,27 869,35
76,4 69,38 869,09
76,5 69,49 868,82
76,6 69,61 868,55
76,7 69,72 868,28
76,8 69,83 868,02
76,9 69,94 867,75
77,0 70,06 867,48
77,1 70,17 867,21
77,2 70,28 866,94
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
77,3 70,39 866,67
77,4 70,51 866,40
77,5 70,62 866,13
77,6 70,73 865,86
77,7 70,85 865,59
77,8 70,96 865,32
77,9 71,07 865,05
78,0 71,19 864,78
78,1 71,30 864,50
78,2 71,41 864,23
78,3 71,53 863,96
78,4 71,64 863,69
78,5 71,76 863,41
78,6 71,87 863,14
78,7 71,98 862,86
78,8 72,10 862,59
78,9 72,21 862,31
79,0 72,33 862,04
79,1 72,44 861,76
79,2 72,56 861,49
79,3 72,67 861,21
79,4 72,79 860,94
79,5 72,90 860,66
79,6 73,02 860,38
79,7 73,13 860,10
79,8 73,25 859,83
79,9 73,36 859,55
80,0 73,48 859,27
80,1 73,60 858,99
80,2 73,71 858,71
80,3 73,83 858,43
80,4 73,94 858,15
80,5 74,06 857,87
80,6 74,18 857,59
80,7 74,29 857,31
80,8 74,41 857,03
80,9 74,53 856,75
81,0 74,64 856,46
81,1 74,76 856,18
81,2 74,88 855,90
81,3 74,99 855,62
81,4 75,11 855,33
81,5 75,23 855,05
81,6 75,34 854,76
81,7 75,46 854,48
81,8 75,58 854,19
81,9 75,70 853,91
82,0 75,82 853,62
82,1 75,93 853,34
82,2 76,05 853,05
82,3 76,17 852,76
83,4 76,29 852,48
82,5 76,41 852,19
82,6 76,52 851,90
82,7 76,64 851,61
82,8 76,76 851,32
82,9 76,88 851,03
83,0 77,00 850,74
83,1 77,12 850,45
83,2 77,24 850,16
595FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.5. Tabelas alcoométricas
5.
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is
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 595
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
83,3 77,36 849,87
83,4 77,48 849,58
83,5 77,60 849,29
83,6 77,72 848,99
83,7 77,84 848,70
83,8 77,96 848,41
83,9 78,08 848,11
84,0 78,20 847,82
84,1 78,32 847,53
84,2 78,44 847,23
84,3 78,56 846,93
84,4 78,68 846,64
84,5 78,80 846,34
84,6 78,92 846,05
84,7 79,04 845,75
84,8 79,16 845,45
84,9 79,28 845,15
85,0 79,40 844,85
85,1 79,53 844,55
85,2 79,65 844,25
85,3 79,77 843,95
85,4 79,89 843,65
85,5 80,01 843,35
85,6 80,14 843,05
85,7 80,26 842,75
85,8 80,38 842,44
85,9 80,50 842,14
86,0 80,63 841,84
86,1 80,75 841,53
86,2 80,87 841,23
86,3 81,00 840,92
86,4 81,12 840,62
86,5 81,24 840,31
86,6 81,37 840,00
86,7 81,49 839,70
86,8 81,61 839,39
86,9 81,74 839,08
87,0 81,86 838,77
87,1 81,99 838,46
87,2 82,11 838,15
87,3 82,24 837,84
87,4 82,36 837,52
87,5 82,49 837,21
87,6 82,61 836,90
87,7 82,74 836,59
87,8 82,86 836,27
87,9 82,99 835,96
88,0 83,11 835,64
88,1 83,24 835,32
88,2 83,37 835,01
88,3 83,49 834,69
88,4 83,62 834,37
88,5 83,74 834,05
88,6 83,87 833,73
88,7 84,00 833,41
88,8 84,13 833,09
88,9 84,25 832,77
89,0 84,38 832,45
89,1 84,51 832,12
89,2 84,64 831,80
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
89,3 84,76 831,48
89,4 84,89 831,15
89,5 85,02 830,82
89,6 85,15 830,50
89,7 85,28 830,17
89,8 85,41 829,84
89,9 85,54 829,51
90,0 85,66 829,18
90,1 85,79 828,85
90,2 85,92 828,52
90,3 86,05 828,19
90,4 86,18 827,85
90,5 86,31 827,52
90,6 86,44 827,18
90,7 86,57 826,85
90,8 86,71 826,51
90,9 86,84 826,17
91,0 86,97 825,83
91,1 87,10 825,49
91,2 87,23 825,15
91,3 87,36 824,81
91,4 87,49 824,47
91,5 87,63 824,13
91,6 87,76 823,78
91,7 87,89 823,44
91,8 88,02 823,09
91,9 88,16 822,74
92,0 88,29 822,39
92,1 88,42 822,04
92,2 88,56 821,69
92,3 88,69 821,34
92,4 88,83 820,99
92,5 88,96 820,63
92,6 89,10 820,28
92,7 89,23 819,92
92,8 89,37 819,57
92,9 89,50 819,21
93,0 89,64 818,85
93,1 89,77 818,49
93,2 89,91 818,12
93,3 90,05 817,76
93,4 90,18 817,40
93,5 90,32 817,03
93,6 90,46 816,66
93,7 90,59 816,30
93,8 90,73 815,93
93,9 90,87 815,55
94,0 91,01 815,18
94,1 91,15 814,81
94,2 91,29 814,43
94,3 91,43 814,06
94,4 91,56 813,68
94,5 91,70 813,30
94,6 91,84 812,92
94,7 91,98 812,54
94,8 92,13 812,15
94,9 92,27 811,77
95,0 92,41 811,38
95,1 92,55 810,99
95,2 92,69 810,60
5.5. Tabelas alcoométricas
596 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 596
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
95,3 92,83 810,21
95,4 92,98 809,82
95,5 93,12 809,42
95,6 93,26 809,02
95,7 93,41 808,63
95,8 93,55 808,23
95,9 93,69 807,82
96,0 93,84 807,42
96,1 93,98 807,01
96,2 94,13 806,61
96,3 94,27 806,20
96,4 94,42 805,78
96,5 94,57 805,37
96,6 94,71 804,96
96,7 94,86 804,54
96,8 95,01 804,12
96,9 95,16 803,70
97,0 95,31 803,27
97,1 95,45 802,85
97,2 95,60 802,42
97,3 95,75 801,99
97,4 95,90 801,55
97,5 96,05 801,12
97,6 96,21 800,68
97,7 96,36 800,24
% V/V % m/m �20 (kg/m3)
97,8 96,51 799,80
97,9 96,66 799,35
98,0 96,81 798,90
98,1 96,97 798,45
98,2 97,12 798,00
98,3 97,28 797,54
98,4 97,43 797,08
98,5 97,59 796,62
98,6 97,74 796,15
98,7 97,90 795,68
98,8 98,06 795,21
98,9 98,22 794,73
99,0 98,38 794,25
99,1 98,53 793,77
99,2 98,69 793,28
99,3 98,86 792,79
99,4 99,02 792,30
99,5 99,18 791,80
99,6 99,34 791,29
99,7 99,50 790,79
99,8 99,67 790,28
99,9 99,83 789,76
100,0 100,0 789,24
597FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.5. Tabelas alcoométricas
5.
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18. Ponto 5.5(587-598) 11/18/05 12:58 PM Page 597
599FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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5.6. AFERIÇÃO 
DOS INTERFERÕES
1. Introdução .................................................................. 601
2. Aferição da actividade antivírica (redução do efeito
citopatogénico)............................................................ 601
3. Aferição de um interferão por meio de células Hep2c 
e do vírus da encefalomiocardite infecciosa .............. 601
3.1. Cultura e preparação das células Hep2c............ 601
3.2. Multiplicação do vírus EMC .............................. 601
3.3. Método de aferição.............................................. 602
3.3.1. Determinação do intervalo de medida .... 602
3.3.2. Aferição .................................................... 602
3.3.3. Análise dos resultados.............................. 602
4. Validação de outros métodos ...................................... 602
4.1. Escolha da linha celular e do vírus.................... 602
4.2. Escolha da técnica de coloração vital ................ 603
4.3. Validação estatística............................................ 603
4.4. Validação do plano de ensaio.............................. 603
5. Reagentes e meios de cultura .................................... 603
19. Ponto 5.6(599-604) 11/18/05 12:59 PM Page 599
5.
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5.6. AFERIÇÃO DOS INTERFERÕES
Esta secção é fornecida a título de informação e conselho;
não constitui parte obrigatória da Farmacopeia.
1. INTRODUÇÃO
As monografias relativas aos interferões humanos incluem,
geralmente, uma aferição biológica fundamentadana acção
inibidora, exercida pelos interferões, sobre o efeito citopato-
génico de um vírus sobre uma cultura celular. Entretanto,
geralmente, não dão especificações pormenorizadas no que se
refere ao vírus, à linha celular e à técnica a utilizar, de modo
a permitir uma certa flexibilidade, indispensável nos casos em
que a monografia inclui várias subclasses de interferões.
A presente monografia tem por finalidade fornecer ao analista
indicações gerais sobre a técnica, a optimização e a validação
deste tipo de ensaios, uma vez escolhida uma combinação
apropriada de linha celular e vírus citopatogénico. Descreve
em pormenor, a título de exemplo de método apropriado, um
processo analítico aplicável a uma aferição de actividade anti-
vírica particular, fornecendo informações sobre outras combi-
nações vírus-linha celular e indicações sobre as modalidades
de adaptação e de validação do processo para essas outras
combinações.
2. AFERIÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIVÍRICA (REDUÇÃO DO
EFEITO CITOPATOGÉNICO)
A aferição da actividade antivírica dos interferões humanos
baseia-se na avaliação da resposta induzida em células humanas
pelos interferões que suprimem ou reduzem o efeito citopatogé-
nico produzido nessas células por um vírus infeccioso. A activi-
dade do interferão é avaliada por comparação da sua capacidade
de proteger células da acção citopatogénica de um vírus com a
de uma preparação padrão apropriada, calibrada em Unidades
Internacionais.
3. AFERIÇÃO DE UM INTERFERÃO POR MEIO DE CÉLULAS
Hep2c E DO VÍRUS DA ENCEFALOMIOCARDITE
INFECCIOSA
O método de aferição que se descreve a título de exemplo
baseia-se na redução do efeito citopatogénico. Utiliza células
humanas Hep2c que são infectadas com o vírus da encefalo-
miocardite infecciosa (EMC) com a finalidade de avaliar a
actividade de diferentes preparações de interferão humano.
Este método foi empregado desde que foram feitos estudos
patrocinados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para
estabelecimento de padrões internacionais dos interferões
humanos alfa, beta e gama e a sua sensibilidade, fiabilidade e
reprodutibilidade para estimulação da actividade desses
diferentes tipos de interferões humanos foram demonstrados
por variadas vezes.
Para as culturas de células de mamíferos, todas as operações
são conduzidas segundo os métodos padronizados estabele-
cidos para estas culturas celulares. Os volumes de reagentes a
utilizar são aqui indicados para culturas efectuadas em frascos
de 75 cm2; podem utilizar-se outros tipos de recipientes
(frascos ou caixas de cultura) e, nesse caso os volumes devem
ser, então, consequentemente adaptados.
3.1. CULTURA E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS HEP2C
As células Hep2c são mantidas e repicadas em meio de cultura A.
601FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.6. Aferição dos interferões
As células são conservadas na forma congelada seguindo
métodos padronizados. Podem ser mantidas em cultura até,
no máximo, 30 passagens após o que devem preparar-se novas
culturas a partir dos lotes congelados.
Para iniciar a aferição, proceda à recolha das células quando
os tapetes celulares apresentarem uma confluência de 90 por
cento, pelo método de tratamento com tripsina que se
descreve a seguir.
– Remova o meio de cultura dos frascos.
– Junte a cada frasco 5 ml de solução de tripsina aquecida a
37ºC, preparada extemporaneamente por diluição a 1/50
com tampão salino de fosfato a partir de uma solução-mãe
concentrada contendo 4 mg/ml de tripsina R e 4 mg/ml de
edetato de sódio R. Rolhe os frascos e agite com movimentos
circulares para lavar o tapete celular. Elimine o excesso de
solução de tripsina.
– Coloque os frascos na incubadora a 37ºC durante 5-10 min.
Proceda a um exame visual ou microscópico para observar
os sinais de separação das células. Ao microscópio, estas
aparecem ou aglutinadas ou separadas flutuando livremente.
Agite energicamente os frascos para separar todas as células
e, de seguida, junte cerca de 5 ml de meio de cultura A. Agite
energicamente para obter uma suspensão de células
separadas.
– Para preparar as suspensões celulares para a aferição,
disperse as células com precaução aspirando e expirando
com uma pipeta para desfazer os agregados celulares e
conte as células ajustando a concentração das suspensões
em 6 � 105 células por mililitro.
3.2. MULTIPLICAÇÃO DO VÍRUS EMC
O vírus EMC é multiplicado em células L-929 de rato de
modo a obter-se uma suspensão-mãe do vírus. A manutenção
das células L-929 deve ser efectuada por tratamento com
tripsina e repicagem como se descreve para as células Hep2c
(NOTA: em caso de crescimento celular fraco, pode ser
necessário substituir o soro de vitela recém-nascida por soro
fetal de vitela).
Tome vários frascos contendo culturas confluentes de células
L-929. Retire o meio de cultura contido nos frascos. Introduza
em cada frasco 2 ml de suspensão do vírus EMC, previamente
diluído até uma concentração de cerca de 2,5 � 108 UFP/ml
com meio de cultura B. Em cada frasco contendo 4-6 � l07
células L-929 a multiplicidade da infecção será aproximada-
mente de 10 UFP/célula. Disperse com precaução a suspensão
vírica na superfície de um tapete celular, agitando com
movimentos circulares, e coloque de novo na incubadora
durante cerca de 1 h. Mantenha o pH do meio entre 7,4 e 7,8.
