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1www.biologiatotal.com.br GE NÉ TI CA M OL EC UL AR TRANSCRIÇÃO E EXPRESSÃO GÊNICA O fluxo da informação genética é um processo no qual conseguimos “abrir” o livro fechado, no caso o DNA, para fazer uma “cópia de trabalho”, que é o RNA. Uma grande diferença entre essas duas classes de moléculas, é que o DNA abrange todo o repositório do genoma de um determinado organismo, enquanto que o RNA se refere apenas a uma parte desse genoma, que é a parte que está sendo expresso em um determinado momento da vida do organismo. Assim, enquanto que o genoma pode ser visto como algo fixo, “imutável” (não no sentido de ser livre de mutações, mas sim no sentido de estar presente, com mínimas alterações, em todas as células, em todos os momentos, em todos os ambientes onde o organismo está), o RNA é algo extremamente dinâmico. A transcrição é o processo pelo qual regiões específicas do DNA, os genes, são copiados para uma fita de RNA para serem posteriormente traduzidos em proteínas (os mRNAs) ou servirem como a sede dessa tradução (os rRNAs e os tRNAs). Apenas uma pequena parte do genoma são transcritos, e por muitas vezes o que é transcrito varia de acordo com os momentos e fases da vida do organismo. O processo todo é orquestrado por um conjunto de proteínas, das quais as RNAs polimerases são as protagonistas. Essas enzimas, assim como as DNA polimerases, adicionam um novo nucleotídeo a uma cadeia já existente, através de uma ligação fosfodiéster, sempre no sentido 5´-3´. O tipo de nucleotídeo adicionado se difere daquele adicionado pelas DNA polimerases, já que na polimerização dos RNAs, são utilizados ribonucleotídeos (e não desoxirribonucleotídeos); esses têm uma hidroxila adicional no segundo carbono da pentose. Além disso, no lugar da base Timina (T), se apresenta a base Uracila (U). A RNA polimerase utiliza apenas uma das fitas unifilamentar do DNA para promover a transcrição do gene, o produto desta polimerização é uma fita simples de RNA. Portanto, esta é uma outra diferença fundamental entre o DNA que possui fita dupla, e os RNAs, fita simples. Frequentemente os RNAs (tRNAs e os rRNAs) adquirem conformações secundárias extremamente complexas, advindas de pareamento intramolecular. Essas conformações transformam essas duas classes de RNAs em “ferramentas”, enquanto que o mRNA, que geralmente se mantém na forma linear, pode ser visto como efetivamente uma página aberta de um livro, pronta para leitura e interpretação. O mRNA é um intermediário entre o DNA e a proteína que será produzida, sua função se resume em portar a mensagem decodificada do DNA. Em geral, sua duração na célula é muito curta e são menos estáveis. Já o RNA transportador e RNA ribossômico podem ser descritos como moléculas estáveis, de vida longa, e que desempenham papel como moléculas funcionais na tradução. Outras várias moléculas de RNA são também produzidas, mas vamos estudar apenas essas três. Entre as três moléculas, o mRNA é a mais processada (particularmente em eucariontes) e também a que sofre um controle da expressão muito mais acurado. Isto ocorre porque o mRNA é quem determina quais as proteínas que vão ser expressas em uma determinada condição, em um determinado ambiente, em um determinado órgão ou tecido entre outras ocasiões. 