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Embriologia veterinária Poul Hyttel University of Copenhagen, Denmark Fred Sinowatz LMU Munich, Germany Morten Vejlsted University of Copenhagen, Denmark Saunders Elsevier 2 Table of Contents Cover image Title page Copyright Revisão científica e tradução Colaboradores Agradecimentos Introdução Prefácio Capítulo 1: História da embriologia Capítulo 2: Mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento embrionário Desenvolvimento embrionário inicial e períodos gestacionais Diferenciação Modelagem Morfogênese Modificações epigenéticas e ciclos de vida Resumo Capítulo 3: Reprodução comparativa Puberdade e ciclo estral Manutenção hormonal da prenhez Resumo Capítulo 4: Gametogênese Células germinativas primordiais Os cromossomos, a mitose e a meiose 3 Citodiferenciação dos gametas Resumo Capítulo 5: Fertilização Transporte do espermatozoide no trato genital feminino Capacitação Interações entre os espermatozoides e a zona pelúcida Adesão e fusão de espermatozoide e ovócito Ativação ovocitária Resumo Capítulo 6: Clivagem embrionária e blastulação Clivagens e ativação do genoma Compactação Blastulação Alongamento do blastocisto Resumo Capítulo 7: Gastrulação, dobramentos embrionários e formação do celoma Desenvolvimento do âmnio Fases iniciais da gastrulação Formação inicial do mesoderma e endoderma O ectoderma e seus derivados iniciais O mesoderma e seus derivados iniciais O endoderma e seus derivados iniciais As células germinativas primordiais Resumo Capítulo 8: Neurulação Formação do tubo neural: neurulação primária e secundária Crista neural Resumo 4 Capítulo 9: Placentação comparada Desenvolvimento do concepto peri-implantação Mudanças no endométrio e reconhecimento materno da prenhez Classificação da placenta Diferenças entre as espécies Prenhez ectópica Resumo Capítulo 10: Desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico Placa neural Tubo neural Linhagens celulares do sistema nervoso central Diferenciação histológica do sistema nervoso central Desenvolvimento da medula espinhal Desenvolvimento do cérebro Sistema nervoso periférico Resumo Capítulo 11: Olho e orelha Desenvolvimento do olho Orelha Resumo Capítulo 12: Desenvolvimento das células do sangue, do coração e do sistema vascular Formação das células do sangue O coração O sistema arterial O sistema venoso Circulação antes e após o nascimento Resumo 5 Capítulo 13: Desenvolvimento do sistema imune Linfócitos Órgãos linfoides e tecidos Resumo Capítulo 14: Desenvolvimento do sistema gastropulmonar Cavidades oral e nasal e palato O intestino anterior Intestino médio Intestino posterior Resumo Capítulo 15: Desenvolvimento do sistema urogenital Desenvolvimento do sistema urinário Desenvolvimento dos órgãos genitais do macho e da fêmea Resumo Capítulo 16: Sistema musculoesquelético O desenvolvimento dos ossos (osteogênese) Esqueleto axial Esqueleto apendicular Crânio Sistema muscular Resumo Capítulo 17: Sistema tegumentar Epiderme Derme (cório) Subcutâneo Apêndices epidérmicos Resumo Capítulo 18: Lista cronológica comparativa do desenvolvimento 6 Capítulo 19: Teratologia História da teratologia Princípios gerais Períodos críticos de suscetibilidade ao desenvolvimento anormal Causas das malformações Classificação das malformações Malformações dos órgãos Malformações congênitas do sistema cardiovascular Malformações congênitas do sistema nervoso Malformações congênitas do sistema urinário Malformações congênitas do sistema genital Malformações congênitas do sistema digestivo Anormalidades congênitas do sistema musculoesquelético Resumo Capítulo 20: A galinha e o camundongo como modelos de embriologia Capítulo 21: Tecnologias em reprodução assistida Inseminação artificial Ovulação múltipla e transferência de embriões Produção in vitro de embriões Criopreservação de oócitos e embriões Clonagem e modificações genéticas de embriões através de transferência nuclear de células somáticas Células-tronco Tecnologias de reprodução assistida em seres humanos Resumo Índice remissivo 7 8 Copyright © 2012 Elsevier Editora Ltda. Tradução autorizada do idioma inglês da edição publicada por Saunders – um selo editorial Elsevier Limited. Todos os direitos reservados e protegidos pela Lei 9.610 de 19/02/1998. Nenhuma parte deste livro, sem autorização prévia por escrito da editora, poderá ser reproduzida ou transmitida sejam quais forem os meios empregados: eletrônicos, mecânicos, fotográficos, gravação ou quaisquer outros. ISBN: 978-85-3525195-1 Copyright © 2010 by Elsevier Limited. This edition of Essentials of Domestic Animal Embryology, First Edition by Poul Hyttel, Fred Sinowatz, Morten Vejlsted is published by arrangement with Elsevier Limited. ISBN: 978-0-7020-2899-1 Capa Folio Design Editoração Eletrônica Thomson Digital Elsevier Editora Ltda. Conhecimento sem Fronteiras Rua Sete de Setembro, n° 111 – 16° andar 20050-006 – Centro – Rio de Janeiro – RJ Rua Quintana, n° 753 – 8° andar 04569-011 – Brooklin – São Paulo – SP Serviço de Atendimento ao Cliente 0800 026 53 40 sac@elsevier.com.br Consulte também nosso catálogo completo, os últimos lançamentos e os serviços exclusivos no site www.elsevier.com.br Nota Como as novas pesquisas e a experiência ampliam o nosso conhecimento, pode haver necessidade de alteração dos métodos de pesquisa, das práticas profissionais ou do tratamento médico. Tanto médicos quanto pesquisadores devem sempre basear-se em sua própria experiência e conhecimento para avaliar e empregar quaisquer informações, métodos, substâncias ou experimentos descritos neste texto. Ao utilizar qualquer informação ou método, devem ser criteriosos com relação a sua própria segurança ou a segurança de outras pessoas, incluindo aquelas sobre as quais tenham responsabilidade profissional. 9 Com relação a qualquer fármaco ou produto farmacêutico especificado, aconselha-se o leitor a cercar-se da mais atual informação fornecida (i) a respeito dos procedimentos descritos, ou (ii) pelo fabricante de cada produto a ser administrado, de modo a certificar-se sobre a dose recomendada ou a fórmula, o método e a duração da administração, e as contraindicações. É responsabilidade do médico, com base em sua experiência pessoal e no conhecimento de seus pacientes, determinar as posologias e o melhor tratamento para cada paciente individualmente, e adotar todas as precauções de segurança apropriadas. Para todos os efeitos legais, nem a Editora, nem autores, nem editores, nem tradutores, nem revisores ou colaboradores, assumem qualquer responsabilidade por qualquer efeito danoso e/ou malefício a pessoas ou propriedades envolvendo responsabilidade, negligência etc. de produtos, ou advindos de qualquer uso ou emprego de quaisquer métodos, produtos, instruções ou ideias contidos no material aqui publicado. O Editor CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO-NA-FONTE SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ H999e Hyttel, Poul Embriologia veterinária / [Poul Hyttel, Fred Sinowatz, Morten Vejlsted]; [tradução Antônio Chaves de Assis Neto … et al.]. - Rio de Janeiro : Elsevier, 2012. 455p. : il. ; 25 cm Tradução de: Essentials of domestic animal embryology Inclui bibliografia e índice ISBN 978-85-3525195-1 1. Animais domésticos - Embriologia. 2. Embriologia veterinária. I. Sinowatz, Fred, 1929-2008. II. Vejlsted, Morten 12-1874. CDD: 636.089264 CDU: 636.09:612.64 10 Revisão científica e tradução SUPERVISÃO DA REVISÃO CIENTÍFICA Antônio Chaves de Assis Neto Professor-doutor do Departamento de Cirurgia (Setor de Anatomia) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP) Mestre e Doutor em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres pela USP Pós-doutor pela Universidade da Califórnia, Davis – Estados Unidos Felipe Perecin Professor-doutor do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA) da USP Médico Veterinário peladorsalmente e encerram o disco embrionário na cavidade amniótica. Após a gastrulação, os três folhetos germinativos diferenciam-se em diversos tipos celulares e determinam a formação do arcabouço da maioria dos sistemas orgânicos, definindo o final do período embrionário (Fig. 2-2). O elevado número de tipos celulares derivados dos folhetos germinativos formados na gastrulação requer, obviamente, um intrincado sistema de organização e diferenciação celular para criar 41 um organismo completo, com seus diferentes, mas interdependentes, tecidos e órgãos. Os diferentes mecanismos que regulam o desenvolvimento embrionário não devem ser vistos como eventos isolados, mas novamente, por conveniência, os processos de diferenciação, modelagem e morfogênese serão descritos separadamente a seguir. Fig. 2-2 Diferenciação de zigoto até a formação dos tecidos corpóreos. O período embrionário é seguido pelo período fetal, o qual se estende até o nascimento, e inclui o crescimento, maturação e remodelagem dos sistemas 42 corpóreos. O desenvolvimento de cada um dos sistemas corpóreos, coletivamente referenciado como “embriologia especial”, será discutido nos capítulos subsequentes. De modo geral, a maioria das perdas embrionárias ocorre no período embrionário inicial. Esta é também a fase em que os embriões estão mais suscetíveis aos agentes teratogênicos (Cap. 19). Diferenciação O corpo de um mamífero adulto é composto por mais de 230 tipos celulares distintos, todos originados de uma única célula, o óvulo fertilizado ou zigoto. O processo pelo qual tipos celulares especializados desenvolvem-se de células menos especializadas é conhecido como diferenciação celular. Em geral, um evento que precede a diferenciação celular é o comprometimento celular, o qual, por sua vez, pode ser dividido em uma fase lábil e reversível denominada especificação celular seguida de uma fase irreversível denominada determinação celular. Uma vez que a célula tenha passado pelo processo de “determinação” o seu destino está fixado e, irrevogavelmente, sofrerá diferenciação. A diferenciação celular é essencialmente regulada mediante diferenças na expressão gênica. A diferenciação das células embrionárias de uma origem comum para gradualmente formar tipos celulares distintos ocorre similarmente a um curso de água que desce a encosta de uma montanha e ramifica-se diversas vezes até atingir a base (Figs. 1-4 e 2-2). E da mesma forma que uma folha que cai na correnteza desce a encosta por um único trajeto, também o faz uma célula particular, que segue um único trajeto durante a diferenciação. Entretanto, tanto para a folha como para a célula, numerosas decisões são tomadas ao longo do caminho até atingir o destino final. Assim, a diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário envolve diversos pontos de ramificação nas quais linhagens celulares dividem-se e as decisões sequenciais tomadas ao longo deste trajeto são determinantes da diferenciação. Como descrito, estas decisões são, em um primeiro momento, reversíveis (especificação celular), mas depois tornam-se irreversíveis (determinação celular). Indução Em um embrião, as células são frequentemente induzidas a diferenciar-se por uma sinalização célula a célula. A interação entre duas ou mais células vizinhas é denominada interação proximal ou indução. Durante o desenvolvimento, a indução entre células e tecidos, ou entre diferentes tecidos, é crucial para a organização e diferenciação das células em seus respectivos órgãos e tecidos. Para que a indução 43 ocorra, entretanto, é necessário que as células induzidas (células potencialmente responsivas) sejam competentes ou receptivas ao sinal indutor. A competência, representada pela expressão de receptores de superfície, por exemplo, está frequentemente presente durante apenas um intervalo de tempo determinado. Se não for induzida durante este período crítico, a célula competente pode iniciar o processo de morte celular programada ou apoptose, em vez de sofrer diferenciação. A apoptose deve ser entendida como um mecanismo normal durante o desenvolvimento embrionário. O primeiro embriologista a investigar os processos de indução foi Hans Spemann (Cap. 1). Em embriões anfíbios, ele notou que a formação do cristalino no ectoderma superficial era somente atingida quando existia interação próxima da vesícula óptica do cérebro em desenvolvimento com o ectoderma superficial (Fig. 2-3, Cap. 11). Spemann removeu a vesícula óptica antes que a interação com o ectoderma ocorresse e como consequência observou que não havia formação do cristalino no ectoderma. Interessantemente, se a vesícula óptica fosse posicionada abaixo do ectoderma superficial do tronco, não era possível induzir a formação do cristalino no ectoderma sobrejacente. Em outras palavras, o ectoderma superficial do tronco não é competente para formar o cristalino. Fig. 2-3 Indução da formação do cristalino estudada por Hans Spemann. Em circunstâncias normais, a ectoderme neural da vesícula óptica induz a formação do cristalino no ectoderma superficial competente da cabeça (1). Uma vesícula óptica ectopicamente posicionada não é capaz de induzir a formação do cristalino no ectoderma superficial não competente do tronco (2). Se a vesícula óptica é removida, não há indução da formação do cristalino (3). Outros 44 tecidos transplantados abaixo do ectoderma superficial competente da cabeça não induzem a formação do cristalino (4). Outro exemplo de indução é a geração do sistema nervoso pela indução do neuroectoderma (Fig. 2-4, Cap. 8). Células iniciais do ectoderma podem tanto diferenciar-se em ectoderma superficial (e deste em epiderme) como em neuroectoderma (e deste formar o sistema nervoso). A princípio, as células iniciais do ectoderma são não comprometidas (ou neutras) e capazes de diferenciar-se em qualquer direção. Entretanto, sinais oriundos da notocorda (uma estrutura mediana das espécies vertebradas que aparece durante a gastrulação, Cap. 7) induzem células ectodérmicas sobrejacentes a diferenciar-se no neuroectoderma. Particularmente, a molécula sinalizadora conhecida como Sonic hedgehog (Shh) desempenha papel crucial neste processo. Células ectodérmicas que não estão na posição mediana do embrião normalmente não recebem sinais indutores e formam o ectoderma superficial. Experimentalmente demonstrou-se que: a remoção da notocorda leva à formação exclusiva do ectoderma superficial.; já o posicionamento da notocorda em uma posição que não a mediana induz à formação de neuroectoderma ao invés de ectoderma superficial; e finalmente o ectoderma mediano removido da influência da notocorda subjacente forma ectoderma superficial. Esses exemplos ilustram que durante a especificação celular o destino da diferenciação celular pode ser alterado pela modificação da posição da célula dentro do embrião. Todavia, uma vez ocorrido a determinação celular, a plasticidade é perdida. 45 Fig. 2-4 O desenvolvimento inicial do sistema nervoso como um modelo de diferenciação, modelagem e morfogênese. Diferenciação: Sonic hedgehog (Shh) secretado da notocorda induz a formação do neuroectoderma sobrejacente. Ainda durante a indução, um gradiente desta molécula está envolvido na determinação da estrutura do tubo neural por uma modelagem em zonas dorsoventrais pela expressão dos fatores de transcrição Pax 6 (ventralmente) e Pax 3 e 7 (dorsalmente). Modelagem: Shh derivado da notocorda (conforme já mencionado) e TGF-β do ectoderma superficial estão envolvidos na modelagem dorsoventral do tubo neural resultando na geração subsequente de fatores de transcrição que controlam a modelagem fina das diferentes camadas aferentes (dorsais) e eferentes (ventrais) de neurônios. Morfogênese: a alteração no formato de uma placa neural achatada para um tubo neural é causada pela formação de pontos de dobramento nos quais as células tornam-se constritas na porção apical e a proliferação celular do ectoderma superficial nas margens da placa neural empurram as laterais uma contra a outra.Células da crista neural deixam o tubo neural nos pontos de dobramento para formar outras estruturas. Modificado de Strachan e Read (2004). 