Após a adsorção do vírus EMC, junte a cada frasco cerca de 
40 ml de meio de cultura B e volte a colocar na incubadora a
37°C durante cerca de 30 h. Mantenha o pH do meio entre
7,4 e 7,8 para obter um rendimento máximo em vírus.
Recolha o sobrenadante da cultura e conserve-o a cerca 
de 40°C.
Coloque os frascos a -20°C para congelar os tapetes celulares
e, de seguida, aqueça até à temperatura ambiente. Junte cerca
de 5 ml de meio de cultura e agite para romper as membranas
celulares. Passe o conteúdo de cada frasco para o recipiente
que contém o sobrenadante da cultura e transfira esta mistura
para tubos de centrífuga de plástico de 50 ml e centrifugue a
cerca de 500 g durante, aproximadamente 10 min, para separar
os resíduos celulares. Reparta o sobrenadante límpido em tubos
de vidro de tampa roscada em fracções de 20, 10, 5, 1, 0,5 ou 
19. Ponto 5.6(599-604) 11/18/05 12:59 PM Page 601
0,2 ml por tubo, segundo as necessidades. Conserve a -70°C. Os
volumes mais altos podem ser descongelados e divididos em
quantidades mais pequenas e recongelados, se necessário.
Convém, entretanto, notar que esta suspensão-mãe do vírus
EMC não conserva o seu título inicial a não ser que seja
conservada ininterruptamente a cerca de -70°C; ciclos de
congelação-descongelação repetidos ou a conservação a
temperaturas mais elevadas (por exemplo, da ordem de -20°C)
conduzem a uma perda progressiva do título.
3.3. MÉTODO DE AFERIÇÃO
3.3.1. Determinação do intervalo de medida
Preparação das soluções de interferão
Dilua o padrão de interferão apropriado (por exemplo, um
padrão OMS de um subtipo de interferão específico) no meio
de cultura A de modo a obter uma série de diluições de razão
10 cobrindo o intervalo de doses de 1 000-0,001 UI/ml. Utilize
placas de microtitulação de 96 cavidades. Introduza em cada
cavidade 100 µl de meio de cultura A. Junte a todas as cavi-
dades, com excepção das que servirão de testemunhas
«vírus», cerca de 100 µl de cada uma das diluições da
preparação padrão. Misture cuidadosamente o conteúdo das
cavidades com uma pipeta multicanais regulada para 100 µl.
Distribuição da suspensão celular
Verta numa placa de Petri estéril a suspensão de células
Hep2c ajustada de modo a conter cerca de 6 � 105 células por
mililitro de meio de cultura A e reparta o conteúdo da placa
de Petri nas cavidades da placa de microtitulação utilizando
uma pipeta multicanais regulada para 100 µl.
Coloque as placas na incubadora a 37°C em atmosfera com 
5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h.
Infecção pelo vírus
Nesta etapa, verifique ao microscóprio que os tapetes de células
Hep2c são confluentes, que apresentam uma distribuição
celular relativamente uniforme, que a morfologia está
correcta e que as célulasestão de boa saúde.
Esvazie, então, a maior parte do meio de cultura contido nas
cavidades, procedendo do seguinte modo: inverta a placa,
sacuda-a e seque-a com papel absorvente (deve proceder-se
sempre do mesmo modo para esvaziar o líquido contido nas
cavidades). Dilua a suspensão-mãe do vírus EMC com meio de
cultura A fresco de modo a obter um título infeccioso de
cerca de 3 x 107 UFP/ml (NOTA: são necessários cerca de 
20 ml de vírus diluído para cada placa, mais 5-10 por cento
de volume suplementar). Coloque a suspensão diluída numa
placa de Petri estéril de 9 cm e, de seguida, com uma pipeta
multicanais regulada para 200 µl, reparta o conteúdo da placa
por todas as cavidades (compreendendo as que servem de
testemunhas «vírus»), com excepção das previstas como
testemunhas «células»; nestas últimas, junte cerca de 200 µl
de meio de cultura A que não contenha vírus.
Volte a colocar as placas na incubadora a 37°C, em atmosfera
com 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h.
Coloração
Examine as placas ao microscópio para confirmar o efeito
citopatogénico produzido pelo vírus EMC sobre as testemunhas
«vírus». O tempo necessário para obter um efeito citopatogé-
nico máximo pode variar de uma aferição para outra devido à
variabilidade intrínseca da reacção das células Hep2c à prova
vírica num determinado período da cultura em contínuo.
Remova a maior parte do meio de cultura contido nas cavidades
para uma solução descontaminante apropriada (por exemplo,
hipoclorito de sódio). Junte nas cavidades solução salina
tamponada de pH 7,4 R e remova-a para uma solução
descontaminante. Introduza em cada cavidade 150 µl de solução
de coloração e deixe a coloração das células efectuar-se
durante cerca de 30 min à temperatura ambiente; de seguida,
remova a solução de coloração para uma solução descontami-
nante. Junte nas cavidades cerca de 150 µl de solução de
fixação, deixe agir durante 10 min à temperatura ambiente e
remova a solução de fixação para uma solução descontaminante.
Lave os tapetes celulares colocando as placas num recipiente
de plástico em água corrente. Seque superficialmente as
placas com papel absorvente. Seque, de seguida, a uma
temperatura compreendida entre 20 e 37°C até evaporação
total da humidade.
Junte em cada cavidade 150 µl de hidróxido de sódio 0,1 M.
Elua o corante agitando suavemente as placas ou batendo
com elas repetidas vezes na palma da mão. Assegure-se que a
repartição da coloração é uniforme no conjunto das cavidades
antes de proceder às determinações espectrofotométricas.
Determine a absorvência em 610-620 nm usando um leitor de
placas de microtitulação, utilizando como «branco» uma
cavidade, ou uma linha de cavidades, que não contenham
células mas 150 µl de hidróxido de sódio 0,1 M. Calcule as
concentrações do padrão de interferão que corresponde,
respectivamente, à redução máxima e à redução mínima do
efeito citopatogénico. Estas concentrações definem o
intervalo de medida que será utilizado para a aferição.
3.3.2. Aferição
Efectue a aferição segundo o método que antes se descreveu,
utilizando:
– Como soluções problema, uma série de diluições a 1/2 da
amostra em meio de cultura A, cujas concentrações
nominais preencham o intervalo de medida da aferição, 
– como soluções padrão, uma série de diluições a 1/2 em
meio de cultura A do padrão apropriado (por exemplo, um
padrão OMS de um subtipo de interferão específico), cujas
concentrações nominais preencham o intervalo de medida
da aferição.
3.3.3. Análise dos resultados
Os resultados das aferições da actividade antivírica ajustam-se
geralmente a uma curva dose-resposta de tipo sigmóide,
quando se constrói o gráfico da concentração em interferão
(logaritmo do inverso da diluição) em função da absorvência.
Construa a curva da concentração em interferão (logaritmo do
inverso da diluição) em função da absorvência determinada,
para as soluções padrão e para as soluções problema. Conside-
rando só a zona linear da curva, calcule o teor em interferão
da amostra por comparação das respostas obtidas com as
soluções problema e as soluções padrão, segundo os métodos
estatísticos habituais para os ensaios em linhas paralelas.
4. VALIDAÇÃO DE OUTROS MÉTODOS
4.1. ESCOLHA DA LINHA CELULAR E DO VÍRUS
Para a aferição da actividade antivírica dos interferões podem
ser utilizados um certo número de outras combinações linha
celular/vírus, por exemplo, o vírus EMC com células do
epitelioma pulmonar A549, o vírus Forest Semliki (vírus SF)
ou o vírus Sindbis com fibroblastos humanos, o vírus da
estomatite vesicular com fibroblastos diplóides humanos, a
5.6. Aferição dos interferões
602 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
19. Ponto 5.6(599-604) 11/18/05 12:59 PM Page 602
linha celular amniótica humana WISH ou a 
linha de células renais bovinas de Madin-Darby. A combinação
linha celular/vírus escolhida deve ser, geralmente, aquela 
cuja resposta à preparação de interferão a titular apresentar 
a sensibilidade máxima e que permita obter respostas paralelas
com preparações da amostra e do padrão do interferão.
4.2. ESCOLHA DA TÉCNICA DE COLORAÇÃO VITAL
A técnica de coloração atrás descrita permite determinar o
número residual de células viáveis. Podem ser igualmente
utilizadas outras técnicas, nomeadamente a coloração com
violeta de metilo ou com violeta de cristal, ou o método de
conversão do azul de tiazol (MTT). Em todos os casos, o
critério de escolha do método deve ser a obtenção, entre a
coloração e o número de células viáveis, de uma relação que
apresente uma linearidade e uma sensibilidade satisfatórias.
4.3. VALIDAÇÃO ESTATÍSTICA
Como todas as aferições biológicas efectuadas segundo o
modelo de linhas paralelas, a aferição da actividade antivírica
deve satisfazer às condições estatísticas habituais de linearidade
da resposta, de paralelismo e de variância.
4.4. VALIDAÇÃO DO PLANO DE ENSAIO
Como para todas as aferições em placas de microtitulação, é
necessária uma validação do plano do ensaio utilizado. É
importante, nomeadamente, despistar os erros resultantes de
uma ordem de distribuição não aleatória nas cavidades ou o
efeito de bordo da placa, e eliminá-los efectuando um plano de
aferição aleatória ou evitando utilizar cavidades com bordos.
5. REAGENTES E MEIOS DE CULTURA
Meio de cultura A (soro de vitela recém-nascida: 10 por cento)
Meio de cultura RPMI 1640, se necessário adicionado 
de antibióticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina 
10 ng/ml) 450 ml
L-Glutamina, 200 mM, estéril 5 ml
Soro de vitela recém-nascida 50 ml
Meio de cultura B (soro fetal de vitela: 2 por cento
Meio de cultura RPMI 1640, se necessário adicionado 
de antibióticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina 
10 ng/ml) 490 ral
L-Glutamina, 200 mM, estéril 5 ml
Soro fetal de vitela 10 ml
Solução de coloração
Negro de naftaleno 0,5 g
Ácido acético glacial 90 ml
Acetato de sódio anidro 8,2 g
Água q.b.p 1 000 ml
Solução de fixação
Formaldeído (40 por cento) 100 ml
Ácido acético glacial 90 ml
Acetato de sódio anidro 8,2 g
Água q.b.p. 1 000 ml
603FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.6. Aferição dos interferões
5.
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19. Ponto 5.6(599-604) 11/18/05 12:59 PM Page 603
605FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
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5.7. QUADRO 
DAS CARACTERÍSTICAS
DOS RADIONUCLIDOS
CITADOS 
NA FARMACOPEIA
PORTUGUESA
5.7. Quadro das características dos radionuclidos 
citados na Farmacopeia Portuguesa ........................ 607
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 605
5.
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5.7. QUADRO DAS CARACTERÍSTICAS
DOS RADIONUCLIDOS CITADOS 
NA FARMACOPEIA PORTUGUESA
O quadro seguinte é publicado para completar a monografia
geral «Preparações radiofarmacêuticas».
Os valores foram obtidos a partir da base de dados do National
Nuclear Data Center (NNDC) situado no Brookhaven National
Laboratory, Upton, NY., Estados Unidos da América,
directamente acessível pela Internet: 
«http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html».
Se for preferida uma outra fonte de informações(valores mais
recentes), deve ser mencionada explicitamente.
Outras fontes de dados:
* DAMRI (Département des Applications et de la Métrologie
des Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, França),
607FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.7. Quadro das características dos radionuclidos
** PTB (Physikalisch-Technishe Bundesanstalt,
Braunschweig, Alemanha),
*** NPL (National Physical Laboratory, Teddington,
Middlesex, Reino Unido).
A incerteza da semi-vida é dada entre parêntesis. Em
princípio, o número entre parêntesis é o valor numérico da
incerteza-padrão dos últimos dígitos correspondentes
ao valor indicado («Guide to the Expression of 
Uncertainty in measurement», International Organisation for
Standardisation (ISO), 1993, ISBN 92-67-20188-3).
São utilizadas as abreviaturas seguintes:
eA = electrões Auger,
ec = electrões de conversão,
�– = electrões,
�+ = positrões,
� = raios gama,
X = raios X
Azoto-13 (13N)
Césio-137 (137Cs)
em equilíbrio 
com Bário-137m
(137mBa)
Carbono-11 (11C)
Chumbo-203 (203Pb)
9,965 (4) min �+ 0,492 (I) (máx: 1,198) 99,8 � 0,511 199,6 (II)
20,385 (20) min �+ 0,386 (I) (máx: 0,960) 99,8 � 0,511 199,5 (II)
30,04 (3) anos eA 0,026 0,8 X 0,005 1
0,032-0,036 7
(137mBa: ec 0,624 8,0
2,552 (1) min) 0,656 1,4 � 0,662 85,1
�– 0,174 (I) 94,4
0,416 (I) 5,6
9,33 (3) h eA 0,055 3 X 0,070-0,073 69
0,083 19
ec 0,246 8,5
0,276 2 � 0,331 79
0,316 2,3 0,361 9,9
0,406 2,0
0,585 3,6
0,692 4,3
0,767 3,2
0,826 2,4
0,908 5,7
0,946 7,9
1,099 1,8
1,277 1,6
51,873 (9) h eA 0,055 3,0 X 0,010 37,0
0,071-0,073 69,6
ec 0,194 13,3 0,083 19,4
� 0,279 80,8
0,401 3,4
(I) Energia média do espectro �.
(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.
