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GIOVANNA FACHETTI FRIGOLI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ALTERAÇÕES CAUSADAS POR EXPOSIÇÃO AO 
INSETICIDA MALATION DURANTE OS PERÍODOS JUVENIL 
E PERIPUBERAL NO SISTEMA GENITAL FEMININO DE 
RATAS WISTAR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Londrina 
2022 
 
GIOVANNA FACHETTI FRIGOLI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ALTERAÇÕES CAUSADAS POR EXPOSIÇÃO AO 
INSETICIDA MALATION DURANTE OS PERÍODOS JUVENIL 
E PERIPUBERAL NO SISTEMA GENITAL FEMININO DE 
RATAS WISTAR 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso 
apresentado ao Colegiado do Curso de 
Biomedicina da Universidade Estadual de 
Londrina, como requisito parcial à obtenção 
do título de Bacharel Biomedicina. 
 
Orientador: Profa. Dra. Glaura Scantamburlo 
Alves Fernandes 
 
Co-orientador: Ma. Rafaela Pires Erthal 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Londrina 
2022 
 
GIOVANNA FACHETTI FRIGOLI 
 
 
 
 
ALTERAÇÕES CAUSADAS POR EXPOSIÇÃO AO INSETICIDA 
MALATION DURANTE OS PERÍODOS JUVENIL E PERIPUBERAL NO 
SISTEMA GENITAL FEMININO DE RATAS WISTAR 
 
 
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado 
ao Colegiado do Curso de Biomedicina da 
Universidade Estadual de Londrina, como 
requisito parcial à obtenção do título de Bacharel 
Biomedicina. 
 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
 
 
____________________________________ 
Orientadora: Profa. Dra. Glaura Scantamburlo 
Alves Fernandes 
Universidade Estadual de Londrina - UEL 
 
 
 
 
____________________________________ 
Profa. Dra. Roberta Losi Guembarovski 
Universidade Estadual de Londrina - UEL 
 
 
 
 
____________________________________ 
Profa. Dra. Daniela Cristina Ceccato Gerardin 
Universidade Estadual de Londrina - UEL 
 
 
 
Londrina, _____de ___________de _____. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho aos meus pais, 
Alessandra e Marcos, por serem os 
maiores e mais fortes pilares em minha 
vida. 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço, primeiramente, à minha orientadora, Dra. Glaura, por, ao 
longo desses quatro anos e meio de curso, nunca me permitir desistir, sempre me 
apoiando e reconhecendo meu trabalho, até nos momentos em que eu mesma era 
incapaz. 
Ao professor Dr. Wellerson Scarano, por me acolher em seu 
laboratório, permitindo e financiando todo o desenvolvimento da parte molecular de 
meu projeto. Sem que ele acreditasse no potencial deste projeto, e no meu, o trabalho 
estaria sempre incompleto. 
À minha co-orintadora e grande amiga, Mestra Rafaela Erthal, por 
todo o amparo, ensinamentos, amizade, paciência e cumplicidade ao longo dos anos 
de trabalho que me trouxeram até aqui. 
Às minhas amigas e colegas de laboratório, Dayane, Ana Paula, 
Karen, Débora e Ivana que, com muito empenho, me auxiliaram de muitos meios no 
desenvolvimento do projeto e realização dos experimentos, sempre com muita 
disposição e alegria. 
Gostaria de agradecer também à Ma. Ariana Musa, por me ensinar 
toda parte de biologia molecular com muito afinco, e ao meu grande amigo Thiago, 
por me auxiliar em alguns finais de semana durante os experimentos, fugindo de sua 
área de pesquisa, e por todos os anos de amizade e cumplicidade na Universidade. 
Agradeço à meus pais, Alessandra e Marcos, pela minha criação e 
educação, por todo amparo, confiança e amor incondicional que me foi por eles dado 
ao longo de minha vida. Obrigada por me trazerem ao mundo e continuamente 
batalharem para garantir que nada me faltasse na vida. 
Aos meus avós, Elza e Roberto Frigoli (in memorian), Rosa e Maurício 
Fachetti (in memorian), por cuidarem e olharem por mim quando meus pais não 
podiam, por todos os momentos de felicidade, amor e carinho que me deram ao longo 
de meus anos de vida. 
Aos meus padrinhos, Katia e Ronaldo, por serem presentes e me 
apoiarem nas minhas decisões de vida, com muito carinho e amor. 
Às minhas tias, Daniela, Karla e Cynthia, pela companhia, amor e 
cumplicidade e aos meus primo, Enzo, e afilhado, Pietro, pelas brincadeiras, sustos, 
 
companhia e amor compartilhado. 
Ao Victor Negri, por compartilhar seu tempo comigo, me 
proporcionando prazeirosos momentos de diversão, e tentando me ensinar a viver a 
vida um dia de cada vez, com muita cumplicidade e amor. 
Aos pais que a vida me deu, Melissa Rose e Tim Medina, e meus 
irmãos, Makenna Foht, Antonio e Elliot Medina, por cuidarem de mim quando meus 
pais estavam longe demais, por me apoiarem em momentos tão difíceis e abrirem seu 
lar e seus corações pra mim, me tratando como parte de sua família. 
À Jo-ann e Nicholas Valdivia, por terem me acolhido e apoiado, me 
tomando como parte de seu lar, sempre acreditando em mim. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Só quem as vivenciou pode compreender as 
seduções da ciência.” – Mary Shelley 
 
 
 
 
FRIGOLI, Giovanna Fachetti. Alterações causadas por exposição ao inseticida 
malation durante os períodos juvenil e peripuberal no sistema genital feminino 
de ratas Wistar. 2022. 103. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em 
Biomedicina) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2022. 
 
 
RESUMO 
 
 
O malation é um inseticida da classe dos organofosforados muito utilizado nas mais 
diversas culturas agrículas e, em países tropicais, utilizado no combate ao mosquito 
Aedes. Durante seu crescimento, crianças e adolescentes estão expostos a esse 
composto, seja por residirem em áreas de pulverização no combate ao mosquito vetor 
da dengue ou através da ingestão de alimentos contaminados. Sabe-se que a 
puberdade é um período crítico para a maturação do sistema reprodutor, assim, o 
objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da exposição ao malation durante os 
períodos juvenil e peripuberal sobre o desenvolvimento pós-natal do sistema 
reprodutor de ratas Wistar. Para tal, foram utilizadas 30 ratas Wistar, provenientes do 
Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina, distribuídas igualmente em 
três grupos experimentais: os grupos M10 e M50 receberam, respectivamente, 10 e 
50 mg/kg de malation diluído em salina (0,9%), via gavage do DPN 22 ao DPN 60. O 
grupo controle recebeu apenas o veículo durante o período de tratamento. Durante o 
período experimental foi avaliada a instalação da puberdade através do dia de 
abertura vaginal e dia de primeiro estro. Ao final do período de tratamento, foi 
verificada a fase de estro, e os animais foram anestesiados com associação de 
cetamina e xilazina e submetidos a eutanásia por punção cardíaca. Plasma foi 
coletado e destinado para análise de dosagem de estradiol. Os órgãos reprodutivos 
foram coletados, pesados e destinados para análises histopatológicas, morfométricas, 
avaliação do perfil oxidativo e quantificação da expressão dos genes ER-α, ER- β, β-
catenina, Bcl-2, FGF2, FOXO, Slug e TP53 por RT-qPCR. As baixas doses testadas 
foram suficientes para causar alterações histopatológicas nos ovários e úteros das 
ratas expostas, porém, não causaram alterações em parâmetros de instalação da 
puberdade e concentração de estrógeno. O aumento no número de folículos atrésicos 
e do diâmetro folicular nos ovários de fêmeas expostas ao malation ocorrereu em 
decorrência de estresse oxidativo e superexperssão dos genes ER- β, β-catenina, Bcl-
2, Slug e FOXO. No útero desses animais, pode-se observar alteração na proporção 
entre endométrio, miométrio e perimétrio, além da presença de descamação de 
células para o lúmen do órgão, hiperplasia do epitélio endometrial e diminuição na 
altura do epitélio glandular, também decorrentes de alterações no perfil oxidativo e 
superexpressão uterina dos genes ER-α, β-catenina, Bcl-2, FGF2, Slug e TP53. 
Assim, no presente estudo, demonstramos que apesar de não alterar a instalação da 
puberdade nem a concentração de estradiol, a exposição de ratas Wistar a baixas 
doses de malation durante os períodos juvenil e peripuberal alterou a morfometria e 
integridade tecidual, o perfil oxidativo eobservou-se descamação de células no lúmen 
deste órgão, nítida proliferação celular anormal no epitélio luminal, bem como a 
presença de vacúolos nessa mesma camada celular. 
 