46 Moléculas sinalizadoras, como a molécula Sonic hedgehog, que atuam entre células com pequena distância são conhecidas como fatores parácrinos ou morfógenos. Muitos desses, envolvidos na indução, estão também envolvidos na criação de padrões morfológicos nas células embrionárias (veja a seguir). Quatro famílias principais destas moléculas sinalizadoras são particularmente importantes: • A família dos fatores de crescimento derivados dos fibroblastos (fibroblast growth factor – FGF), que inclui mais de 20 proteínas. • A família Hedgehog, incluindo as proteínas codificadas pelos genes Sonic hedgehog (Shh), Desert hedgehog (Dhh) e Indian hedgehog (Ihh).1 • A família Wingless (Wnt), que contém ao menos 15 proteínas, as quais interagem com receptores transmembrana conhecidos como proteínas Frizzled. • A superfamília do fator de crescimento transformador-β (transforming growth factor – TGF-β), que inclui ao menos 30 moléculas, tais como as famílias do TGF- β, da ativina e das proteínas ósseas morfogenéticas (bone morphogenetic protein – BMP), bem como as proteínas nodal, fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), inibina e substância inibitória mülleriana (MIS). Potencial celular e genômico O zigoto e as primeiras gerações de blastômeros possuem potencial de desenvolvimento, ou potência, equivalentes. Na realidade, cada uma destas células é capaz, independentemente das demais, de dar origem a todos os tipos celulares que compõem o embrião propriamente dito, bem como às células que formam as membranas extraembrionárias e a porção embrionária da placenta. Esta característica celular é conhecida como totipotência celular. Nos animais domésticos, totipotência celular foi demonstrada pela primeira vez em ovelhas pelo cientista dinamaquês Steen Willadsen. Ele isolou blastômeros de embriões ovinos após as primeiras clivagens e deles produziu gêmeos e quadrigêmeos após transferências para ovelhas receptoras. De modo figurativo, totipotência celular corresponde ao início da correnteza na Figura 1-4. Em pouco tempo, entretanto, iniciam-se as ramificações e as células embrionárias tornam-se mais e mais restritas no seu potencial de desenvolvimento (ou seja, elas perdem potência). Como descrito anteriormente neste capítulo, subpopulações de células embrionárias, como a MCI e o epiblasto, mantém a capacidade de formar todos os tecidos do embrião propriamente dito, mas perdem a capacidade de formar tecidos extraembrionários. Essa característica é conhecida como pluripotência. No entanto, experimentos com células-tronco embrionárias (CTEs) tem desafiado este conceito demonstrando que 47 CTEs, que são derivadas in vitro da MCI, podem originar trofectoderma. A geração da ovelha clonada Dolly, em 1996, por Wilmut e colegas, pela introdução de uma célula diferenciada da glândula mamária dentro de um ovócito cujo genoma havia sido removido, demonstrou que até mesmo uma célula diferenciada possui algum tipo de totipotência (Cap. 21). Neste contexto é importante diferenciar totipotência celular de totipotência genômica. Assim, o zigoto e os primeiros blastômeros possuem totipotência celular, uma vez que são por si só capazes de originar tanto o embrião por completo como todos os tecidos extraembrionários. A célula da glândula mamária, por sua vez, possui totipotência genômica; a célula pode formar todos os tecidos, mas apenas com o auxílio do aparato citoplasmático e reprogramação genômica provida pelo citoplasma do ovócito. Após a gastrulação (Cap. 7), a pluripotência permanece apenas nas células da linhagem germinativa, uma vez que as demais células embrionárias diferenciam-se em um dos três folhetos germinativos: o ectoderma, o mesoderma e o endoderma. Células em cada um desses folhetos germinativos somáticos são consideradas multipotentes e, em geral, possuem distintos potenciais de desenvolvimento. Ao final, células em cada um dos folhetos germinativos dão origem a células progenitoras unipotentes tecido-específicas ou células precursoras (classicamente designadas em histologia pelo sufixo: -blastos) capazes de produzir apenas tipos específicos de célula diferenciada. A linhagem germinativa masculina, ao menos em camundongos, pode, entretanto, albergar células-tronco pluripotentes uma vez que a espermatogênese é contínua. No entanto, na maioria das vezes as células de uma determinada linhagem atingem um estágio final de diferenciação no qual elas se tornam completamente maduras e não mais se dividem; neste momento elas estão terminantemente diferenciadas. Para manter a capacidade regenerativa de órgãos e tecidos, entretanto, algumas células mantêm-se plásticas, formando um conjunto de células-tronco somáticas unipotentes (ou mesmo multipotentes) que podem ser recrutadas. As células-tronco hematopoiéticas e as células-tronco mesenquimais da medula óssea adulta são exemplos de células-tronco somáticas. Controle molecular da diferenciação No nível molecular, diversas vias complexas estão envolvidas nas decisões tomadas ao longo dos processos de diferenciação celular. Dois dos fatores-chaves que participam desse processo são: • Alterações epigenéticas (cromatina). Alterações epigenéticas resultam em padrões estáveis (ou seja, herdáveis) de expressão gênica nas células 48 descendentes de qualquer linhagem celular. Conforme mencionado anteriormente, a constituição genética (ou seja, a combinação das sequências de DNA) não é alterada durante a diferenciação; todas as células descendentes do zigoto originam-se de divisões mitóticas e, portanto, devem possuir a mesma informação genética. Uma exceção ocorre no desenvolvimento dos linfócitos nos quais ocorrem rearranjos genéticos. Porém, diversos mecanismos epigenéticos, de um modo rígido e bem orquestrado, controlam como os genes são sequencialmente expressos durante o desenvolvimento embrionário de modo a governar os mecanismos de diferenciação. Os três mecanismos epigenéticos mais importantes são: metilação do DNA, pelo qual a cromatina de algumas regiões do genoma torna-se altamente condensada e transcricionalmente inativa (veja a seguir); modificações nas proteínas histonas incluindo a acetilação das histonas, que comumente leva a uma conformação mais relaxada da cromatina permitindo a transcrição; e regulação gênica por polycomb-trithorax (operando, p. ex., nos genes Hox descritos adiante), que modificam a estrutura da cromatina em conformações transcricionalmente reprimidas (Polycomb) ou ativas (trithorax). Sabe-se que pelo menos os processos de metilação do DNA e modificação das proteínas histonas estão associados, gerando um poderoso mecanismo de silenciamento gênico de longo prazo. • Fatores de transcrição. A presença de fatores de transcrição estáveis ativa a expressão de genes importantes para o desenvolvimento. Ao longo de quase a totalidade deste livro, alguns dos principais fatores de transcrição atuantes nos mais diferentes aspectos moleculares do desenvolvimento embrionário são apresentados em quadros. Incluindo os principais genes Hox, descritos adiante. Modelagem Modelagem é o processo pelo qual células embrionárias organizam-se em tecidos ou órgãos. Embora a diferenciação dê origem a células com estrutura e função especializada, esse processo isoladamente não forma um organismo; as células diferenciadas necessitam ser organizadas espacialmente em três dimensões com uma relação muito bem definida entre elas. Todos os embriões mamíferos tendem a seguir eixos básicos de planos corpóreos gerando os eixos craniocaudal, dorsoventral e proximodistal. O eixo dorsoventral já está presente no blastocisto, com a MCI posicionada em um polo (Cap. 6). A formação do eixo craniocaudal ocorre na gastrulação (Cap. 7), enquanto que a formação do eixo proximodistal é adiada até a formação dos membros (Cap. 16). Modelagem é a consequência da expressão regional de genes que podem ser 49 determinados pela açãode gradientes de moléculas sinalizadoras. Células-alvo próximas da fonte geradora de moléculas sinalizadoras estão expostas a maior concentração de sinalizadores que aquelas mais distantemente localizadas. Moléculas sinalizadoras que atuam desta maneira são conhecidas como morfógenos. Os eixos embrionários craniocaudal e proximodistal são modelados pelos gradientes morfogenéticos conhecidos em maior ou menor extensão. Um exemplo de modelagem pela expressão gênica regional controlada por gradientes de moléculas sinalizadoras é a formação do tubo neural (Fig. 2-4). Nesse contexto, a expressão dos genes Sonic hedgehog originada da notocorda (que é também ativo durante a indução do neuroectoderma) e TGF-β originada do ectoderma superficial está envolvida na determinação inicial da modelagem dorsoventral do tubo neural que resulta na geração sequencial de fatores de transcrição os quais controlam de modo fino a modelagem das diferentes camadas aferentes (dorsais) ou eferentes (ventrais) de neurônios. Genes homeóticos Outro bom exemplo de expressão gênica regional resultando em modelagem é representado pelos genes homeóticos da mosca das frutas, conhecidos como genes Homeobox (ou Hox) nos mamíferos. Na mosca das frutas, Drosophila melanogaster, esses genes são originalmente associados à geração da identidade posicional das células ao longo do eixo craniocaudal. A manipulação artificial desses resulta em alteração no desenvolvimento de todos os segmentos corpóreos. No mutante Antennapedia, por exemplo, observou-se o crescimento de pernas em vez de antenas na cabeça. Portanto, os genes homeóticos atuam governando a diferenciação celular em segmentos ou regiões inteiras do corpo. Os estudos com drosófilas mutantes revelaram dois agrupamentos de genes homeóticos localizados em um único cromossomo e que codificam fatores de transcrição com homeodomínios (que se refere ao sítio de ligação ao DNA). Esses genes são expressos ao longo do eixo craniocaudal, dividindo o corpo em zonas discretas (Fig. 2-5). Genes similares são encontrados nos mamíferos. Nos camundongos e nos humanos, os genes Hox estão reunidos em quatro agrupamentos denominados Hox-A, Hox-B, Hox-C e Hox-D, cada um deles localizado em um cromossomo particular. Verificou-se, em camundongos ao menos, que os genes Hox localizados na extremidade 3’ de cada um dos agrupamentos são expressos nas fases mais iniciais do desenvolvimento e controlam a modelagem das porções anteriores dos corpos, enquanto que os genes localizados nas porções mais próximas da extremidade 5’ são expressos mais tardiamente e controlam a formação das porções mais posteriores do corpo. Nos mamíferos, a expressão dos genes Hox ocorre inicialmente durante a gastrulação, começando pelos 50 genes da posição 3’. Portanto, temporal e espacialmente, os genes Hox controlam o desenvolvimento dos segmentos corpóreos da porção anterior para a posterior. Em contraste ao que ocorre nas drosófilas, há sobreposição na expressão dos genes Hox nos mamíferos. Assim, de uma combinação particular da expressão de genes Hox oriundos dos quatro agrupamentos em cada região ao longo do eixo do corpo as células obtêm a sua identidade posicional específica. Esse padrão de identidade é conhecido como o “código Hox”. Fig. 2-5 Disposição dos genes homeóticos na Drosophila e dos genes Hox no camundongo. A homologia entre os genes da Drosophila e aqueles do camundongo em cada agrupamento é indicada pelo código de cores. Um gradiente de ácido retinoico (AR) está envolvido na definição do “código Hox”. Modificado de Sadler (2006). O “código Hox” parece ser induzido pela exposição de células pluripotentes ou multipotentes a um gradiente de moléculas sinalizadoras. Um gradiente de ácido 51 retinoico, e alguns dos seus derivados imediatos, está provavelmente envolvido neste processo. Durante a gastrulação, a involução2 das células que formam o mesoderma e o endoderma ocorre pelas regiões organizadoras no sulco primitivo estendendo-se em direção à extremidade posterior do epiblasto (Cap. 7). Cada região organizadora impõe um “código Hox” às células sofrendo involução. No camundongo, três regiões organizadoras foram identificadas: a região organizadora inicial da gástrula, a região organizadora intermédia da gástrula e a região organizadora tardia da gástrula. A região organizadora tardia é também conhecida como nodo primitivo. Em associação do centro sinalizador anterior e o endoderma visceral anterior (EVA), os centros organizadores da gástrula formam gradientes anteroposteriores de moléculas sinalizadoras. Esses gradientes induzem a expressão de determinados genes Hox, determinando o previamente mencionado “código Hox”. Morfogênese Morfogênese é o mecanismo pelo qual tecidos e órgãos ganham forma. Assim, enquanto modelagem consiste na reunião de células em regiões que formarão os órgãos, a morfogênese consiste na aquisição da forma interna e completa pelos órgãos. Portanto, durante a morfogênese estruturas como tubos, folhetos e agregados densos de células são formados em resposta a diferentes taxas de proliferação celular, alterações no tamanho e/ou formato das células, fusão celular e/ou alterações nas propriedades de adesão celular, por exemplo. A formação do tubo neural durante a neurulação é um exemplo no qual alterações locais no formato celular e na proliferação celular aproximam grupos celulares distantes para formar uma nova estrutura (Fig. 2-4, Cap. 8). A transformação de uma placa neural achatada em um tubo neural fechado é causada tanto pela formação de pontos de dobramento, nos quais as células sofrem constrição apical devido a alterações no formato celular, bem como pela proliferação celular nas margens empurrando os dois lados um contra o outro. Outro exemplo de morfogênese é encontrado no epiblasto durante o processo de gastrulação: uma única camada de células é convertida em três folhetos germinativos somáticos e na linhagem celular germinativa pela involução celular (Cap. 7). Um último exemplo de morfogênese é a morte celular programada (apoptose) nas membranas das mãos e dos pés criando espaços entre os dígitos (Cap. 16). Modificações epigenéticas e ciclos de vida A metilação do DNA é provavelmente o mais compreendido dos mecanismos 52 epigenéticos que atuam no desenvolvimento animal (Fig. 2-6). Em geral, a metilação do DNA está relacionada à inibição da expressão gênica. Nas células germinativas primordiais recém-formadas, o DNA está altamente metilado assim como nas suas progenitoras epiblásticas. Entretanto, no momento em que as células germinativas adentram a crista genital, o DNA torna-se amplamente desprovido de metilação. Durante a gametogênese subsequente, quando ovócitos e espermatozoides são formados da linhagem derivada das células germinativas primordiais, novas metilações do DNA são estabelecidas, em um processo conhecido com metilação de novo. Essa desmetilação e remetilação ampla do genoma representa o primeiro ciclo da reprogramação epigenética necessária para o desenvolvimento da próxima geração. É importante ressaltar que ocorre metilação dependente do sexo em alguns loci específicos (que posteriormente levarão à expressão monoalélica de alguns genes particularmente importantes para o desenvolvimento embrionário), formando a base para o imprinting genômico. Aparentemente, o gameta masculino torna-se mais metilado que o feminino. Fig. 2-6 Padrões globais de metilação do DNA. Um primeiro ciclo de desmetilação e remetilação do DNA que inclui os genes imprinted é observado durante o desenvolvimento dos gametas das células germinativas primordiais do embrião. Um segundo ciclo de desmetilação e remetilação é observado após a fertilização quando o genoma paterno é ativamente desmetilado. Neste segundo ciclo de reprogramação epigenética, os genes imprinted não sofrem desmetilação. A partir do momento em que ocorre desenvolvimento do blastocisto, o genoma é remetilado. Modificado de Dean et al. (2003). O segundo ciclo de reprogramação epigenética ocorre após afertilização. Em espécies tais como camundongo, rato, porco e bovinos, o genoma paterno é claramente mais lábil que o materno e inicia um processo de desmetilação ativa tão 53 logo o zigoto é formado. Aparentemente esse fenômeno não se aplica a coelhos e ovelhas. No entanto, próximo do estágio de mórula e blastocisto inicial, ambos os genomas parentais estão igualmente desmetilados. De modo interessante, e de grande importância para o desenvolvimento, os genes imprinted metilados não são afetados por esse ciclo de desmetilação e permanecem metilados. Os imprintings são somente apagados e redefinidos durante a gametogênese. O fato de os genes imprinted metilados manterem sua metilação sexo-específica permite a expressão monoalélica sexo-específica desses genes, o que é de fundamental importância para o desenvolvimento embrionário e, em especial, para o desenvolvimento placentário. O segundo ciclo de desmetilação é rapidamente sucedido por um ciclo de metilação de novo que coincide aproximadamente com a diferenciação dos blastômeros em trofectoderma e MCI. Curiosamente, a extensão da metilação é, em algumas espécies, mais pronunciada nas células