Radionuclido Semi-vida
Tipo
Emissão electrónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Tipo
Emissão fotónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Chumbo-201 (201Pb)
(produz Tálio-201
radioactivo)
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 607
5.7. Quadro das características dos radionuclidos
608 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
(I) Energia média do espectro �.
(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.
Crípton-81m (81mKr)
Crómio-51 (51Cr)
Enxofre-35 (35S)
Flúor-18 (18F)
Fósforo-32 (32P)
Fósforo-33 (33P)
Estrôncio-89 (89Sr)
em equilíbrio com
Ítrio-89m (89mY)
Estrôncio-90 (90Sr)
em equilíbrio com
Ítrio-90 (90Y)
77,27 (3) dias eA 0,006 47 X 0,006-0,007 25
�+ 0,179 (I) 0,9 � 0,511 38,0 (II)
0,631 (I) 18,1 0,847 100,0
1,038 14,1
1,175 2,2
1,238 66,1
1,360 4,3
1,771 15.5
2,015 3,0
2,035 7,8
2,598 17,0
3,202 3,1
3,253 7,6
271,79 (9) dias eA + ec 0,006-0,007 177,4 X 0,006-0,007 57
ec 0,014 7,4 � 0,014 9,2
0,115 1,8 0,122 85,6
0,129 1,3 0,136 10,7
0,692 0,15
70,86 (7) dias eA 0,006 49,4 X 0,006-0,007 26,3
�+ 0,201 (I) 14,9 � 0,511 29,9 (II)
0,811 99,4
0,864 0,7
1,675 0,5
5,2714 (5) anos �– 0,096 (I) (máx. 0,318) 99,9 � 1,173 100,0
1,333 100,0
13,10 (3) s ec 0,176 26,4 X 0,012-0,014 17,0
0,189 4,6
� 0,190 67,6
27,7025 (24) dias eA 0,004 67 X 0,005 22,3
� 0,320 9,9
87,51 (12) dias �– 0,049 (I) (máx: 0,167) 100
50,53 (7) dias �– 0,583 (I) (máx: 1,492) 99,99 � 0,909 0,01
(89mY: 16,06 (4) s)
28,74 (4) anos �– 0,196 (I) (máx: 0,546) 100
(90Y: 64,l0 (8) h)
109,77 (5) min �+ 0,250 (I) (máx: 0,633) 96,7 � 0,511 193,5(II)
14,26 (4) dias �– 0,695 (I) (máx: 1,71) 100
25,34 (12) dias �– 0,076 (I) (máx: 0,249) 100
Radionuclido Semi-vida
Tipo
Emissão electrónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Tipo
Emissão fotónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Cobalto-57 (57Co)
Cobalto-58 (58Co)
Cobalto-60 (60Co)
Cobalto-56 (56Co)
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 608
609FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.7. Quadro das características dos radionuclidos
5.
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(I) Energia média do espectro �.
(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.
Gálio-66 (66Ga)
Gálio-67 (67Ga)
Germânio-68 (68Ge)
em equilíbrio com
Gálio-68 (68Ga)
Gálio-68 (68Ga)
Índio-110 (110In)
Índio-110m (110m In)
Índio-114m (114mIn)
em equilíbrio com
Índio-114(114In)
Índio-111 (111In)
9,49 (7) h eA 0,008 21 X 0,009-0,010 19,1
�+ 0,157 (I) 1 � 0,511 112 (II)
0,331 (I) 0,7 0,834 5,9
0,397 (I) 3,8 1,039 37
0,782 (I) 0,3 1,333 1,2
1,90 (I) 50 1,919 2,1
2,190 5,6
2,423 1,9
2,752 23,4
3,229 1,5
3,381 1,5
3,792 1,1
4,086 1,3
4,295 4,1
4,807 1,8
3,2612 (6) dias eA 0,008 62 X 0,008-0,010 57
ec 0,082-0,084 30,4 � 0,091-0,093 42,4
0,090-0,092 3,6 0,185 21,2
0,175 0,3 0,209 2,4
0,300 16,8
0,394 4,7
0,888 0,15
67,629 (24) min eA 0,008 5,1 X 0,009-0,010 4,7
�+ 0,353 (I) 1,2 � 0,511 178,3
0,836 (I) 88,0 1,077 3,0
270,82 (27) dias eA 0,008 42,4 X 0,009-0,010 44,1
�+ 0,353 (I) 1,2 � 0,511 178,3
(68Ga: 67,629 (24) min) 0,836 (I) 88,0 1,077 3,0
4,9 (1) h eA 0,019 13,4 X 0,023-0,026 70,5
� 0,642 25,9
0,658 98,3
0,885 92,9
0,938 68,4
0,997 10,5
69,1 (5) min eA 0,019 5,3 X 0,023-0,026 27,8
�+ 1,015 (I) 6,1 � 0,511 123,4 (II)
0,658 97,8
2,129 2,1
2,8047 (5) dias eA 0,019 15,6 X 0,003 6,9
0,023-0,026 82,3
ec 0,145 7,8
0,167-0,171 1,3 0,171 90,2
0,219 4,9 � 0,245 94,0
0,241-0,245 1,0
49,51 (1) dia eA 0,162 40 X 0,023-0,027 36,3
0,186-0,190 40
� 0,190 15,6
*�– 0,777 (I) (máx: 1,985) 95 0,558 3,2
(114In: 71,9 (1) s) 0,725 3,2
Radionuclido Semi-vida
Tipo
Emissão electrónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Tipo
Emissão fotónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 609
5.7. Quadro das características dos radionuclidos
610 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
(I) Energia média do espectro �.
(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.
Iodo-133 (133I) 
(produz Xénon-133
radioactivo)
Iodo-135 (135I)
(produz Xénon-135
radioactivo)
Molibdénio-99 (99Mo)
em equilíbrio com
Tecnécio-99m (99mTc)
13,27 (8) h eA 0,023 12,3 X 0,004 9,3
0,027-0,031 86,6
lc 0,127 13,6
0,154 1,8 � 0,159 83,3
0,158 0,4 0,346 0,1
0,440 0,4
0,505 0,3
0,529 1,4
0,538 0,4
59,402 (14) dias eA + ec 0,004 80 X 0,004 15,5
0,023-0,035 33 0,027 114
0,031 26
� 0,035 6,7
13,11 (5) dias eA 0,023 6 X 0,027-0,031 42,2
ec 0,354 0,5 � 0,388 34
0,634 0,1 0,491 2,9
0,511 2,3 (II)
�– 0,109 (I) 3,6 0,666 33
0,290 (I) 32,1 0,754 4,2
0,459 (I) 8,0 0,880 0,8
1,420 0,3
�+ 0,530 (I) 1
8,02070 (11) dias ec 0,46 3,5 X 0,029-0,030 3,9
0,330 1,6
� 0,080 2,6
0,284 6,1
�– 0,069 (I) 2,1 0,365 81,7
0,097 (I) 7,3 0,637 7,2
0,192 (I) 89,9 0,723 1,8
20,8 (1) h �– 0,140 (I) 3,8 � 0,530 87
0,162 (I) 3,2 0,875 4,5
0,299 (I) 4,2 1,298 2,4
0,441 (I) 83
6,57 (2) h �– 0,140 (I) 7,4 � *0,527 13,8
0,237 (I) 8 0,547 7,2
0,307 (I) 8,8 0,837 6,7
0,352 (I) 21,9 1,039 8,0
0,399 (I) 8 1,132 22,7
0,444 (I) 7,5 1,260 28,9
0,529 (I) 23,8 1,458 8,7
1,678 9,6
1,791 7,8
64,10 (8) h �– 0,934 (I) (máx: 2,280) 100
65,94 (1) h �– 0,133 (I) 16,4 X 0,018-0,021 3,6
0,290 (I) 1,1
0,443 (I) 82,4 � 0,041 1,1
0,141 4,5
0,181 6
0,366 1,2
(99mTc: 6,01(1) h) 0,740 12,1
0,778 4,3
Radionuclido Semi-vida
Tipo
Emissão electrónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Tipo
Emissão fotónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Iodo-123 (123I)
Iodo-125 (125I)
Iodo-126 (126I)
Iodo-131 (131I)
Ítrio-90 (90Y)
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 610
611FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.7. Quadro das características dos radionuclidos
5.
 T
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s 
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is
(I) Energia média do espectro �.
(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.
Tálio-200 (200Tl)
Tálio-201 (201Tl)
Tálio-202 (202Tl)
Tecnécio-99m (99mTc)
Tecnécio-99 (99Tc)
Telúrio-121 (121Te)Oxigénio-15 (15O) 122,24 (16)s �+ 0,735 (I) (máx: 1,732) 99,9 � 0,511 199,8 (II)
4,576 (5) h eA 0,011 31,3 X 0,013-0,014 57,2
ec 0,176 25,0 � 0,190 64
0,188 4,3 0,446 23,2
0,457 3,0
�+ 0,253 (I) 1,8 0,510 5,3
0,447 (I) 25,0 0,511 54,2
(81mKr: 13,10 (3) s 0,538 2,2
39,26 (2) dias eA + ec 0,017 12 X 0,020-0,023 9,0
ec 0,030-0,039 88,3 � 0,497 91
0,610 5,8
�– 0,031 (I) 6,6
(103mRh: 0,064 (I) 92,9
56,144 (20) min)
26,1 (1) h ec 0,285 3,4 X 0,010 32,0
0,353 1,4 0,069-0,071 63,3
0,08 17,5
�+ 0,495 (I) 0,3
� 0,368 87,2
0,579 13,8
0,828 10,8
1,206 29,9
1,226 3,4
1,274 3,3
1,363 3,4
1,515 4,0
72,912 (17) h ec 0,016-0,017 17,7 X 0,010 46,0
0,027-0,029 4,1 0,069-0,071 73,7
0,052 7,2 0,080 20,4
0,084 15,4
0,153 2,6 � 0,135 2,6
0,167 10,0
12,23 (2) dias eA 0,054 2,8 X 0,010 31,0
0,069-0,071 61,6
ec 0,357 2,4 0,080 17,1
� 0,440 91,4
2,11 � 105 anos �– 0,085 (I) (máx: 0,294) 100
6,01(1) h ec 0,002 74 X 0,018-0,021 7,3
eA 0,015 2,1 � 0,141 89,1
ec 0,120 9,4
0,137-0,140 1,3
**19,16 (5) dias eA 0,022 11,6 X 0,026-0,030 75,6
� 0,470 1,4
0,508 17,7
Radionuclido Semi-vida
Tipo
Emissão electrónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Tipo
Emissão fotónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Ruténio-103 (103Ru)
em equilíbrio 
com Ródio-103m
(103mRh)
Rubídio-81 (81Rb)
em equilíbrio com
Cripton-81m (81mKr)
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 611
5.7. Quadro das características dos radionuclidos
612 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
154,0 (7) dias eA 0,003 88,0 X 0,026-0,031 50,5
0,022-0,023 7,4
� 0,212 81,4
ec 0,050 33,2 1,102 2,5
(121Te: 19,16(5) dias 0,077 40,0
0,180 6,1
*12,33 (6) anos *�– *0,006 (I) (máx: 0,019) *100
11,84 (7) dias eA 0,025 6,8 X 0,004 8,3
0,030 44,0
ec 0,129 61 0,034 10,2
0,159 28,5
0,163 8,3 � 0,164 2,0
5,243 (1) dias eA 0,026 5,8 X 0,004 6,3
0,031 40,3
ec 0,045 55,1 0,035 9,4
0,075-0,080 9,9
� 0,080 38,3
�– 0,101 (I) 99,0
2,19 (1) dias eA 0,025 7 X 0,004 7,8
0,030 45,9
ec 0,199 64,0 0,034 10,6
0,228 20,7
0,232 46 � 0,233 10,0
9,14 (2) h ec 0,214 5,5 X 0,031-0,035 5,0
�– 0,171 3,1 � 0,250 90,2
0,308 96,0 0,608 2,9
Radionuclido Semi-vida
Tipo
Emissão electrónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Tipo
Emissão fotónica
Energia (MeV)
Probabilidade 
de emissão
(por 100
desintegrações)
Trítio (3H)
Xénon-131m (131mXe)
Xénon-133 (133Xe)
Xénon-133m (133Xe)
(produz Xénon-133
radioactivo)
Xénon-135 (135Xe)
Telúrio-121m (121mTe)
em equilíbrio com
Telúrio-121 (121Te)
(I) Energia média do espectro �.
(II) Probabilidade de emissão máxima correspondente a uma aniquilação total na fonte por 100 desintegrações.
20. Ponto 5.7(605-612) 11/18/05 1:00 PM Page 612
613FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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ge
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is
5.8. HARMONIZAÇÃO 
DAS FARMACOPEIAS
5.8. Harmonização das Farmacopeias.............................. 615
21. Ponto 5.8(613-616) 11/18/05 1:02 PM Page 613
5.
 T
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to
s 
ge
ra
is
5.8. HARMONIZAÇÃO 
DAS FARMACOPEIAS
Este capítulo geral serve somente como informação. Contém
indicações sobre o grau de harmonização e, por consequência,
da possibilidade de intermutação dos diversos capítulos gerais
e monografias da Farmacopeia dos Estados Unidos da América
do Norte, da Farmacopeia Europeia e da Farmacopeia Japo-
nesa. Não modifica em nada o estatuto das monografias e
capítulos gerais que fazem fé em caso de dúvida ou litígio
quando a conformidade com a Farmacopeia é solicitada.
A Comissão da Farmacopeia Europeia reconhece a utilidade de
uma cooperação com outras farmacopeias para a elaboração de
monografias e capítulos gerais harmonizados. Esta harmoni-
zação é totalmente compatível com os objectivos da Comissão
e apresenta diversas vantagens, nomeadamente a simplificação
e a racionalização dos métodos de controlo da qualidade e os
processos de registo. Aliás, esta harmonização auxilia positi-
vamente os trabalhos da Conferência Internacional sobre a
Harmonização (ICH) e a Cooperação Internacional sobre a
Harmonização Veterinária (VICH) na medida em que certas
notas explicativas dependem dos capítulos gerais da Farmaco-
peia para a sua aplicação.