Tabela 4 – Parâmetros histológicos uterinos. 
 Grupos experimentais 
Parâmetros Controle 
(n=5 animais) 
M10 
(n=5 animais) 
M50 
(n=5 animais) 
Morfometria uterina (m) 
Miométrio 164,7 ± 6,4 197,3 ± 8,2** 168,6 ± 7,7 
Endométrio 523,3 ± 26,7 505,7 ± 26,5 518,1 ± 32,4 
Perimétrio 172,5 ± 9,9 174,0 ± 12,1 136,1 ± 9,8* 
Epitélio luminal 18,0 ± 0,5 23,8 ± 0,8**** 22,8 ± 1,0**** 
Epitélio glandular 12,8 ± 0,5 12,2 ± 0,5 10,8 ± 0,4*** 
Número de glândulas 27,9 ± 1,6 25,5 ± 2,6 26,6 ± 5,4 
Dados apresentados como média ± erro padão da média. One-way ANOVA com teste 
a posteriori de Dunnett. *ppor 15 dias, causaram alterações histológicas 
ovarianas semelhantes às visualizadas no presente estudo, além de verificarem 
aumento na concentração de MDA. Outro estudo verificou que a exposição a uma 
única dose de 100mg/kg de malation via gavage aumentou a ocorrencia de apoptose 
nas células ovarianas e também diminuiu a atividade da SOD, porém, não foi capaz 
de alterar a concentração de MDA (OSZOY et al., 2016). No presente estudo, o 
aumento na concentração de MDA (M10 e M50) corrobora com os dados de Koç e 
colaboradores (2009), bem como o prejuízo na atividade da enzima SOD (M50) 
corrobora com os achados de Bhardwaj e Saraf (2015) e de Ozsoy e colaboradores 
(2016). Entretanto, antagonizando o achado de Bhardwaj e Saraf (2015), não 
verificamos alterações na atividade da enzima CAT. 
Há indícios na literatura de que o malation, assim como outros 
 45 
pesticidas de sua classe, pode ser detoxificado por intermédio da via da glutationa, 
consumindo GSH por intermédio da síntese de GST (KEHRER, 1993; TIMUR et al., 
2003; ZIMNIAK et al., 1997; KOSTAROPOULOS et al., 2001). Um estudo realizado 
com ratos em idade neonatal demonstrou que a exposição materna ao malation (10 
g/dia de ração contendo 500 ppm do inseticida) durante a gestação e lactação foi 
capaz de alterar essa via em alguns tecidos: foi observada superativação da via no 
fígado e coração e diminuição na mesma em tecidos cerebrais. Porém, a via se 
manteve inalterada nos rins e pulmões (TIMUR et al., 2003). Esses resultados 
sugerem que em alguns tecidos essa via pode estar alterada, enquanto outros são 
menos suscetíveis a essa alteração nesta via de detoxificação de substâncias. 
No presente estudo, a manutenção da concentração de GSH e a 
diminuição atividade da enzima GST, em ambos os grupos expostos ao malation, 
apontam que o desbalanço observado entre EROS e enzimas antioxidantes 
encontrado nos ovários desses animais pode estar relacionado com a inalteração 
desta via, ou até mesmo diminuição em sua atividade, aumentando assim os danos 
por estresse oxidativo neste tecido. Sabe-se que uma condição de estresse oxidativo, 
semelhante à descrita pelos achados neste estudo, podem causar inflamação e o 
desenvolvimento de doenças crônicas, como câncer (REUTER et al., 2010), além de 
levar ao aumento da ativação do processo apoptótico (AGARWAL et al., 2012; 
DEVINE et al., 2012). 
As alterações morfométricas foliculares observadas em nosso estudo 
vão de concordância aos achados de Nishi e Hundal (2013), que demonstraram que 
baixas doses (0,1 e 2,5 mg/kg) de outro inseticida da classe dos organofosforados, o 
clorpirifós, causou aumento no diâmetro folicular. Há na literatura alguns estudos 
relacionando diâmetro folicular com taxas de fecundação e desenvolvimento 
embrionário em protocolos de fertilização in vitro (ECTORS et al., 1997; BERGH et al., 
1998), esses estudos apontam que ovócitos de tamanho médio apresentam melhores 
taxas de desenvolvimento embrionário que ovócitos considerados pequenos ou 
grandes. Assim, nossos resultados sugerem um possível prejuízo no desenvolvimento 
embrionário, uma vez que o tamanho folicular pode vir a alterar a fertilidade. 
Sabe-se que o gene FOXO é responsivo a uma condição de estresse 
oxidativo, podendo ser esta uma justificativa para o aumento na expressão de FOXO 
visualizada por nós (LIM et al., 2017; WANG et al., 2017). E essa superexpressão do 
gene FOXO, por sua vez, indica maiores índices de apoptose folicular nesses animais, 
 46 
por intermédio da via descrita acima. Assim, a superexpressão do gene FOXO e a 
manutenção da expressão de FGF-2 nos ovários corrobora com o aumento na 
quantidade de folículos atrésicos e a manutenção no desenvolvimento folicular 
normal, respectivamente. 
Apesar de o estrogênio apresentar papel inibitório ao 
desenvolvimento folicular (HUANSHENG et al., 2011), no presente estudo, a 
superexpressão de receptores estrógenos tipo β no ovário, e a consequente 
sensibilização deste órgão para a ação deste hormônio, que não teve sua produção 
alterada, neste tipo de receptor não foram suficientes para alterar o desenvolvimento 
e crescimento folicular nas fêmeas expostas ao malation. Além disso, esse gene é 
considerado um supressor tumoral em lesões mamárias e prostáticas (FIXEMER et 
al., 2003; PARK et al., 2003; ROGER et al., 2001), e sua expressão reduzida tem sido 
relacionada com cânceres ovarianos (CHAN et al., 2008). Treek e colaboradores 
(2007) evidenciaram que sua função supressora tumoral nos ovários é independente 
da ação de hormônios estrógenos. 
Sabe-se que a expressão de FOXO é capaz de regular a expressão 
de genes ERs (MADUREIRA et al., 2006), assim, a superexpressão deste gene pode 
ser um mecanismo pelo qual houve superexpressão de ERs encontrada em nosso 
estudo, tanto no ovário quanto no útero. A superexpressão do gene ER- β verificada 
no presente estudo pode estar relacionada com o aumento no número de folículos 
atrésicos após a exposição ao malation e também com um mecanismo protetor a 
outras alterações na expressão gênica verificadas no presente estudo. É interessante 
ressaltar, que Lombardi e colaboradores (2016) relataram que a expressão de ER-β 
está relacionada com ativação da via da β-catenina, o que está em concordância com 
nossos resultados. 
 Apesar do aumento no tamanho dos folículos, sua função na 
produção hormonal não foi alterada, mantendo a concentração plasmática deste 
hormônio. Essa alteração pode ser justificada por meio da sensibilização do tecido ao 
estímulo hormonal, causada pela superexpressão de ERs. Além disso, essa também 
pode ser a justificativa pela qual não houve alteração na instalação da puberdade e 
manutenção do peso dos órgãos reprodutivos. 
 A superexpressão de β-catenina resulta em aumento na proliferação 
celular (GUMBINER, 1995), em nosso estudo, essa superexpressão pode vir a ser um 
fator indutor para proliferação celular anormal nos ovários. Outros genes 
 47 
superexpressos em nosso estudo, Bcl-2 e Slug, apresentam ação anti-apoptótica 
(VAUX et al., 1992; HENGARTNER et al., 1994; HOCKENBERY et al., 1990; MAJI et 
al., 2018), assim, além de uma possível indução de proliferação celular mediada pela 
superexpressão de β-catenina, há indícios de que essas células viriam a apresentar 
uma vida celular mais longa. 
Embora a expressão ovariana dos demais genes avaliados neste 
trabalho considerados proto-oncogenes (o supracitado FGF-2) ou supressores 
tumorais (TP53) não serem afetados pela exposição a baixas doses do pesticida, 
houve alterações em genes importantes para a manutenção do ciclo celular normal 
(ER-β, β-catenina, FOXO, Bcl-2 e Slug). Sabe-se que o impedimento do programa 
apoptotico pode levar a um prolongamento anormal do tempo de vida celular, o que 
contribuiria para o acúmulo de mutações no material genético destas células, e em 
casos extremos, contribuir para a formação de tumores (HSU e HSUEH, 2000). 
Em relação ao útero, sabe-se que a enzima antioxidante SOD está 
presente em grandes quantidades nas células do endométrio, onde apresenta papel 
de extrema importância na fisiologia deste órgão, permitindo tanto a ocorrência da 
menstruação, quando não há fertilização, quanto da reação decidual, que ocorre neste 
tecido durante a implantação embrionária (SUGINO, 2007). A alteração na ação desta 
enzima encontrada no útero dos animais expostos ao malation, mesmo não atrelada 
a estresse oxidativo, pode acarretar problemas reprodutivos, podendo afetar tanto a 
fisiologia normal desse sistema quanto a capacidade de implantação do embrião após 
exposição a esse inseticida. A peroxidação lipídica no útero desses animais estava 
diminuida, provavelmente pelo aumento da atividade da enzima GST, num 
mecanismo compensatório, mesmo com a manutenção da concentração de GSH. 
Assim como Timur e colaboradores (2003), que demonstraram que alguns tecidos 
eram maissensíveis a alterações no sistema glutationa de detoxificação de 
substâncias, verificamos que o útero foi mais suscetível a superativação da via das 
glutationas para detoxificação do malation do que o ovário. 
Abolaji e colaboradores (2015) observaram uma alteração parecida 
no perfil oxidativo nos ovários e úteros de ratas após exposição a 2,5-hexanodiona, 
um químico industrial. Após a exposição ao composto, houve declínio na atividade das 
enzimas SOD e GST no ovário dos animais, enquanto nos úteros ocorreu aumento da 
atividade, corroborando com nossa hipótese das diferentes respostas, tecido-
dependentes. O aumento na atividade de GST verificado no presente estudo podem 
 48 
ser resultantes de uma resposta adaptativa para combater uma situação de estresse 
oxidativo (ABOLAJI et al., 2015). Assim, decorrente do aumento na atividade 
enzimática antioxidante, ocorre a neutralização e diminuição na concentração de 
EROS, conforme demonstrado em nosso estudo, pela diminuição nos níveis de 
peroxidação lipídica após exposição ao malation. Esses mesmos resultados também 
foram observados por Mondal e colaboradores (2018), que verificaram diminuição na 
concentração de MDA após exposição ao glutamato monosódico. 
Apesar da manutenção da concentração plasmática de estrógeno, a 
superexpressão de receptores do tipo alfa encontrada no presente estudo após 
exposição ao malation sensibilizou este órgão para a ação deste hormônio, induzindo 
assim, aumento na proliferação celular, em concordância com nossos achados 
histológicos uterinos, podendo vir a prejudicar a fertilidade. 
Um estudo realizado por Jeong e colaboradores (2009) demonstrou 
que alterações na expressão do gene β-catenina no útero causam o aparecimento de 
metaplasias no epitélio endometrial e hiperplasia no epitélio glandular uterino. Em 
nosso estudo, verificamos hiperplasia no epitélio endometrial juntamente com 
superexpressão do gene β-catenina, em concordancia com o estudo de Jeong e 
colaboradores (2009). Porém, mesmo com a superexpressão de β-catenina após 
exposição ao malation, houve redução na altura do epitélio glandular uterino, o que 
indica uma diminuição em sua composição e atividade secretora, antagonizando os 
achados deste mesmo estudo anterior. Além disso, assim como a superexpressão de 
ER-α alteraram a fertilidade das ratas, impedindo a implantação e a ocorrência da 
reação decidual (LESSEY et al., 2006; DOROSTGHOAL et al., 2018), a desregulação 
na expressão de β-catenina também tem sido relacionada com esses mesmos 
fenômenos (JEONG et al., 2009). 
Em nosso estudo, o espessamento no miométrio verificado na análise 
morfométrica uterina, vai de concordância com o descrito por Otsuki e colaboradores 
(1994), visto a superexpressão deste gene neste órgão e a maior concentração de 
sua expressão estar localizada nas células musculares lisas no útero. Entretanto, 
antagonizando o achado destes mesmos autores, verificamos a hipoplasia do epitélio 
glandular, local onde, de acordo com Otsuki e colaboradores (1994), há uma alta 
expressão de Bcl-2. 
A superexpressão do gene Slug também está relacionada com a 
hiperplasia do epitélio luminal e com o aumento do miométrio e perimétrio nos animais 
 49 
expostos ao malation, devido a sua atividade anti-apoptótica (MAJI et al., 2018). Há, 
na literatura, indícios de que alterações na expressão deste gene podem alterar a 
fertilidade, devido a alterações teciduais durante a implantação (DU et al., 2009). 
A superexpressão do gene TP53 tem sido muito relacionada com a 
prevenção de tumores no cérvice uterino (SKOMEDAL et al., 1999) e em outras 
regiões deste órgão (TAYLOR, 2006; URABE et al., 2014; TSUYOSHI e YOSHIDA, 
2018), sendo este gene considerado um supressor tumoral (NIGRO et al., 1989; 
LEVINE et al., 1991; CALLAHAN, 1992), por induzir parada no ciclo celular e 
consequente morte celular programada como resposta a alterações em outros genes 
essênciais para a manutenção celular (DANILOVA et al., 2010). Estudos in vitro, de 
Calaf e Roy (2008) e Calaf e colaboradores (2009), verificaram que o malation nas 
concentrações de 100 ng/mL e 2 µL/mL, respectivamente, aumentou a expressão de 
p53 em células mamárias in vitro. Apesar desses estudos utilizarem linhagens de 
células diferentes de nossos tecidos, seus resultados são semelhantes aos nossos 
achados uterinos in vivo. Além disso, o afinamento no epitélio glandular uterino pode 
estar corelacionado com o aumento de apoptose neste tecido promovido pela ação 
de TP53. Há indícios na literatura de que a superexpressão de TP53 pode estimular 
a espressão de Slug (GAO et al., 2018), sendo essa uma possível justificativa para 
sua superexpressão uterina. 
Assim, além das alterções no perfil oxidativo uterino, há alterações em 
genes importantes para a regulação do ciclo celular (ER-α, β-catenina, Bcl-2, Slug e 
TP53), compatíveis com as alterações histopatológicas verificadas. Sabe-se que, a 
longo prazo, as alterações histopatológicas verificadas, juntamente com as alterações 
na expressão desses genes, podem evoluir, e em casos mais extremos, contribuir 
para a formação de tumores. Reuber (1985) verificou o potencial tóxico e 
carcinogênico do malation em diversos tecidos, alguns deles que apresentam função 
endócrina, como os testículos e a medula da adrenal. Assim, o presente estudo 
evidencia que há um potencial tóxico carcinogênico do malation no sistema reprodutor 
feminino de ratas Wistar após exposição durante o período peripuberal. 
 50 
6 CONCLUSÃO 
 