pluripotentes que formarão a MCI (e posteriormente o epiblasto) do que naquelas que formarão o trofectoderma. A inativação do cromossomo X corresponde à inativação seletiva de alelos de um dos dois cromossomos X das fêmeas gerando um mecanismo de compensação de dose ou hemizigose funcional para os genes ligados ao X. O cromossomo X inativo pode ser visto como o corpúsculo de Barr, uma fração de cromatina condensada situada ao longo do interior do envelope nuclear das fêmeas dos mamíferos. O processo de inativação é iniciado por um único gene, o XIST, que é expresso apenas no cromossomo X inativo. O XIST é um dos poucos genes imprinted ligados ao X. O processo de inativação inicia-se durante o período de metilação de novo do segundo ciclo de reprogramação epigenética que ocorre no estágio de blastocisto. Na MCI, a inativação do cromossomo X herdado do pai ou da mãe ocorre de modo aleatório. No entanto, no trofectoderma o alelo do XIST herdado da mãe é preferencialmente reprimido levando à inativação do cromossomo X de origem paterna. Isso ilustra o fenômeno conhecido como conflito dos genomas parentais ou “a batalha dos sexos”: no trofectoderma e outros tecidos extraembrionários há uma preferência pela expressão de genes3 de origem paterna enquanto que nas células que formarão o embrião propriamente dito há preferência pela expressão de genes maternos. Nas células germinativas primordiais, que transmitem os genes às próximas gerações, os imprints genômicos têm que ser apagados e o cromossomo X inativo deve ser reativado de modo a possibilitar que cromossomos X ativos sejam repassados a todos os gametas. Resumo A gestação compreende os períodos embrionário e fetal. Durante o período 54 embrionário, o zigoto é gerado pela fertilização e as clivagens resultam na formação da mórula. Subsequentemente, no blastocisto forma-se o trofectoderma e a massa celular interna (MCI). A MCI dá origem ao hipoblasto e ao epiblasto estabelecendo o disco embrionário bilaminar após a eclosão da zona pelúcida. A seguir, o epiblasto inicia o processo de gastrulação resultando na formação do disco embrionário trilaminar com três folhetos da linhagem germinativa somática (ectoderme, mesoderme e endoderme) além das células germinativas primordiais. Os três folhetos germinativos participam na formação dos órgãos. Durante o período fetal, que se estende até o termo, os sistemas orgânicos crescem, amadurecem e tornam-se remodelados. O desenvolvimento é um processo gradual regulado por diferentes processos incluindo os princípios gerais de proliferação e crescimento celular bem como processos mais específicos do desenvolvimento embrionário tais como diferenciação celular, modelagem e morfogênese. Diferenciação celular pode ser entendida como uma série de decisões sequenciais que guiam as células pelas etapas de especificação reversível até a determinação irreversível. As células podem ser induzidas a diferenciarem-se pelo contato célula a célula ou por moléculas sinalizadoras, os morfógenos. As células diferenciadas são agrupadas e relacionam-se tridimensionalmente para formar tecidos e órgãos por meio dos processos de modelagem. Durante a modelagem, morfógenos podem atuar de modo complexo, produzindo gradientes que resultam em zonas de diferenciação celular distintas. A modelagem ocorre por ativações regionais na expressão de genes, dentre os quais um bom exemplo é a expressão dos genes mamíferos Hox na definição do eixo craniocaudal do embrião. Alterações finais no formato geral de tecidos e órgão são obtidas pela morfogênese. Leituras adicionais Allegrucci C., Thurston A., Lucas E., Young L. Epigenetics and the germline. Reproduction. 2005;129:137– 149. Dean W., Santos F., Reik W. Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic cell nuclear transfer. Cell Dev. Biol. 2003;14:93–100. Garcia-Fernàndez J. The genesis and evolution of the homeobox gene clusters. Nat. Rev. Gen. 2005;6:881– 892. Gilbert S.F. Developmental Biology, 7th edn. Sinauer Associates, Inc., 2003. Gjørret J.O., Knijn H.M., Dieleman S.J., Avery B., Larsson L.-I., Maddox-Hyttel P. Chronology of apoptosis in bovine embryos produced in vivo and in vitro. Biol. Reprod. 2003;69:1193–1200. Gjørret J.O., Fabian D., Avery B.M., Maddox-Hyttel P. Active caspase-3 and ultrastructural evidence of apoptosis in spontaneous and induced cell death in bovine in vitro produced preimplantation embryos. Mol. Reprod. Dev. 2007;74:961–971. 55 Noden D.M., de Lahunta A. The Embryology of Domestic Animals. Williams & Wilkins; 1985. Pearson J.C., Lemons D., McGinnis W. Modulating Hox gene functions during animal body patterning. Nat. Rev. Gen. 2005;6:893–904. Robb L., Tam P.P.L. Gastrula organiser and embryonic patterning in the mouse. Seminars in Cell & Developmental Biology. 2004;15:543–554. Sadler T.W. Langman’s Medical Embryology, 10th edn. Lippincott Williams & Wilkins, 2006. Strachan T., Read A.P. Human Molecular Genetics, 3rd edn. Garland Science, 2004. Swales A.K.E., Spears N. Genomic imprinting and reproduction. Reproduction. 2005;130:389–399. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K. Viable offspring from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997;385:810–814. Young L., Beaujean N. DNA methylation in the preimplantation embryo: The different stories of the mouse and sheep. Anim. Reprod. Sci. 2004;82–83:61–78. 1 Nota da Tradução: os genes “hedgehog” são assim chamados, pois, em drosófilas, a sua mutação leva à formação de projeções puntiformes nos embrião, lembrando o aspecto de um porco-espinho. Já o sonic hedgehog foi um gene da mesma família nomeado em analogia ao personagem do jogo de videogame. 2 Nota da Tradução: o processo de involução celular consiste na interiorização de uma camada externa em expansão de modo a recobrir a superfície interna das células externas remanescentes. 3 Nota da Revisão Científica: leia-se dos genes imprinted já que a expressão dos demais genes do cromossomo X será de origem materna no trofectoderma. 56 Capítulo 3 Reprodução comparativa Morten Vejlsted Este capítulo oferece uma introdução sobre os sistemas regulatórios envolvidos na reprodução, com um enfoque particular nas fêmeas e nos hormônios da prenhez que possuem relação direta com a embriologia. Para mais detalhes sobre aspectos mais gerais da biologia reprodutiva, especialmente no macho, sugestões de leituras adicionais estão listados no final deste capítulo. Puberdade e ciclo estral Os sistemas endócrino e nervoso atuam em conjunto na cascata de eventos que levam à formação e maturação dos gametas, à fertilização, ao estabelecimento e manutenção da prenhez, ao nascimento e, finalmente, aos cuidados com a prole. Esses processos iniciam-se na puberdade. Na fêmea, a puberdade é marcada pelo início da atividade cíclica regular dos ovários, o que afeta o comportamentode todo o sistema genital: o ciclo estral nos animais domésticos. O sistema reprodutivo nas fêmeas consiste em um par de ovários, nos quais os ovócitos desenvolvem-se, e em um trato genital tubular constituído pelos ovidutos, útero, vagina e vestíbulo (Fig. 3-1). O oviduto é dividido em uma porção larga em forma de funil em sua extremidade, o infundíbulo, que recebe o(s) ovócito(s) na ovulação, uma porção tubular e mais grossa, a ampola, e uma porção longa e mais fina, o istmo, que se conecta ao útero. Acredita-se que a fertilização ocorra na transição entre ampola e istmo. O ovário, exceto na égua, é encontrado dentro da bursa ovariana – uma cavidade formada pela mesossalpinge. Nos animais domésticos o útero é bicornual, contendo dois cornos uterinos, o corpo uterino e a cérvix. O corpo uterino é curto na maioria das espécies, mas relativamente longo em éguas. A cérvix apresenta um ou mais óstios internos voltados ao corpo uterino e um óstio externo voltado à vagina. O óstio externo forma a proeminente porção vaginal em ruminantes e em éguas. O canal cervical apresenta pregas longitudinais. Pregas circulares adicionais são encontradas em ruminantes, e protusões, os pulvini cervicales, intercalam-se entre si na cérvix da porca. O orifício 57 uretral marca a transição entre a vagina e o vestíbulo, o qual está em continuidade externamente com a vulva. Na vaca e na égua adultas, os ovários e o útero podem ser facilmente manipulados por palpação retal, um método extensivamente usado para o monitoramento do status reprodutivo dos ovários, particularmente em vacas. Na égua, e menos extensivamente em outras espécies, o status ovariano e o início da prenhez podem ser facilmente monitorados por ultrassonografia transretal. Fig. 3-1 Órgãos genitais da porca em aspecto dorsal. O quadro ‘B’ em A é apresentado em magnificação em B. 1: Corpo uterino; 2: Corno uterino; 3: Pulvini cervicales; 4: Ovário com folículos antrais; 5: Infundíbulo; 6: Ampola; 7: Ístmo; 8: Ápice do corno uterino. O bastão de madeira aponta para o óstio abdominal do oviduto. Antes da puberdade, o desenvolvimento inicial dos gametas femininos, os ovócitos, dentro dos folículos ovarianos, é regulado mais ou menos de forma autônoma. Contudo, como será explicado no Capítulo 4, alguns ovócitos pré-púberes nunca atingem o estágio de desenvolvimento no qual eles estão aptos para serem 58 fertilizados. Depois do início da puberdade, sinais provenientes de certas áreas do cérebro, incluindo a glândula pineal, hipotálamo e hipófise, estimulam a produção ovócitos fertilizáveis. Da hipófise anterior (adeno-hipófise), as gonadotrofinas (i.e., hormônios estimuladores das células gonadais) FSH (hormônio folículo estimulante) e LH (hormônio lutenizante) são liberadas. Esta liberação é controlada pelos GnRHs (hormônios liberadores de gonadotrofinas) que são secretados pelo hipotálamo e levados para a hipófise anterior pelo sistema porta hipotalâmico-hipofisário. A secreção de GnRHs, e então FSH e LH, é influenciada por estímulos visuais, olfatórios, auditivos e táteis do ambiente e também por sistemas de retroalimentação homeostáticos no próprio animal. O sistema nervoso central somente estará maturo suficientemente para permitir a integração complexa de todos esses sinais com o advento da puberdade. O advento da puberdade precede o desenvolvimento da maturidade física. No entanto, mesmo sendo fértil, a fêmea na puberdade (sexualmente madura e capaz de reproduzir) ainda não atingiu sua máxima fertilidade. Os fatores que influenciam o advento da puberdade incluem idade, peso corporal, raça, nutrição, doenças e, em algumas espécies, estação do ano e proximidade ao macho. As idades as quais as espécies domésticas mais comuns atingem a puberdade são listadas na Tabela 3-1. Tabela 3-1 Idade da puberdade de algumas espécies de animais domésticos Espécies Idade na puberdade Bovina 8-18 meses Equina 10-24 meses Suína 6-8 meses Ovina 6-15 meses Caprina 4-8 meses Canina 6-20 meses Felina 5-12 meses O FSH liberado pela hipófise atinge o ovário pela circulação sistêmica. No ovário, ele estimula um grupo de folículos em crescimento a desenvolver-se (Cap. 4). Os estrógenos, que são produzidos pelas células da granulosa e da teca que delimitam o folículo e circundam o ovócito, exercem retroalimentação positiva na secreção hipotalâmica de GnRH. Outro efeito principal dos estrógenos é a indução dos sintomas de estro, e o advento da puberdade nas fêmeas é sempre sinalizado pela primeira ocorrência de estro ou cio (receptividade sexual). Depois da puberdade, as fêmeas domésticas entram em uma fase da vida caracterizada por repetidos ciclos estrais. O ciclo estral é subdividido em proestro, estro, metaestro e diestro (Tabelas 59 3-2, 3-3). Tabela 3-2 Características das diferentes fases do ciclo estral e anestro Fase1 Características Proestro Fase que precede imediatamente o estro. Os principais hormônios produzidos pelos ovários são os estrógenos. Estro O período (em condições naturais) de aceitação do macho. A ovulação ocorre durante esta fase em todas as espécies domésticas, com a exceção da vaca onde a ovulação ocorre logo após o término do estro. Os principais hormônios produzidos pelos ovários, em resposta ao FSH e ao LH, são os estrógenos. Metaestro Fase subsequente ao estro quando o macho não é mais aceito. Período de formação do corpo lúteo. O principal hormônio produzido nos ovários é a progesterona. Diestro Período da maturidade funcional do corpo lúteo. O principal hormônio produzido nos ovários é a progesterona. Anestro Fase prolongada de descanso sexual na qual o estro é interrompido em algumas espécies. O sistema reprodutivo está em fase quiescente. 1 As fases de proestro e estro podem ser coletivamente chamadas como fase folicular e as fases de metaestro e diestro podem ser chamadas de fase luteal. Tabela 3-3 Características do ciclo estral e do momento da ovulação em espécies de animais domésticos Na maioria das espécies, a elevação dos níveis de estrógenos produzidos pelos folículos ovarianos durante o proestro atinge uma concentração limiar que faz com que ocorra uma maior secreção de GnRH pelo hipotálamo durante o estro. Atingindo a hipófise anterior, o GnRH estimula principalmente um pico de secreção de LH (Fig. 3-2; Tabela 3-4). No ovário, o LH é necessário para a finalização do processo de maturação do(s) ovócito(s) (Cap. 4) e a liberação dele(s) pelo processo de ovulação. Entre as espécies domésticas, a gata e a camela sãos as únicas em que o pico de GnRH que possibilita a ovulação é induzido pela cópula. Além disso, a gata pode 60 continuar apresentando comportamento de estro e aceitando o macho mesmo tendo entrado na fase de metaestro (veja a seguir). Fig. 3-2 Eventos ovarianos e concentrações dos hormônios reprodutivos no plasma sanguíneo durante o ciclo estral em vacas. Durante o estro (E), a produção de estrógenos pelos folículos em desenvolvimento resultam no pico de LH e, em menor extensão, FSH pela hipófise levando à ovulação do ovócito (1). Os folículos não ovulados entram em atresia (2) e as células foliculares do folículo ovulado desenvolvem-se no corpo lúteo (3) secretando progesterona. Uma nova onda de folículos desenvolve-se (4), mas entra em atresia (5). Uma outra onda de crescimento folicular produz então o folículo ovulatório (6) para o próximo estro. Se o ovócito ovulado não for fertilizado não resultando em prenhez, a prostaglandina é liberada pelo endométrio causando a regressão do corpo lúteo e eventual formação do corpo albicans (7). O ciclo estral é dividido em estro (E), metaestro (ME), diestro (DE) e proestro (PE). Tabela 3-4 Hormônios reprodutivos importantes, sua origem e funções principais Hormônio Origem Função principal Melatonina Glândula pineal Responsável pela sazonalidade em equinos, ovinos, caprinos e felinos. GnRH Hipotálamo Estimula a secreção de FSH e LH pela hipófise anterior. FSH Hipófise Estimula o desenvolvimento de folículos no ovário. 61 anteriorLH Hipófise anterior Estimula o desenvolvimento e maturação de folículos e ovócitos e suporta a formação e manutenção do corpo lúteo no ovário. Induz os sintomas de estro. Estrógenos Folículo ovariano Estimula a secreção de GnRH pelo hipotálamo e o número de receptores de GnRH na hipófise anterior. Progesterona Corpo lúteo Prepara o endométrio para a prenhez, mantém a prenhez e diminui a secreção de GnRH pelo hipotálamo. Prostaglandina F2α Útero Induz a regressão do corpo lúteo. Em seguida à ovulação, as células que delimitavam o folículo antes da ruptura dele iniciam o processo de luteinização para a formação do corpo lúteo, e mantêm esse processo de luteinização sob o efeito contínuo do LH durante o metaestro. O desenvolvimento do corpo lúteo inicia-se gradualmente algumas horas antes da ovulação e é marcado pela síntese de progesterona, em vez de estrógenos, pelas células foliculares. O corpo lúteo formado por estas células depois da ovulação é bem definido, algumas vezes um pouco cavitário, esférico e de cor amarelada em vacas, razão pela qual é denominado corpo lúteo. Durante o diestro, a produção de progesterona pelo corpo lúteo atinge o seu máximo. As funções principais da progesterona são: primeiro, exercer o efeito de retroalimentação negativa no hipotálamo, inibindo a liberação de GnRH e, então, um novo recrutamento de ovócitos para uma nova ovulação; e, segundo, preparar o endométrio para a prenhez. Se for realizada uma inseminação e a concepção ocorrer, a progesterona é o principal hormônio responsável pela manutenção da prenhez. No animal não prenhe (excluindo a gata e a cadela), a vida média do corpo lúteo é relativamente curta; na ausência do embrião dentro do útero, o endométrio libera prostaglandina-F2α promovendo a luteólise (regressão do corpo lúteo). O consequente declínio da progesterona resulta na remoção do bloqueio hipotalâmico da secreção de GnRH e possibilita o retorno ao ciclo estral. No útero gestante, a liberação de prostaglandina F2α na corrente sanguínea é bloqueada, permitindo a persistência do corpo lúteo. Esta inibição na liberação de prostaglandina é o componente do “reconhecimento materno da gestação” o qual depende de sinais espécie-específicos produzidos pelo(s) embrião(s) e reconhecido pelo endométrio (Tabela 3-5; Cap. 9). Em caninos e felinos, o útero aparenta não ter nenhum efeito na meia vida do corpo lúteo, e o processo de regressão dele nestas espécies ainda não foi elucidado. Na cadela, o corpo lúteo pode permanecer funcional por até mais que dois meses. No final da gestação, a progesterona é também produzida pela placenta (Cap. 9), dando ao corpo lúteo uma função de certa forma supérflua em algumas espécies. 