Os trabalhos de harmonização são realizados de uma forma
bem definida, mas informal, no Grupo de Discussão das
615FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.8. Harmonização das Farmacopeias
Farmacopeias (PDG) que associa a Farmacopeia dos Estados
Unidos, a Farmacopeia Europeia e a Farmacopeia Japonesa.
Informações sobre os pontos que serão tratados pelo PDG
figurarão nas versões posteriores do presente capítulo.
A harmonização dos capítulos gerais tem como fim a obtenção
de métodos ou normas intercambiáveis; tal implica que a
conformidade estabelecida com ajuda de uma das farmacopeias
será exactamente a mesma se o capítulo correspondente de
uma qualquer das outras farmacopeias tiver sido utilizado.
Qualquer diferença residual entre os capítulos gerais harmoni-
zados das três farmacopeias será descrita nas sucessivas versões
do presente capítulo.
A harmonização das monografias tem como fim obter normas
idênticas para todas as características de uma substância. A
harmonização integral de certas monografias pode revelar-se
difícil por causa, por exemplo, de diferenças de estatuto jurídico
ou de interpretações divergentes. Se tal acontecer, a PDG
decidiu aprovar e publicar monografias em que o maior número
possível de elementos terão sido harmonizados. Os elementos
divergentes que subsistem nas monografias harmonizadas serão
descritos nas sucessivas versões do presente capítulo.
As três farmacopeias decidiram não modificar unilateralmente
as monografias e capítulos gerais harmonizados; as revisões
serão efectuadas simultaneamente pelas três farmacopeias
segundo o processo mais conveniente.
21. Ponto 5.8(613-616) 11/18/05 1:02 PM Page 615
617FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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5.9. POLIMORFISMO
5.9. Polimorfismo.............................................................. 619
22. Ponto 5.9(617-620) 11/18/05 1:03 PM Page 617
5.
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5.9. POLIMORFISMO
O polimorfismo (ou polimorfismo cristalino) é a capacidade
de um composto no estado sólido se apresentar em várias
formas cristalinas diferentes enquanto que a sua composição
química não varia. O estado sólido de uma molécula pode
apresentar-se igualmente numa forma não cristalina
designada pelo termo amorfa.
Quando o fenómeno é observado para um corpo simples ou
elemento (enxofre, por exemplo) o termo polimorfismo
substitiu-se por alotropia.
O termo pseudomorfismo é utilizado para os solvatos
(incluindo os hidratos) nos quais um solvente participa na
malha cristalina em proporções estequiométricas; por vezes,
por extensão, este termo é empregado igualmente para os
compostos de inclusão nos quais o solvente está englobado na
malha em proporções variáveis. Por isso, o termo
«pseudopolimorfismo» é ambíguo dada a sua utilização em
situações diferentes; é, portanto, preferível só reter os termos
«solvatos» e «hidratos».
Quando uma monografia indica que a substância apresenta
polimorfismo, pode tratar-se de um polimorfismo cristalino
verdadeiro, da existência de um solvato, de alotropia ou da
existência de uma forma amorfa.
A constância da composição química implica que todas as
formas cristalinas e a forma amorfa de uma dada espécie
apresentam um comportamento químico idêntico em solução
ou à fusão; pelo contrário, as suas características físico-
-químicas e físicas (solubilidade, dureza, compressibilidade,
massa volúmica, ponto de fusão, etc.) e, por consequência, a
sua reactividade e a sua biodisponibilidade poderão ser
diferentes no estado sólido.
Quando uma molécula apresenta polimorfismo, a forma mais
estável termodinamicamente é aquela cuja entalpia livre é
mínima a uma dada temperatura e pressão. As outras formas
encontram-se num estado chamado metastável. Nas
condições normais de temperatura e pressão, uma forma no
estado metastável pode manter-se imutável ou poderepresentar uma transição para uma forma
termodinamicamente mais estável.
Se existem várias formas cristalinas, uma de entre elas é
termodinamicamente mais estável a uma certa pressão e
temperatura. Uma dada forma cristalina pode constituir uma
fase que é susceptível de se encontrar em equilíbrio com
outras fases sólidas e também com as fases líquida e gasosa.
Se cada uma das formas cristalinas é a mais estável a
determinada temperatura, a passagem de uma para outra é
reversível: neste caso, a transição é chamada de
619FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.9. Polimorfismo
enanteotrópica. Ao contrário, se só uma das formas é estável a
qualquer temperatura, a transição é irrreversível ou
monotrópica. A passagem de uma fase a outra é um equilíbrio
de variância 1 o que explica que a uma dada pressão este
estado é caracterizado por uma temperatura chamada de
temperatura de transição.
As formas cristalinas diferentes ou solvatos podem ser geradas
por variação das condições de cristalização (temperatura,
pressão, solvente, concentração, velocidade de cristalização,
indução do meio de cristalização, presença e concentração de
impurezas, etc.).
O estudo do polimorfismo pode ser realizado utilizando as
seguintes técnicas:
– difracção de raios-X dos pós,
– difracção de raios-X de um só cristal,
– análise térmica (2.2.34) (calorimetria diferencial,
termogravimetria, termomicroscopia),
– microcalorimetria,
– análise de absorção da água,
– microscopias óptica e electrónica,
– ressonância magnética nuclear no estado sólido,
– espectrofotometria de absorção no infravermelho (2.2.24),
– espectrometria de Raman (2.2.48),
– determinação da solubilidade e da velocidade intrínseca de
dissolução,
– determinação da massa volúmica.
Estas técnicas são muitas vezes complementares e é
indispensável utilizar várias.
Os diagramas pressão/temperatura e energia/temperatura
baseados nos dados analíticos são ferramentas úteis para
conhecer as relações energéticas (enanteotropismo,
monotropismo) e a estabilidade termodinâmica de cada
modificação de um composto polimórfico.
No caso dos solvatos, a análise calorimétrica diferencial e a
termogravimetria devem ser privilegiadas, associadas a
determinações da solubilidade e da velocidade intrínseca de
dissolução e à difracção de raios-X.
No caso dos hidratos, o estabelecimento das isotérmicas de
absorção/desabsorção da água deve ser efectuado para
conhecer as zonas de estabilidade relativa.
Em geral, os hidratos são menos solúveis na água que as
formas anidras e os solvatos são menos solúveis no seu
solvente que as formas não solvatadas.
22. Ponto 5.9(617-620) 11/18/05 1:03 PM Page 619
621FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.
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is
5.10. CONTROLO
DAS IMPUREZAS NAS
SUBSTÂNCIAS PARA USO
FARMACÊUTICO
5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso
farmacêutico ............................................................ 623
23. Ponto 5.10(621-626) 11/18/05 1:03 PM Page 621
5.
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5.10. CONTROLO DAS IMPUREZAS 
NAS SUBSTÂNCIAS 
PARA USO FARMACÊUTICO
Preâmbulo
As monografias das substâncias para uso farmacêutico da
Farmacopeia têm como objectivo assegurar uma qualidade
destas substâncias que seja aceite pelos utilizadores. Tendo
em conta a missão que a Farmacopeia desempenha em
matéria de saúde pública, é indispensável que as suas
monografias permitam um controlo adequado das impurezas.
As exigências de qualidade são estabelecidas na base de
considerações de ordem científica, técnica e regulamentar.
As exigências relativas às impurezas figuram, por um lado,
nas monografias específicas e, por outro, na monografia geral
«Substâncias para uso farmacêutico» que são
complementares: as monografias específicas fixam os critérios
de aceitação das impurezas, enquanto que a monografia geral
define as exigências relativas à qualificação, identificação e
declaração das impurezas orgânicas eventualmente presentes
nos princípios activos.
Os limiares de declaração, de identificação e de qualificação
especificados na monografia geral «Substâncias para uso
farmacêutico» aplicam-se a todas as substâncias aparentadas.
Entretanto, se uma monografia não inclui ensaio das
substâncias aparentadas apoiado num método quantitativo, a
presença de impurezas novas de teor superior a um dos
limites arrisca-se a passar desapercebida porque o ensaio não
permite detectá-la.
As exigências da rubrica «Substâncias aparentadas» da
monografia «Substâncias para uso farmacêutico»,
nomeadamente no que respeita aos limiares, não se aplica aos
excipientes, como também são excluídos das disposições desta
rubrica os produtos biológicos, os peptidos, os
oligoelementos, os produtos radiofarmacêuticos, os produtos
de fermentação e produtos semi-sintéticos derivados, os
produtos à base de plantas e os produtos brutos de origem
animal ou vegetal. Se os limiares indicados na monografia
geral não se aplicam, os conceitos gerais de declaração, de
identificação (na medida do possível) e de qualificação das
impurezas são em compensação válidos para estas classes de
substâncias.
Bases da elaboração das monografias da Farmacopeia
A elaboração das monografias visa as substâncias presentes
nos medicamentos que foram autorizados pelas Autoridades
competentes que aderiram à Farmacopeia Europeia. Estas
monografias não incluem, portanto, necessariamente todas as
substâncias para uso farmacêutico presentes no mercado
mundial.
As impurezas orgânicas e inorgânicas presentes nas
substâncias objecto de avaliação pelas Autoridades
competentes são, por este facto, qualificadas do ponto de vista
da sua inocuidade no teor máximo autorizado (dose diária
máxima), a menos que novos dados sobre a inocuidade,
posteriores à avaliação, justifiquem limites mais baixos.
As monografias das substâncias para uso farmacêutico da
Farmacopeia Europeia são elaboradas por grupos de peritos e
grupos de trabalho que funcionam em colaboração com as
Autoridades nacionais da Farmacopeia, as autoridades
competentes em matéria de autorização de entrada no
623FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico
mercado, os laboratórios nacionais de controlo e o laboratório
da Farmacopeia Europeia; eles são igualmente assistidos nas
suas tarefas pelos produtores das substâncias e/ou fabricantes
da indústria farmacêutica que as utilizam.
Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico
A qualidade das substâncias no que respeita às impurezas é
controlada por um conjunto de ensaios prescritos nas
monografias. Estes ensaios têm como finalidade incluir as
impurezas orgânicas e inorgânicas pertinentes em vista das
origens donde provieram as substâncias activas contidas nos
medicamentos autorizados.
O controlo dos solventes residuais é objecto das disposições
contidas na monografia geral «Substâncias para uso
farmacêutico» e no capítulo geral «Solventes residuais». O
certificado de conformidade para uma monografia da
Farmacopeia Europeia indica, para uma substância de uma dada
origem, quais são os solventes residuais controlados assim
como os critérios de aceitação específicos e o método de
controlo validado se for diferente dos métodos descritos no
capítulo geral «Identificação e controlo dos solventes residuais».
As monografias das substâncias químicas orgânicas
comportam geralmente um ensaio intitulado «Substâncias
aparentadas» que abarca as impurezas orgânicas pertinentes.
Pode ser completado por outros ensaios, específicos, quando o
ensaio de carácter geral não permite controlar uma dada
impureza ou quando razões particulares (por exemplo, em
relação com a inocuidade) justificam que seja prescrito um
controlo especial.
Quando a monografia cobre substâncias que apresentam
perfis de impurezas diferentes, pode conter um ensaio das
substâncias aparentadas único que inclua todas as impurezas
mencionadas na rubrica «Impurezas» ou incluir vários
ensaios que permitam o controlo de todos os perfis de
impurezas. É, então, possível verificar a conformidadeda
monografia aplicando somente os ensaios que são pertinentes
com vista ao perfil de impurezas conhecido para a substância
e a origem consideradas.
Podem, assim, figurar instruções relativas ao controlo das
impurezas na rubrica «Produção» numa monografia, por
exemplo, quando só um método de controlo de uma impureza
é utilizado pelo fabricante porque é tecnicamente demasiado
complexo para ser de uso geral ou não pode ser aplicado à
substância farmacêutica final e/ou quando a validação do
processo de produção (compreendendo a etapa de purificação)
constitui uma garantia de controlo suficiente.
Rubrica «lmpurezas» das monografias de princípios activos
A rubrica «Impurezas» de uma monografia apresenta a lista
das impurezas (com estrutura e denominação química, na
medida do possível), geralmente orgânicas, de que se sabe que
são detectadas pelos ensaios prescritos na monografia. Esta
informação é baseada nos dados disponíveis quando da
elaboração ou da revisão da monografia e não é
necessariamente exaustiva. A rubrica compreende as
impurezas especificadas e, se for caso disso, as outras
impurezas detectáveis.
A todas as impurezas especificadas está associado um critério
de aceitação que não é superior ao autorizado pelas
Autoridades competentes.
As outras impurezas detectáveis são impurezas potenciais de
estrutura definida que não são normalmente presentes para
23. Ponto 5.10(621-626) 11/18/05 1:03 PM Page 623
além de um limiar de identificação nas substâncias que
entram na composição de medicamentos autorizados pelas
Autoridades competentes. São citadas para informação na
rubrica «Impurezas».
Se além das impurezas especificadas e outras impurezas
detectáveis de um princípio activo aparecer qualquer outra
impureza, incumbe ao utilizador da substância verificar, em
função do teor e da natureza dessa impureza bem como da
dose diária máxima e do limiar de identificação/qualificação
apropriado se a sua identificação/qualificação é ou não
necessária em termos da monografia geral «Substâncias para
uso farmacêutico», rubrica «Substâncias aparentadas».
É importante notar que limiares específicos são aplicados às
substâncias para uso exclusivamente veterinário.
Interpretação do ensaio das substâncias aparentadas nas
monografias dos princípios activos
Qualquer monografia específica de uma substância para uso
farmacêutico deve ser lida e interpretada conjuntamente com
a monografia geral «Substâncias para uso farmacêutico».