A partir dos dados acima apresentados e discutidos, podemos 
concluir que a exposição ao malation durante os períodos juvenil e peripuberal causou 
prejuízos ao sistema reprodutor feminino, uma vez que houve alterações na 
morformetria, perfil oxidativo e na expressão de genes importantes para a manutenção 
da vida celular, além de prejudicar a integridade tecidual uterina e ovariana de ratas 
Wistar. Os resultados indicam que a exposição ao malation nestes períodos pode 
causar danos nas funções reprodutivas desses animais. 
 
 
 
 51 
REFERÊNCIAS 
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 62 
APÊNDICES 
 
 63 
ANEXO A 
Aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UEL) 
 
	BANCA EXAMINADORA
	AGRaDECIMENTOS
	LISTA DE ILUSTRAÇÕES
	lista de tabelas
	lista de abreviaturas e siglas
	1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
	1.1 Sistema Genital Feminino
	1.2 Estresse Oxidativo e Sistema Genital Feminino
	1.3 Expressão Gênica e o Sistema Genital Feminino
	1.4 Malation
	2 OBJETIVOS
	2.1 Objetivo Geral
	2.2 Objetivos Específicos
	3 METODOLOGIA
	3.1 Animais
	3.2 Drogas e Reagentes Utilizados
	3.2.1 Procedência
	3.2.2 Doses
	3.3 Instalação da Puberdade
	3.4 Coleta dos materiais
	3.5 Avaliação morfológica dos ovários e úteros
	3.6 Dosagem hormonal
	3.7 Avaliação do perfil oxidativo de ovários e úteros
	3.7.1 Lipoperoxidação
	3.7.2 Sistema Glutationa
	3.7.3 Superóxido Dismutase (SOD)
	3.7.4 Catalase (CAT)
	3.8 Reação em cadeia da polimerase quantitativa e em tempo real (RT-qPCR)
	3.8.1 Validação por RT-qPCR
	3.8.2 Construção da biblioteca de cDNA e RT-qPCR
	3.9 Análise Estatística
	3.10 Comitê de Ética
	4 RESULTADOS
	5 DISCUSSÃO
	6 CONCLUSÃO
	REFERÊNCIAS
	APÊNDICES
	ANEXO Aa expressão de genes importantes para a 
manutenção celular nos úteros e ovários, podendo prejudicar a capacidade 
reprodutiva dessas fêmeas. 
 
 
Palavras-chave: Organofosforado. Ovário. Útero. Estresse oxidativo. Expressão 
gênica.
 
FRIGOLI, Giovanna Fachetti. Alterations caused by exposition to the pesticide 
malathion during the juvenile and peripubertal periods into the female genital 
system of Wistar rats. 2022. 103. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em 
Biomedicina) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2022. 
 
 
ABSTRACT 
 
 
Malathion, an organophosphate pesticide, is widely applied in a large variety of 
agricultural cultures and, in tropical countries, it is also used in the active combat of the 
Aedes mosquito. While growing up, children and teenagers are constantly exposed to 
this compound, as for living in areas where it is pulverization is used in the containment 
of the dengue spread, or through consumpsion of contaminated food. Knowing the 
importance of puberty as a critical period for the maturation of the reproductive system, 
the objective of the present study is to evaluate malathion exposure during the juvenile 
and peripubertal periods into the post-natal development of the female reproductive 
system of Wistar rats. For that, 30 female Wistar rats, provenient from Animal House 
of Biological Sciences Centre, were equally distribuited into three experimental groups: 
animals in M10 and M50, respectivelly, received 10 and 50 mg/kg of malathion dilluted 
in saline (0,9%) via gavage from PND 22 to PND 60. Control group received only the 
vehicle throughout the entire treatment period. During the experimental period, puberty 
installation was evaluated through the day of the vaginal opening and the day of the 
first estrus. At the end of the treatment period, during the estrus phase, the animals 
were anesthetized with an association of cetamine and xilazine and euthanized by 
heart puncture. Blood samples were retrieved and destined to oestradiol dosage. 
Ovaries and uteri were harvested, wheighted and destined to histoapathological and 
morphometric analysis, evaluation of the oxidative profile and expression quantification 
of the ER-α, ER- β, β-catenina, Bcl-2, FGF2, FOXO, Slug e TP53 genes by RT-qPCR. 
The low doses used were sufficient to cause histopathological alterations in the ovaries 
and uterus, however, were not enough to alter puberty installation and estrogen 
concentration. The increase in the number of atretic follicles and in the follicular 
diameter ocurred in consequence of oxidative stress and overexpression of ER- β, β-
catenin, Bcl-2, Slug and FOXO genes in the ovaries after exposure to malathion. In the 
uterus, alteration in the proportion between endometrium, miometrium and 
perimetrium, desquamation and hiperplasia of the luminal epithelium, and thinning of 
glandular epithelium were observed, also in consequence of alterations in the oxidative 
profile and overexpression of ER-α, β-catenin, Bcl-2, Slug and TP53 genes in this 
organ. Therefore, in this study, we demonstrated that although exposure to low doses 
of malathion during the juvenile and peripubertal periods does not alter neither puberty 
intallation nor estrogen concentrations, it compromises tissue integrity and 
morphometry through oxidative stress and alteration of key genes to the maintenance 
of the cell cicle in the ovaries and uteri, which may lead to impairment in the 
reproductive capacity of these female rats. 
 
 
 
 
 
Key words: Organophosphate. Ovary. Uterus. Oxidative stress. Gene expression. 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
Figura 1 – Representação esquemática da posição anatomica e anatomia do sistema 
reprodutor feminino humano ....................................................................................... 12 
Figura 2 – Representação esquemática da posição anatomica e anatomia do sistema 
reprodutor feminino de ratas ....................................................................................... 13 
Figura 3 – Representação esquemática dos ciclos menstruais e ovariano ............. 18 
Figura 4 – Formula estrutural do O,O dimetil ditiofosato de dietil mercaptosuccinato
 ..................................................................................................................................... 26 
Figura 5 – Expressão ovariana dos genes ER- β, β-catenina, Bcl-2, FGF2, FOXO, 
Slug e TP53 ................................................................................................................. 40 
Figura 6 – Expressão uterina dos genes ER- β, β-catenina, Bcl-2, FGF2, FOXO, Slug 
e TP53. ........................................................................................................................ 42 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Lista de primers utilizados. ....................................................................... 34 
Tabela 2 – Parâmetros de peso corpóreo e dos órgãos, concentração de estradiol e 
instalação da puberdade. ............................................................................................ 36 
Tabela 3 – Parâmetros histológicos ovarianos. ......................................................... 37 
Tabela 4 – Parâmetros histológicos uterinos ............................................................. 38 
Tabela 5 – Perfil oxidativo ovariano e uterino ............................................................ 36 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
ACh Acetilcolina 
AChE Acetilcolinesterase 
ATP Adenosina trifosfato 
CAT Catalase 
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar 
CDNB 2,4-Dinitroclorobenzeno 
CYP1A2 Citocromo P450 1A2 
CYP2B6 Citocromo P450 2B6 
CYP3A4 Citocromo P450 3A4 
DL50 Dose Letal 50 
DPN Dia pós-natal 
ER- Receptor de estrogênio alpha 
ER- Receptor de estrogênio beta 
EROS Espécies reativas de oxigênio 
FSH Hormônio folículo-estimulante 
GnRH Hormônio liberador de gonadotropinas 
GSH Glutationa reduzida 
HHG Hipotalâmico-hipofisário-gonadas 
LH Hormônio luteinizante 
MDA Malondialdeído 
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro 
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo 
NBT Nitro azul tetrazólio 
RNA Ácido ribonucleico 
RT-qPCR Reverse transcriptase quantitative polimerase chain reaction 
SOD Superóxido Dismutase 
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 12 
1.1 SISTEMA GENITAL FEMININO ................................................................................................... 12 
1.2 ESTRESSE OXIDATIVO E SISTEMA GENITAL FEMININO ..................................................................... 22 
1.3 EXPRESSÃO GÊNICA E O SISTEMA GENITAL FEMININO .................................................................... 23 
1.4 MALATION .......................................................................................................................... 25 
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 28 
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................. 28 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................................. 28 
3 METODOLOGIA ........................................................................................................... 29 
3.1 ANIMAIS............................................................................................................................ 29 
3.2 DROGAS E REAGENTES UTILIZADOS ................................................................................. 29 
3.2.1 Procedência .......................................................................................................................................... 293.2.2 Doses .................................................................................................................................................... 29 
3.3 INSTALAÇÃO DA PUBERDADE ........................................................................................... 30 
3.4 COLETA DOS MATERIAIS ................................................................................................... 30 
3.5 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DOS OVÁRIOS E ÚTEROS......................................................... 31 
3.6 DOSAGEM HORMONAL ...................................................................................................... 31 
3.7 AVALIAÇÃO DO PERFIL OXIDATIVO DE OVÁRIOS E ÚTEROS ................................................ 31 
3.7.1 Lipoperoxidação ................................................................................................................................... 32 
3.7.2 Sistema Glutationa ............................................................................................................................... 32 
3.7.3 Superóxido Dismutase (SOD) ............................................................................................................... 32 
3.7.4 Catalase (CAT)....................................................................................................................................... 33 
3.8 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA E EM TEMPO REAL (RT-QPCR) . 33 
3.8.1 Validação por RT-qPCR ....................................................................................................................... 33 
3.8.2 Construção da biblioteca de cDNA e RT-qPCR ................................................................................ 33 
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................................... 34 
3.10 COMITÊ DE ÉTICA ........................................................................................................... 35 
4 RESULTADOS .......................................................................................................... 36 
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 44 
6 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 50 
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 51 
APÊNDICES ..................................................................................................................... 62 
ANEXO A ........................................................................................................................ 63 
 