62 Tabela 3-5 Duração da gestação, período do reconhecimento materno da gestação e número médio de nascidos em espécies de animais domésticos As raças domésticas de suínos e bovinos são animais policíclicos não estacionais, o que significa que porcas e vacas experimentam uma atividade cíclica recorrente durante o ano, interrompida somente com a prenhez, lactação e condições patológicas. Em contraste, a égua, a ovelha, a cabra e a gata são animais policíclicos estacionais; a atividade cíclica deles é profundamente influenciada pela quantidade e duração da luminosidade do dia. A percepção das alterações dos períodos diários de luz é mediada pela glândula pineal que, através da síntese de melatonina e outros hormônios, influenciam a liberação de GnRH. A égua é um animal com reprodução em dias longos, o que significa que o período de mais alta atividade cíclica é entre a primavera e o outono na maioria dos indivíduos. Durante o inverno, as éguas normalmente entram em anestro. Do mesmo modo, a gata está em anestro no outono e inicia sua atividade cíclica com o aumento do período diário de luz. Pequenos ruminantes, por sua vez, são animais com reprodução em dias curtos exibindo atividade cíclica durante o outono e início do inverno, seguido por um período de anestro. A cadela é monocíclica e apresenta longos períodos com um único estro. Normalmente, um ou dois (algumas vezes três) períodos estrais são observados por ano, separados por longos períodos de anestro, sem que uma sazonalidade óbvia seja identificada. Manutenção hormonal da prenhez 63 A fonte de progesterona, o principal hormônio responsável pela manutenção da prenhez, varia entre as espécies. Na vaca, a principal fonte é o corpo lúteo durante a primeira metade da gestação e a placenta entre aproximadamente os dias 120-150 até o dia 250. Na égua, vários corpos lúteos acessórios são formados durante o segundo mês de gestação e, juntamente com o corpo lúteo original ou “primário”, produzem progesterona até o final do terceiro mês. A partir desta data, a placenta assume essa produção até o parto. Na ovelha, os corpos lúteos são a maior fonte durante o primeiro terço da gestação, mas são substituídos pela placenta após isso. Em porcas, cabras, cadelas e gatas, os corpos lúteos são a maior fonte de progesterona durante toda a gestação. A produção de progesterona pelo corpo lúteo na ausência da prenhez é mais pronunciada na gata e na cadela na qual, como explicado anteriormente, o útero não gestante não induz a luteólise mediada por prostaglandina. A maioria das cadelas experimentam pseudoprenhezes com (exibindo) ou sem (não exibindo) sinais clínicos durante os períodos de metaestro e diestro. Outro hormônio da hipófise, a prolactina, é provavelmente responsável por este fenômeno. Na gata, o corpo lúteo também persiste por um período prolongado na ausência da prenhez. No entanto, durante a estação de atividade cíclica, a gata retorna ao estro. Os mecanismos regulando a meia-vida do corpo lúteo na cadela e na gata não são conhecidos. Resumo Os órgãos genitais femininos consistem em ovários, ovidutos, útero (subdividido em cornos, corpo e cérvix), vagina e vestíbulo. Na puberdade, a fêmea entra no ciclo estral que consiste em proestro, estro, metaestro e diestro. A vaca e a porca são animais policíclicos não estacionais, a égua, a ovelha, a cabra e a gata são policíclicos estacionais e a cadela é monocíclica. Nas espécies policíclicas estacionais e monocíclicas, a ciclicidade é interrompida por longos períodos de anestro. No proestro, folículos antrais em desenvolvimento sintetizam estrógenos que estimulam a liberação do pico pré-ovulatório de LH (hormônio luteinizante) e em menor intensidade a liberação de FSH (hormônio folículo estimulante) durante o estro subsequente, o qual é caracterizado pela aceitação do macho. O pico de LH estimula a maturação do ovócito e do folículo, culminando com uma ou mais ovulações, dependendo da espécie. Durante o período subsequente, o metaestro, o(s) folículo(s) ovulado(s) desenvolve(m)-se em um ou mais corpos lúteos que sintetizam progesterona, o hormônio responsável pela preparação do útero para a prenhez. A produção de progesterona atinge o seu máximo durante o diestro. Se a prenhez é estabelecida, o corpo lúteo (ou corpos lúteos) permanece(m) funcional(ais), mas se a 64 concepção falhar, a liberação de prostaglandina-F2α pelo endométrio causará a regressão do corpo lúteo (ou dos corpos lúteos) e o retorno do animal ao proestro. Leitura adicional Allen W.R. Maternal recognition and maintenance of pregnancy in the mare. Anim. Reprod. 2005;2:209–223. Arthur’s Veterinary Reproduction and Obstetrics 2001, 8th edn. Noakes, D.E., Parkinson, T.J. and England, G.C.W. eds. W. B. Saunders. Concannon P., Tsutsui T., Shille V. Embryo development, hormonal requirements and maternal responses during canine pregnancy. J. Reprod. Fert. Suppl. 2001;57:169–179. Denker H.-W., Eng L.A., Hammer C.E. Studies on the early development and implantation in the cat. II. Implantation. Proteinases. Anat. Embryol. 1978;154:39–54. Denker H.-W., Eng L.A., Mootz U., Hammer C.E. Studies on the early development and implantation in the cat. I. Cleavage and blastocyst formation. Anatomischer Anzeiger. 1978;144:457–468. Engel E., Klein R., Baumgärtner W., HoffmannB. Investigations on the expression of cytokines in the canine corpus luteum in relation to dioestrus. Anim. Reprod. Sci. 2005;87:163–176. Evans H.E., Sack W.O. Prenatal development of domestic and laboratory mammals: Growth curves, external features and selected references. Anat. Histol. Embryol. 1973;2:11–45. Holst P.A., Phemister R.D. The prenatal development of the dog: Preimplantation events. Biol. Reprod. 1971;5:194–206. Patten B.M. Embryology of the pig, 3rd edn. Blakiston: New York, 1948. Rüsse, I. and Sinowatz, F. (1998): Lehrbuch der Embryologie der Haustiere. 2. Auflage. Parey Buchverlag. Senger P. Pathways to pregnancy and parturition, 2nd edn. Current Conceptions, Inc., 2003. 65 Capítulo 4 Gametogênese Poul Hyttel Durante o processo de fertilização o genoma materno e o paterno unem-se no interior do óvulo unicelular fecundado, o zigoto. Para conduzir os dois genomas ao sítio de união na tuba uterina, células especializadas conhecidas como gametas se desenvolveram. O gameta materno, o ovócito1, é a maior célula do organismo e possui uma competência própria para iniciar o desenvolvimento embrionário uma vez que tenha passado por um processo conhecido como ativação, descrito no Capítulo 5. Essa habilidade particular do ovócito é utilizada biotecnologicamente, especialmente na clonagem por transferência de núcleo. A clonagem envolve a remoção do genoma do ovócito e depois fazendo com que o citoplasma restante inicie o desenvolvimento embrionário controlado pelo genoma da célula doadora do núcleo que foi introduzido pela fusão com o ovócito enucleado (Cap. 21). O gameta paterno, o espermatozoide, por sua vez, desenvolveu a habilidade de deslocamento e penetração nos revestimentos do ovócito; são essas qualidades dinâmicas do espermatozoide que o tornam apto a transportar o genoma paterno do macho à fêmea. A seguir iremos focar em como esses gametas especializados desenvolvem-se e como seus genomas são preparados para a fertilização e, ainda, como a arquitetura particular dessas células é alcançada. A primeira fase desse processo envolve a colonização da gônada em desenvolvimento pelas células germinativas primordiais das quais se desenvolvem as células germinativas. O processo subsequente, pelo qual os gametas maternos e paternos são produzidos das células germinativas primordiais, é chamado de gametogênese. A gametogênese inclui a meiose, para possibilitar a recombinação do material genético e para a redução do número de cromossomos do complemento diploide para o haploide, e a citodiferenciação, para alcançar a estrutura celular característica do gameta feminino ou masculino. Células germinativas primordiais 66 As células germinativas primordiais são os predecessores dos gametas femininos e masculinos. Quando o embrião diferencia-se nos estratos (camadas) germinativos somáticos (ectoderma, mesoderma e endoderma) durante o processo de gastrulação (Cap. 7), a maior parte das células perde sua pluripotência (a habilidade de dar origem a todos os tipos celulares do organismo mamífero). No entanto, um grupo de células permanece pluripotente. Essas são as células germinativas primordiais as quais, ao menos em suínos, se tornam primeiro identificáveis na borda posterior do disco embrionário durante a gastrulação. Desse local, elas se movem para o mesoderma e endoderma recém-formados (Fig. 4-1). Poucos dias depois as células germinativas primordiais são encontradas no mesoderma visceral circundando o saco vitelino e o alantoide, externamente ao embrião propriamente dito. Presumivelmente, as células germinativas primordiais são trazidas para essa localização externa ao embrião em formação, para “resgatá-las” ou “protegê-las” dos sinais de diferenciação que estão dirigindo a gastrulação dentro do embrião propriamente dito. Quando os primeiros somitos estiverem formados, as células germinativas primordiais poderão ser encontradas no mesoderma do saco vitelino e do alantoide, mas também no mesoderma da ainda incipiente crista genital, onde elas estão prontas para colonizar a gônada em desenvolvimento (Figs. 4-2, 4-3, 4-4). Assim sendo, de forma ativa ou passiva, as células germinativas primordiais são conduzidas ao longo do aspecto caudal do saco vitelino e do alantoide, para o mesentério primitivo e depois para a gônada ainda indiferenciada, mas em desenvolvimento. Durante sua realocação, as células germinativas podem ser reconhecidas pelo seu tamanho relativamente grande e pelo uso de técnicas especiais de coloração como aquelas para detecção de atividade da fosfatase alcalina ou para o fator de transcrição OCT4, o qual está envolvido na manutenção da pluripotência celular (Figs. 4-3, 4-4). Fig. 4-1 Posicionamento das células germinativas primordiais no endoderma. A: Disco embrionário do embrião de suíno no dia 14 do desenvolvimento. Notar sulco primitivo (1). A 67 linha ‘B’ indica o plano do corte para a Figura 4-1B. B: Corte transversal do disco embrionário corado para o OCT4. Notar os núcleos individualmente corados para o OCT4 no endoderma (1) identificando as células germinativas primordiais (setas). 2: Mesoderma; 3: Ectoderma. Fig. 4-2 Migração das células germinativas primordiais (vermelho) do saco vitelino (1) ao longo do pedúnculo do saco vitelino (2) para o mesentério (4) do intestino primitivo (3) e para a crista genital (5) localizada medialmente ao mesonefro (6). 7: Alantoide; 8: Úraco (pedúnculo do alantoide). Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 68 Fig. 4-3 Embrião de suíno no dia 21 de desenvolvimento corado para OCT4. Notar as células germinativas primordiais (pequenos pontos escuros) no pedúnculo do saco vitelino (seta) onde estão retornando para o embrião propriamente dito. 69 Fig. 4-4 Corte sagital de um embrião de suíno no dia 26 do desenvolvimento (A). O corte está corado para OCT4. Os quadros ‘B’ e ‘C’ estão ampliados. B: Núcleos de duas células germinativas primordiais (setas) localizados na região da crista genital em desenvolvimento. C: Núcleos de três células germinativas primordiais (setas) na parede do alantoide (1). 2: Saco vitelino; 3: Intestino primitivo; 4: Cavidade amniótica; 5: Coração. Modificado de Vejlsted et al. (2006). Reimpresso com permissão de John Wiley & Sons, Inc. Durante e após a sua migração, as células germinativas primordiais proliferam por mitose. As células germinativas primordiais femininas (XX) e masculinas (XY) 70 tornam-se comprometidas com a diferenciação sexo-específica das gônadas e são circundadas por células somáticas (Cap. 15). As células são agora denominadas de ovogônias e espermatogônias, respectivamente. Essas células sofrem mais proliferação antes de iniciar a gametogênese e, consequentemente, a meiose. Os cromossomos, a mitose e a meiose As características de um novo indivíduo são determinadas por genes específicos identificados como sequências de nucleotídeos no ácido desoxirribonucleico (DNA). É importante ter em mente que não são as próprias sequências dos genes, mas a expressão equilibrada e controlada deles, controlada por regulação epigenética, que é crucial para o comportamento dessas células e, portanto, para o desenvolvimento do concepto. Juntamente com numerosas proteínas, o DNA constitui os cromossomos. Os cromossomos de um indivíduo herdados da mãe e do pai. Em humanos, nos quais os genes foram extensivamente mapeados pelo Projeto Genoma Humano (HUGO), é estimado que existam cerca de 25.000 genes nos 46 cromossomos. O número de genes funcionais em animais domésticos é provavelmente similar. Em células somáticas os cromossomos aparecem como pares homólogos para formar o complemento cromossômico diploide. O número cromossômico diploide é designado 2n visto que inclui uma cópia materna e uma paterna de cada cromossomo. Os números cromossômicos diploides em animais domésticos estão listados na Tabela 4-1. Um par de cromossomos refere-se aos cromossomos sexuais, enquanto os demais são chamados de autossômicos. Se o par de cromossomos sexuais for XX, o indivíduo é geneticamenteuma fêmea; se XY, geneticamente um macho. Um cromossomo de cada par é herdado da mãe por meio do ovócito e o outro do pai por meio do espermatozoide. Assim, para resultar em um complemento cromossômico diploide normal após a fertilização, os gametas devem conter apenas um cromossomo de cada par, chamado de complemento cromossômico haploide e designado como 1n. Os gametas então contêm apenas metade do número de cromossomos presente nas células somáticas. Tabela 4-1 Número de cromossomos em várias espécies animais. 71 As divisões das células somáticas ocorrem por mitose, que transfere uma cópia completa do complemento cromossômico para cada uma das células-filhas. Durante a gametogênese, entretanto, os mecanismos especiais da meiose são responsáveis por produzir o complemento cromossômico haploide nas células germinativas. Mitose A mitose é o processo pelo qual uma célula divide seu complemento cromossômico igualmente entre as células-filhas; a cariocinese descreve o processo completo, incluindo a mitose, pelo qual o núcleo de uma célula dá origem a um núcleo em cada uma das células-filhas. Normalmente, a cariocinese é acompanhada da citocinese, a divisão do citoplasma (incluindo organelas e inclusões) entre as células-filhas. Assim, a cariocinese e a citocinese combinadas resultam em duas células-filhas que em princípio são geneticamente idênticas às suas células progenitoras, cada uma recebendo um complemento cromossômico diploide completo (Fig. 4-5). A mitose é uma fase do ciclo celular somático, e a outra fase a intérfase. A intérfase é subdividida nas fases G1, na fase de síntese de DNA (S) e na fase G2. Durante a fase S, cada cromossomo replica o seu DNA para produzir duas cromátides. Como já mencionado, o complemento cromossômico diploide é designado como 2n. Antes da fase S, cada cromossomo consiste em um único filamento de DNA, então, cada gene está presente em duas cópias (2c), uma de origem materna e outra de origem paterna. Após a fase S, como cada cromossomo consiste agora em duas cromátides, 72 então cada gene estará presente em quatro cópias (4c), embora o número de cromossomos seja mantido em 2n. Durante as fases G1, S e G2 os cromossomos são extremamente longos, espalhados pelo núcleo em domínios específicos e não podem ser individualizados sob o microscópio de luz. Fig. 4-5 Fases da mitose: A: G2 da intérfase; B: Prófase; C: Prometáfase; D: Metáfase; E: Anáfase; F: Telófase; G: Células-filhas em G1 da intérfase. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). A mitose pode ser subdividida em prófase, metáfase, anáfase e telófase. Quando as células passam da fase G2 da intérfase para a prófase da mitose, os cromossomos 73 enovelam-se, contraem-se, condensam-se e espessam-se (Fig. 4-5 B). Eles se tornam visíveis sob o microscópio de luz e cada um pode ser visto sob a forma de duas cromátides unidas em uma região estreita conhecida como centrômero. Também durante a prófase, o par de centríolos duplica-se no citoplasma adjacente ao núcleo e os dois pares resultantes tornam-se dispostos em polos opostos do núcleo. À medida que a célula progride da prófase para a metáfase (um estágio frequentemente chamado de prometáfase), os microtúbulos começam a formar-se dos dois pares de centríolos e o envelope nuclear começa a desmantelar-se (Fig. 4-5 C). Alguns dos microtúbulos de cada par de centríolos fixam-se a estruturas nas cromátides, os cinetocoros, que são encontradas nos centrômeros de cada cromossomo. Isso estabelece o fuso mitótico com um par de centríolos em cada polo. Outros microtúbulos passam diretamente de um par de centríolos ao outro sem se fixar nos cromossomos. À medida que o fuso se forma, os cromossomos alinham-se no plano equatorial, definindo a metáfase da divisão celular (Fig. 4-5 D). Subsequentemente, o centrômero de cada cromossomo divide-se, as duas cromátides separam-se e, tracionadas pelos microtúbulos, começam a migrar em direção aos polos do fuso durante a anáfase (Fig. 4-5 E). Nessa fase, cada cromátide se transformou em um novo cromossomo. O arranjo dos cromossomos em dois grupos, um em cada polo do fuso, estabelece a telófase da divisão celular (Fig. 4-5 F). Continuando na telófase, os cromossomos desenovelam e alongam e o envelope nuclear se reorganiza em cada uma das células-filhas em formação. Esse evento completa a divisão do núcleo e de seu DNA (cariocinese) nos dois núcleos das células-filhas que contêm as mesmas sequências de DNA e o mesmo número de cromossomos do núcleo parental (2n, 2c). A cariocinese é seguida da citocinese para dividir o citoplasma igualmente entre as células-filhas. Meiose A meiose é um processo envolvendo duas divisões celulares especializadas (meiose I e II) que ocorrem nas células germinativas para gerar os gametas haploides maternos e paternos, o ovócito e o espermatozoide. Cada uma das duas divisões meióticas inclui as mesmas fases da mitose: prófase, metáfase, anáfase, telófase, exceto pela ausência de prófase na meiose II. Além de produzir gametas com o complemento cromossômico haploide, uma segunda e igualmente importante função da meiose é a de permitir a recombinação genética; o processo que garante que o genoma de próxima geração seja uma combinação única dos genomas parentais. O processo mais complexo ocorre na meiose I, que é caracterizada por uma prófase particularmente longa, a qual pode ser subdividida nos estágios de leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e a diacinese. Está além do escopo deste texto de abordar cada um desses 74 estágios, além de dizer que eles recebem seus nomes de acordo com a aparência morfológica dos cromossomos. Assim que as células germinativas iniciam a meiose I, a célula materna é chamada de ovócito primário enquanto que o equivalente paterno é um espermatócito primário. Na fêmea, a meiose se inicia durante a vida fetal e então é bloqueada no estágio de diplóteno da meiose I até a puberdade e é reiniciada apenas pouco antes da ovulação. Essa duração prolongada do estágio de diplóteno é também conhecida como estágio de dictióteno ou dictiato. No macho, por sua vez, a meiose inicia-se após a puberdade, quando então se torna um processo contínuo. Intercâmbio de segmentos cromossômicos e recombinação genética Assim como na mitose, as células germinativas maternas e paternas (ovogônias e espermatogônias) passam pela fase S antes de iniciar a meiose. Isso forma duas cromátides em cada cromossomo (2n, 4c) como na mitose. Esse é o estado da célula germinativa quando ela entra no estágio de leptóteno da prófase da meiose I (Fig. 4- 6). Em contraste com a mitose, entretanto, os cromossomos homólogos alinham-se em pares durante a prófase da meiose I. Cada par de cromossomos consiste, portanto, em quatro cromátides (4c) e é, por conseguinte, chamada de tétrade. Fig. 4-6 Fases da meiose no macho (A) e na fêmea (B). 75 Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Na tétrade, cada cromossomo materno combina-se com a sua contraparte paterna em toda a sua extensão por meio do complexo sinaptonêmico. As cromátides pareiam perfeitamente, ponto a ponto, na fêmea; assim elas fazem também no macho exceto para a combinação XY, onde o cromossomo Y menor não pareia com o cromossomo X. Esse pareamento cromossômico permite a troca de segmentos de cromátides por um processo de intercâmbio de segmentos cromossômicos (crossing-over). As cromátides se torcem, ou passam uma por sobre a outra, em certos pontos (a quiasmata), para formar uma estrutura com aspecto de X. Mais tarde durante a prófase, o complexo sinaptonêmico é gradualmente desmantelado, o DNA quebra-se na quiasmata e as extremidades livres das contrapartes unem-se, dessa forma, trocando segmentos de DNA entre as cromátides maternas e paternas. A troca de cromatina, associada à segregação ao acaso dos cromossomos maternos e paternos durante a meiose II (veja mais adiante), proporciona a base molecular para a recombinação genética que é característica da reprodução sexuada. Durante a diacinese, os cromossomos homólogos são gradualmente liberadosuns dos outros. Com a transição da diacinese para a metáfase da meiose I, o envelope nuclear desaparece e os fusos meióticos são formados. Na célula germinativa masculina, os polos do fuso meiótico são constituídos de pares de centríolos como na mitose. Entretanto, pelo menos nas grandes espécies domésticas e em contraste com aqueles de camundongos, os ovócitos não possuem centríolos e os polos do fuso são constituídos de um material desconhecido identificado ultraestruturalmente como pequenos agrupamentos de vesículas. Os microtúbulos do fuso se fixam em cada cromossomo homólogo em uma tétrade na meiose I em vez de se fixarem nas cromátides como ocorre na mitose. Durante a metáfase da meiose I, os cromossomos se alinham no plano equatorial, mas durante a anáfase, são os cromossomos homólogos e não suas cromátides que são separadas, para serem agrupadas nos polos do fuso durante a telófase. Assim, em contraste com a mitose, a meiose I separa cromossomos homólogos em vez de cromátides. Após completar a meiose I, a célula germinativa é haploide, contendo apenas um cromossomo (1n) de cada par. Deve ser ressaltado, no entanto, que o conteúdo de DNA da célula germinativa nesse estágio ainda é 2c porque cada cromossomo consiste em duas cromátides. Espermatócitos, espermátides, ovócitos e corpúsculos polares Ao final da telófase da meiose I, o espermatócito primário divide-se em dois espermatócitos secundários por citocinese (Fig. 4-6). No ovócito, porém, o fuso é 76 localizado na periferia da grande célula esférica e a telófase é associada a uma citocinese muito desigual resultando em duas células-filhas, uma muito maior que a outra. A célula-filha maior é agora chamada de ovócito secundário enquanto que a célula-filha menor, que é quase desprovida de organelas, é o primeiro corpúsculo polar. Imediatamente após completar a meiose I, os ovócitos secundários e os espermatócitos secundários iniciam a meiose II sem uma intérfase. Consequentemente, não há a fase S, nem replicação do DNA e os cromossomos mantêm-se com a mesma quantidade de DNA (2c). Os cromossomos também se mantêm condensados, prontos para passar diretamente pela metáfase, anáfase e telófase da meiose II sem necessitar passar pela prófase. Na telófase da meiose II, as duas cromátides de cada cromossomo são separadas e então cada gameta recebe apenas um único cromossomo de cada par homólogo (1n) contendo um único filamento de DNA (1c). O espermatócito secundário divide-se em duas espermátides. O ovócito, por sua vez, novamente se divide de forma desigual resultando em uma célula-filha grande, a precursora do zigoto e do embrião, e um pequeno segundo corpúsculo polar. Além disso, no ovócito, a meiose II é novamente bloqueada em metáfase, o estágio (M II) em que o ovócito é ovulado. Exceções a essa regra são encontradas no cão e na raposa em que o ovócito é ovulado na prófase da meiose I. Em grandes espécies domésticas, ao menos, o primeiro e segundo corpúsculos polares degeneram sem se dividir. Citodiferenciação dos gametas Enquanto a meiose provê os gametas com o número haploide de cromossomos e possibilita a recombinação genética, há uma necessidade paralela de se construir uma arquitetura celular especializada que caracteriza os dois gametas. Essa citodiferenciação forma ovócitos de ovogônias por meio da ovogênese e espermatozoides de espermatogônias pela espermatogênese. Ovogênese Desenvolvimento dos folículos primordiais Após a chegada e proliferação na gônada feminina em desenvolvimento, as células germinativas primordiais são circundadas por células foliculares – células somáticas achatadas derivadas do epitélio superficial do ovário em desenvolvimento (Fig. 4-7). Isso transforma as células germinativas primordiais em ovogônias que continuam a proliferar, mas sem completar a citocinese, mantendo-as ligadas umas às outras por 77 estreitas pontes citoplasmáticas. Os aglomerados de ovogônias resultantes, derivados de células germinativas primordiais individuais, podem ser identificados no embrião em estágios de desenvolvimento que variam entre as espécies (Tabela 4-2). Fig. 4-7 Desenvolvimento do folículo primordial. A: Célula germinativa primordial (1) circundada por células pré-foliculares (2). B: aglomerados de ovogônias (3) e ovócitos (4) associados a células pré-foliculares. C: Multiplicação das células pré-foliculares (5). D: Desenvolvimento das células pré-foliculares em células foliculares (6) circundadas pela lâmina basal (7) e associadas a ovócitos individuais. E: O folículo primordial final isolado. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Tabela 4-2 Cronologia de eventos durante a diferenciação da gônada em várias espécies. 78 A maioria das ovogônias continua sua proliferação mitótica, mas algumas se diferenciam em ovócitos primários bem maiores. Esses ovócitos imediatamente entram na fase S do ciclo celular e depois na prófase da meiose I. As ovogônias proliferam rapidamente e em algumas espécies (notadamente em bovinos e humanos) são contadas em milhões (Tabela 4-3). Entretanto, essa proliferação é seguida de apoptose que leva à perda da maior parte das ovogônias e dos ovócitos primários, com a sobrevivência de apenas uma pequena população próxima à superfície do ovário em desenvolvimento. Todos os ovócitos primários sobreviventes iniciaram a prófase da meiose I quando se tornam bloqueados no estágio de diplóteno, ainda com o núcleo intacto. Revestidos por células foliculares achatadas, esses ovócitos formam os folículos primordiais (Figs. 4-8, 4-9, 4-10). As células foliculares apoiam-se em uma membrana basal que as separa das células do estroma ao seu redor. Os folículos primordiais constituem uma reserva de folículos quiescentes da qual a fêmea irá recrutar folículos para o crescimento e ovulação para o resto de sua vida reprodutiva. Os números de células germinativas primordiais, ovogônias e ovócitos em várias espécies animais e em humanos estão listados na Tabela 4-3. Tabela 4-3 Número de ovogônias e ovócitos em várias idades de diferentes espécies. Espécies Número de ovogônias e/ou ovócitos 79 Bovinos Dia 50: 16.000 Dia 110: 2.700.000 Ovinos Ao nascimento: 54.000-1.000.000 Caprinos 6 meses após o nascimento: 24.000 3 anos após o nascimento: 12.000 Suínos Dia 110: 491.000 10 dias após o nascimento: 60.000-509.000 9 meses após nascimento: 50.000 2-10 anos após o nascimento: 16.000 Canino Ao nascimento: 700.000 5 anos após o nascimento: 35.000 10 anos após o nascimento: 500 Humano Dia 60: 600.000 Dia 150: 6.800.000 Ao nascimento: 400.000-500.000 7 anos após o nascimento: 13.000 (Rüsse e Sinowatz, 2000) 80 Fig. 4-8 Desenvolvimento folicular no ovário bovino do folículo primordial (1) passando pelos folículos primário (2) e secundário (3) até o folículo terciário (4). No oviduto, o ovócito maduro em metáfase II (5), o zigoto fecundado (6) apresentando dois pronúcleos, o estágio de 2 (7), 4 (8) e 8 células (9), e na extremidade do corno uterino, a mórula (10) e o blastocisto (11) são mostrados. 81 Fig. 4-9 Desenvolvimento folicular em bovinos. A: Folículo primordial. O ovócito (1) é circundado por células foliculares achatadas (2) apoiadas sobre a membrana basal (3). 4: Célula do estroma; 5: Arteríola. B: Folículo primário. O ovócito (1) é circundado por células da granulosa cuboides (2). C: Folículo secundário inicial no qual a polarização do compartimento das células da granulosa tornou-se evidente (setas). O inserto mostra um detalhe da interface ovócito-células da granulosa com microvilos do ovócito (1) e projeções das células da granulosa (2). 3: Mitocôndria do ovócito. D: Folículo secundário. O ovócito (1) é circundado por um compartimento de múltiplas camadas de células da granulosa cuboides (2), e as células do estroma iniciaram a formação das camadas da teca (3). O inserto mostra um detalhe da interface ovócito-células da granulosa com as projeções das células da granulosa (4) 82 penetrando na zona pelúcida em desenvolvimento (5). As projeções das células dagranulosa formam contato com o ovócito por meio de junções do tipo gap (6). 7: Complexo de Golgi do ovócito. E: Folículo terciário pequeno apresentando o antro (1) e o ovócito localizado no cumulus oophorus (2). F: Folículo terciário grande apresentando o ovócito no cumulus oophorus (1) e a camada de células da granulosa (2) circundando o antro. As tecas interna (3) e externa (4) diferenciaram-se e separam-se das células da granulosa pela membrana basal (6). Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Fig. 4-10 Desenvolvimento folicular em bovinos. A: Folículo primordial apresentando células foliculares achatadas (1) e o ovócito (2) com seu núcleo (seta). B: Folículo primário apresentando células da granulosa cuboides (3). 2: Ovócito; Seta: Núcleo do ovócito. C: Folículo secundário apresentando múltiplas camadas de células da granulosa (3). 2: Ovócito; Seta: Núcleo do ovócito. D: Folículo terciário apresentando a camada de células da granulosa (3) e as células do cumulus (5) circundando o ovócito (2). As camadas da teca (7) começaram a se formar. 