2 GE NÉ TI CA M OL EC UL AR Moléculas de RNA classificadas em moléculas de informação e função. RNA MENSAGEIRO O mRNA tem a função de codificar a informação genética do DNA e levar até os ribossomos para que seja traduzida em proteína. Essa molécula é instável, apresenta meia vida muito curta, de poucos minutos em procariontes podendo chegar até 6 horas nos eucariotos, o que de certa forma é de extrema importância no controle da expressão gênica. No entanto, em alguns poucos casos ela é quase que totalmente estável, como o mRNA da globina, umas vez que o seu produto é necessário a taxas máximas quase que o tempo todo. Em geral, nos procariontes, as moléculas de mRNA traduzidas são cópias diretas dos genes, e não há modificações ou processamento. Já nos eucariontes, os mRNAs sofrem intensa modificação e processamento antes da tradução, incluindo modificações químicas e remoção de íntrons, que ocorre dentro do núcleo da célula antes de ser enviado ao citoplasma. Diferenças entre procariotos e eucariotos no processo de transcrição. Estrutura do tRNA. RNA TRANSPORTADOR O RNA transportador tem como função fornecer aminoácidos ao ribossomo para a produção de polipeptídeos de acordo com as informações genéticas do mRNA. Cada tRNA possui uma alça anticódon formado por uma trinca de nucleotídeos complementares ao códon do mRNA e permite que o aminoácido correto seja adicionado na síntese proteica. Os tRNAs apresentam tamanhos variados entre 74 e 95 bases, sendo o mais comum 76. Na extremidade 3’ apresentam sempre uma sequência terminal CCA, que pode se ligar covalentemente ao aminoácido específico. Além das bases nitrogenadas comuns (adenina, citosina, guanina e uracila), o tRNAs apresentam também bases modificadas como a ribotinina. As modificações destas bases muitas vezes são metilações, as quais impendem que as bases fiquem pareadas modificando a estrutura tridimensional do tRNA. RNA RIBOSSOMAL O RNA ribossomal (rRNA) faz parte da constituição dos ribossomos compondo suas unidades e subunidades em conjunto com diversas proteínas. Nos ribossomos encontra- se aproximadamente 80% de todo o RNA contido na célula e neles é que são montadas as proteínas. Nos procariontes mais de 50 proteínas ribossômicas diferentes interagem com o rRNA para formar a complexa estrutura tridimensional do ribossomo. Ribossomos são compostos por três diferentes rRNAs em procariontes e por quatro em eucariontes. 3www.biologiatotal.com.br GE NÉ TI CA M OL EC UL AR Em procariontes, a transcrição se dá como um operon, assegurando assim número igual de cópias de cada rRNA (16S, 23S e 5S) para montar os conjuntos sem sobra. Em eucariontes, além do óperon principal (18S, 28S e 5,8S), há um gene adicional, para a subunidade 5S, que é transcrito independentemente. O rRNA é obtido por transcrição e o produto final dos genes são moléculas de RNA. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS Em procariotos a transcrição pode ser simples ou policistrônica (contendo mais de um gene). O processo de transcrição pode ser dividido em três etapas: 1) início, 2) elongamento e 3) término e liberação da molécula de RNA. INÍCIO O processo de transcrição se inicia pelo reconhecimento do promotor do gene, logo após ocorre a formação da bolha com separação dos filamentos do DNA. Os promotores são capazes de determinar o molde que deve ser transcrito e a frequência dessa transcrição. O reconhecimento dos promotores ocorre pela subunidade sigma da RNA polimerase, sem esta subunidade a transcrição seria um evento aleatório. Esta ligação da polimerase ocupa cerca de 100 bases, 70 acima do sítio de início da transcrição, e 30 abaixo (notação: -70 e +30). As regiões mais importantes são as –35 e –10, onde se encontram a região consenso dos promotores (TATAAT região -10, e TTGACA região -35). Alguns promotores bacterianos apresentam uma região a mais chamada de UP (Upstream) que seria uma sequência de consenso a mais, é encontrada em alguns genes altamente expressos, com a finalidade de catalisar o processo de transcrição. Representação de um sítio de iniciação do processo de transcrição. Representação de um sítio de finalização do processo de transcrição. ELONGAMENTO Assim que a RNA polimerase encontra o promotor ela faz a abertura do DNA formando a bolha de transcrição. Uma vez a bolha formada, a RNA polimerase libera a subunidade sigma e inicia o processo de elongamento do RNA adicionando os ribonucleosídeos