 12 
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
 
1.1 SISTEMA GENITAL FEMININO 
 
O sistema genital feminino é constituído pelos órgãos envolvidos nos 
processos reprodutivos. Os órgãos reprodutivos de fêmeas humanas são os ovários, 
o útero, as tubas uterinas e a vagina (GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015; GUYTON e 
HALL, 2011), conforme ilustrado na Figura 1. Já em ratas, o sistema reprodutor é 
composto por um par de ovários, com seus respectivos ovidutos, um útero 
bicornificado e a vagina (DIXON et al., 2018; HAMID e ZAKARIA, 2013), a anatomia 
deste sistema pode ser verificada na Figura 2. As principais funções exercidas pelos 
orgãos do sistema genital feminino são: a produção e maturação dos oócitos, as 
células reprodutivas femininas; a manutenção de um óvulo durante todo seu 
desenvolvimento, desde a fase embrionária até o nascimento; e a produção dos 
hormônios sexuais femininos, estrógeno e progesterona (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 
2013). 
 
Figura 1. Representação esquemática da posição anatomica e anatomia do sistema 
reprodutor feminino humano. 
 
Fonte: o próprio autor. 
Os ovários são órgãos pares localizados na região pélvica da 
cavidade abdominal e revestidos por uma camada de tecido conjuntivo denso, a túnica 
Tuba uterina
Ovários
Vagina
Cavidade uterina
Miométrio
Endométrio
Cérvice uterino
Fundo uterino
Canal cervical
Ligamento 
ovariano
Fímbrias
Folículos ovarianos
Útero
 13 
albugínea. Os ovários podem ser divididos em duas principais regiões: o córtex e a 
medula (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). A região cortical é a mais externa, 
adjacente à túnica albugínea, e é nela que estão presentes os folículos ovarianos. Já 
a região medular é mais interna, formada por tecido conjuntivo frouxo onde são 
encontrados os vasos sanguíneos ovarianos de maior calibre (JUNQUEIRA e 
CARNEIRO, 2013). 
 
Figura 2. Representação esquemática da posição anatomica e anatomia do sistema 
reprodutor feminino de ratas. 
 
Fonte: o próprio autor. 
Os folículos ovarianos são estruturas compostas pelo oócito, a célula 
gametótica feminina, e um agrupamento de células que o envolvem, as células 
foliculares ou células da granulosa (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Essas 
estruturas podem ser classificadas de acordo com a organização das células da 
granulosa como: folículos primordiais, folículos primários, folículos secundários, 
folículos pré-antrais, folículos antrais, folículos de Graaf – ou folículos maduros 
(BEZERRA et al., 2012; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Ao nascimento, todos os 
folículos que virão a se desenvolver durante o período reprodutivo já se encontram 
presentes nos ovários, quiescentes no estágio primordial (PETERS et al., 1978). 
Os folículos primordiais são estruturas caracterizadas por um oócito, 
com grande núcleo esférico, circundado por uma única camada de células foliculares 
Cérvice uterino
Ovários
Corno uterino
Bursa ovariana
Trompa uterina
 14 
achatadas (BORGEEST et al., 2002; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Por 
estímulos hormonais, essa estrutura cresce, diferenciando-se em folículo primário 
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013), caracterizado por um oócito, com tamanho 
máximo de 120 m, circundado por uma única camada de células foliculares cuboidais 
(BORGEEST et al., 2002; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Esse folículo, por sua 
vez, cresce e se diferencia em folículo secundário, que apresenta oócito circudando 
por duas camadas de células da granulosa cuboidais, e já é possível de se observar 
o início da organização da zona pelúcida e das tecas (ALVES, 2010). 
São considerados pré-antrais, os folículos primordiais, primários, 
secundários e os que apresentam mais de duas camadas de células foliculares, porém 
ainda não possuem antro (BORGEEST et al., 2002). Como antrais, são classificados 
os folículos que já apresentam antro, cavidade cheia de líquido, em desenvolvimento 
(BORGEEST et al., 2002; BEZERRA et al., 2012). Uma vez maduro, os folículos 
passam a ser denomidados de folículos de Graaf, que apresentam o antro em seu 
ápice de tamanho. Esses folículos maduros podem atingir até 2,5 cm de diâmetro em 
humanos (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). 
As tubas uterinas são dois tubos musculares que, em uma 
extremidade apresenta abertura para a cavidade peritoneal próximo ao ovário, o 
infundíbulo, e na extremidade oposta, a intramural, penetra no óstio do útero e se abre 
no interior deste (DIXON et al., 2018). Em humanos, possui aproximadamente 10 cm 
de comprimento (GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015), e na porção do infundíbulo estão 
presentes fímbrias que se movimentam ativamente, promovendo a movimentação do 
oócito em direção ao útero (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). Em ratas, o oviduto 
envolve os ovários, como uma cápsula, numa estrutura denominada de bursa 
ovariana (HAMID e ZAKARIA, 2013). 
Histologicamente, as tubas uterinas são compostas também por três 
camadas: a camada serosa é a mais externa e é constituída de peritônio; a camada 
muscular, média, é composta por fibras musculares lisas; e a camada mais interna, 
mucosa, composta por epitélio colunar ciliado (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). É 
nas tubas uterinas que ocorre a fertilização do oócito, e os cíliospresentes na mucosa 
deste órgão apresentam papel importante no transporte do óvulo em direção ao útero 
(GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015), local de sua implantação para posterior 
desenvolvimento (LANGMAN, 2005). 
O útero humano é um orgão em formato de pera, sendo a porção mais 
 15 
dilatada e superior denominada de fundo uterino e a mais estreita e inferior, que se 
abre na vagina, denominada de colo uterino. Este órgão está localizado na cavidade 
peritoneal anteriormente adjacente à bexiga (NETTER, 2014). Já o útero de ratas é 
constituído por dois cornos parcialmente fundidos em sua porção caudal, que 
apresentam cada um seu próprio lúmen e canal cervical (DIXON et al., 2018). Esse 
fator anatômico contribui para que sejam gestados muitos filhotes concomitantemente 
(HAMID e ZAKARIA, 2013). Histologicamente, o útero é composto por três camadas: 
endométrio, miométrio e perimétrio (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). 
O endométrio, camada mais interna, pode ser subdividido em duas 
camadas: a camada basal, mais externa, adjacente ao miométrio, constituída 
principalmente por tecido conjuntivo e poucas glândulas uterinas; e a camada 
funcional, a porção mais interna, onde estão localizadas a maior parte das glândulas 
uterinas e o epitélio luminal. O endométrio humano é altamente irrigado por diversos 
vasos sanguíneos que são de extrema importância para a descamação deste tecido 
que ocorre durante a menstruação. A porção funcional é a que mais sofre alterações 
durante o ciclo menstrual em humanos (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). O 
miométrio e o perimétrio são as camadas mais externas do útero. A primeira é formada 
por camadas de fibras musculares lisas dispostas em diferentes sentidos, e a segunda 
é composta principalmente por tecido conjuntivo (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013). 
A vagina é um órgão fibromuscular em formato tubular em humanos, 
com comprimento de 6 a 12 cm que se extende entre a vulva e o cérvice uterino 
(GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015). Histologicamente, a parede vaginal é composta por 
três camadas. A mais interna, mucosa, é formada por epitélio estratificado não 
queratinizado apoiado numa lâmina própria de tecido conjuntivo extremamente 
vascularizada (GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015). A camada média, muscular, é 
composta por duas camadas de fibras musculares, estando na mais interna as fibras 
dispostas longitudinalmente e na mais externa dispostas circularmente (GRAZIOTTIN 
e GAMBINI, 2015). Já a camada mais externa desse órgão, a adventícia, é composta 
por tecido conjuntivo denso rico em fibras colágenas e elastina, o que garante sua 
elasticidade (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2013; GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015). Em 
ratas, a vagina apresenta entre 15 e 20 mm de comprimento, e assim como a de 
humanas, sua abertura é separada do orifício uretral (DIXON et al., 2018). 
A diferenciação do sistema genital feminino de mamíferos tem início 
ainda no período embrionário em humanos, na sétima semana do desenvolvimento 
 16 
(LANGMAN, 2005), e em ratas, ocorre dentre os dias 14 e 18 do desenvolvimento 
(DIXON et al., 2018). Essa diferenciação é decorrente da ausência da expressão da 
proteína SRY, cujo material genético correspondente se encontra no gene Y, que não 
está presente em indivíduos deste sexo (GRAZIOTTIN e GAMBINI, 2015). 
Logo após o nascimento, tanto em roedores quanto em humanos, 
ocorrem pulsos de liberação de hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH) pelo 
hipotálamo. Após esse curto período, há um longo período de quiescência, marcado 
pela ausência deste hormônio em indivíduos infantes (LAFFAN et al., 2017). 
A puberdade é o período pelo qual os indivíduos adquirem capacidade 
reprodutiva através da maturação do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal (HHG) 
(OJEDA, 1980; GOLUB et al., 2008) que tem início a partir de alterações epigenéticas 
que permitem a ocorrência de “pulsos geradores” de GnRH e posterior secreção deste 
hormônio pelo hipotálamo (LOMNICZI et al., 2015). Em seres humanos, esses pulsos 
neuroendócrinos podem ocorrer a partir do sétimo ano de vida, e todo o processo 
púbere pode durar aproximadamente 10 anos. Já em ratos, costumam ocorrer a partir 
do 15º dia pós natal (DPN) e a maturação sexual ocorre aproximadamente no 65º 
DPN (LAFFAN et al., 2017). A secreção de GnRH em pulsos curtos pouco se altera 
durante o decorrer do ciclo menstrual em humanas, ocorrendo aproximadamente, a 
cada 90 minutos (GUYTON e HALL, 2011). 
A liberação de GnRH é responsável por estimular a produção de 
hormônio luteinizante (LH) (OJEDA et al., 2006; GUYTON e HALL, 2011). Em ratas 
costuma-se observar esse fenômeno, denominado de “anestro” por Andrews e Ojeda 
em 1981, em meados do DPN 30. Essa produção pulsada de LH, por sua vez, estimula 
a maturação ovariana, e precede o primeiro ciclo estral por aproximadamente 8 ou 9 
dias (WESTWOOD, 2008). 
Após a puberdade, os principais hormônios envolvidos nas funções 
reprodutivas do organismo feminino são: o GnRH; o hormônio ículosículo-estimulante 
(FSH) e o LH, secretados em resposta à liberação de GnRH; e, finalmente, o 
estrógeno e a progesterona, liberados pelos ovários em resposta à presença de FSH 
e LH (GUYTON e HALL, 2011). 
O ciclo menstrual e ciclo ovulatório são os nomes dados a uma série 
de alterações cíclicas que ocorrem no organismo feminino humano, mais 
especificamente no útero e ovários, respectivamente, durante os anos reprodutivos. 
Ambos ciclos apresentam duração aproximada de 28 dias, podendo, contudo, serem 
 17 
mais curtos ou longos (GUYTON e HALL, 2011). Essas alterações cíclicas dependem 
da ação de dois principais hormônios, LH e FSH, secretados pela adenohipófise 
(GUYTON e HALL, 2011). Esses hormônios, uma vez na corrente sanguínea, chegam 
aos seus respectivos receptores específicos nos ovários, induzindo a proliferação 
celular e a secreção de estrógeno (GUYTON e HALL, 2011). O ciclo ovariano pode 
ser dividido em duas principais fases, separadas pela oocitação: a fase folicular e a 
fase lútea (GUYTON e HALL, 2011). 
Na fase folicular, pelo estímulo de LH e FSH, mas principalmente do 
último, ocorre o crescimento e desenvolvimento dos folículos ovarianos (ZELEZNIK, 
2004). O início do desenvolvimento folicular é mediado por fatores de transcrição e 
outros fatores que apresentam ação local, sabe-se que os folículos primordiais e 
primários ainda não apresentam receptores hormonais, portanto não respondem a 
presença dos mesmos (OKTEM e URMAN, 2010). A cada ciclo, de 6 a 12 folículos 
iniciam seu desenvolvimento, mas apenas um chega ao final desse processo e é 
ovocitado (GUYTON e HALL, 2011). A partir da ativação dos receptores hormonais, o 
oócito começa a crescer e as células da granulosa também crescem e se multiplicam, 
resultando no aparecimento de mais camadas destas (ZELEZNIK, 2004). Algumas 
células fusiformes, presentes no interstício dos ovários, começam a se agrupar em 
camadas ao redor das células foliculares, organizando-se e originando uma estrutura 
denominada teca (ZELEZNIK, 2004). A teca pode ser dividida em interna e externa e 
apresenta duas principais funções. A teca interna secreta os hormônios estrógeno e 
progesterona, já a teca externa é uma capsula de tecido conjuntivo altamente 
vascularizada, que envolve o folículo em desenvolvimento (GUYTON e HALL, 2011). 
Após a formação das tecas, as células da granulosa secretam o 
líquido folicular, altamente rico em estrógeno, cujo acúmulo no interior do folículo dá 
origem ao antro folicular. A partir desta fase, os folículos passam a ser denominados 
de vesiculares, e passam a crescer de modo acelerado por três principais fatores. O 
acúmulo de líquido folicular estimula a expressão de receptores de FSH nas células 
da granulosa, sensibilizando ainda mais essas células à ação deste hormônio 
(GUYTON e HALL, 2011). Além disso, a combinação da ação do FSH e do estrógeno 
promove a expressão de receptores para LH nas células da granulosa,aumentando 
a secreção folicular também por meio da ação deste hormônio. E, finalmente, a alta 
concentração de estrógeno nos folículos, somada à alta concentração de LH, causam 
a proliferação das células foliculares, aumentando consequentemente sua secreção 
 18 
(GUYTON e HALL, 2011). Após aproximadamente uma semana de crescimento 
folicular, a maioria dos que iniciaram seu desenvolvimento ficam atrésicos, ou seja, 
involuem, e apenas um continua seu desenvolvimento e atinge maturação. Quando 
maduro, o folículo apresenta diâmetro aproximado de 1 a 1,5 cm e é oocitado. A 
oocitação é o processo pelo qual o oócito e a corona radiata, formada pelas células 
da granulosa, são expelidos do ovário para a tuba uterina, e depende de um pico de 
LH para acontecer (GUYTON e HALL, 2011). 
 