2: Ovócito; 4: Antro; 6: Zona pelúcida. Crescimento folicular e ovocitário 83 O crescimento folicular ocorre quando os folículos são recrutados da reserva primordial e desenvolvem-se em folículos primários, secundários e terciários. Deve ser enfatizado que a grande maioria dos folículos que entram na fase de crescimento falha em completá-la; a maioria degenera-se por meio de um processo chamado de atresia com apenas uma minoria completando seu crescimento e chegando a atingir a ovulação. Ao menos nas grandes espécies domésticas, o crescimento folicular é iniciado durante a vida fetal (Tabela 4-2). No entanto, nenhum dos ovócitos inclusos nos folículos (exceto, talvez, por alguns folículos atrésicos) reinicia a meiose até que a puberdade seja atingida. Com a ativação do folículo primordial, as células foliculares começam a proliferar e formam uma monocamada de células cuboides ao redor do ovócito para formar o folículo primário (Figs. 4-8, 4-9, 4-10). As células foliculares são agora chamadas de células da granulosa. Com essa ativação, a fase de crescimento ovocitário é iniciada, na qual o ovócito das espécies domésticas cresce de menos de 30 μm para mais de 120 μm de diâmetro. Durante esse crescimento, o ovócito sofre muitas modificações morfológicas incluindo o desenvolvimento dos grânulos corticais (veja adiante) no citoplasma. Além disso, torna-se competente para reiniciar e meiose e sustentar o desenvolvimento embrionário após a fertilização. As células da granulosa proliferam para formar várias camadas em torno do ovócito, estrutura que passa a ser conhecida como folículo secundário (Figs. 4-8, 4- 9, 4-10). O ovócito e as células da granulosa circundantes sintetizam certas glicoproteínas que são depositadas entre o ovócito e as células formando a zona pelúcida. Essa estrutura é atravessada por numerosas projeções das células da granulosa mais internas, as quais por meio disso mantêm contato com o ovócito pelas junções comunicantes (nexus ou junções do tipo gap). As células do estroma circundando as células da granulosa diferenciam-se mais internamente na teca interna, uma camada de células produtoras de esteroides, e mais externamente na teca externa, formada de camadas concêntricas de células que têm funções de suporte. As células esteroidogênicas da teca interna e as células da granulosa são, em conjunto, responsáveis pela síntese de estradiol no folículo por meio de um sistema “duas células”; as células da teca interna produzem andrógenos que são transportados para as células da granulosa onde são aromatizados em estrógenos. À medida que o desenvolvimento continua, espaços preenchidos por líquido aparecem entre as células da granulosa, os quais se unem em uma única cavidade, o antro, caracterizando o folículo terciário (Figs. 4-8, 4-9, 4-10). Tais folículos são também chamados de folículos antrais. Em paralelo com a expansão do antro, o ovócito se torna localizado em uma protrusão das células da granulosa, o cumulus oophorus, que se entende em direção ao antro. As células da granulosa do cumulus 84 oophorus são chamadas de células do cumulus. À medida que o folículo desenvolve- se, o ovócito também se desenvolve até que atinja sua estrutura característica. O processo de ovulação é desencadeado pela onda pré-ovulatória de LH, mas algumas evidências sugerem que mesmo antes desse estímulo, o ovócito passa por modificações no folículo antral em desenvolvimento que aumentam sua competência para ser fecundado e para sustentar o desenvolvimento embrionário inicial. Esse processo pode ser chamado de capacitação ovocitária. Maturação folicular e ovócitária O folículo terciário continua seu desenvolvimento e, se selecionado para ovulação, entra na fase final da maturação folicular e ovocitária, estimulada pela onda pré- ovulatória da LH. O período do início do pico de LH até a ovulação é espécie- específico e varia de menos de 12 horas a mais de 40 horas. Durante a maturação pré-ovulatória do folículo, a síntese de esteroides para a produção de estradiol muda para a produção de progesterona e a parede do folículo prepara-se para romper para liberar o ovócito. A maturação pré-ovulatória do ovócito tem componentes nucleares bem como citoplasmáticos (Figs. 4-11, 4-12). A maturação nuclear do ovócito refere-se ao processo da meiose, a qual é reiniciada do estágio de diplóteno da meiose I e continua até a fase de metáfase da meiose II, quando (exceto no cão e na raposa) o ovócito é ovulado. O núcleo do ovócito primário é frequentemente chamado de vesícula germinativa, e o reinício da meiose é evidenciado morfologicamente pelo desmantelamento dessa estrutura (Fig. 4-11). A maturação citoplasmática do ovócito envolve a reestruturação e modulação de muitas organelas do ovócito. Ela é particularmente evidente em bovinos, em que os grânulos corticais (que antes do pico de LH são encontrados em grandes aglomerados) migram para posições solitárias adjacentes à membrana plasmática em preparação para a exocitose durante a fertilização (Fig. 4-11). 85 Fig. 4-11 Maturação final do ovócito após o pico de LH em bovinos. Antes do pico de LH, o ovócito está em estágio de diplóteno e é caracterizado por um núcleo localizado perifericamente (vermelho) e pela localização periférica das organelas. Em nível ultraestrutural, o ovócito apresenta um retículo endoplasmático liso (REL; verde) bem desenvolvido, associado a gotículas de lipídios (esferas pretas grandes) e mitocôndrias (azul), complexos de Golgi (vermelho) e aglomerados de grânulos corticais (esferas pretas pequenas). O ovócito comunica-se através de junções do tipo gap com as projeções das células do cumulus (setas). Cerca de 10 h após o pico de LH, o ovócito reinicia a meiose e o envelope nuclear dissolve-se no REL fazendo com que o núcleo, isto é, a vesícula germinativa, se desarranje e os microtúbulos (linhas pretas) apareçam adjacentes aos cromossomos em condensação (preto no núcleo vermelho). O espaço perivitelino entre o ovócito e a zona pelúcida desenvolve-se e no ovócito as mitocôndrias tendem a se posicionar em torno das gotículas de lipídios e os complexos de Golgi diminuíram em tamanho. As junções do tipo gap entre o ovócito e as células do cumulus são parcialmente perdidas. Aproximadamente 15 h após o pico de LH, o ovócito atinge a fase de metáfase da primeira divisão meiótica (metáfase I). O número e o tamanho das gotículas de lipídios aumentam, as mitocôndrias organizam-se em torno das gotículas e esses conglomerados atingem uma distribuição mais uniforme no citoplasma. 86 Numerosos ribossomos (pontos pretos) aparecem, especialmente em torno dos cromossomos, e o tamanho dos complexos de Golgi diminuem ainda mais. As junções do tipo gap entre o ovócito e as projeções das células do cumulus desintegram-se. Aproximadamente 24 h após o pico de LH, o ovócito atinge a metáfase da segunda divisão meiótica (metáfase II) e ocorre a extrusão do primeiro corpúsculo polar. A maior parte dos grânulosFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” (UNESP), Jaboticabal Doutor em Medicina Veterinária pela FCAV-UNESP, Jaboticabal Pós-doutor pela FZEA-USP REVISÃO CIENTÍFICA Aline Adriana Bolzan (Cap. 11) Professora Doutora do Departamento de Cirurgia da FMVZ-USP Residência em Clínica Cirúrgica de Pequenos Animais pela FCAV-UNESP, SP Medica Veterinária pela FCAV-UNESP, Jaboticabal Mestre e Doutora em Cirurgia Veterinária (Oftalmologia) pela FCAV/UNESP, Jaboticabal Antônio Chaves de Assis Neto (Caps. 1, 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21 e Índice - parte) Felipe Perecin (Caps. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 18 e Índice - parte) Flávio V. Meirelles (Cap. 2) Professor Associado Professor Livre-docente pela FZEA-USP, Pirassununga Médico Veterinário pela UNESP, Jaboticabal Mestre pela Universidade de Montreal Doutor pela FMRP-USP, Ribeirão Preto Ricardo De Francisco Strefezzi (Cap. 19) Professor-doutor do curso de Medicina Veterinária da FZEA-USP Médico Veterinário Mestre e Doutor em Patologia Experimental e Comparada pela USP TRADUÇÃO Antônio Chaves de Assis Neto (Caps. 1, 9, 14 e Índice - parte) 11 Cláudia Barbosa Fernandes (Cap. 6) Professora Doutora do Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP Medica Veterinária pela Universidade Estadual de Londrina (UEL) Mestre e Doutora em Reprodução Animal pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP, Botucatu Cláudia Lima Verde Leal (Cap. 4) Professora Livre-Docente do Departamento de Ciências Básicas da FZEA-USP, Pirassununga Médica Veterinária pela FCAV-UNESP, Jaboticabal Mestre em Zootecnia (Melhoramento Genético Animal) pela FCAV-UNESP, Jaboticabal Doutora em Medicina Veterinária (Reprodução Animal) pela FMVZ-USP Daniele dos Santos Martins (Cap. 15) Professora-doutora do Departamento de Zootecnia da FZEA-USP Médica Veterinária pelo Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos (UNIFEOB) Mestre em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres pela FMVZ-USP Doutora e Pós-doutora em Ciências pela FMVZ-USP Érika Branco (Cap. 17) Professora Doutora da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), Belém Pesquisadora do Laboratório de Pesquisa Morfológica Animal da UFRA Médica Veterinária pelo UNIFEOB Doutora em Ciências pela FMVZ-USP Fabrizio Grandi (Cap. 19) Graduado em Medicina Veterinária pela FMVZ-USP Residência em Anatomia Patológica Veterinária pela FMVZ-UNESP, Botucatu Mestre e doutorando pelo Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB-UNESP) Revisor científico dos periódicos Veterinary Clinical Pathology, Comparative Clinical Pathology e Veterinary World. Felipe Perecin (Cap. 2 e Índice - parte) Fernando Yutaka Moniwa Hosomi, M.V., MSc. (Cap. 8) Prefeitura Municipal de São Paulo - PMSP Secretaria Municipal de Saúde - SMS Coordenação de Vigilância em Saúde - COVISA Centro de Referência Nacional de Controle de Zoonoses Urbanas - CCZ Subgerência de Vigilância e Controle de Animais Domésticos – SVCAD Flávia Thomaz Verechia Pereira (Cap. 16) Professora adjunta da UNESP, Dracena Docente de Anatomia, Histologia e Embriologia Animal Médica Veterinária 12 George Shigueki Yasui (Cap. 7) Zootecnista pela Universidade Federal de Viçosa (UFV) Mestre em Produção Animal pela UENF Mestre e Doutor em Fisheries Sciences pela Hokkaido University Juliana Lopes Almeida (Cap. 21) Médica Veterinária pela Universidade Federal de Pelotas Mestre em Ciências Agrárias (Reprodução Animal) pela Universidade de Brasília PhD em Patologia Comparativa pela Universidade da Califórnia, Davis – Estados Unidos Luciano Andrade Silva (Caps. 3 e 18) Professor Doutor do curso de Medicina Veterinária no Departamento de Zootecnia da FZEA-USP Médico Veterinário pela UFV PhD in Animal Molecular and Cellular Biology pela Universidade da Flórida, Gainesville – Estados Unidos Mestre em Medicina Veterinária (Reprodução Animal) pela UFV Luiz Felipe de Moraes Barros (Cap. 11) Médico Veterinário pela FMVZ-USP Mestre e Doutor em Ciências (Clínica Cirúrgica Veterinária) pela FMVZ-USP Lilian de Jesus Oliveira (Caps. 12 e 13) Médica Veterinária pela FMVZ-USP Mestre em Ciências (Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres) pela FMVZ- USP Doutora em Animal Molecular and Cellular Biology pela University of Florida, EUA Pós-doutoranda do Departamento de Ciências Básicas da FZEA-USP Nicolle Gilda Teixeira de Queiroz Hazarbassanov (Cap. 10) Especialista em laboratório do Laboratório de Farmacologia Aplicada e Toxicologia da FMVZ-USP Médica Veterinária formada pela FMVZ-USP Doutora em Ciências (Oncologia) pela Fundação Antonio Prudente - Hospital A. C. Camargo Ricardo José Garcia Pereira (Cap. 20) Professor-doutor de Reprodução de Aves do Departamento de Reprodução Animal da FMVZ-USP Simone Cristina Méo Niciura (Cap. 5) Pesquisadora da Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos Médica Veterinária pela FCAV-UNESP, Jaboticabal Mestre e Doutora em Medicina Veterinária (Reprodução Animal) pela FCAV- UNESP, Jaboticabal 13 14 Colaboradores Diversos pesquisadores altamente qualificados demonstraram entusiasmo e prontidão em contribuir com este livro. Keith J. Betteridge, BVSc MVSc PhD FRCVS University Professor Emeritus Department of Biomedical Sciences Ontario Veterinary College University of Guelph, Ontario Canada Gry Boe-Hansen, DVM Phd Lecturer School of Veterinary Science University of Queensland, Australia Henrik Callesen, DVM PhD DVSc Research Professor Department of Genetics and Biotechnology Faculty of Agricultural Sciences, Aarhus University, Denmark Ernst-Martin Füchtbauer, PhD Dr.habil Associate Professor Department of Molecular Biology Aarhus University Denmark Vanessa Hall, PhD Post Doc Department of Basic Animal and Veterinary Sciences Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen Denmark 15 Poul Hyttel, DVM Phd DVSc Professor Department of Basic Animal and Veterinary Sciences Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen Denmark Palle Serup, Phd Director of Research Department of Developmental Biology Hagedorn Research Institute Denmark Fred Sinowatz, Dr.med vet. Dr.med Dr.habil Professor Institute of Veterinary Anatomy, Histology and Embryology LMU Munich, Germany Gábor Vajta, MD PhD DVSc Scientific Director Cairns Fertility Centre Australia Adjunct Professor, University of Copenhagen, Denmark Adjunct Professor, James Cook University, Australia Morten Vejlsted, DVM Phd Assistant Professor Department of Large Animal Sciences Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Denmark 16 Introdução Ao longo dos últimos 20 anos, os esforços da pesquisa científica moderna rapidamente aumentaram nossos conhecimentos acerca dos processos normais e anormais de desenvolvimento dos animais domésticos. À medida que o nosso profundo conhecimento sobre os mecanismos celulares e moleculares aumenta, também aumenta o reconhecimento do potencial de uso e da aplicação bem-sucedida desse conhecimento para incrementar a produção animal de alimentos e fibras. É durante o desenvolvimento embrionário e fetal, da formação dos gametas até o parto, que os poderosos avanços na manipulação genética molecular e nas tecnologias de reprodução assistida são empregados, levando a grandes impactos na produção animal ao redor do mundo. Como resultado desses avanços, continua a existir uma necessidade não atendida de um texto contemporâneo sobre o desenvolvimento dos animais domésticos para ser utilizado como base para a educação e treinamento dos veterinários, zootecnistas e biólogos do desenvolvimento. Embriologia veterinária preenche essa necessidade fornecendo aos estudantes, aos professores e aos veterinários uma apresentação aprofundada dos processos cronológicos elaborados que culminam com a formação de estruturas embrionárias funcionais, do desenvolvimento dos gametas até o período periparto. À medida que o nosso entendimento dos processos precisos e orquestrados do desenvolvimento animal avançam, e oscorticais está distribuída ao longo da membrana plasmática. As gotículas de lipídios e as mitocôndrias atingem uma posição mais central no citoplasma deixando uma zona periférica um tanto desprovida de organelas, na qual as características mais proeminentes são os grandes aglomerados de REL. Os complexos de Golgi estão praticamente ausentes. A ovulação ocorre aproximadamente 24 horas após o pico de LH. Fig. 4-12 Cortes histológicos de ovócitos bovinos. A: Ovócito bovino em estágio de diplóteno. Seta: Núcleo. 1: Zona pelúcida; 2: Células do cumulus. B: Ovócito bovino em metáfase da segunda divisão meiótica (metáfase II). Seta: placa da metáfase II com primeiro corpúsculo polar adjacente a ela; 1: Zona pelúcida; 2: Células do cumulus. Espermatogênese Desenvolvimento das espermatogônias e dos túbulos seminíferos Após chegar e proliferar na gônada masculina em desenvolvimento, as células 87 germinativas primordiais localizam-se em cordões sólidos de células de sustentação primitivas, as progenitoras das células de Sertoli, que se desenvolvem do epitélio superficial da gônada. Pouco antes da puberdade, os cordões celulares adquirem uma luz e desenvolvem-se nos túbulos seminíferos dos testículos. Em paralelo, as células de sustentação gradualmente assumem as características das células de Sertoli e as células germinativas primordiais desenvolvem-se em espermatogônias (Figs. 4-13, 4- 14). Fig. 4-13 Célula de Sertoli e células espermatogênicas nos túbulos seminíferos do testículo. 1: Células de Sertoli; 2: Espermátide – fase de maturação; 3: Espermátide: fase de capuchão; 4: Espermátide – fase de acrossomo; 5: Espermátide – fase de Golgi; 6: Espermatócitos primários conectados por pontes citoplasmáticas; 7: Barreira hematotesticular; 8: Espermatogônia; 9: Lâmina basal; 10: Núcleo da célula de Sertoli. 