trifosfatados complementares a fita de DNA molde. O fechamento temporário da bolha é catalisado pela RNA polimerase, além da adição de TÉRMINO E LIBERAÇÃO O processode transcrição termina quando a RNA polimerase transcreve um sinalizador de término ou finalizador que antecedem o ponto de término. Sinalizadores de término são sequencias que determinam o fim da transcrição quando reconhecidas pela RNA polimerase, bem similar ao mecanismo dos promotores. Já os finalizadores, temos a finalização palindrônica, onde o RNA assume a forma de uma alça ou grampo. Quando a RNA polimerase encontra uma dessas regiões finalizadora, se desencadeia uma série de eventos, onde: 1) a RNA polimerase paralisa a síntese de RNA, 2) a molécula de RNA liberta-se da RNA polimerase, 3) a molécula de RNA separa-se da fita de DNA e 4) a RNA polimerase separa-se da fita molde de DNA. Assim que a RNA polimerase paralisa, uma proteína com atividade de helicase (proteína rô) desenrola o híbrido RNA/DNA da bolha de transcrição dando fim ao processo de transcrição. 4 GE NÉ TI CA M OL EC UL AR O PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS A transcrição dos eucariotos segue um padrão similar a dos procariotos, com algumas peculiaridades. A primeira dela se deve as sequências promotoras e as moléculas de RNA polimerase envolvidas no processo. As RNA polimerases se dividem em três grupos distintos RNA polimerase I (transcreve grandes rRNA), RNA polimerase II (transcreve Pré-mRNA, alguns snRNA, e snoRNA) e RNA polimerase III (transcreve tRNA, pequeno rRNA, e snRNA). As três RNA polimerases eucarióticas dependem de fatores proteicos de transcrição para iniciar a síntese de RNA, diferente da RNA polimerase procariótica que era capaz de transcrever de forma autônoma. Esses fatores de transcrição necessitam se ligar cada qual ao seu sítio e região promotora do DNA apropriada para então dar início ao processo de transcrição do RNA. A RNA polimerase II se posiciona e inicia sua atividade quando reconhece um promotor chamado TATA box, que se trata de um curto segmento (TATAAAA) conservado na posição -30pb. Outra região promotora conservada é o CAAT box, que possui sequência de consenso GGCCAATCT, localizado geralmente próximo à região -80pb. Além destas duas sequencias promotoras, outras regiões conservadas atuam como promotores em eucariotos, envolvendo fatores basais de transcrição. As RNA polimerases I e III também necessitam de complexos de transcrição envolvendo fator de transcrição e regiões promotoras para iniciar a transcrição pelas RNA. Os promotores dos genes transcritos por essas duas RNA polimerases são bem distintos daqueles utilizados pela RNA polimerase II. ELONGAMENTO As RNA polimerases catalisam o elongamento da cadeia de RNA utilizando os mesmos mecanismos já descritos para a transcrição em procariontes. Com a diferença que no início do processo elongamento dos precursores dos mRNA eucarióticos, quando a cadeia está com 30 nucleotideos de comprimento, a enzima guanil- transferase, adiciona um “quepe” à extremidade 5’ do mRNA. Esse quepe é constituído de 7-PPP- metilguanosina, obedecendo a uma ligação 5´-5´-trifosfato bastante atípica. As funções do quepe envolvem o splicing correto, proteção contra degradação por exonucleases, e também serve de chave para o início da tradução, posto que interage com a subunidade 40S via proteínas de ligação ao quepe, por exemplo fator eIF2. TÉRMINO Em eucariontes, a terminação se dá por mecanismos ainda não bem estudados e compreendidos. Após a terminação, a RNA polimerase é liberada, desfosforilada, e reciclada para nova polimerização. PROCESSAMENTO DE RNA Os RNAs pré-mensageiro, ou RNA heterogêneo nuclear (hnRNA), são os produtos da transcrição. Diferente dos procariotos, mRNA dos eucariotos precisam passar por um processamento para então ser utilizado na tradução. Este processamento se torna