Quando uma monografia estabelece, para as impurezas, um
critério de aceitação geral («qualquer outra impureza»,
«outras impurezas», «qualquer impureza») que equivale a um
teor nominal superior ao limiar de identificação aplicável para
a substância considerada (ver monografia geral «Substâncias
para uso farmacêutico») este limite aplica-se unicamente às
impurezas especificadas citadas na rubrica «Impurezas». Se
são presentes outras impureza, convém determinar, à luz das
disposições da monografia geral, se é necessário identificá-las
(na medida do possível), declará-las, especificá-las e 
qualificá-las. Incumbe ao utilizador da substância determinar
a validade dos critérios de aceitação para as impurezas não
citadas na rubrica «Impurezas» ou citadas como outras
impurezas detectáveis.
Os exemplos juntos são apresentados com a finalidade de
ajudar à interpretação dos critérios de aceitação das
impurezas nas monografias específicas. Estes exemplos
correspondem a diversas apresentações redaccionais
actualmente empregadas nas monografias na expectativa de
uma harmonização para uma futura edição.
Exemplo 1
A monografia de uma substância para uso humano inclui
uma rubrica «Impurezas» onde estão incluídas 8 impurezas
(A-H) das quais 2 (G,H) mencionadas como outras impurezas
detectáveis e especifica os critérios de aceitação seguintes:
– impureza A: no máximo, a área do pico principal do croma-
tograma obtido com a solução padrão (b) (0,5 por cento),
– qualquer outra impureza: no máximo, a área do pico
principal do cromatograma obtido com a solução padrão
(c) (0,2 por cento),
– total: no máximo, 2 vezes a área do pico principal do croma-
tograma obtido com a solução padrão (b) (1,0 por cento),
– limite de exclusão: 0,25 vezes a área do pico principal do croma-
tograma obtido com a solução padrão (c) (1,0 por cento),
Uma substância satisfará ao ensaio se:
– a impureza A está presente numa concentração nominal
inferior ou igual a 0,5 por cento,
– as impurezas B, C, D, E e F estão cada uma presentes numa
concentração nominal inferior ou igual a 0,2 por cento,
– qualquer outra impureza está presente numa concentração
nominal inferior ou igual ao limiar de identificação
aplicável para a substância activa considerada,
– a soma das concentrações nominais das impurezas
presentes num teor superior ao limite de exclusão é
inferior ou igual a 1,0 por cento.
Exemplo 2
A monografia de uma substância para uso humano inclui
uma rubrica «Impurezas» onde são incluídas 6 impurezas 
(A-F) com os critérios de aceitação seguintes:
Se, no cromatograma obtido com a solução problema,
aparecerem outros picos, além do pico principal, nenhum
tem área superior à área do pico principal do cromatograma
obtido com a solução padrão (b) (0,5 por cento) e a soma das
suas áreas não é superior a 2 vezes a área do pico principal do
cromatograma obtido com a solução padrão (b) (1,0 por
cento). Não considere um pico devido ao «branco» nem picos
de área inferior a 0,1 vezes a área do pico principal do
cromatograma obtido com a solução padrão (b).
Uma substância satisfará ao ensaio se:
– as impurezas A, B, C, D, E e F estão cada uma presentes numa
concentração nominal inferior ou igual a 0,5 por cento,
– qualquer outra impureza está presente numa concentração
nominal inferior ou igual ao limiar de identificação
aplicável para a substância activa considerada,
– a soma das concentrações nominais das impurezas
presentes num teor superior ao limite de exclusão é
inferior ou igual a 1,0 por cento.
Exemplo 3
A monografia, mais explícita, de uma substância para uso
humano cuja dose diária máxima não ultrapassa 2 g/dia inclui
uma rubrica «Impurezas» onde estão incluídas 7 impurezas
(A-F) definidas como Impurezas especificadas e 1 (G)
mencionada como Outras impurezas detectáveis.
Limites:
– factor de correcção: para o cálculo do teor, multiplique a
área do pico da impureza A por 2,3,
– impureza B: no máximo, 3 vezes a área do pico principal
do cromatograma obtido com a solução padrão (a) 
(0,3 por cento),
– impureza E: no máximo, 4 vezes a área do pico principal do 
cromatograma obtido com a solução padrão (a) (0,4 por cento),
– impurezas A, C, D e F: para cada impureza, no máximo, 2
vezes a área do pico principal do cromatograma obtido com
a solução padrão (a) (0,2 por cento),
– qualquer outra impureza: para cada impureza, no máximo,
a área do pico principal do cromatograma obtido com a
solução padrão (a) (0,1 por cento),
– total: no máximo, a área do pico principal do cromatograma
obtido com a solução padrão (b) (1,0 por cento),
– limite de exclusão: 0,5 vezes a área do pico principal do croma-
tograma obtido com a solução padrão (a) (0,05 por cento).
Uma substância satisfará ao ensaio se:
– a impureza B está presente numa concentração nominal
inferior ou igual a 0,3 por cento,
– a impureza E está presente numa concentração nominal
inferior ou igual a 0,4 por cento,
5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico
624 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
23. Ponto 5.10(621-626) 11/18/05 1:03 PM Page 624
– as impurezas A, C, D e F estão cada uma presentes numa
concentração nominal inferior ou igual a 0,2 por cento,
sendo a área do pico da impureza A multiplicada por 2,3
para o cálculo do teor,
– qualquer outra impureza está presente numa concentração
nominal inferior ou igual a 0,10 por cento (limiar de
identificação),
– a soma das concentrações nominais das impurezas
presentes num teor superior ao limite de exclusão é
inferior ou igual a1,0 por cento.
Recomendações aos utilizadores de monografias de
princípios activos
As monografias fornecem especificações que visam garantir
que as substâncias cujos perfis de impurezas correspondem
aos tomados em conta quando da elaboração e/ou revisão da
monografia são de qualidade apropriada. Incumbe ao
utilizador da substância verificar se a monografia permite um
controlo adequado das impurezas para uma substância de
determinada origem, nomeadamente por meio do processo de 
certificação de conformidade das monografias da Farmacopeia.
Uma monografia que inclui um ensaio de substâncias
aparentadas baseado num método quantitativo (por exemplo,
a cromatografia líquida, a cromatografia em fase gasosa e a
electroforese capilar) assegura um controlo adequado das
impurezas, para uma substância de uma determinada origem,
se as impurezas presentes num teor superior ao limiar de
identificação aplicável são impurezas especificadas
mencionadas na rubrica «Impurezas».
Se a substância contém outras impurezas além das
mencionadas na rubrica «Impurezas», há que verificar se elas
são detectáveis pelo método descrito na monografia. Se não
for esse o caso, será necessário desenvolver um novo método
e solicitar a revisão da monografia. Segundo os teores
detectados e os limites propostos, será de encarar a
identificação e/ou a qualificação destas impurezas.
Quando um ensaio de substâncias aparentadas único cobre
vários perfis de impurezas, só são de mencionar no certificado
de análise as impurezas pertinentes para o perfil conhecido
associado a uma origem particular, a menos que o detentor da
autorização de colocação no mercado não utilize substâncias
activas que apresentem perfis de impurezas diferentes.
Identificação das impurezas (atribuição dos picos)
Quando uma monografia especifica um limite individual para
uma impureza, é muitas vezes necessário definir um meio de
identificar essa impureza, por exemplo, com a ajuda de
substâncias de referência, de um cromatograma representativo
ou da retenção relativa. O utilizador pode julgar necessário
identificar impurezas para além daquelas para as quais a
monografia fornece um meio de identificação, por exemplo,
com o objectivo de verificar a aplicabilidade da especificação
de um determinado perfil de impurezas por comparação com a
rubrica «Impurezas». A Farmacopeia não fornece outras
substâncias de referência, cromatogramas representativos ou
informações sobre as retenções relativas além dos indicados na
monografia. Cabe, pois, aos utilizadores escolher as técnicas
científicas de identificação disponíveis.
Novas impurezas/impurezas especificadas presentes num
teor superior ao limite indicado
Quando a utilização de um novo método de produção ou a
modificação de um processo já utilizado conduz ao
aparecimento de uma nova impureza, é necessário aplicar as
prescrições da monografia geral «Substâncias para uso
farmacêutico», no que respeita a identificação e qualificação,
e verificar a capacidade da monografia de permitir o controlo
dessa impureza. Os certificados de conformidade constituem
um meio de confirmar, para uma substância de determinada
origem, que a nova impureza é adequadamente controlada,
ou fazer a proposta de um método de controlo com um
critério de aceitação definido. Neste último caso, será
determinada uma revisão da monografia.
Quando a utilização de um novo método de produção ou a
modificação de um processo já utilizado conduz à presença de
uma impureza especificada com um teor superior ao limite
especificado, é necessário aplicar as disposições da monografia
geral «Substâncias para uso farmacêutico» no que respeita à
qualificação.
Métodos cromatográficos
O capítulo geral 2.2.46. Técnicas de separação cromatográfica
trata de diferentes aspectos do controlo das impurezas.
Para todos os fins úteis, estão disponíveis no site da DEQM
(www.pheur.org) informações sobre o nome comercial das
colunas e outros reagentes e equipamentos que demonstraram
serem convenientes quando da elaboração das monografias.
GLOSSÁRIO
Outras impurezas detectáveis: impurezas potenciais de
estrutura definida de que se sabe que são detectadas pelos
ensaios da monografia mas que não são normalmente
presentes acima do limiar de identificação nas substâncias
que entram na composição dos medicamentos autorizados
pelas Autoriidades competentes. Fazem parte das impurezas
não especificadas e são, portanto, limitadas por um critério de
aceitação global.
Concentração nominal: concentração de uma impureza
calculada a partir da concentração da solução padrão prescrita
e tendo em conta o factor de correcção prescrito.
Impureza: numa substância para uso farmacêutico, qualquer
composto além da entidade química definida como sendo essa
substância.
Impureza identificada: impureza cuja caracterização
estrutural foi realizada.
Impureza não identificada: impureza cuja caracterização
estrutural não foi realizada e que é unicamente definida por
propriedades analíticas de ordem qualitativa (retenção
relativa, por exemplo).
Impureza não especificada: impureza limitada por um
critério de aceitação global e não individualmente citada com
um critério de aceitação específico.
Impureza potencial: impureza teoricamente susceptível de
aparecer quando da produção ou da conservação. Pode ou
não estar efectivamente presente na substância. Quando se
sabe que uma impureza potencial é detectada pelos ensaios
da monografia mas não é normalmente presente nas
substâncias que entram na composição dos medicamentos
autorizados pelas Autoridades competentes, ela será citada
para informação na rubrica «Impurezas» nas Outras
impurezas detectáveis.
625FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico
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23. Ponto 5.10(621-626) 11/18/05 1:03 PM Page 625
Impureza especificada: impureza individualmente citada e limi-
tada numa monografia por um critério de aceitação específico.
Uma impureza especificada pode ser ou não ser identificada.
Limite de exclusão: nos ensaios cromatográficos, teor nominal
até ao dos picos/sinais não são considerados para o cálculo da
soma das impurezas. O limite de exclusão e o limiar da
declaração têm geralmente o mesmo valor numérico.
Qualificação: processo de aquisição e de avaliação dos dados
que estabelecem a inocuidade biológica de uma impureza
especificada ou de um determinado perfil de impurezas no
teor ou teores especificados.
Limiar de declaração: limite a partir do qual uma impureza
deve ser declarada.
Limiar de qualificação: limite a partir do qual tem lugar a
qualificação de uma impureza. 
Limiar de identificação: limite a partir do qual uma impureza
deve ser identificada.
Substâncias aparentadas: nas monografias, título dado aos
ensaios de carácter geral para as impurezas orgânicas.
5.10. Controlo das impurezas nas substâncias para uso farmacêutico
626 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
23. Ponto 5.10(621-626) 11/18/05 1:03 PM Page 626
627FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
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5.11. CARACTERÍSTICAS
NAS MONOGRAFIAS
5.11. Características nas monografias.............................. 629
24. Ponto 5.11(627-630) 11/18/05 2:03 PM Page 627
629FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.11. Características nas monografias
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5.11. CARACTERÍSTICAS 
NAS MONOGRAFIAS
Como se indica nas Prescrições Gerais, as indicações que
figuram na rubrica «Características» não são para interpretar
de modo rigoroso e não constituem exigências. A título de
informação para os utilizadores, os métodods recomendados
pelos autores das monografias como base para as indicações
dizendo respeito à higroscopicidade, cristalinidade e
solubilidade são apresentadas a seguir.
HIGROSCOPICIDADE
Este método é para ser realizado nos produtos em cuja
monografia se exige que satisfaçam aos ensaios de perda por
secagem ou de água. Dá indicação da higroscopicidade da
substância sem ser uma verdadeira determinação desta.
Utilize uma caixa de pesagem de vidro de 50 mm deou por dispositivo transdérmico (compreendendo
a película protectora e a camada de suporte).
– Enterobactérias e outras bactérias Gram-negativas (2.6.13).
Dispositivos transdérmicos: ausência de bactérias,
verificada em 1 dispositivo (comprendendo a película
protectora e a camada de suporte). Outras preparações: no
máximo, 10 bactérias por grama ou por mililitro.
– Ausência de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1,0 g,
1 ml ou 1 dispositivo (comprendendo a película protectora
e a camada de suporte) (2.6.13).
– Ausência de Staphylococcus aureus verificada em 1,0 g, 
1 ml ou 1 dispositivo (comprendendo a película protectora
e a camada de suporte) (2.6.13).
Categoria 3
A. Preparações para administração por via oral ou rectal
– Contagem de germes aeróbios viáveis totais (2.6.12). No
máximo, 103 bactérias e 102 leveduras por grama ou por
mililitro.