Figura 3. Representação esquemática dos ciclos menstruais e ovariano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: adaptado de https://www.famema.br/ensino/embriologia/ovogenese.php 
Nessa figura estão correlacionadas esquemáticamente os eventos que ocorrem durante os 
ciclos menstrual e ovariano. Na fase folicular do ciclo, conforme a adenohipófise libera 
quantidades crescentes de FSH, a concentração de LH se mantém, assim, por meio do 
estímulo de FSH ocorre o crescimento dos folículos ovarianos. Esses folículos, por sua vez, 
são compostos por células responsáveis pela produção de estrógeno, cuja concentração 
gradativamente cresce ao longo desta fase, até atingir seu máximo próximo da oocitação. 
Enquanto isso, no útero, ocorre reepitelização do endométrio e início do crescimento do 
mesmo, devido a ação do estrogênio. Para que ocorra a oocitação são necessários picos nas 
concentrações de LH e FSH. Após esse fenômeno, inicia-se fase lútea dos ciclos. Nesta fase 
ocorre aumento da secreção de estrógeno e progesterona pelo corpo lúteo durante seu 
crescimento. No útero, por ação destes hormônios, o endométrio cresce cada vez mais, 
tornando-se altamente vascularizado. Por feedback negativo, o aumento na concentração de 
estrógeno e progesterona diminui a produção de LH e FSH. A diminiução na concentração 
destes hormônios, principalmente do LH, causa involução do corpo lúteo e diminuição na sua 
atividade secretória. A concentração de estrógeno e progesterona começa a decair, causando 
 19 
descamação e necrose no endométrio uterino e retorno na produção dos hormônios da 
hipófise anterior, por feedback positivo. A partir destes eventos têm-se o incío de um novo 
ciclo. 
 
