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Sequenciamento de DNA 
Para que serve o sequenciamento de DNA? 
- A sequência nucleotídica de um gene permite a dedução da sequência de 
aminoácidos. 
- A partir da sequência de aminoácidos, é possível fazer uma comparação com 
outras sequências já conhecidas e sugerir uma função para aquela proteína. 
- Além disso, a partir da sequência de aminoácidos é possível identificar também 
determinados locais de ligação a cofatores, regiões transmembranares e locais de 
reconhecimento de receptores. 
- Por outro lado, em regiões não-codantes é possível identificar trechos de 
controle de replicação/regulação da expressão gênica. 
- Um exemplo de aplicação do sequenciamento é a comparação da sequência de 
genes de indivíduos de uma mesma espécie, possibilitando a identificação de 
mutações. Nesse sentido, uma mutação presente em um gene de pacientes com 
determinada doença, mas ausente em pessoas sadias, pode sugerir maior 
susceptibilidade a desenvolver aquela doença. 
- Por outro lado, a comparação de genes entre diferentes organismos pode levar a 
hipóteses sobre a relação evolutiva entre eles. Como exemplo, temos o gene do 
16s-rRNA, amplamente utilizado na classificação de bactérias. 
Clonagem DNA em vetor 
- A clonagem em vetor é um processo realizado antes do sequenciamento 
propriamente dito, para fazer cópias do trecho de DNA que se deseja sequenciar. 
- Para isso, a amostra de DNA é fragmentada em diferentes trechos, que são 
inseridos em vetores plasmidiais. Os plasmídeos são inseridos em bactérias, como 
E. coli, por meio de um choque térmico. Além disso, os plasmídeos também contêm 
um gene que confere resistência a um antibiótico. Dessa forma, posteriormente é 
possível selecionar as bactérias que receberam o plasmídeo por meio dessa 
resistência. 
- Assim, as bactérias são cultivadas em meio de cultura com antibiótico. Dessa 
forma, somente as bactérias que incorporaram o plasmídeo crescerão no meio de 
cultura. 
- A partir disso, o DNA pode ser extraído e sequenciado. 
💡 Obs.: nos casos de clonagem de grandes insertos em vetores (20 kb), o 
método de Sanger só poderia determinar os primeiros 600 a 800 nucleotídeos 
após o sítio de clonagem, devido à limitação dessa técnica. Dessa forma, para 
contornar isso, após a leitura desse primeiro trecho, pode ser sintetizado um 
novo primer complementar ao final da região que acabou de ser sequenciada. 
Assim, esse procedimento era repetido até terminar o sequenciamento da região 
desejada. 
 
Sequenciamento de Sanger 
- O sequenciamento de Sanger é uma técnica utilizada para determinar a 
sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. Esse método baseia-se no 
uso de dideoxirribonucleotídeos (ddNTPs), que são nucleotídeos modificados sem 
o grupo hidroxila (-OH) no carbono 3’. 
- Normalmente, durante a replicação do DNA, a DNA polimerase adiciona 
nucleotídeos complementares à fita molde, ligando-os à extremidade 3' da cadeia 
em crescimento. Esse processo ocorre porque os nucleotídeos convencionais 
(dNTPs) possuem um grupo hidroxila (-OH) no carbono 3’, que permite a formação 
de uma ligação fosfodiéster com o próximo nucleotídeo, estendendo a cadeia de 
DNA. 
- No entanto, no sequenciamento de Sanger, quando um ddNTP é incorporado, a 
síntese é interrompida. Como esses nucleotídeos não possuem o grupo 3’-OH, a 
DNA polimerase não consegue adicionar mais nucleotídeos, resultando em 
fragmentos de diferentes comprimentos. Esses fragmentos são então separados 
por eletroforese, permitindo a leitura da sequência do DNA. 
 