– Ausência de Escherichia coli (1,0 g ou 1,0 ml).
519FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.1.4. Qualidade microbiológica das preparações farmacêuticas
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15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 519
B. Preparações para administração por via oral contendo
matérias primas de origem natural (animal, vegetal ou
mineral), quando é impossível um pré-tratamento
antimicrobiano e é autorizada para as matérias primas
uma contaminação microbiana superior a 103
microrganismos por grama ou por mililitro. Excluem-se
os medicamentos com base em plantas descritos na
categoria 4.
– Contagem de germes aeróbios viáveis totais (2.6.12). No
máximo, 104 bactérias e 102 fungos e leveduras por
grama ou mililitro.
– Enterobactérias e outras bactérias gram-negativas. No
máximo, 102 bactérias por grama ou por mililitro
(2.6.13).
– Ausência de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).
– Ausência de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
– Ausência de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
(2.6.13).
Categoria 4
Medicamentos com base em plantas, exclusivamente
compostos por uma ou várias drogas vegetais (inteiras, em
fragmentos ou em pó).
A. Medicamentos com base em plantas que necessitam do
uso de água fervente.
– Contagem dos germes aeróbios viáveis totais (2.6.12).
No máximo, 107 bactérias e 105 fungos e leveduras por
grama ou por mililitro.
– No máximo, 102 Escherichia coli por grama ou por
mililitro (2.6.13), utilizando diluições apropriadas.
B. Outros medicamentos com base em plantas em que não
intervem a água fervente.
– Contagem dos germes aeróbios viáveis totais (2.6.12).
No máximo, 105 bactérias e 104 fungos e leveduras por
grama ou por mililitro.
– Enterobactérias e outras bactérias gram-negativas. No
máximo. 103 bactérias por grama ou por mililitro
(2.6.13).
– Ausência de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
– Ausência de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).
5.1.5. APLICAÇÃO DO CONCEITO F0
À ESTERILIZAÇÃO PELO VAPOR 
DAS PREPARAÇÕES AQUOSAS
Esta secção é publicada a título de inforrnação.
O valor F0 associado a um processo de esterilização pelo vapor
saturado exprime a sua letalidade, em termos de tempo (em
minutos) de exposição à temperatura de 121°C que seria
necessário para obter o mesmo resultado que com o processo
utilizado, aplicado ao produto na sua embalagem final, em
relação aos microrganismos que possuem um valor de Z de 10.
O vator F0 total de um processo tem em conta as fases de
aquecimento e de arrefecimento do ciclo e pode ser calculado
por integração relativamente aos tempos das taxas de
letalidade associados a intervalos de temperatura pouco
pronunciados.
Quando um ciclo de esterilização pelo vapor é escolhido na
base do conceito F0, é confirmado que ele permite obter, de
modo constante, uma adequada segurança de esterilidade.
Para validar o processo, pode igualmente ser necessário
efectuar um acompanhamento microbiológico contínuo e
rigoroso durante a produção de rotina para demonstrar que
os parâmetros microbiológicos se mantêm compreendidos
dentro das tolerâncias estabelecidas para obter um NSE de,
pelo menos, 10–6.
Na esterilização pelo vapor, Z caracteriza a resistência de um
microrganismo às variações de temperatura. Define-se como a
variação de temperatura necessária para modificar o valor D
de um factor de 10.
D é o valor de um parâmetro de esterilização (duração ou
dose absorvida) necessário para reduzir até 10 por cento do
valor inicial o número de micorganismos viáveis. D só tem
significado em condições experimentais bem definidas.
Entre estes diferentes parâmetros existem as seguintes
relações matemáticas:
F0 = D121 (log N0 – log N) = D121 log IF
D121 = valor de D dos esporos de referência (5.1.2) a 121°C,
N0 = número inicial de microrganismos viáveis,
N = número final de microrganismos viáveis,
IF = factor de inactivação.
Z = 
D1 = valor de D do microrganismo à temperatura T1,
D2 = valor de D do microrganismo à temperatura T2.
IF = N0 – N = 10t/D
t = tempo de exposição,
D = valor de D do microrganismo nas condições de
exposição.
T2 – T1��
log D1 – log D2
5.1.5. Aplicação do conceito F0 à esterilização pelo vapor das preparações aquosas
520 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5 e 5.1.(511-520) 11/18/05 12:30 PM Page 520
521FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
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5.2. TEXTOS GERAIS
SOBRE VACINAS
5.2. Textos gerais sobre vacinas ...................................... 523
5.2.1. Terminologia utilizada nas monografias 
das vacinas .................................................... 523
5.2.2. Bandos de frangos isentos de 
microrganismos patogénicos específicos 
para a produção e o controlo da qualidade 
das vacinas .................................................... 523
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação 
de vacinas para uso humano ........................ 525
5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparação 
de vacinas para uso veterinário .................... 529
5.2.5. Substâncias de origem animal utilizadas na
preparação de vacinas para uso veterinário .......... 531
5.2.6. Avaliação da inocuidade das vacinas para uso
veterinário .................................................................. 532
5.2.7. Avaliação da eficácia das vacinas para uso 
veterinário .............................................................. 534
5.2.8. Minimização do risco da transmissão de agentes 
de encefalopatias espongiformes animais por 
produtos medicamentosos para uso humano e 
para uso veterinário .............................................. 534
5.2.9. Avaliação da inocuidade de cada lote de vacinas 
e soros para uso veterinário .................................. 538
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 521
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5.2. TEXTOS GERAIS 
SOBRE VACINAS
5.2.1. TERMINOLOGIA UTILIZADA 
NAS MONOGRAFIAS DAS VACINAS
Sistema de lote semente. Sistema em que lotes sucessivos de
um produto derivam do mesmo lote semente primário. Para a
produção de rotina, um lote semente de trabalho é preparado
a partir do lote semente primário. A origem e a história das
passagens do lote semente primário e do lote semente de
trabalho são registadas.
Lote semente primário. Cultura de um microrganismo
distribuída, a partir de um único granel, em recipientes
processados em conjunto numa única operação de forma a
assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir a
contaminação. Um lote semente primário na forma liquida é
normalmente conservado a uma temperatura igual ou
inferior a -70°C. Um lote semente primário liofilizado é
conservado a uma temperatura que reconhecidamente
assegure a sua estabilidade.
Lote semente de trabalho. Cultura de microrganismo a partir
do lote semente primário e que se destina a ser utilizado na
produção. Os lotes semente de trabalho são distribuídos em
recipientes e conservados como descrito anteriormente para o
lote semente primário.
Sistema de banco de células. Sistema em que lotes sucessivos
de um produto são fabricados a partir de culturas de células
que derivam do mesmo banco de células primário. Utiliza-se
um certo número de recipientes dodiâmetro
externo e 15 mm de altura. Pese a caixa e a tampa (m1).
Introduza a quantidade de substância especificada no ensaio
de perda por secagem ou água e pese de novo (m2). Coloque a
caixa não fechada num exsicador apropriado contendo uma
solução saturada de cloreto ou de sulfato de amónio, a 25°C,
ou numa estufa climática regulada para 25°C e 80 ± 2 por
cento de humidade relativa. Deixe em repouso durante 24 h.
Coloque a tampa na caixa e pese (m3).
Calcule o aumento de massa em percentagem usando a
expressão:
� 100
O resultado é expresso do seguinte modo:
– deliquescente: absorção de água suficiente para que haja
formação de uma solução,
– muito higroscópico: aumento de massa superior ou igual a
15 por cento,
– higroscópico: aumento de massa inferior a 15 por cento e
superior ou igual a 2 por cento,
– ligeiramente higroscópico: aumento de massa inferior a 2
por cento e superior ou igual a 0,2 por cento.
CRISTALINIDADE
Este método é empregado para estabelecer o carácter
cristalino ou amorfo de uma substância.
m3 � m2
�m2 � m1
Numa lâmina de vidro limpa coloque algumas partículas da
amostra em óleo mineral. Examine ao microscópio
polarizante. As partículas cristalinas apresentam uma
birrefringência e observam-se posições de extinção quando da
rotação do suporte da lâmina.
SOLUBILIDADE
A quantidade máxima de substância necessária para este
ensaio é de 111 mg (para cada solvente) e o volume máximo
de solvente é de 30 ml.
Procedimento de dissolução
Agite energicamente durante 1 min e coloque numa manta
termostatada à temperatura de 25,0 ± 0,5°C durante 15 min.
Se a dissolução da amostra for incompleta, agite novamente
durante 1 min e coloque na manta termostatada durante mais
15 min.
Método
Pese para um tubo com rolha esmerilada (160 mm � 160 mm)
100 mg da amostra finamente pulverizada (90). Junte 0,1 ml
do solvente e proceda como descrito no procedimento de
dissolução. Se a dissolução for completa, a amostra é muito
solúvel.
Se a dissolução for incompleta, junte 0,9 ml do solvente e
proceda como descrito no procedimento de dissolução. Se a
dissolução for completa a amostra é facilmente solúvel.
Se a dissolução for incompleta, junte 2,0 ml do solvente e
proceda como descrito no procedimento de dissolução. Se a
dissolução for completa a amostra é solúvel.
Se a dissolução for incompleta, junte 7,0 ml do solvente e
proceda como descrito no procedimento de dissolução. Se a
dissolução for completa a amostra é ligeiramente solúvel.
Se a dissolução for incompleta, pese 10 mg da amostra
finamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte 
10,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento
de dissolução. Se a dissolução for completa a amostra é pouco
solúvel.
Se a dissolução for incompleta, pese 1 mg da amostra
finamente pulverizada (90) para um tubo rolhado, junte 
10,0 ml do solvente e proceda como descrito no procedimento
de dissolução. Se a dissolução for completa a amostra é muito
pouco solúvel.
24. Ponto 5.11(627-630) 11/18/05 2:03 PM Page 629
Menu inicialbanco de células primário
para preparar o banco de células de trabalho. O sistema de
banco de células é validado no nível máximo de passagens que
se atinge na produção de rotina.
Banco de células primário. Uma cultura de células distribuída
em recipientes numa única operação, processados em
conjunto e conservados de forma a assegurar a uniformidade
e a estabilidade e a prevenir a contaminação. Um banco de
células primário é normalmente conservado a uma
temperatura igual ou inferior a -70°C.
Banco de células de trabalho. Cultura de células derivada do
banco de células primário e destinada a ser utilizada na
preparação de culturas de células de produção O banco de
células de trabalho é distribuído em recipientes e processado
e conservado como descrito para o banco de células
primário.
Cultura de células primárias. Cultura de células obtida por
tripsinização de um órgão ou tecido apropriado. As células
são essencialmente idênticas às do tecido animal de origem e
não têm mais do que 5 passagens in vitro após a preparação
inicial obtida a partir do tecido animal.
Linhas celulares. Cultura de células com elevada capacidade
de multiplicação in vitro. Nas linhas celulares diplóides, as
células têm essencialmente as mesmas características que as
do tecido animal de origem. Nas linhas celulares contínuas,
as células são capazes de se multiplicarem indefinidamente
em cultura e podem ser obtidas de tecidos sãos ou tumorais.
Algumas linhas celulares contínuas podem, em certas
condições, ter actividade oncogénica.
523FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas
Cultura de células de produção. Cultura de células derivada
de um ou de vários recipientes do banco de células de
trabalho ou cultura de células primárias destinadas a ser
utilizadas na produção.
Células testemunha. Quantidade de células reservadas, no
momento da inoculação do vírus, a servirem de células
testemunha não inoculadas. As culturas são incubadas em
condições similares às culturas celulares utilizadas na produção.
Colheita única. Material colhido por uma ou várias vezes de
uma única cultura celular de produção inoculada com o
mesmo lote semente de trabalho ou com uma suspensão
proveniente do lote semente de trabalho, incubado e colhido
num único ciclo de produção.
Mistura monovalente de colheitas. Mistura de colheitas
contendo a mesma estirpe ou tipo de microrganismo ou
antigénio e derivadas de ovos, de recipientes de culturas
celulares etc. e processadas ao mesmo tempo.
Granel final. Produto submetido a todas as fases de fabrico com
exclusão do acondicionamento final. É constituído por uma ou
várias misturas de colheitas monovalentes, provenientes de
culturas de uma ou mais espécies ou tipos de microrganismos,
após eventual clarificação, diluição ou adição de adjuvante ou
outra substância auxiliar. É tratado de forma a assegurar a sua
homogeneidade e utilizado para enchimento dos recipientes
pertencentes a um ou a vários lotes finais.
Lote final. Um conjunto de recipientes definitivos, fechados, ou
de outras unidades de dosagem, que se espera seja homogéneo
nomeadamente no que respeita ao risco de contaminação
durante o enchimento ou preparação do produto final. As
unidades de dosagem são cheias ou preparadas de forma
diferente, a partir do mesmo granel final, liofilizadas em
conjunto, se for o caso, e fechadas numa única sessão contínua
de trabalho. Levam um número ou um código de identificação
que identifica o lote final. Quando o granel final é cheio e/ou
liofilizado em várias sessões de trabalho diferentes, resultam
vários lotes finais aparentados (também chamados sublotes ou
lotes de repartição) que normalmente são identificados com
uma parte comum no número ou código de identificação.
Vacinas combinadas. Preparação com vários componentes,
formulada de tal forma que os vários antigénios são
administrados simultaneamente. Os diferentes componentes
antigénicos destinam-se a proteger contra diferentes tipos ou
estirpes do mesmo microrganismo e/ou contra diferentes
espécies de microrganismos. Uma vacina mista pode ser
apresentada pelo fabricante, quer sob a forma de uma
preparação líquida única ou liofilizada, quer sob a forma de
vários constituintes acompanhados das indicações necessárias
para a mistura antes da utilização.