Esse pico de LH ocorre aproximadamente 16 horas antes da 
oocitação e é decorrente de um aumento de 6 a 10 vezes em sua produção, 
acompanhado de um aumento, em menor grau, da produção de FSH. LH e FSH agem 
sinergicamente dilatando o folículo nos dias que antecedem a oocitação. Além disso, 
o LH é responsável por converter as células da teca e da granulosa em células 
secretoras de progesterona. Por isso, um dia antes da oocitação, pode-se observar 
uma queda na concentração sérica de estrógeno e aumento na concentração de 
progesterona (GUYTON e HALL, 2011; SUGINO, 2007). 
Após a oocitação tem início a denominada fase lútea, na qual as 
células da granulosa e teca interna remanescentes no ovário se transformam em 
células luteínicas. Durante o processo de luteinização, promovido pela ação do LH, 
essas células aumentam expressivamente de tamanho e apresentam inclusões 
lipídicas, que lhes conferem um aspecto amarelado. As células da granulosa, uma vez 
luteinizadas, são responsáveis pela produção de progesterona e estrógeno, já as 
células da teca que compõem o corpo lúteo são responsáveis pela produção de 
androstenediona e testosterona, que, por sua vez, são convertidos pela enzima 
aromatase presente nas células da granulosa em estrógenos (GUYTON e HALL, 
2011). 
O corpo lúteo cresce por 7 ou 8 dias após a oocitação, atingindo um 
tamanho de aproximadamente 1,5 cm de diâmetro. Após esse período ocorre sua 
involução, que compreende também a perda de suas funções secretoras. Após 
aproximadamente 12 dias da oocitação, essa estrutura passa a ser conhecida como 
corpo albicans, que é substituído por tecido conjuntivo e absorvido pelo ovário no 
decorrer de outros ciclos (GUYTON e HALL, 2011). 
O estrógeno e a progesterona secretados pelo corpo lúteo exercem 
feedback negativo na adenohipófise, reduzindo a secreção de LH e FSH. A baixa 
concentração desses hormônios promove a involução do corpo lúteo. Devido a 
involução desta estrutura, que ocorre aproximadamente dois dias antes da 
menstruação, a inibição por feedback da hipófise anterior é cessada, ocasionando a 
produçãp de FSH e LH novamente por esta glândula, dando início, assim, a um novo 
ciclo ovariano e promovendo a menstruação (GUYTON e HALL, 2011). 
 20 
Concomitantemente ao ciclo ovulatório, descrito acima, ocorre o ciclo 
menstrual no útero, caracterizado por uma série de alterações, também cíclicas, que 
ocorrem no endométrio. Num primeiro momento, ocorre a proliferação do endométrio, 
seguida de alterações secretórias nas glândulas deste tecido e, por fim, sua 
descamação, fenômeno conhecido como menstruação (GUYTON e HALL, 2011). 
Na fase proliferativa do ciclo, que tem duração aproximada de 11 dias, 
ocorre a proliferação das células estromais e glandulares que compoem o endométrio 
(GUYTON e HALL, 2011), devido à ação dos estrógenos secretados pelos ovários nos 
primeiros dias do ciclo (REYNOLDS et al., 1992). Esse crescimento é progessivo e, 
durante a oocitação, o endométrio apresenta de 3 a 5 milímetros de espessura, 
normalmente. Nessa fase, as glândulas endometriais secretam muco fino e pegajoso 
na região do cérvix uterino (GUYTON e HALL, 2011). 
Na fase secretora, ou fase progestacional, do ciclo menstrual, devido 
à alta concentração de estrógenos e progesterona secretados pelo corpo lúteo no 
ovário, o endométrio se espessa ainda mais, e as glândulas uterinas se tornam mais 
tortuosas, propiciando um acúmulo de substâncias secretórias nas células epiteliais 
glândulares. Pode-se observar ainda um aumento no citoplasma das células 
estromais do endométrio, com aumento nas reservas de lipídios e glicogênio, 
acompanhado de um aumento na vascularização deste tecido. No auge desta fase, 
que ocorre aproximadamente 7 dias após a oocitação, o endométrio apresenta entre 
5 a 6 cm de espessura. As alterações que ocorrem durante essa fase do ciclo se dão 
com a finalidade de tornar o útero um lugar propício à implantação do óvulo, permitindo 
a gestação (GUYTON e HALL, 2011). 
Caso não ocorra a fertilização do oócito liberado pelo ovário neste 
mês, consequentemente não há a implantação do mesmo na parede uterina. A 
redução nas concentrações de estrógeno e progesterona que ocorre a partir da 
involução do corpo lúteo levam à ocorrência da menstruação (SUGINO, 2007). A partir 
da ausência da influência do estrógeno sobre as células do endométrio, as mesmas 
começam a involuir. Devido à involução deste tecido, os vasos sanguíneos que o irriga 
em abundância se tornam vasoespáticos (GUYTON e HALL, 2011). 
Devido a essas alterações, somada à diminuição da chegada de 
nutrientes a este local e a desestimulação hormonal, ocorre necrose no endométrio 
uterino, principalmente nos vasos sanguíneos. As camadas necróticas do endométrio 
se separam da parte sadia desse tecido, originando pequenas hemorragias. A massa 
 21 
de tecido necrótico descamado e sangue na cavidade uterina são expelidos através 
da vagina por pequenas contrações involuntárias deste órgão, num fenômeno 
conhecido como menstruação. Após 4 a 7 dias do início da menstruação, ocorre a 
reepitelização do endométrio uterino, consequentemente cessando as hemorragias e 
permitindo o reínicio do ciclo (GUYTON e HALL, 2011). Os ciclos ovariano e uterino 
estão esquematizados, ilustrados e resumidos na Figura 3. 
Em ratas, durante o ciclo estral, o epitélio vaginal e cervical passam 
por alterações significativasque caracterizam as diferentes fases do ciclo (DIXON et 
al., 2018). Roedores apresentam ciclo estral com duração dentre 4 a 5 dias que é 
dividido em 4 fases: proestro, estro, metaestro e diestro (OJEDA e URBANSKI, 1994; 
HAMID e ZAKARIA, 2013). O primeiro ciclo estral regular de uma rata costuma ocorrer 
aproximadamente uma semana após a abertura do canal vaginal, entre os dias pós 
natais 33 e 42 (MAEDA et al., 2000). As fases estrais das ratas apresentam duração 
de horas, sendo a mais longa o diestro, com aproximadamente 57 horas (LOHMILLER 
e SWING, 2006). 
O proestro é caracterizado pela presença de fluido aquoso no útero e 
é nessa fase em que são encontrados as maiores concentrações de estrógeno de 
todo o ciclo (DIXON et al., 2018). No útero, o epitélio apresenta-se cuboidal ou colunar, 
e pode-se visualizar a presença de infiltrado inflamatório, acompanhada de pouca ou 
nenhuma degeneração. Nos ovários, o proestro pode ser caracterizado pela 
degeneração dos corpos luteos e a presença de alguns vacuolos citoplasmáticos, 
resultantes do processo esteroidogênico (WESTWOOD, 2008). Ao final dessa fase, 
as ratas já se encontram receptivas aos machos (LOHMILLER e SWING, 2006). Na 
vagina, pode-se observar a presença de mitoses no epitélio, pouca degeneração e 
descamação, e a formação do estrato granuloso. Ao final desta fase, o epitélio se 
encontra totalmente cornificado, podendo apresentar descamação das células 
mucosas (WESTWOOD, 2008) e alguma queratinização no epitélio (DIXON et al., 
2018). 
No início da fase estral, pode-se observar no útero de ratas a 
presença de degeneração acompanhada de processo necrótico nas células epiteliais 
uterinas, sendo as células glandulares as primeiras a passarem por esse processo. 
Além disso, pode-se visualizar também infiltração leucocitária e diminuição da 
atividade mitótica dessas células. A dilatação uterina pode persistir até o final do estro. 
Nos ovários, nessa fase, pode-se observar corpos lúteos em processo degenerativo, 
 22 
cujas cavidades centrais se encontram preenchidas por líquido, infiltrados basofílicos 
e desprovidas de tecido fibroso (WESTWOOD, 2008). É nessa fase do ciclo que as 
fêmeas se encontram mais receptivas aos machos, permitindo a cópula (HAMID e 
ZAKARIA, 2013). Já na vagina de fêmeas nessa fase, pode-se visualizar a 
descamação das camadas mucosas e cornificadas e uma diminuição na altura do 
epitélio, acompanhados do aumento de infiltrado leucocitário nesse órgão 
(WESTWOOD, 2008). 
O útero na fase de metaestro é caracterizado pela visualização tanto 
de atividade mitótica nas células epiteliais uterinas quanto degeneração destas 
mesmas células. Já nos ovários, os corpos lúteos ainda contém resquícios de fluido 
na cavidade central, algumas células basofílicas e completamente livre de tecido 
fibroso. O início dessa fase, na vagina, é marcado pelo completo descolamento da 
camada cornificada e pela descamação contínua dos estratos granulosos e 
germinativos, pode-se visualizar também a presença de infiltrado leucocitário 
(WESTWOOD, 2008). 
Já em diestro, o útero se encontra com seu menor diâmetro, 
avascularizado. Inicialmente podem ser observadas algumas poucas mitoses, porém, 
com o avançar da fase sua presença se torna mais abundante, e algumas raras 
células degenerativas podem ser visualizadas. No final desta fase pode-se observar 
edema no estroma do órgão. Nos ovários, podem ser observados corpos lúteos em 
seu maior tamanho, que podem apresentar pequenos vacúolos citoplasmáticos ou 
não, e formação de tecido fibroso na cavidade central (WESTWOOD, 2008). Tanto no 
metaestro quanto em diestro, as fêmeas não apresentam comportamento receptivo 
aos machos (LOHMILLER e SWING, 2006). Na vagina, o início dessa fase é marcado 
por apresentar o epitélio em sua menor altura, podendo estar presente infiltração 
leucocitária ou não. No avançar desta fase, ocorre o alargamento do epitélio, sem 
formação clara do estrato granuloso e uma redução na infiltração de leucócitos 
(WESTWOOD, 2008). O epitélio vaginal atinge seu ápice em tamanho ao final desta 
fase, e mantém-se alargado até o início do estro (DIXON et al., 2018). 
 
1.2 ESTRESSE OXIDATIVO E SISTEMA GENITAL FEMININO 
 
O estresse oxidativo é caracterizado pela alteração na homeostase 
entre espécies reativas de oxigênio (EROS) e agentes antioxidantes, sejam estes 
 23 
enzimáticos ou não (BURTON e JANIAUX, 2011). O perfil oxidativo pode ser alterado 
tanto por um aumento nas concentrações de EROS como por prejuízos no sistema 
antioxidante celular (RUDER et al., 2009). 
As EROS são normalmente formadas nas mitocôndrias, durante o 
processo de produção de energia pela respiração celular (RUDER et al., 2009), porém 
a produção de EROS também pode ocorrer na cadeia curta de elétrons no retículo 
endoplasmático, no citocromo P450 e na enzima NADPH oxidase (AGARWAL et al., 
2012). Hábitos como o tabagismo e o consumo de álcool, e a exposição à poluentes 
ambientais também são capazes de estimular a produção de EROS (RUDER et al., 
2009), alterando assim o perfil oxidativo. 
Os antioxidantes e as EROS apresentam papel fundamental em 
alguns processos fisiológicos do sistema genital feminino, como a finalização da 
meiose I no oócito dominante, estimulada pelas EROS e inibida por antioxidantes, e a 
progressão da meiose II neste mesmo oócito, estimulada por antioxidantes 
(AGARWAL et al., 2012). Entretanto, sabe-se que essas moléculas podem induzir a 
alterções patológicas, por apresentarem capacidade de depleção de ATP, causar 
inflamação tecidual e necrose, mediar apoptose e apresentar potencial mutagênico, 
podendo causar danos cumulativos ao DNA (BEHRMAN et al., 2001) 
Alterações no perfil oxidativo estão relacionados com uma série de 
distúrbios do trato genital feminino, como endometriose (MIER-CABRERA et al., 2010) 
e síndrome dos ovários policísticos (PALACIO et al., 2006), além de poder causar 
complicações na gravidez, causando abortos espontâneos (HEMPSTOCK et al., 
2003) e até mesmo pré-eclâmpsia (RUMBOLD et al., 2008). 
 