necessário devido a existência de sequências éxons (codificantes) e íntrons (não-codificantes) presentes na molécula. Dentre esses processamentos estão a colocação do quepe (colocada logo no início da transcrição) e da cauda de poliadeninas e ainda a remoção dos íntrons. Para adição da cauda de poliadeninas, uma sequência (consenso: AAUAAA) é transcrita após os éxons finais na extremidade 3´; esse segmento ajuda a sinalizar um futuro evento de clivagem por uma endonuclease. A clivagem é efetuada pela endonuclease, e eventualmente a RNA polimerase dissocia-se do processo. Após a clivagem, a enzima poli(A)-polimerase adiciona uma cauda de As, com 150-200 resíduos de adenosina. Assim como o quepe, essa cauda desempenha importantes funções 5www.biologiatotal.com.br GE NÉ TI CA M OL EC UL AR na longevidade e na tradução: serve como sítio de ligação para proteínas, protege contra degradação por exonucleases. Adição do quepe e da cauda de poliadeninas. Mecanismo de splicing via spliceossomo. O transcrito primário contém íntrons e éxons; todos os íntrons deverão ser removidos, em uma ou mais etapas, e além disso os éxons poderão ser seletivamente removidos, no processo chamado de splicing alternativo ou embaralhamento de éxons. Resume-se que todas ou pelo menos a maioria das reações de processamento do hnRNA se dão no núcleo da célula, e a molécula de mRNA é então liberada para o citoplasma, na forma de um mRNA maduro. Nessa passagem, o mRNA é adicionado de algumas outras proteínas que o protege contra a degradação, formando um complexo denominado informossomo. MECANISMOS DE SPLICING Existem basicamente quatro tipos de íntrons (Grupo I, Grupo II, Pré-mRNA nuclear e tRNA) com mecanismos distintos de splicing. Os íntrons do grupo I e II possuem formas distintas de realizarem sua própria remoção. Os íntrons do grupo I se dobram em nove hastes e são retirados em conjunto com reações de transesterificações. Já os íntrons do grupo II realizam as reações de transesterificação formando uma estrutura em laço. Os íntrons tRNA são encontrados nos genes de tRNA e seu mecanismo de recomposição está relacionado a enzimas que cortam e ligam o RNA. Os íntrons do pré-mRNA são os mais comuns e possuem mecanismos de remoção semelhantes ao do grupo II, mas não conseguem auto realizar, necessitando do auxílio do spliceossomo (complexo de proteínas e moléculas de RNA - snRNPs e RNA nucleares). No spliceossomo as moléculas que compõem o complexo de snRNPs se posicionam sobre a sequência do do RNA localizando o íntron. Quando ativo o spliceossomo a extremidade 5’ do íntron é ligada ao ponto de ramificação, dobrando o íntron em forma de laço e realizando o corte. Em seguida, a estrutura do complexo Lariat é liberada, juntamente com o restante das snRNP, e os éxons adjacentes são unidos. SPLICING ALTERNATIVO – EMBARALHAMENTO DE ÉXONS Uma das possíveis vantagens evolutivas da existência de íntrons e éxons em eucariontes é a possibilidade de se fazer o “embaralhamento” de diferentes éxons, através da remoção seletiva de alguns deles, permitindo portanto 6 GE NÉ TI CA M OL EC UL AR a formação de várias proteínas a partir de um mesmo transcrito primário. Por exemplo, o mRNA do gene da alfa-tropomiosina (15 éxons e 14 íntrons), pode dar origem a nove diferentes proteínas, dependendo do controle celular exercido. Em outras situações, vias alternativas de processamento envolvem múltiplos sítios de corte no final 3´. Assim, um mesmo transcrito pode gerar mais de um produto final pelo corte e eliminação de um segmento de um éxon em alguns transcritos, enquanto que em outros o éxon inteiro é mantido. Representação de splicing alternativo. DEZ MANDAMENTOS DA TRANSCRIÇÃO 1. O RNA é produzido sob a forma de uma fita simples, o que tem duas implicações principais: i. Ele pode ser mais facilmente degradado, o que é particularmente sensível para o RNA mensageiro; ii. Ele pode formar estruturas secundárias e terciárias muito mais complexas que as do DNA, o que é notório para os RNAs ribossômicos e mais ainda para os transportadores. 