5.2.2. BANDOS DE FRANGOS ISENTOS
DE MICRORGANISMOS PATOGÉNICOS
ESPECÍFICOS PARA A PRODUÇÃO 
E O CONTROLO DA QUALIDADE 
DAS VACINAS
INTRODUÇÃO
Quando uma monografia o especifica, os frangos, ovos
embrionados e culturas celulares utilizados para a produção e
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 523
controlo de qualidade das vacinas são obtidos a partir de ovos
produzidos por um bando de frangos isentos de
microrganismos patogénicos específicos (SPF). A qualidade de
um bando SPF é assegurada por meio do sistema descrito a
seguir. A lista de microrganismos estabelecida é baseada nos
conhecimentos actuais e será actualizada sempre que for
necessário.
PRINCÍPIOS GERAIS E MÉTODOS
Um bando é definido como um grupo de aves pertencentes a
um meio ambiente comum e cujo criador não teve nenhum
contacto com bandos não SPF. Uma vez o bando definido, não
se junta qualquer ave não SPF.
Nos bandos SPF estabelecidos numa base de rotação, os
nascimentos e a criação do bando de substituição é sempre
efectuada em pavilhões com ambiente controlado. Com
acordo das Autoridades Nacionais, pode ser admitida a
introdução de ovos embrionados SPF provenientes de um
bando SPF controlado, de outro pavilhão do mesmo local. A
partir das 8 semanas de idade, estas aves de substituição são
consideradas como um bando e controladas mensalmente de
acordo com o descrito em «Ensaios posteriores». No
momento da postura, todas as aves de substituição são
controladas de acordo com o indicado em «Ensaio inicial».
O bando é colocado em condições que reduzam ao mínimo o
risco de contaminação. É isolado de qualquer bando não SPF,
instalado num isolador ou sobre uma rede, num pavilhão com
ar filtrado sob pressão positiva. São tomadas medidas
apropriadas a fim de impedir o acesso de roedores, aves
selvagens, insectos e de pessoas não autorizadas.
O pessoal autorizado a penetrar nas instalações não teve
contacto com nenhuma ave ou agente susceptível de infectar
o bando. Aconselha-se ao pessoal a tomar duche e a mudar de
roupa ou usar vestuário protector para entrar no pavilhão.
Os produtos introduzidos no pavilhão são esterilizados. Os
alimentos são submetidos a tratamento apropriado de modo a
evitar a introdução de microrganismos indesejáveis e a água
provém de um reservatório clorado. Nenhum medicamento
que possa interferir com a detecção de doenças no grupo pode
ser administrado.
Mantém-se um registo permanente da saúde geral do bando e
qualquer anomalia é tomada em consideração. Os factores a
controlar compreendem a morbilidade, a mortalidade, a
condição física geral, o consumo de alimentos, a postura
diária e a qualidade dos ovos, a fertilidade e taxa de
nascimentos. Os ovos sujos são eliminados; a superfície dos
ovos limpos ainda quentes pode ser desinfectada.
O bando provém de frangos isentos de agentes patogénicos
transmitidos por via vertical. Em particular, cada frango que
dá origem ao bando é objecto de controlo repetido para
assegurar que está isento do vírus da leucose e dos seus
anticorpos. A fim de estabelecer o estatuto SPF de um bando,
este é mantido nas condições SPF durante um período de
ensaio de, pelo menos, 4 meses. Demonstra-se, após 6
semanas e no fim do período do ensaio, que todos os animais
do bando estão isentos de qualquer manifestação de infecção
provocada pelos agentes que figuram na lista da rubrica
«Ensaio inicial».
Para cada nova geração de um determinado bando, a
totalidade do bando é controlada o mais tardar até à idade de
20 semanas, utilizando os ensaios prescritos em «Ensaio
inicial». Após o ensaio inicial, efectuam-se mensalmente os
ensaios prescritos em «Ensaios posteriores» numa amostra
representativa de 5 por cento (10 aves, no mínimo, e 200, no
máximo) comum ensaio final de 4 semanas após a última
colheita de ovos.
No momento escolhido, colhem-se amostras de sangue, de um
número apropriado de aves, para todos os ensaios. As amostras
de soro obtidas são analisadas para pesquisa de anticorpos
contra os agentes correspondentes. Os ensaios de
seroneutralização são efectuados em misturas de 5 soros, no
máximo. Todos os outros ensaios são efectuados
individualmente em cada soro. Utilizam-se controlos positivos e
negativos em todos os ensaios. Os reagentes utilizados nos
ensaios são aferidos em relação aos reagentes padrão
internacionais ou europeus, caso estes estejam disponíveis. No
caso do vírus da leucose aviária, além da pesquisa de anticorpos
efectuada nas amostras do soro, são colhidas amostras
apropriadas para pesquisa do vírus.
Além dos ensaios serológicos, efectua-se um exame clínico
uma vez por semana, pelo menos, a fim de verificar se as aves
estão isentas do vírus da varíola aviária e de sinais de outras
infecções. Em caso de mortalidade, efectuam-se exames
necrópsicos e, quando necessário para confirmação do
diagnóstico, exames histopatológicos para verificar se as aves
mortas estão ou não isentas de qualquer sinal de infecção.
Verifica-se a ausência de Salmonella spp, pelo exame de
culturas de amostras de fezes, pelo menos uma vez em cada 
4 semanas; pode utilizar-se para os ensaios uma mistura de 
10 amostras, no máximo.
Se se obtiver um resultado positivo num ensaio efectuado
para definir o estatuto SPF de um bando, este não pode ser
qualificado SPF. Se se obtiver um resultado positivo num
ensaio efectuado num bando definido como SPF, o bando
perde o estatuto SPF. Como se descreve a seguir, aplicam-se
disposições especiais para o agente da anemia dos pintos
(AAP). Nenhum frango, embrião ou cultura celular, recolhido
após o último ensaio negativo é utilizado e todos os produtos
obtidos a partir destas colheitas são destruídos e os ensaios de
controlo de qualidade efectuados com estes produtos não são
válidos, devendo ser repetidos.
Para voltar a ter o estatuto SPF, o bando é mantido nas
condições SPF e os ensaios de rotina mensais continuam a ser
efectuados em 5 por cento do bando, excepto para a detecção
do agente causal de infecção que originou o resultado positivo,
em que o ensaio é efectuado mensalmente em todas as aves do
bando. As aves infectadas e a sua descendência são retiradas do
bando. O bando volta a ter o estatuto SPF após 2 ensaios
consecutivos totalmente negativos.
Um resultado positivo no ensaio de pesquisa do AAP não
exclui necessariamente a utilização dos produtos do bando.
No entanto, as vacinas vivas preparadas com substratos
provenientes dos bandos SPF e destinadas a aves com menos
de 7 dias de idade, são preparadas com substratos isentos do
AAP. As vacinas inactivadas administradas a aves com menos
de 7 dias podem ser produzidas a partir de material
proveniente de bandos sem prova de estarem isentos do AAP,
com a condição de se demonstrar que o método de
inactivação utilizado é eficaz para o AAP.
Mantém-se durante, pelo menos, cinco anos, um registo
permanente da mortalidade e dos resultados dos controlos
efectuados no bando. Qualquer constatação da diminuição da
postura ou da taxa de nascimentos, excepto os casos
acidentais identificados como sendo de origem não infecciosa
e a obtenção de resultados indicando a existência de infecção
por um agente específico são imediatamente comunicados ao
utilizador dos ovos.
5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas
524 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 524
ENSAIO INICIAL
Sob reserva de autorização das Autoridades Nacionais,
podem ser utilizados outros tipos de ensaios desde que
possuam uma sensibilidade pelo menos igual á do tipo de
ensaio indicado e uma especificidade apropriada.
5.2.3. SUBSTRATOS CELULARES
UTILIZADOS NA PREPARAÇÃO 
DE VACINAS PARA USO HUMANO
O presente capítulo geral trata das linhas celulares diplóides e 
das linhas celulares continuas utilizadas na preparação de vacinas 
para uso humano; os aspectos específicos das vacinas preparadas 
com a tecnologia do ADN recombinante são tratados na 
monografia «Produtos obtidos pela tecnologia do ADN 
recombinante». O quadro fornece uma lista de ensaios a efectuar 
nas diferentes etapas (células semente, banco de células 
primário, banco de células de trabalho, células pertencentes ao 
nível de duplicação da população, pelo menos, igual ao nível 
máximo que irá ser utilizado na produção). Descrevem-se a 
seguir as disposições gerais respeitantes à utilização das linhas 
celulares e à aplicação dos métodos de ensaio.
Quando uma vacina é produzida com células primárias, ou 
células que foram submetidas apenas a uma pequeno número de 
passagens, sem constituição de um banco de células, as 
exigências aplicáveis à vacina constam da monografia específica.
Linhas celulares diplóides. A linha celular diplóide possui uma
capacidade elevada mas definida de multiplicação in vitro.
Linhas celulares contínuas. Uma linha celular contínua
possui uma capacidade ilimitada de multiplicação in vitro;
muitas vezes as células apresentam diferenças de cariotipo
com as células de origem; podem ser obtidas a partir de um
tecido saudável ou de um tecido tumoral.
525FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação de vacinas para uso humano
5.
 T
ex
to
s 
ge
ra
is
Tipo de ensaio
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Inibição de hemoaglutinação
Anticorpos fluorescentes 
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Seroneutralização contra cada
serotipo presente no país de 
origem
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Seroneutralização
Imunoadsorção com enzima
conjugada para o vírus e
seroneutralização para os
anticorpos
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Inibição de hemoaglutinação
Anticorpos fluorescentes
Anticorpos fluorescentes
lmunoadsorção com enzima
conjugada
Aglutinação e, para confirmar
um ensaio positivo, inibição de
hemoaglutinação
Aglutinação e, para confirmar
um ensaio positivo, inibição de
hemoaglutinação
Aglutinação
Tipo de ensaio
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Inibição de hemaglutinação
Anticorpos fluorescentes 
Microrganismo
Adenovirus aviários
Adenovírus hemoaglutinante
aviário (Vírus da doença dos ovos
moles; vírus do síndrome da queda
da postura 76 – EDS 76 
Agente da anemia dos pintos 
Reovírus aviários
Vírus da encefalomielite aviária
Vírus da bronquite infecciosa
aviária
Vírus da bursite aviária
Vírus da gripe tipo A
Vírus da laringotraqueíte
infecciosa aviária
Vírus da leucose aviária
Vírus da doença de Marek
Vírus da doença de Newcastle
Vírus da nefrite aviária
Vírus via reticuloendoteliose
aviária
Vírus da rinotraqueíte do perú
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma synovise
Sallmonella pulloram
Microrganismo
Adenovírus aviários
Adenovírus hemaglutinante
aviário
Agente da anemia dos pintos 
ENSAIOS POSTERIORES
Sob reserva de autorização das Autoridades Nacionais,
podem ser utilizados outros tipos de ensaios desde que
possuam uma sensibilidade pelo menos igual à do tipo de
ensaio indicado e uma especificidade apropriada.
Microrganismo
Reovírus aviários
Vírus da encefalomielite aviária
Vírus da bronquite infecciosa
aviária
Vírus da bursite aviária
Vírus da gripe tipo A
Vírus da laringotraqueíte
infecciosa aviária
Vírus da leucose aviária
Vírus da doença de Marek
Vírus da doença de Newcastle
Vírus da nefrite aviária
Vírus via reticuloendoteliose
aviária
Vírus da rinotraqueíte do perú
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma synovise
Sallmonella pulloram
Tipo de ensaio
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Imunodifusão contra cada
serotipo presente no país de 
origem
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Seroneutralização
Imunoadsorção com enzima
conjugada para os anticorpos
Imunoadsorção com enzima
conjugada
Inibição dehemaglutinação
Anticorpos fluorescentes
Anticorpos fluorescentes
lmunoadsorção com enzima
conjugada
Aglutinação e, para confirmar
um ensaio positivo, inibição de
hemoaglutinação
Aglutinação e, para confirmar
um ensaio positivo, inibição de
hemoaglutinação
Aglutinação
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 525
No caso de vacinas injectáveis preparadas com uma linha 
celular contínua, o procedimento de purificação é validado 
para se demonstrar a redução da concentração de ADN das 
células do substrato até um nível equivalente, no máximo, a 
10 ng por dose humana unitária, salvo indicação em contrário.
Sistema de banco de células. A produção de vacinas em
linhas celulares contínuas ou em linhas celulares diplóides
baseia-se num sistema de banco de células. A idade in vitro
das células é contada a partir do lote semente primário. Cada
banco de células de trabalho é preparado a partir de 1 ou
vários recipientes do banco de células primário. A utilização,
a identidade e o inventário dos recipientes são
minuciosamente registados.
Meios e substâncias de origem humana ou animal. A
composição dos meios utilizados para o isolamento e para o
conjunto das culturas posteriores é minuciosamente
registado; se são utilizadas substâncias de origem humana ou
animal, elas estão isentas de agentes estranhos.
Se for utilizada albumina humana, ela está em conformidade 
com a monografia «Solução de albumina humana». Através de 
ensaios apropriados, demonstra-se que os soros de origem 
bovina utilizados para a preparação e manutenção das culturas 
celulares são estéreis e isentos de vírus bovinos, nomeadamente 
do vírus da diarreia bovina assim como de micoplasmas.