1.3 EXPRESSÃO GÊNICA E O SISTEMA GENITAL FEMININO 
 
 O crescimento e desenvolvimento de folículos em estágios iniciais e 
a manutenção da reserva ovariana é mediada por uma série de fatores de crescimento 
e outros fatores inibitórios que apresentam ação local nos ovários (OKTEM e URMAN, 
2010). O gene FOXO, mais especificamente o FOXO3, apresenta importante papel 
na manutenção da reserva folicular ovariana, exercendo ação inibitória no 
desenvolvimento de folículos primordiais, controlando o crescimento ovocitário (JOHN 
et al., 2008), impedindo a progressão do ciclo celular (UHLENHAUT e TREIER, 2011). 
A ativação de FOXO3 pode induzir morte celular por apoptose nos folículos, causando 
 24 
perda da integridade mitocondrial, subsequente liberação do citocromo c e finalmente 
ativação das caspases (LIU et al., 2009). De modo oposto, o gene FGF-2 está 
relacionado com a diferenciação de folículos primordiais em folículos primários, 
portanto estimulando o desenvolvimento (OKTEM e URMAN, 2010). Já nos úteros, a 
expressão do gene FOXO tem sido relacionada com a manutenção da integridade 
tecidual e com a ocorrência da implantação (VASQUEZ et al., 2018), refletindo 
diretamente na fertilidade. 
 A expressão de ER-β nas células da granulosa apresentam 
importante papel no desenvolvimento folicular, maturação ovocitária e no processo 
esteroidogênico (CHAKRAVARTHI et al., 2021). Enquanto o ER-β apresenta papel 
inibitório na transcrição gênica (PAECH et al., 1997), sendo considerado um supressor 
tumoral em tecidos mamários e prostáticos (FIXEMER et al., 2003; PARK et al., 2003; 
ROGER et al., 2001), o gene ER-α é tido como um ativador da transcrição gênica 
quando estimulado por estrógeno (PAECH et al., 1997; AHLBORY-DIEKER et al., 
2009), assim, promovendo a proliferação celular na presença deste hormônio (ZHOU 
etal., 2005). A expressão adequada de ER-α no epitélio uterino é importante, pois age 
impedindo a ocorrência de apoptose neste tecido, garantindo respostas adequadas 
do epitélio no decorrer do ciclo uterino (WINUTHAYANON et al., 2010), entretanto, 
sua superexpressão durante a janela em que ocorre a implantação tem sido 
relacionada com infertilidade (LESSEY et al., 2006; DOROSTGHOAL et al., 2018). 
 Sabe-se que a superexpressão do gene β-catenina, bem como o 
acúmulo citoplasmático do produto de sua transcrição, estão relacionados à diversos 
tipos de câncer ovariano (AREND et al., 2013). Essa condição acaba por aumentar a 
concentração intracelular do produto de sua transcrição, que pode se direcionar para 
a região da membrana celular, onde irá atuar propiciando maior força de ligação entre 
as células, ou em regiões mais internas no citoplasma, onde irão ativar sua via de 
sinalização, propiciando a proliferação celular (GUMBINER, 1995). O acúmulo desta 
proteína nas células está relacionado com a indução de proliferação celular 
(GUMBINER, 1995). Há, também, indícios na literatura de que a superexpressão do 
gene β-catenina esteja relacionada com o desenvolvimento de diferentes tipos de 
tumores uterinos (YANG et al., 2003; LUSBY et al., 2013). 
 Convencionalmente, Bcl-2 é tido como um agente anti-apoptótico, ou 
seja, sua ação é conhecida por impedir o acontecimento da morte celular programada 
(VAUX et al., 1992; HENGARTNER et al., 1994; HOCKENBERY et al., 1990). Nos 
 25 
úteros, esse gene é expresso principalmente nas células epiteliais glandulares, 
estromais e musculares lisas presentes no útero e a regulação de sua expressão 
também ocorre hormonalmente (OTSUKI et al., 1994), principalmente por estímulo de 
progesterona (MATSUO et al., 1997). Otsuki e colaboradores (1994) demonstraram 
que nas fases do ciclo uterino em que há menor expressão de Bcl-2 são as que podem 
ser encontrados corpos apoptóticos nos tecidos, evidenciando sua função anti-
apoptótica. A superexpressão de Bcl-2 tem sido relacionada com a ocorrência de 
diferentes tumores uterinos (SAEGUSA et al., 1995; MATSUO et al., 1997; 
NAKAMURA et al., 1997; TJALMA et al., 1998). 
 Assim como Bcl-2, o gene Slug também apresenta ação anti-
apoptótica (MAJI et al., 2018), e alterações em sua expressão também tem sido 
correlacionadas com a ocorrência de prejuízos à fertilidade (DU et al., 2009; KOLER 
et al., 2009). 
 
 
1.4 MALATION 
 
 O malation é um inseticida pertencente a classe dos 
organofosforados, cuja nomenclatura química é O,O dimetil ditiofosato de dietil 
mercaptosuccinato (EPA, 2009), e é utilizado na agricultura, indústria e prática 
veterinária desde a década de 1980 (BADR et al., 2020). Sua formula molecular é 
C10H19O6PS2 (PubChem, 2022) e sua fórmula estrutural se encontra representada na 
Figura 4. Compostos pertencentes a classe dos organofosforados são considerados 
moderadamente ou fracamente polares, e moderados ou não persistentes quanto à 
sua meia vida (EPA, 2009). 
 Durante a degradação ambiental do inseticida em questão é formado 
um metabólito primário do mesmo, o malaoxon. Esse metabólito é considerado 
aproximadamente 40 vezes mais tóxico que o malation propriamente dito (BAIOMY et 
al., 2015), e fica disponível ao contato humano direto (EPA, 2009). Por ser 
considerado menos tóxico que outras substâncias de sua classe, o malation é um dos 
pesticidas mais utilizados na atualidade (OSZOY et al., 2016; BOGEN e SINGHAL, 
2017), aumentando, assim, a probabilidade de contato e intoxicação. 
 
Figura 4. Formula estrutural do O,O dimetil ditiofosato de dietil mercaptosuccinato 
 26 
(malation). 
 
 
 
 
 
 
 
 Esse inseticida pode ser absorvido pelo organismo por diferentes vias: 
dérmica, respiratória e digestiva, sendo a última de maior importancia nas intoxicações 
acidentais em crianças, principalmente, e em adultos durante o consumo e preparo 
de alimentos contaminados (LARINI, 1996), porém, a via dérmica representa a maior 
via de exposição ocupacional (TCHOUNWOU et al., 2015). Devido a sua natureza 
lipofílica, esse inseticida é rapidamente absorvido e distribuído em diversos tecidos e 
órgãos, podendo ser danoso aos diferentes sistemas do organismo (SELMI et al., 
2018). 
 Uma vez no organismo, o malation é metabolizado em malaoxon, 
metabólito responsável por seu mecanismo de ação, no fígado, por intermédio da 
ação do citocromo P-450, que realiza sua desulfuração (ABDOLLAHI et al., 2004; 
GUYTON e HALL, 2015). Em baixas concentrações, essa desulfuração é catalizada 
pelas CYP1A2, majoritariamente, e CYP2B6. Já em altas concentrações, a CYP3A4 
também apresenta papel importante na metabolização deste (BURATTI et al., 2005). 
 Sua ação se da no sistema nervoso central, tanto de insetos quanto 
de mamíferos, por meio da inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE) através de 
sua fosforilação. Ocasionando, assim, um acúmulo de acetilcolina (ACh) nas fendas 
sinapticas e junções neuromusculares (DHOUIB et al., 2015). O acúmulo desse 
neurotransmissor nas sinapses induz a uma ativação exacerbada dos receptores 
muscarínicos e nicotínicos nos músculos e nervos, causando agitação, hipersalivação, 
convulsões, falhas respiratórias e a eventual morte (MILESON et al., 1998; 
VELMURUGAN et al., 2017). 
 Além disso, alguns contaminantes nas formulações comerciais deste 
inseticida podem aumentar sua toxicidade (BURATTI et al,. 2005), como alguns 
inibidores das carboxilesterases. Tanto o malation como o malaoxon podem ser 
detoxificados por meio da ação destas enzimas, originando ácido monocarboxílico, 
 27 
que compete com o malation pelo citocromo P-450. Uma vez inibidas, ocorre um 
desbalanço da competição por esse citocromo, promovendo a formação de malaoxon 
(BURATTI et al., 2005; CHEN et al., 2013). 
 Dentre os efeitos de intoxicação aguda por malation pode-se citar: 
dificuldade respiratória (CHOI et al., 1998), distúrbios cardiovasculares (DIVE et al., 
1994) e gastrointestinais (RIVETT e PORTGIETER, 1987). 
 
 28 
2 OBJETIVOS 
2.1 OBJETIVO GERAL 
 
Visto a falta de informações específicas na literatura e da relevância 
clínica, social e política do assunto, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a exposição 
a baixas doses de malation durante os períodos juvenil e peripuberal pode causar 
danos ao desenvolvimento pós-natal dos ovários e úteros de ratas. 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
Verificar a influência do malation sobre o processo gametogênico e 
parâmetros histopatológicos e morfométricos nos ovários e úteros; 
Verificar a influência do malation na instalação da puberdade dos 
animais através da observação das datas da abertura vaginal e primeiro estro; 
Verificar a influência do malation sobre a fisiologia dos folículos 
ovarianos através da dosagem de estradiol; 
Analisar a fisiologia ovariana através da dosagem de estradiol; 
Contribuir com dados sobre os efeitos e mecanismos tóxicos da 
exposição ao inseticida malation sobre o desenvolvimento através da avaliação dos 
marcadores de estresse oxidativo e expressão gênica nos ovários e úteros; 
Desenvolver um trabalho de conclusão de curso para a obtenção do 
título de Bacharela em Biomedicina. 
 
 29 
3 METODOLOGIA 
 
3.1 ANIMAIS 
 
Foram utilizados 30 ratas fêmeas da linhagem Wistar, com idade 
inicial de 21 dias, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de 
Londrina – UEL. 
Os animais foram aclimatados ao Biotério do Laboratório de 
Toxicologia e Distúrbios Metabólicos por um dia, que antecedeu o início do período 
experimental. Os animais foram distribuídos casualmente em três grupos 
experimentais (n=10 animais/grupo). Dois grupos foram tratados com malation nas 
doses de 10 mg/Kg ou 50 mg/Kg de peso corpóreo via gavage. O outro grupo (grupo 
controle) recebeu apenas o veículo (salina) em igual volume. 
 O período de tratamento foi entre o DPN 22 e 60 (OJEDAet al., 1980). 
Todos os animais foram pesados a cada três dias e receberam água e ração ad 
libidum. Foi determinado o dia de abertura vaginal e de primeiro estro dos animais. 
Os procedimentos de manuseio, administração de drogas, anestesia 
e eutanásia dos animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais 
da Universidade Estadual de Londrina (OF. CIRC. CEUA n. 01/2020). 
 
3.2 DROGAS E REAGENTES UTILIZADOS 
3.2.1 Procedência 
O inseticida Malation (dietil-dimetoxitiofosforiltio; CAS no. 121-75-5; 
Cheminova) foi cedido por Dominus Química (Jandaia do Sul, Brasil). 
3.2.2 Doses 
Os grupos experimentais tratados com Malation (M10 e M50) 
receberam 10 e 50 mg/kg do inseticida. A DL50 oral da formulação utilizada, de acordo 
com as especificações do fabricante, para ratos, é maior que 5000 mg/kg. As doses 
utilizadas são menores que a dose sem efeitos adversos observáveis (NOAEL, do 
inglês No Observed Adverse Effect Level) para o sistema reprodutor de ratos, que 
 30 
para esse composto é de 130 mg/kg de peso corpóreo (FAO, 1997). A média das 
doses utilizadas em nosso estudo representa o ajuste da dose de AOEL (do inglês, 
Acceptable Operator Exposure Level) (FOUREMAN e KENYON, 2006) de 0,03 mg/kg 
em humanos (Comissão Europeia). Considerando a variabilidade interespécies, 
adicionamos o fator de segurança de 10 (NIELSEN et al., 2008). As doses foram 
consideradas baixas e relativamente seguras aos parâmetros reprodutivos em 
estudos prévios (WELSHONS et al., 2006), e já foram utilizadas em estudos prévios 
com ratos Wistar machos por nosso grupo (ERTHAL et al., 2020; ERTHAL et al., 
2020). 
 