Etapas 
- No início da técnica, uma amostra de DNA é distribuída igualmente em quatro 
tubos. Cada um contém a mesma quantidade de DNA polimerase, primers, dNTPs e 
a mesma quantidade de um ddNTP diferente em cada tubo. 
- Os tubos são aquecidos para que as fitas duplas se separem em fitas simples e os 
primers se ligam a uma sequência específica de nucleotídeos (para qual foram 
desenvolvidos) nas fitas simples. 
- A DNA polimerase inicia a síntese de DNA, inserindo os nucleotídeos presentes 
na solução. Quando um ddNTP é inserido ao acaso na cadeia de DNA, o 
alongamento da cadeia é interrompido, pois a DNA polimerase precisa de um 
terminal 3’ OH livre para adicionar os nucleotídeos e os ddNTPs não tem OH no 
carbono 3’. 
- Portanto, várias moléculas de DNA de tamanhos diferentes são produzidas em 
cada tubo. 
- Em seguida, é feita uma eletroforese em um gel capilar. Os ddNTPs são marcados 
com fluoróforos e emitem fluorescência quando excitados por determinados 
comprimentos de onda. Assim, a partir desta fluorescência, o resultado da 
eletroforese mostra a sequência das bases na cadeia de DNA da amostra. 
 
💡PCR-based Cycle Sequencing é uma variação do sequenciamento de Sanger 
que incorpora uma reação de PCR para amplificar o DNA antes do 
sequenciamento. É utilizado quando há pouca quantidade de DNA na amostra. 
 
Sequenciamento Cíclico em Arranjo (Pirossequenciamento) 
- O pirossequenciamento é uma técnica que permite o sequenciamento em larga 
escala com redução de custos. O processo ocorre em várias etapas: 
 
1. Fragmentação do DNA 
- A amostra de DNA é fragmentada por técnicas como sonicação ou ultrassom. 
 
2. Ligação de Adaptadores 
- Os fragmentos gerados são ligados a pares de adaptadores (A e B). O adaptador B 
contém uma biotina em uma de suas extremidades. 
 
3. Separação por Biotina-Streptoavidina 
- A mistura é adicionada a uma coluna contendo streptoavidina, que se liga 
fortemente à biotina. Assim, os fragmentos de DNA contendo adaptador B são 
retidos na coluna. Em seguida, uma lavagem com substância alcalina desnatura as 
fitas duplas, liberando as fitas simples sem biotina. 
 
 
 
4. Amplificação por PCR em Emulsão 
- Para amplificar os fragmentos, realiza-se uma PCR em emulsão. Esse processo 
ocorre em micelas contendo todos os reagentes necessários e suspensas em óleo. 
Cada micela deve conter um único fragmento de DNA, juntamente com uma 
microesfera revestida com primers. Assim, as cópias geradas do fragmento 
permanecem aderidas à microesfera. 
 
 
5. Transferência para o Chip e Sequenciamento 
- Após a amplificação, as microesferas são transferidas para um chip contendo 
micropoços, onde ocorre o sequenciamento. Durante o processo, um dos quatro 
dNTPs é adicionado por ciclo, na presença da DNA polimerase. Isso significa que os 
dNTPs são incorporados de forma sequencial, um por vez. 
 
6. Detecção do Pirofosfato e Emissão de Luz 
- Quando um dNTP é incorporado ao DNA complementar, ocorre a liberação de 
pirofosfato. Esse pirofosfato gera ATP, que é utilizado pela enzima luciferase para 
produzir luz. A intensidade luminosa gerada é proporcional ao número de 
nucleotídeos incorporados no ciclo. 
 
7. Lavagem e Repetição do Ciclo 
- Após cada ciclo, o ATP gerado e qualquer dNTP não incorporado são degradados 
pela enzima apirase. Em seguida, uma lavagem remove esses componentes antes 
da adição do próximo dNTP. O ciclo completo com os quatro nucleotídeos ocorre 
em apenas 60 segundos. 
 
8. Geração do Pirograma 
- O resultado do sequenciamento é registrado em um pirograma, que exibe os 
dados obtidos a partir da luz emitida durante o processo. A quantidade de luz 
emitida em cada ciclo é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados em 
cada ciclo. Dessa forma, é possível determinar a sequência de DNA da amostra. 
 
Sequenciamento de 3ª e 4ª geração 
- As tecnologias de sequenciamento de 3ª e 4ª geração representam avanços 
significativos na análise de genomas, proporcionando maior rapidez, precisão e 
capacidade de leitura de moléculas longas em comparação com métodos 
anteriores. 
- As técnicas de 3ª geração utilizam moléculas individuais e longas de DNA ou RNA 
como molde, permitindo o sequenciamento direto sem a necessidade de 
amplificação prévia. As técnicas de 4ª geração ainda estão em desenvolvimento. 
 
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