2. O açúcar do RNA é uma ribose e não uma desoxirribose, como no DNA. Uma implicaçãoé que o RNA pode ser mais reativo do que o DNA. 3. A composição de bases é semelhante entre o DNA precursor e o RNA, mas a base pirimídica uracila (U) é encontrada em lugar da timina. 4. Um determinado transcrito de RNA é originário de apenas uma fita do DNA, a fita- molde, mas ambas as fitas podem produzir diferentes transcritos. Isto pode ser demonstrado por experimentos de hibridização DNA-RNA. 5. Como na replicação do DNA, a transcrição apresenta uma polaridade, um molde e mecanismos semelhantes de adição de nucleotídeos. Apresenta também as fases de iniciação, alongamento e terminação. 6. Ao contrário da replicação, a transcrição não requer um iniciador, já que RNAs polimerases têm a capacidade de inserir nucleotídeos sem o iniciador, e geralmente apenas segmentos limitados de DNA são transcritos (os genes que estão sendo expressos em um determinado momento da vida do organismo). 7. O RNA é semelhante à fita não-molde. 8. O produto da transcrição é uma fita simples, e apenas parte do DNA se encontra aberto em um determinado momento da transcrição. 9. Ao contrário da replicação, onde o DNA, após abrir-se, não volta a se reanelar com a mesma fita original, na transcrição a fita de DNA é apenas transitoriamente aberta; ela volta a se reanelar assim que a cópia de RNA é feita. 10. Um gene pode ser transcrito simultaneamente por várias RNA polimerases. Retirado da apostila de Tcacenco (2014) 7www.biologiatotal.com.br EX ER CÍ CI OS EXERCÍCIOS 1 2 3 4 5 6 7 8 Quais as diferenças entre o DNA e RNA? Porque a transcrição, ao contrário da replicação, não requer um iniciador (primer)? Como que ocorre o início da transcrição de um gene? É um processo que ocorre de forma aleatória ao longo da cadeia de DNA? Qual a função do RNA transportador? E quais as duas regiões mais importantes de sua estrutura? Em uma fita de DNA com a sequência AGATGACCTCTAGGTCTT. Qual será a sequência do transcrito em RNA formado a partir desta sequência de DNA? Quais as formas que ocorre a terminação do processo de transcrição e liberação do transcrito nos procariontes? O que seria o “quepe” adicionado na frente do mRNA e qual a sua função? Por conta da existência de regiões íntrons no DNA de eucariontes é necessário efetuar o seu processamento. Essa presença de íntrons apresenta alguma vantagem? Por que o mRNA recém transcrito precisa ser processado em organismos eucariotos? Quais seriam as consequências de não realizar este processamento? QUESTÃO RESOLVIDA NA AULA 8 EX ER CÍ CI OS ANOTAÇÕES 9 10Numere a segunda coluna de acordo com a primeira. Coluna 1 1 – DNA 2 – RNA Transcrição é o processo pelo qual uma molécula de RNA é produzida, a respeito disso, assinale a alternativa correta. a) Uma molécula de RNA é usada como molde para a síntese de outra molécula. b) As duas fitas do DNA serão usadas no processo de síntese de RNA. c) O DNA funciona como um molde para a transcrição do RNA. d) Durante a transcrição, as fitas de DNA permanecem completamente unidas. e) Duas fitas de RNA são produzidas no final de cada transcrição. Coluna 2 ( ) Dupla hélice ( ) Ribose ( ) Fita única ou simples ( ) Desoxirribose ( ) Bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina, timina ( ) Bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina, uracila A sequência correta é: a) 1 – 2 – 1 – 2 – 2 – 1 b) 2 – 1 – 1 – 2 – 2 – 2 c) 1 – 2 – 2 – 1 – 1 – 2 d) 2 – 1 – 2 – 1 – 1 – 2 e) 1 – 1 – 2 – 2 – 2 – 1 9www.biologiatotal.com.br GE NÉ TI CA M OL EC UL AR GABARITO DJOW TRANSCRIÇÃO E EXPRESSÃO GÊNICA 1 - O DNA é uma cadeia de fita dupla no formato de dupla hélice, já o RNA é uma fita simples. As bases nitrogenadas são diferentes no açúcar pentose, sendo que no DNA temos a desoxirribose e no RNA a ribose. Além disso, no DNA temos a base Timina (T), enquanto que no RNA é a base Uracila (U). 