Efectuam-se ensaios apropriados na tripsina utilizada para a
preparação das culturas celulares para demonstrar a
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação de vacinas para uso humano
526 FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5. Textos gerais
Ensaio
Células
semente
Banco
de células
primário
(BCP)
Banco
de células
de trabalho
(BCT)
Células do nível de duplicação 
de população pelo menos igual 
ao nível máximo que irá ser 
utilizado na produção
QUADRO 1 – Ensaios efectuados nas linhas celulares
Morfologia
Selecção apropriada entre os seguintes
ensaios (por ex. isoenzimas), imunológicos
(por ex. histocompatibilidade), marcadores
citogenéticos, impressão genómica
Cariotipo (linhas celulares diplóides)
Longevidade das células (linhas
celulares diplóides)
Contaminação bacteriana e fúngica
Micoplasmas
Ensaio em culturas celulares
Co-cultura
Ensaios em animais e em ovos
Pesquisa específica de potenciais
contaminantes de acordo com a origem das
células (ver a seguir em «Agentes
contaminantes infecciosos»)
Retrovírus
Poder tumorígeno
� � � �
� � � �
� � �(1) �(1)
� � � �
� � � �
� � � �
� � � �
� � �(2) �(2)
� � �(2) �(2)
� � �(2) �(2)
� �(3) � �(3)
� � � �(4)
1. IDENTIDADE E PUREZA
2. AGENTES ESTRANHOS
3. PODER TUMORÍGENO
(1) A característica diplóide demonstra-se para cada banco de células de trabalho utilizando-se as células com nível de duplicação da população, pelo menos,
igual ao nível máximo que irá ser utilizado para a produção.
(2) Ensaio efectuado em cada banco de células de trabalho utilizando-se as células com nível de duplicação da população, pelo menos, igual ao nível máximo que
irá ser utilizado para a produção.
(3) Ensaio efectuado em cada banco de células primárias utilizando-se as células com nível de duplicação da população, pelo menos, igual ao nível máximo que
irá ser utilizado para a produção.
(4) As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 são reconhecidas como não possuindo poder tumorígeno e não necessitam do ensaio de poder tumorígeno. Os
ensaios de poder tumorígeno já não são realizados em linhas celulares com poder tumorígeno conhecido ou previsto.
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 526
esterilidade e a ausência de micoplasmas e de vírus,
nomeadamente de pestivírus e parvovírus.
Células semente. Os dados na base dos quais é avaliada a
aceitabilidade das células semente compreendem, sempre que
possível, a origem, a história e a caracterização.
Origem das células semente. Para as linhas celulares
humanas, o dossier contem as seguintes informações do
dador: origem étnica e geográfica, idade, sexo, estado
fisiológico geral, tecido ou órgão utilizado, resultados da
eventual pesquisa de agentes patogénicos.
Para as linhas celulares animais, o dossier contém as
seguintes informações da origem das células: espécie,
linhagem, condições de exploração, origem geográfica, idade,
sexo, estado fisiológico geral, tecido ou órgão utilizado,
resultados da eventual pesquisa de agentes patogénicos.
As células de origem neural (por exemplos os neuroblastomas
e as células P12) podem conter substâncias que concentrem
os agentes das encefalopatias espongiformes; estas células não
são utilizadas na produção de vacinas.
História das células semente. O dossier contem as seguintes
informações: método utilizado para isolar as células semente,
os métodos de cultura e qualquer outro procedimento
utilizado para estabelecer o banco de células primário,
nomeadamente aqueles susceptíveis de provocar uma
exposição das células a agentes estranhos.
As informações disponíveis sobre os ingredientes dos meios
de cultura das células, por exemplo a proveniência das
substâncias de origem animal, são muitas vezes incompletas;
em casos justificados e autorizados, os bancos de células já
estabelecidos com esses meios podem ser utilizados para a
produção de vacinas.
Caracterização das células semente. A caracterização das
células semente assenta nos seguintes aspectos:
(1) identidade (por exemplo isoenzimas, serologia, impressão
genómica),
(2) características de crescimento e propriedades morfológicas
(microscopia óptica e electrónica),
(3) cariotipo das linhas celulares diplóides,
(4) longevidade in vitro das linhas celulares diplóides, em
termos do nível de duplicação da população
Estabilidade dos substratos celulares. Demonstra-se que a
linha celular tem uma viabilidade apropriada nas condições
previstas para a sua conservação. Para cada produto preparado
com a linha celular, é necessário demonstrar que pode ser
obtida uma produção reprodutível com as células
pertencentes aos níveis de passagens situadas entre o início e
o fim da duração prevista de utilização.
Agentes contaminantes infecciosos. As linhas celulares
utilizadas para a produção de vacinas estão isentas de agentes
infecciosos. As pesquisas de agentes contaminantes 
efectuam-se como indicado no quadro.
Consoante a origem e a história da linha celular, pode ser
necessária a pesquisa de alguns potenciais contaminantes
específicos, nomeadamente aqueles que reconhecidamente
constituem agentes infecciosos latentes da espécie de
origem (por exemplo o vírus símio 40 para o macaco rhesus).
No caso de linhas celulares provenientes de roedores, são
efectuados ensaios para a produção de anticorpos no
murganho, no rato e no hamster para detectar eventuais
vírus específicos da espécie.
Pesquisam-se retrovírus nas linhas celulares como se
descreve adiante. Se for detectada a presença de retrovírus
capazes de se replicarem, a linha celular não é aceitável para a
produção de vacinas.
Poder tumorígeno. Para a preparação de vacinas vivas, a linha
celular não possui poder tumorígeno ao nível de duplicação
da população utilizada na produção.
Se a linha celular com poder tumorígeno for utilizada na
preparação de outras vacinas, valida-se o sistema de
purificação a fim de demonstrar que a concentração de ADN
proveniente das células é equivalente, no máximo, a 10 ng
por dose humana unitária, salvo indicação em contrário e que
a concentração em proteínas provenientes das células do
substrato é reduzida até um limite aceitável.
Se a linha celular possuir um reconhecido poder tumorígeno,
não é necessário proceder a ensaios de poder tumorígeno. Se
o potencial poder tumorígeno de uma linha celular for
desconhecido, a linha celular é consideradacomo
tumorígena, ou é submetida a um ensaio de poder
tumorígeno in vitro como adiante se descreve; se os
resultados do ensaio in vitro forem negativos ou se não forem
claramente positivos, a linha celular será objecto de um
ensaio in vivo como adiante se descreve. Os ensaios são
efectuados em células pertencentes ao nível de duplicação da
população, pelo menos, igual ao nível máximo que irá ser
utilizado na produção. As linhas celulares MRC-5, WI-38 e
FRhL-2 são reconhecidas como não possuindo poder
tumorigeno e não necessitam do ensaio de poder tumorígeno.
Caracterização genómica. Demonstra-se a diploidia das linhas 
celulares diplóides; se não estiver validada a eliminação de células 
intactas durante o tratamento após a colheita, é necessário 
efectuar uma caracterização mais aprofundada pela análise do 
cariotipo. São examinadas amostras provenientes de 4 níveis de 
passagens regularmente distribuídas pelo período de vida da 
linha celular. Cada exame incide em, pelo menos, 200 células em 
metafase, para se verificar o número exacto de cromossomas e 
avaliar a frequência de hiperploidia, de hipoploidia, de poliploidia, 
de fracturas e de anomalias estruturais.
As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 são reconhecidas
como sendo diplóides e bem caracterizadas; desde que não
tenham sido geneticamente modificadas, não é necessário
efectuar uma caracterização mais aprofundada.
MÉTODOS DE ENSAIO APLICÁVEIS ÀS CULTURAS
CELULARES
Identificação. A identidade das células estabelece-se com base
na impressão genómica e numa escolha apropriada dos
seguintes aspectos:
(1) características bioquímicas (análise dos isoenzimas),
(2) características imunológicas (antigénios de
histocompatibilidade),
(3) marcadores citogenéticos.
Células contaminantes. As impressões genómicas efectuadas
com finalidade de identificação servem igualmente para
demonstrar a ausência de células contaminantes.
Contaminação bacteriana e fúngica. O banco de células
primário e o banco de células de trabalho satisfazem ao
ensaio de esterilidade (2.6.1), efectuado para cada meio em 
10 ml do sobrenadante das culturas celulares e em 1 por
cento dos recipientes, com o mínimo de 2 recipientes.
527FARMACOPEIA PORTUGUESA VIII
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparação de vacinas para uso humano
5.
 T
ex
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s 
ge
ra
is
15. Ponto 5.2.(521-540) 11/18/05 12:32 PM Page 527
Micoplasmas (2.6.7). O banco de células primário e o banco
de células de trabalho satisfazem ao ensaio dos micoplasmas,
efectuado em 1 ou vários recipientes pelo método cultural e
pelo método de epifluorescência em culturas celulares.
Pesquisa de agentes estranhos em culturas celulares. As
células satisfazem ao ensaio dos vírus hemadsorventes e aos
ensaios de pesquisa dos agentes estranhos em culturas
celulares que estão descritos no capitulo 2.6.16 em «Culturas
celulares de produção: células testemunhas». Se as células
são de símio, são também inoculadas em culturas de células
renais de coelho para pesquisa do herpesvírus B (herpesvírus
1 de cercopiteco).
Co-cultura. Co-cultive separadamente células intactas e
células lisadas com outros sistemas celulares compreendendo
células humanas e células de símio. Pesquise a aparição de
eventuais alterações morfológicas. Efectue a pesquisa de
agentes hemaglutinantes nos líquidos de cultura. As células
satisfazem ao ensaio se não houver qualquer indicação da
presença de agente estranho.
Retrovírus. Pesquise a eventual presença de retrovírus:
(1) através de ensaio de infectividade,
(2) por microscopia electrónica de transmissão,
(3) se os ensaios (1) e (2) derem resultados negativos, pela
pesquisa da transcriptase inversa (em presença do
magnésio e do manganésio) realizada nos depósitos
obtidos por centrifugação a alta velocidade.
Ensaio em animais. A cada grupo dos seguintes animais,
injecte por via intramuscular (ou no caso de murganhos
recém-nascidos, por via subcutânea) 107 células viáveis
igualmente repartidas entre os animais do grupo:
(1) 2 ninhadas com, pelo menos, 10 murganhos recém-
-nascidos com menos de 24 horas de idade,
(2) 10 murganhos adultos.
Injecte por via intracerebral em cada um dos 10 murganhos
adultos 106 células viáveis para detecção da eventual presença
do vírus da coriomeningite linfocitária.
Mantenha os animais em observação durante, pelo menos, 4
semanas. Examine os animais que apresentam sintomas de
doença ou anomalia para determinar a sua causa. As células
satisfazem ao ensaio se não se observarem sinais de presença
de agentes estranhos. O ensaio só é válido se, pelo menos, 80
por cento dos animais de cada grupo permanecem de boa
saúde e sobrevivem até ao final do período de observação.
No caso de células de roedores (por exemplo células ováricas
de hamster chinês ou células renais de hamster recém-
nascido), efectue, nos animais aos quais as células foram
injectadas, uma pesquisa de anticorpos contra potencias
contaminantes víricos para a espécie.
Ensaios em ovos. Injecte, pelo menos, 106 células viáveis na
cavidade alantóide de cada um de 10 ovos de galinha SPF
(5.2.2) com 9 a 11 dias idade, e no saco vitelino de 10 ovos de
galinha SPF (5.2.2) com 5 a 6 dias idade. Incube-os durante,
pelo menos, 5 dias. Proceda à pesquisa de hemaglutininas nos
líquidos alantóides, com eritrócitos mamíferos e aviários;
efectue o ensaio a temperaturas de 5 ± 3°C e 20-25°C e
proceda à leitura dos resultados decorridos 30 a 60 min. As
células satisfazem ao ensaio se não se observar qualquer sinal
da presença de agentes estranhos. O ensaio só é válido se,
pelo menos, 80 por cento dos embriões permanecem sãos e
sobrevivem até ao final do período de observação.
Ensaio de poder tumorígeno in vitro. Podem ser utilizados
os seguintes ensaios:
(1) formação de colónias em gelose mole,
(2) produção de crescimento celular invasivo após inoculação
em culturas de órgãos,
(3) estudo da actividade de transformação através, por
exemplo, do sistema de prova 3T3 que põe em evidência a
presença de oncogenes activos.
Ensaio de poder tumorígeno in vivo. O ensaio consiste em
estabelecer uma comparação entre a linha celular continua e
uma testemunha positiva apropriada (por exemplo células
HeLa ou Hep2).
São apropriados os seguintes sistemas animais:
(1) murganhos atímicos (genotipo Nu/Nu),
(2) murganhos, ratos ou hamsters recém-nascidos tratados
com soro ou com globulina antitimocitária,
(3) murganhos timectomizados e irradiados que foram recons-
tituídos CF-, B+) com medula óssea de murganhos sãos.
Qualquer que seja o sistema animal escolhido, a linha celular
e as células de referência são injectadas em grupos distintos
de 10 animais cada um. Em ambos os casos, o inóculo por
animal é de 107 células em suspensão num volume de 0,2 ml
e a injecção pode ser por via intramuscular ou subcutânea. Se
se utiliza animais recém-nascidos, estes são tratados com 
0,1 ml de soro ou globulina antitimocitária nos dias 0, 2, 7 e
14 após o nascimento. São considerados soros ou as
globulinas activos aqueles que suprimem os mecanismos
imunitários dos animais em crescimento ao ponto de a
inoculação das 107 células de referência positivas produzirem
regularmente de tumores e metástases. Se os animais forem
severamente afectados e apresentarem sem ambiguidades
tumores de crescimento progressivo, sacrifique-os antes do
final do ensaio para evitar sofrimento inútil.
No final do período de observação, sacrifique e examine todos
os animais, incluindo os grupos testemunhas; pesquise, no
local de injecção e noutros órgãos por exemplo, os gânglios
linfáticos, os pulmões, os rins e o fígado), sinais
macroscópicos e microscópicos de proliferação das células
inoculadas.
Em todos os casos, examine os animais em intervalos
regulares procedendo à palpação para detectar a formação
eventual de nódulos nos locais de injecção. Meça os nódulos
em 2 direcções perpendiculares e registe regularmente os
resultados das medições para determinar se são de
crescimento progressivo. Se alguns animais apresentarem,
durante a observação,