3.3 INSTALAÇÃO DA PUBERDADE 
 
Foi determinado o dia médio em que ocorreu a completa abertura 
vaginal. Neste dia, as fêmeas foram pesadas e então lavados vaginais diários foram 
coletados de acordo com Marcondes et al. (2002) para detectar o dia do primeiro estro, 
caracterizado pela predominância de células epiteliais cornificadas, que juntamente 
com a ocorrência da abertura vaginal, compõe o indicativo da instalação da 
puberdade. As observações se iniciaram a partir do 30º dia pós-natal (DPN 30). 
 
3.4 COLETA DOS MATERIAIS 
 
A partir do DPN 61, foram realizados lavados vaginais para verificação 
da fase do ciclo estral em que as fêmeas se encontravam. Ao verificar a fase de estro, 
as fêmeas foram anestesiadas com a associação de xilazina e cetamina e submetidas 
à eutanásia por punção cardíaca para a coleta de ovários e úteros com fluido, os quais 
foram pesados em balança de precisão e destinados ao processamento histológico 
ou avaliação de balanço oxidativo e análises moleculares. O sangue foi coletado em 
tubo heparinizado (heparina sódica) para dosagens hormonais. Os ovários do lado 
direito e lateral direita do útero serão fixados em solução fixadora de Alfac (85% de 
álcool 80%, 10% de formol e 5% de ácido acético glacial) e processados para inclusão 
em parafina para posterior obtenção de cortes histológicos de 5µm de espessura (três 
cortes não seriados por animal) corados com hematoxilina e eosina. Os ovários 
esquerdos e lateral uterina esquerda serão congelados em freezer -80ºC para 
avaliação do perfil oxidativo e da expressão dos genes ER-α/ER-β, BCL-2, TP53, 
SLUG e β-catenina por RTq-PCR. 
 31 
 
3.5 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DOS OVÁRIOS E ÚTEROS 
 
No ovário direito foi realizada a contagem de corpos lúteos e a 
classificação e contagem dos folículos por área do corte. A classificação foi baseada 
nos diferentes estágios de desenvolvimento folicular, na morfologia dos folículos e no 
número de camadas de células da granulosa (Borgeest et al., 2002; Talsness et al, 
2005): folículos primordiais e primários (contados juntos - uma única camada de 
células planas ou cuboides da granulosa), folículos pré-antrais (duas a quatro 
camadas de células cuboides da granulosa sem presença de espaço antral) e folículos 
antrais (várias camadas de células da granulosa e um espaço antral claramente 
definido). A medida do diâmetro dos folículos e do oócito também foi calculada a partir 
de 4 medidas por estrutura, 10 estruturas por animal, um total de 40 medidas por 
animal. 
Os parâmetros observados no útero foram a medida da altura do 
endométrio, altura de epitélio luminal e glandular e a contagem de número de 
glândulas. Em cada corte histológico, dez diferentes regiões foram analisadas, dando 
um total de trinta medidas. 
 
3.6 DOSAGEM HORMONAL 
 
A dosagem da concentração de estradiol foi realizada no Laboratório 
de Imunologia Aplicada do Hospital Universitário de Londrina. O sangue coletado foi 
centrifugado a 2400 rpm, por 20 minutos a 3,5C, para separação do plasma, que 
ficou congelado até o momento dos ensaios hormonais. A dosagem foi realizada de 
acordo com as instruções do fabricante utilizando kit comercial. Todas as amostras 
foram dosadas em um mesmo ensaio para evitar erros inter-ensaio. 
 
3.7 AVALIAÇÃO DO PERFIL OXIDATIVO DE OVÁRIOS E ÚTEROS 
 
A análise do estresse oxidativo foi realizada por meio da quantificação 
da lipoperoxidação e outras substâncias antioxidantes. 
 32 
3.7.1 Lipoperoxidação 
A concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitpurico 
(TBARS) foram avaliados de acordo com o descrito por Federici e colaboradores 
(2007). A concentração de MDA, um produto intermediário da peroxidação lipídica, foi 
determinada a partir da diferença das absorbâncias lidas em 535 e 572 nm (Multiskan 
GO; Thermo Scientific, Vantaa, Finland). Os resultados foram expressos em 
nmmol/mg de proteína. 
3.7.2 Sistema Glutationa 
A atividade da glutationa S-transferase foi avaliada por 
espectofotometro usando GSH, 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e tampão fosfato 
de potássio. A absorbância da amostra foi medida em 340 nm por 5 minutos em 
intervalos de 40 segundos, conforme descrito por Keen e colaboradores (1975). 
A concentração de GSH foram determinados de acordo com o 
proposto por Rahman e colaboradores (2007), com algumas modificações. Para tal, 
utilizou-se de ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzóico) NBT no homogenato. A concentração 
de GSH foi medida em 412 nm e os resultados expressos como micromols/mg de 
proteína. 
3.7.3 Superóxido Dismutase (SOD) 
A avaliação da atividade da enzima superóxido dismutase foi 
realizada de acordo com o descrito por Senthilkumar e colaboradores (2021) com 
algumas alterações. A enzima foi proveniente de homogenatos normalizados a 
1mg/ml. Preparou-se uma mistura reativa contendo tampão carbonato de sódio 
(50mM, pH 10,2), nitroblue tetrazoilium (NBT) (96 M) e Triton X-100 (0,6%), que foi 
incubada por 2 minutos com hidrocloreto de hidroxilamina (NH2OH· HCl) (20 mM, pH 
6,0). O volume final foi ajustado para 200 µL. A reação consiste na quantificação de 
complexos formados por ânions superóxido com a adição de NBT e NH2OH· HCl de 
coloração amarelada com a redução do NBT, formando coloração azulada lida a 560 
nm por 2 minutos em intervalos de 15 segundos. Os resultados foram expressos em 
 33 
unidade de atividade da SOD, de acordo com a fórmula proposta por Zhang e 
coolaboradores (2016). 
3.7.4 Catalase (CAT) 
A atividade enzimática da catalase foi determinada pela degradação 
do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Após a determinação da concentração 
de proteínas (normalizadas 1,0 mg/ml em PBS), 297 μl de meio de reação será 
colocado em microplaca de UV4 (em duplicata) a 240nm por 60 segundos (AEBI et 
al., 1984). 
 
3.8 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUANTITATIVA E EM TEMPO REAL (RT-QPCR) 
3.8.1 Validação por RT-qPCR 
O RNA total foi extraído pelo método orgânico de isolamento do RNA 
com TRI Reagent (Sigma-Aldrich,EUA), seguindo as instruções fornecidas pelo 
fabricantes. A extração do RNA (n=4/grupo), foi realizada utilizando reagente TRIZOL 
(Ambion, USA), seguindo as recomendações do fabricante. Após extração, a 
concentração do RNA total foi determinada no NanoVue(GE Healthcare, USA) e a 
pureza do RNA foi avaliada de acordo com as razões A260nm/A280nm e 
A260nm/A230nm (aceitável quando ambas as razões foram superiores a 1,8). A 
qualidade do RNA foi obtida pelo número da integridade do RNA (RNA Integrity 
Number, RIN), a partir da análise dos RNAs ribossomais baseadas em microfluídos, 
utilizando-se o sistema 2100 Bioanalyzer (Agilent, EUA). Só foram utilizadas amostras 
com o RIN>7,0. 
 
3.8.2 Construção da biblioteca de cDNA e RT-qPCR 
 
cDNA do mRNA foi sintetizado a partir de amostras de RNA total de 
10ng usando primers de haste-loop de miRNA específicos e o kit de transcrição 
 34 
reversa TaqMan MicroRNA (Thermo Fisher Scientific, EUA). As amostras de RNA total 
também foram transcritas reversamente em cDNA usando a Mistura Principal de RNA 
para cDNA de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific, EUA). 
A reação de transcrição reversa (RT) foi realizada utilizando-se o 
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 RXN (BioRad), conforme especificação do fabricante. 
Os primers para os genes analisados foram desenhados através da plataforma 
Primer-Blast program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), a partir de 
sequências publicadas no GenBank (www.pubmed.com), e sintetizados pela Exxtend 
Biotecnologia Ltda (Paulínia – SP, Brasil). A termociclagem foi realizada no 
equipamento QuantStudio (Life Technologies, EUA), sob as seguintes condições: 
Ativação da Polimerase GoTag Hot Start 2 min. a 95°C seguida de 40 ciclos de 15 
seg. a 95°C e 1 min. a 60°C, finalmente, curva de dissociação na faixa de 60-95°C. 
Um gráfico de amplificação foi traçado para cada amostra mostrando um aumento do 
corante de repórter fluorescente (ΔRn) em cada ciclo de PCR. A partir deste gráfico, 
foi determinado o ciclo em que a reação cruza o limiar de detecção (limiar do ciclo - 
CT). A quantificação relativa de cada gene foi realizada usando o método CT 2-ΔΔ de 
acordo com Livak e Schmittgen, (2001). Os valores obtidos para todas as amostras 
foram normalizados pela relação obtida entre os genes alvo e os genes endógenos, 
descritos na Tabela 1. As análises de RT-qPCR foram realizadas em parceria com o 
Laboratório de Desreguladores Endócrinos e Carcinogênese do Instituto de 
Biociências de Botucatu – IBB/UNESP. 
 
Tabela 1. Lista de primers utilizados. 
Genes Primer forward Primer reverse 
GAPDH GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTC GAGGCTGGCACTGCACAA 
ER- CACATCAGGAAATGTCAAGCAGT AAGAGCTAAGCCAGTCGCTC 
ER-β TGAGTGCAGCTCAACAGAGG TCTGTAGTCTGTCCGCCTCA 
BCL2 ACTCTTCAGGGATGGGGTGA TGACATCTCCCTGTTGACGC 
FOXO CTTTCCCGTGGAGCAGAACT GTGCTCTGGAGTAGGGATGC 
TP53 TCATGGAGGATTCACAGTCGG TCGCTGTGGTGGGCAGAATA 
FGF-2 TCCATCAAGGGAGTGTGTGC TCCGTGACCGGTAAGTGTTG 
Slug CCTCATCTTTGGGGCGTGTA ATGGCATGGGGGTCTGAAAG 
β-catenina ACTCCAGGAATGAAGGCGTG GAACTGGTCAGCTCAACCGA 
 
 
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 
 
Os dados foram inicialmente submetidos a testes de normalidade 
 35 
(Shapiro–Wilk) e homogeneidade de variância (Bartlett). Para comparação dos dados 
obtidos serão utilizados o teste estatístico para análise de variância - ANOVA, com 
teste “a posteriori” de Dunnet ou o teste não paramétrico de Kruskall-Wallis, com teste 
“a posteriori” de Dunn, de acordo com a característica de cada variável. As diferenças 
foram consideradas estatisticamente significativas quando p