2 - Na replicação a polimerização é realizada pela DNA polimerase, e esta enzima só consegue polimerizar a partir da terminação 3’OH. Já a transcrição é realizada pelas RNA polimerases, estas conseguem polimerizar sem a necessidade do grupamento 3’OH disponível. 3 - O processo de transcrição se inicia pelo reconhecimento do promotor do gene. Os promotores são capazes de determinar o molde que deve ser transcrito e a frequência dessa transcrição. O reconhecimento dos promotores ocorre pela subunidade sigma da RNA polimerase, sem esta subunidade a transcrição seria um evento aleatório. 4 - O RNA de transportador tem como função fornecer aminoácidos ao ribossomo para a produção de polipeptídeos de acordo com as informações genéticas do mRNA. Cada tRNA possui uma alça anticódon formado por uma trinca de nucleotídeos complementares ao códon do mRNA e permite que o aminoácido correto seja adicionado na síntese proteica. Na extremidade 3’ apresentam sempre uma sequência terminal CCA, que pode se ligar covalentemente ao aminoácido específico. 5 - O transcrito formado terá a sequência UCUACUGGAGAUCCAGAA. 6 - O processo e transcrição nos procariontes pode ser terminado a partir da de uma região de finalização que a RNA encontra durante o processo de transcrição e reconhece que é momento de parada. Ou ainda, durante a transcrição o RNA toma um formato de uma alça ou grampo, gerando uma terminação palindrônica. Nestes dois casos a RNA polimerase paralisa o processo de transcrição, então o transcrito de RNA liberta-se da RNA polimerase, e se separa da fita de DNA. 7 - O quepe é constituído de 7-PPP-metilguanosina, obedecendo a uma ligação 5´-5´-trifosfato bastante atípica. As funções do quepe são de manter splicing correto, proteção contra degradação por exonucleases, e também serve de chave para o início da tradução, posto que interage com a subunidade 40S via proteínas de ligação ao quepe. 8 - A presença íntrons e éxons em eucariontes é considerada uma vantagem evolutivas. Pois a partir destas regiões é possível efetuar o “embaralhamento” de diferentes éxons, através do splicing alternativo. Desta forma, a eliminação dos íntrons e remoção seletiva de alguns éxons permite a formação de várias proteínas a partir de um mesmo transcrito primário. 9 - [C] O DNA é um ácido nucleico que apresenta dupla-hélice, possui a desoxirribose como pentose e suas bases nitrogenadas são adenina, guanina, citosina e timina. Já o DNA apresenta a ribose como pentose, sua fita é simples e suas bases são adenina, guanina, citosina, uracila. 10 - [C] Uma fita de DNA é usada como molde para a formação de uma molécula de RNA. O trecho do DNA que contém o gene a ser transcrito abre-se e a síntese inicia-se naquele ponto. REFERÊNCIAS ALBERTS, B.; JOHNSON, A. Biologia molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2010 SNUSTAD, D.P. e SIMMONS, M.J. Fundamentos de genética. 2° ed. Rio de Janeiro: guanabara Kogan, 2013 TCACENCO, F. A. Biologia molecular. Itajaí, SC: Autor e editor, 2014. 218 p. VALADARES, B. L. B., ARAÚJO, E. D. DE; PANTALEÃO, S. DE M. Genética Básica. São Cristóvão: Universidade Federal de Sergipe, CESAD, 2011. ZAHA, A. (Org.). Biologia molecular básica. 3. ed., rev. e atual. Porto Alegre, RS: Mercado Aberto, 2003. 421 p. O mRNA recém transcrito nos eucariotos apresenta regiões íntrons e éxons, mas apenas as regiões éxons é que codificam polipeptídios, desta forma é preciso remover as regiões íntrons. Se por acaso não ocorrer esse processamento, essa remoção dos íntrons, o gene transcrito não seria capaz de servir para a tradução da proteína correta. É necessário que ocorra o processamento via mecanismos de splicing. QUESTÃO RESOLVIDA NA AULA