88 Modificado de Liebich (2004). Fig. 4-14 Cortes histológicos de testículo de cachaço (A) e de carneiro (B). A: Túbulos seminíferos (1) do testículo de cachaço com as células de Leydig (2) entre eles. B: Túbulo seminífero de carneiro com células de Sertoli (3), espermatogônias (4), espermatócitos (5) e espermátides (6). A espermatogênese inclui todos os eventos pelos quais as espermatogônias transformam-se em espermatozoides. Esse processo pode ser subdividido em espermatocitogênese (o desenvolvimento dos espermatócitos das espermatogônias), meiose (as duas divisões meióticas dos espermatócitos) e espermiogênese (a reestruturação celular das espermátides em espermatozoides sem nenhuma divisão celular). A meiose já foi descrita, então a ênfase será dada à espermatocitogênese e espermiogênese. Há uma relação celular próxima entre as células espermatogênicas e as células de Sertoli durante a espermatogênese; as células de Sertoli são necessárias para o suporte físico e para a regulação parácrina da espermatogênese, e também formam a barreira hematotesticular, ao vedar os túbulos seminíferos com junções oclusivas. Espermatocitogênese As espermatogônias estão localizadas perifericamente nos túbulos seminíferos, adjacentes à lâmina basal e ao exterior (i. e., próximas da circulação sanguínea) da 89 barreira hematotesticular. Três tipos podem ser identificados: espermatogônias do tipo A, intermediárias e do tipo B. As espermatogônias do tipo A1 são as células- tronco para a espermatogênese. Assim, as primeiras mitoses de uma espermatogônia do tipo A1 resultarão em novas células-tronco do tipo A1 e em espermatogônias de segunda geração do tipo A2, com capacidade de progredir ao longo da espermatogênese (Fig. 4-15). Isso garante uma população perpétua de células-tronco para a espermatogênese. A espermatogônia do tipo A2 irá, ao menos em ruminantes, dar origem a uma nova geração subsequente de espermatogônias do tipo A3, as quais finalmente se dividem em espermatogônias intermediárias que compartilham características morfológicas com as espermatogônias do tipo A e do tipo B. As espermatogônias intermediárias darão origem às espermatogônias do tipo B, das quais há duas gerações, ao menos em ruminantes. Fig. 4-15 A espermatogênese no touro. A espermatogônia-tronco do tipo A1 no círculo divide-se em uma espermatogônia do tipo A2, a qual inicia a diferenciação em espermatozoide, 90 e uma espermatogônia do tipo A1, a qual garante o suprimento contínuo de células-tronco espermatogênicas nos túbulos seminíferos. Meiose A última divisão mitótica da espermatogônia do tipo B resulta na formação dos espermatócitos primários. Essas células iniciam a meiose I, com sua longa prófase característica. Ao contrário do ovócito, o espermatócito não bloqueia sua meiose no estágio de diplóteno da prófase. Os espermatócitos deslocam-se pela barreira hematotesticular para o compartimento luminal dos túbulos seminíferos. Isso ocorre por meio de um mecanismo similar a um zíper envolvendo junções oclusivas; as junções são formadas atrás (em posição basal) dos espermatócitos antes que as junções formadas à frente deles (no seu lado luminal) sejam dissolvidas, para possibilitar a passagem das células. A conclusão da meiose I resulta na formação de dois espermatócitos secundários, os quais se dividem cada um em duas espermátides pela meiose II. Através dessa série de divisões, da espermatogônia de segunda geração do tipo A até as espermátides, a citocinese é incompleta, deixando as células de uma geração ainda conectadas por finas pontes citoplasmáticas. Espermiogênese As espermátides são transformadas em espermatozoides pela espermiogênese, a qual engloba quatro fases: de Golgi, de capuchão, de acrossomo e de maturação. Durante a fase de Golgi, o complexo de Golgi produz grânulos acrossômicos os quais se fundem para produzir um único grande grânulo acrossômico que se localiza adjacente ao núcleo (Fig. 4-16). O par de centríolos da espermátide realoca-se no polo oposto do núcleo onde o centríolo proximal torna-se associado ao núcleo. Ao mesmo tempo, um anoxena, consistindo em dois microtúbulos centrais circundados por nove pares de microtúbulos, desenvolve-se do centríolo distal. 91 Fig. 4-16 O desenvolvimento das espermátides por meio das fases de Golgi, de capuchão, de acrossomo e de maturação. Modificado de Liebich (2004). Durante da fase de capuchão, o grânulo acrossômico achata-se e cobre uma porção maior do núcleo da espermátide. Durante a fase de acrossomo a cromatina no núcleo se condensa à medida que as histonas são substituídas por protaminas. O grânulo acrossômico é reestruturado em um acrossomo, o qual contém enzimas importantes para a penetração do espermatozoide nos revestimentos do ovócito durante a fertilização. Finalmente, o acrossomo recobre cerca de dois terços do núcleo condensado da espermátide, o citoplasma é alocado para o desenvolvimento da cauda e as mitocôndrias são arranjadas em torno do axonema em crescimento. À medida que essas modificações ocorrem, a espermátide gira de forma que o acrossomo fique voltado para a lâmina basal do túbulo seminífero e a cauda em desenvolvimento fique voltada para a luz. Durante a fase de maturação, a arquitetura espécie-específica da cabeça e da cauda do espermatozoide desenvolve-se. A maior parte do citoplasma, incluindo a maioria das organelas, é separada formando o corpo residual (o qual é fagocitado pelas células de Sertoli), e as espermátides são desconectadas umas das outras. Finalmente, o espermatozoide é liberado das células de Sertoli para a luz dos túbulos 92 seminíferos. Espermatozoides O comprimento do espermatozoide no momento em que é liberado varia de acordo com a espécie, mas varia de aproximadamente 60 μm no cachaço a 75 μm no touro. No microscópio de luz, o espermatozoide parece consistir em duas estruturas: a cabeça e a cauda. No entanto, no microscópio eletrônico, a cauda pode ser subdividida em colo, peça intermediária, peça principal e peça terminal (Fig. 4-17). Fig. 4-17 Estrutura do espermatozoide de touro. A cabeça (I) é conectada à peça 93 intermediária (III) pelo colo (II). A peça intermediária está em continuidadecom a peça principal (IV) e a peça terminal (V). A cabeça apresenta o núcleo (1) com cromatina altamente compactada e a porção anterior do núcleo é recoberta pelo acrossomo (2) com membranas acrossômicas interna e externa localizadas internamente à membrana plasmática (3). Uma placa basal (4) conecta a cabeça ao colo, a qual contém um centríolo proximal (5) e um centríolo distal que se estende para o axonema localizado centralmente na peça intermediária e na peça principal da cauda, consistindo de dois pares de microtúbulos centrais (6) e nove periféricos (7). A peça intermediária apresenta nove fibras densas (8) circundadas por uma hélice de mitocôndrias (9). Na peça terminal, o axonema é gradualmente perdido. 10: Segmento equatorial da cabeça; 11: Bainha fibrosa. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). A cabeça do espermatozoide contém o núcleo, que determina o formato da cabeça. A porção anterior do núcleo é recoberta pelo acrossomo, delineado por uma membrana acrossômica interna e uma externa. O acrossomo contém enzimas hidrolíticas que são liberadas durante a fertilização como resultado da reação acrossomal (Cap. 5). A região posterior do acrossomo é estreita e essa região da cabeça do espermatozoide é chamada de região equatorial, a qual se continua posteriormente na região pós-acrossomo. O núcleo do espermatozoide possui uma cobertura de citoesqueleto conhecida como teca perinuclear, a qual contém fatores ativadores do ovócito. O colo é curto e conectado à cabeça por uma placa basal. Ele contém um centríolo proximal e um centríolo distal que se continua no axonema da cauda. Os centríolos são circundados por nove fibras densas periféricas, as quais se continuam nas fibras densas da cauda. A peça intermediária da cauda tem a estrutura característica de um flagelo, contendo um axonema central consistindo em dois microtúbulos centrais e nove pares periféricos. O axonema é circundado por nove fibras densas, as quais, por sua vez, são circundadas por uma hélice de mitocôndrias alongadas. Em ruminantes, a hélice mitocondrial inclui cerca de 40 voltas. Um espessamento em forma de anel da membrana plasmática da peça intermediária, o annulus, marca o limite entre a peça intermediária e a peça principal da cauda. A peça principal da cauda é a porção mais longa. Contém o axonema circundado de nove fibras densas. A hélice mitocondrial não está mais presente e as fibras densas são, ao contrário, circundadas por nervuras semicirculares de proteínas estruturais que se fundiram com duas das fibras densas para formar a bainha fibrosa. A transição entre a peça principal e a peça terminal da cauda é marcada pelo final da bainha fibrosa. Proximalmente, a peça final ainda contém o axonema, mas 94 distalmente os pares de microtúbulos são reduzidos a microtúbulos únicos, os quais terminam em vários níveis. Os espermatozoides são transportados por contrações peristálticas dos túbulos seminíferos e ductos subsequentes, e no ducto do epidídimo adquirem motilidade e capacidades fecundantes. Resumo Células germinativas primordiais migram da parede do saco vitelino para a gônada indiferenciada em desenvolvimento onde proliferam por mitose. As células germinativas primordiais associam-se às células somáticas e desenvolvem-se em ovogônias e espermatogônias. Subsequentemente iniciam a gametogênese que inclui a meiose e a citodiferenciação dos gametas. A meiose proporciona aos gametas o número haploide de cromossomos (metade do diploide) e a recombinação, enquanto a citodiferenciação resulta na estruturação celular das formas características dos dois gametas, o ovócito e o espermatozoide. Na fêmea, as ovogônias formam os ovócitos primários que iniciam a meiose I, mas bloqueiam no estágio de diplóteno da prófase. Um ovócito primário circundado por suas células somáticas (células foliculares) constitui o folículo primordial, e esse tipo folicular constitui-se na reserva quiescente de folículos, da qual os folículos são recrutados para o crescimento passando pelos estágios de folículo primário, secundário e terciário. O ovócito primário não reinicia a meiose e progride em sua maturação nuclear até a metáfase da meiose II, somente após a puberdade, pouco antes da ovulação. Em paralelo, o ovócito completa a sua maturação citoplasmática. No macho, as espermatogônias são associadas a células somáticas em sólidos cordões celulares que são as progenitoras dos túbulos seminíferos. A espermatogênese começa após a puberdade e inclui a espermatocitogênese, a meiose e a espermiogênese. A espermatocitogênese inclui várias divisões mitóticas das espermatogônias que se dividem em espermatócitos primários. Pelas duas divisões da meiose, os espermatócitos primários produzem espermatócitos secundários haploides e depois as espermátides. A espermiogênese é o processo de reestruturação transformando espermátides em espermatozoides. Quadro 4-1 Regulação molecular do desenvolvimento da linhagem germinativa Assim como para as três principais camadas germinativas, a especificação da linhagem germinativa ocorre durante o processo de gastrulação. Ao menos em camundongos, a especificação é iniciada por sinais locais originados externamente ao embrião propriamente 95 dito. Esses sinais incluem as proteínas de morfogênese óssea (BMP) 4 e 8b atuando pela via Smad. Células responsivas do epiblasto iniciam então a expressão de fragilis/Ifitm3 e dessa população específica de células epiblásticas, as células precursoras comprometidas com a linhagem germinativa são recrutadas. Um regulador transcricional-chave desse processo é o Blimp1/Prdm1. Funções relacionadas ao Blimp1 incluem a repressão aos programas somáticos incipientes nas células do epiblasto em gastrulação, sendo a redução da expressão do gene Hox um indicador. Outros genes relacionados à especificação da linhagem germinativa incluem Stella e c-kit, este último servindo como receptor para o fator de célula- tronco/ligante kit, expresso em células revestindo o trajeto do transporte de células germinativas para a gônada em desenvolvimento. Associada à sua repressão à diferenciação em célula somática, precursores da linhagem germinativa mantêm a expressão de genes associados à pluripotência, incluindo Oct4, Sox2 e Nanog, e mostram substanciais modificações epigenéticas. Esse último incluindo a desmetilação global do DNA à medida que as células germinativas povoam a crista genital, seguida por metilação de novo e aquisição de marcas (imprints) genômicas sexo-específicas durante a gametogênese subsequente (Cap. 2, Fig. 2-3). No embrião feminino, as células germinativas iniciam a meiose durante as fases iniciais do desenvolvimento ovariano. Marcadores moleculares expressos durante esse período do desenvolvimento incluem Stra8 e SCP3, esse último uma proteína do complexo sinaptonêmico envolvido no pareamento dos cromossomos homólogos. Aparentemente, a entrada em meiose desencadeia a perda da pluripotência das células germinativas. Os ovócitos guiam o desenvolvimento gonadal inicial. A foliculogênese é iniciada pela expressão do fator de transcrição Figα, um fator específico para células germinativas femininas e essencial, por exemplo, para a produção das proteínas da zona pelúcida. O continuado desenvolvimento folicular depende de uma gama de fatores endócrinos e produzidos localmente. Em contraste com a situação no embrião fêmea, a presença de células germinativas não é necessária para o desenvolvimento do testículo. Em vez disso, a diferenciação da gônada é controlada pela linhagem de células de Sertoli induzida pela expressão do gene Sry ligado ao Y (região determinadora do sexo do cromossomo Y) em células somáticas da crista genital. Sox9, Fgf9 e Dax1 estão entre os genes expressos após a expressão inicial de Sry. Ao chegarem à crista genital, as células germinativas masculinas são impedidas de entrar em meiose. Em vez disso, elas entram em estado de bloqueio mitótico quando chegam a um número apropriado de células, que é espécie-específico. Leituras adicionais Berndston W.E., DesjardinsC. The cycle of the seminiferous epithelium in the bovine testis. Am. J. Anat. 1974;140:167–179. 96 Brennan J., Capel B. One tissue, two fates: molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nature Rev. Gen. 2004;5:509–521. Dieleman S.J., Kruip T.A.M., Fontijne P., de Jong W.H.R., van dr Weyden G.C. Changes in oestradiol, progesterone, and testosterone concentrations in follicular fluid and in the micromorphology of preovulatory bovine follicles relative to the peak of luteinizing hormone. J. Endocr. 1983;97:31–42. Grøndahl C., Hyttel P., Grøndahl M.L., Eriksen T., Godtfredsen P., Greve T. Structural aspects of equine oocyte maturation in vivo. Mol. Reprod. Dev. 1995;42:94–105. Heuser C.H., Streeter G.L. Early stages in the development of pig embryos, from the period of initial cleavage to the time of the appearance of limb buds. Contr. Embryol. Carneg. Inst. 1927;20:1–19. Hyttel P., Farstad W., Mondain-Monval M., Bakke Lajord K., Smith A.J. Structural aspects of oocyte maturation in the blue fox. Anat. Embryol. 1990;181:325–331. Hyttel P., Fair T., Callesen H., Greve T. Oocyte growth, capacitation and final maturation in cattle. Theriogenology. 1997;47:23–32. Liebich H.-G. Funktionelle Histologie der Haussaugtiere. Stuttgart, Germany: Schatter; 2004. Moor R.M., Warnes G.M. Regulation of meiosis in mammalian oocytes. Br. Med. Bull. 1979;35:99–103. Rüsse I., Sinowatz F. Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2nd edn. Berlin: Parey Buchverlag; 1998. Sutovsky P., Manandhar G., Wu A., Oko R. Interactions of sperm perinuclear theca with the oocyte: implications for oocyte activation, anti-polysperm defense, and assisted reproduction. Microsc. Res. Tech. 2003;61:362–378. Vejlsted M., Offenberg H., Thorup F., Maddox-Hyttel P. Confinement and clearance of OCT4 in the porcine embryo at stereomicroscopically defined stages around gastrulation. Mol. Reprod. Dev. 2006;73:709–718. Wrobel K.-H., Süss F. Identification and temporospatial distribution of bovine primordial germ cells prior to gonadal sexual differentiation. Anat. Embryol. 1998;197:451–467. 1 Nota da Revisão Científica: A nomenclatura ‘ovócito’ e termos relacionados como ‘ovogênese’, ‘ovogônia’, ‘ovocitário’ são equivalentes aos termos ‘oócito’, ‘oogênese’, ‘oogônia’ e ‘oocitário’, respectivamente. 97 Capítulo 5 Fertilização Fred Sinowatz A reprodução sexuada ocorre por meio da fertilização, durante a qual dois gametas haploides fundem-se e produzem um indivíduo geneticamente único. A fertilização, processo pelo qual o espermatozoide e o ovo se unem, ocorre na região da ampola do oviduto (Cap. 3). O complexo formado pelo ovo mamífero, que é ovulado e entra no oviduto pelo infundíbulo, consiste em três componentes: (1) o ovócito, aprisionado na metáfase da meiose II na maioria dos animais domésticos (com exceção dos cães, em que a maturação final até a metáfase II ocorre no oviduto), (2) a zona pelúcida, uma matriz extracelular que circunda o ovócito, constituída de glicoproteínas que são sintetizadas tanto pelo ovócito quanto pelas células do cumulus circundantes em animais domésticos, e (3) as células do cumulus, que consistem em várias camadas de células do cumulus oophorus inseridas em uma matriz extracelular, composta principalmente de ácido hialurônico. É comum considerar a zona pelúcida e o ovócito como uma única estrutura, levando à descrição do complexo formado pelo ovo ovulado como o complexo cumulus-ovócito (COC), particularmente no contexto dos procedimentos biotecnológicos (Fig. 5-1). 98 Fig. 5-1 Complexo cumulus-ovócito (1) na ampola de oviduto ovino, onde a fertilização. 2: Dobras mucosas do oviduto. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Transporte do espermatozoide no trato genital feminino A duração da cópula varia entre diferentes animais domésticos (Cap. 3). A cópula dura menos que um minuto em ruminantes, é um pouco mais longa em cavalos, vários minutos em porcos e pode durar de cinco a 30 minutos em cães. Em várias espécies mamíferas (bovinos, ovinos, coelhos, cães, gatos e primatas), o sêmen é depositado na porção cranial da vagina. Em outras espécies (porcos, cavalos e camelídeos), o sêmen é ejaculado diretamente na cérvix (porcos) ou, via processo uretral, tanto na cérvix quanto no útero. Em ruminantes, o ejaculado possui volume pequeno (em geral somente 3 a 4 mL), mas contém uma enorme concentração de espermatozoides. Assumiu-se por muito tempo que, após ser depositada no útero por inseminação artificial, a maior parte dos espermatozoides ascende em direção ao oviduto. Entretanto, estudos recentes demonstraram claramente que uma grande proporção desses espermatozoides é perdida por transporte retrógrado; mais de 60% dos espermatozoides depositados no útero são perdidos para o exterior dentro de 12 horas após a inseminação artificial. Essa perda pode ser muito maior caso os espermatozoides sejam depositados na cérvix, e isso pode resultar em comprometimento da fertilidade. No cachaço, o volume de ejaculado é grande (200 a 400 mL) com, comparativamente, baixa concentração de espermatozoides. Devido a seu grande volume, a maior parte do ejaculado flui da cérvix para o útero. O cachaço ejacula uma série de frações seminais com diferentes características. A primeira fração contém poucos espermatozoides e consiste principalmente em secreções das glândulas sexuais acessórias. A segunda fração é rica em espermatozoides. A maior parte da fração final origina-se das glândulas bulbouretrais e forma um coágulo que reduz a perda retrógrada de espermatozoides. O garanhão ejacula em uma série de “jatos”, dos quais o primeiro geralmente contém a fração rica em espermatozoides. O plasma seminal do último jato é altamente viscoso e, como no porco, pode servir para minimizar a perda retrógrada de espermatozoides pelo trato genital feminino. No cão, a primeira das três frações do ejaculado origina-se na próstata, a única glândula sexual acessória nessa espécie. O volume dessa fração límpida e acelular, 99 chamada de fração pré-espermática, varia de 0,5 a 5 mL, dependendo da raça. A segunda fração, de cor opaca, é rica em espermatozoides. Seu volume varia de 1 a 4 mL e contém entre 300 milhões e dois bilhões de espermatozoides. A última fração também é produzida pela próstata. Seu volume pode variar em uma ampla faixa, de 1 a até 80 mL, dependendo da raça. Ejaculado vigorosamente, essa última fração de fluido prostático pode forçar a fração rica em espermatozoides cranialmente em direção ao útero. No gato, o volume de ejaculado é pequeno (0,2 a 0,3 mL) e não se sabe se ele é compreendido por múltiplas frações. A perda retrógrada de espermatozoides pelo trato genital feminino depende de vários fatores. Os mais importantes são o volume e a natureza física do ejaculado e o local de sua deposição dentro do trato genital feminino. Como mencionado, em algumas espécies, como no porco, as proteínas do plasma seminal formam um tampão vaginal visível que evita que os espermatozoides sejam perdidos para o exterior. Em alguns roedores de laboratório, o tampão vaginal sólido que é formado após a cópula pode ser visto externamente e usado para determinar o momento do coito (Cap. 20). O transporte de espermatozoides até a ampola do oviduto é resultado, principalmente, do elevado tônus e motilidade da túnica muscular do trato genital feminino. Esse transporte pode ser dividido em duas fases, uma fase rápida e uma fase sustentada de transporte. Dentro de poucos minutos após a cópula, os espermatozoides já alcançaram o oviduto. Embora os gametas masculinos estejam próximos ao ovócito após um período bastante curto, esses espermatozoides não são viáveis e não participam da fertilização; é a fase sustentada do transporte espermático que é importante para a fertilização bem-sucedida. Na fase sustentada, os espermatozoides são transportados para os ovidutos a partir de possíveis reservatórios na junção útero-tubárica ou na cérvix, durante um período prolongado, liberando-os de maneira mais uniforme.A principal barreira para o transporte espermático é a cérvix uterina que também pode servir como um reservatório de espermatozoides em várias espécies. Em ruminantes, e em menor importância na égua, a cérvix possui um sistema intricado de dobras e sulcos. Como em outras espécies domésticas, o epitélio da cérvix de ruminantes produz um muco altamente viscoso que proíbe a penetração dos espermatozoides pelo canal cervical durante a maior parte do ciclo estral. Somente durante o estro é que o muco modifica sua viscosidade, quando um muco menos viscoso rico em sialomucinas é produzido pelas regiões basais das criptas cervicais. Um segundo tipo de muco, que contém principalmente sulfomucinas e é muito mais viscoso, é secretado pelas porções apicais do epitélio que recobre as pontas das dobras cervicais. Esses dois tipos diferentes de secreção criam dois compartimentos 100 distintos dentro do canal cervical, um basal com baixa viscosidade e outro mais central com alta viscosidade. O ambiente com baixa viscosidade nas regiões basais das dobras oferece um ‘caminho privilegiado’ pelo qual os espermatozoides podem se mover mais facilmente em direção ao útero. A habilidade do espermatozoide em usar esse caminho privilegiado depende da sua habilidade em nadar pelas criptas da cérvix; os espermatozoides imóveis não são capazes de progredir e são eliminados. Consequentemente, a cérvix age como um filtro para a remoção de espermatozoides inviáveis. Capacitação Os espermatozoides não estão aptos a fertilizar o ovócito imediatamente após a chegada ao trato genital feminino; para adquirir fertilidade eles devem permanecer no trato genital feminino por um certo período (Fig. 5-2). As modificações que ocorrem durante esse período constituem a capacitação dos espermatozoides. O local onde a capacitação acontece varia entre as espécies. Em espécies nas quais os espermatozoides são liberados na porção média da cérvix (porca) ou na cérvix caudal e imediatamente entram no corpo do útero, a capacitação provavelmente começa no útero e termina no istmo do oviduto. Em espécies nas quais a deposição de sêmen é intravaginal, a capacitação é provavelmente iniciada durante a passagem do espermatozoide pela cérvix. Nem todos os espermatozoides são capacitados ao mesmo tempo e, como o processo geralmente se estende por várias horas, cada espermatozoide pode apresentar um grau diferente de capacitação, dependendo de sua localização dentro do trato genital feminino. Fig. 5-2 Oviduto bovino Os espermatozoides podem ficar temporariamente ligados ao 101 epitélio do istmo no oviduto por mecanismos de ligação mediados por açúcar (p. ex., fucose). 1. espermatozoide; 2. quinocílios; 3. microvilos. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). A capacitação compreende um conjunto de processos complexos. Já foi claramente demonstrado que a membrana plasmática do espermatozoide (particularmente a da cabeça) sofre modificações marcantes durante a capacitação. Os processos importantes durante a capacitação são: a remoção da cobertura glicoproteica e das proteínas do plasma seminal (adsorvidas durante a estocagem no epidídimo e a ejaculação) da superfície dos espermatozoides; o acoplamento funcional das cascatas transdutoras de sinal que regulam o início da reação acrossomal pelas glicoproteínas da zona pelúcida; as alterações na motilidade dos flagelos que são necessárias para penetração da zona pelúcida; e, finalmente, o desenvolvimento da capacidade de fundir-se com a membrana plasmática do ovócito. Esses processos são acompanhados por modificações no metabolismo, nas propriedades biofísicas da membrana plasmática, e na fosforilação proteica, junto com a elevação dos níveis de cálcio intracelular e do pH, e hiperpolarização do potencial de membrana. A capacitação pode ser revertida pela devolução dos espermatozoides já capacitados ao plasma seminal. Uma vez descapacitados dessa maneira, eles necessitam de uma capacitação adicional antes de readquirirem sua fertilidade. Grande parte do conhecimento sobre o processo de capacitação foi adquirido nos estudos in vitro. Vários fatores causam capacitação in vitro. Primeiro, o efluxo de colesterol da membrana espermática é mediado por proteínas ligadoras de esterol e dá início a vários aspectos da capacitação. A reorganização da membrana espermática após a depleção de colesterol é considerada a etapa inicial da capacitação. Na segunda etapa, várias proteínas da membrana plasmática do espermatozoide são fosforiladas nas tirosinas por um mecanismo dependente de AMPc. Os espermatozoides expressam uma forma solúvel de adenilcliclase sensível a bicarbonato que pode controlar esses eventos de fosforilação. Na terceira etapa, a elevação do pH intracelular e dos níveis de bicarbonato pode levar ao estímulo para a produção de AMPc. Pela ativação dos canais regulados por nucleotídeos cíclicos na membrana plasmática do flagelo espermático, os espermatozoides podem ser modificados para o padrão hiperativado de motilidade que é característico dos espermatozoides capacitados. In vivo, ações sinérgicas de múltiplos fatores parecem mediar a capacitação. Foi demonstrado que as proteínas ligadoras de esterol, como as lipoproteínas de alta densidade, estão presentes no fluido do oviduto e podem aceleram o efluxo de 102 colesterol dos espermatozoides. Além disso, a progesterona, derivada do fluido folicular e da secreção pelas células do cumulus que circundam o ovócito após a ovulação, pode estar envolvida na regulação de alguns aspectos do processo. Interações entre os espermatozoides e a zona pelúcida A zona pelúcida (ZP) é uma matriz extracelular que circunda o ovócito e o embrião inicial e que exerce várias funções importantes durante a fertilização e o desenvolvimento embrionário inicial. Na maioria das espécies de mamíferos, é composta de três glicoproteínas (ZPA, equivalente à ZP2 de camundongo; ZPB, equivalente à ZP1 de camundongo; ZPC, equivalente à ZP3 de camundongo), produtos das famílias gênicas ZPA, ZPB e ZPC que foram identificadas como altamente homólogas entre as espécies mamíferas. A maior parte das informações sobre a estrutura e a função da ZP foi obtida de estudos em camundongos. Dados recentes em porcos e em outros animais domésticos, no entanto, indicaram que as descobertas no modelo murino nem sempre são aplicáveis a outras espécies. Por exemplo, enquanto a ZP3 é o receptor espermático primário no camundongo, são a ZPA e a ZPC que possuem atividade de receptor no porco. Também contrário ao camundongo (em que o ovócito em crescimento é a única fonte de glicoproteínas para a zona pelúcida), essas proteínas são expressas tanto no ovócito quanto nas células de granulosa em um padrão variável entre os estágios nos animais domésticos. A ZP está envolvida em vários estágios críticos da fertilização: a adesão e a ligação do espermatozoide capacitado à ZP; a indução subsequente da reação acrossomal e a penetração na ZP; e as modificações da ZP induzidas pela fertilização que evitam a polispermia. Adesão dos espermatozoides à zona pelúcida O primeiro contato entre o espermatozoide e a ZP, a adesão, é uma associação fraca e não específica entre os gametas e parece ser uma interação bastante ao acaso (Fig. 5-3). Esta é seguida por uma ligação relativamente firme, que é específica à espécie e é mediada por receptores complementares na ZP (receptores espermáticos) e na superfície do espermatozoide. No camundongo a adesão inicial entre o espermatozoide e a zona pelúcida é mediada pela ZP3, uma glicoproteína constitutiva da ZP que se liga a receptores na cabeça anterior do espermatozoide com acrossoma intacto. Essa adesão à ZP provavelmente é baseada em processos de reconhecimento entre proteína e carboidrato, por meio da associação entre resíduos 103 da α-galactosil covalentemente ligadas a moléculas de oxigênio da ZP3 com um receptor correspondente no espermatozoide. A ligação secundária é então mediada pela ZP2. Outros autores, entretanto, consideram que a ligação espermatozoide-zona pelúcidaé um evento puramente dependente de proteínas. Fig. 5-3 Reação acrossomal. Uma vez ligados à zona pelúcida, os espermatozoides sofrem a reação acrossomal, durante a qual enzimas hidrolíticas são liberadas do acrossoma da cabeça do espermatozoide. Ela começa quando a membrana plasmática do espermatozoide forma sítios múltipos de fusão com a membrana acrossomal externa resultando na formação de várias vesículas pequenas. (a) Espermatozoide com acrossoma intacto. (b) Vesiculação da membrana plasmática e da membrana acrossomal externa; (c) Penetração na zona pelúcida pelo espermatozoide. 1: Fusão da membrana plasmática e da membrana acrossomal externa do espermatozoide; 2: Zona pelúcida. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Em outras espécies que não o camundongo, foi sugerido que vários carboidratos das proteínas da zona pelúcida estão envolvidos na ligação espermática. Ensaios de inibição da ligação espermatozoide-ZP revelaram um papel da D-manose na ZP humana e de ratos. O pré-tratamento de espermatozoides humanos com D-manose inibiu a penetração do espermatozoide na ZP. No rato, o α-metil manosídeo e a D- manose acabaram sendo os inibidores mais potentes. Foi demonstrado que a L-fucose e a fucoidina estão envolvidas no reconhecimento espermatozoide-ZP em ovócitos de cobaia, hamster, rato e humanos. Reação acrossomal 104 Uma vez ligado, o espermatozoide sofre a reação acrossomal (Fig. 5-3) que tem como resultado a liberação de enzimas hidrolíticas pelo acrossomo da cabeça do espermatozoide. Isso permite que o espermatozoide penetre na matriz da ZP por uma combinação da digestão enzimática das glicoproteínas da ZP e da propulsão vigorosa pela cauda do espermatozoide. A reação acrossomal, induzida pelas glicoproteínas da ZP, consiste em uma fusão ordenada da membrana plasmática do espermatozoide e a membrana acrossomal externa. Ela tem início quando a membrana plasmática forma sítios múltiplos de fusão com a membrana acrossomal externa resultando na formação de muitas vesículas pequenas (vesiculação). Após a ocorrência da vesiculação, o conteúdo enzimático do acrossoma é disperso, e o núcleo espermático permanece coberto somente pela membrana acrossomal interna (Fig. 5-4). A acrosina e a hialuronidase são enzimas liberadas durante a reação acrossomal. A acrosina hidrolisa as proteínas da ZP e também aumenta a habilidade do espermatozoide em se ligar a essas proteínas. Durante o processo da penetração na ZP, os espermatozoides que sofreram reação acrossomal são ligados temporariamente e liberados pelas glicoproteínas da ZP via mecanismos de ligação secundários que envolvem a pró-acrosina. Os espermatozoides também avançam em direção do espaço perivitelínico pela batida vigorosa da cauda. A pró-acrosina é a forma inativa da enzima acrosina e possui grande afinidade pela ZP. Assim, a pró-acrosina auxilia na ligação à zona pelúcida à medida que a reação acrossomal progride. Quando a pró-acrosina é convertida em acrosina, o espermatozoide penetra usando a enzima para digerir um pequeno buraco na zona pelúcida e passar por ele. 105 Fig. 5-4 Espermatozoide bovino sofrendo a reação acrossomal na superfície da zona pelúcida. 1: Espermatozoide apresentando vesiculação da membrana plasmática e da membrana acrossomal externa. 2: Zona pelúcida, composta por glicoproteínas (ZPA, ZPB, ZPC). Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Adesão e fusão de espermatozoide e ovócito Após a penetração da ZP, o espermatozoide adere-se e funde-se à membrana plasmática do ovócito. A membrana do ovócito funde-se com a membrana do segmento equatorial do espermatozoide (Cap. 4), e o espermatozoide fertilizante, incluindo sua cauda, é engolfado pelo ovócito. Estritamente, esse processo deveria ser referido como singamia. A fusão de membrana dos gametas masculino e feminino envolve fertilina-α do espermatozoide (também conhecida como desintegrina 1 ou ADAM1), fertilina-β (ADAM2) e ciritestina (ADAM3), assim como CRISP1 (proteína secretória 1 rica em cisteína). As integrinas encontradas na membrana plasmática do ovócito são receptores para ADAMs dos espermatozoides. Acredita-se que as proteínas mediadoras de adesão em ambos os gametas funcionem como complexos multiméricos nas membranas plasmáticas. Após a adesão, a membrana plasmática do espermatozoide funde-se à membrana plasmática do ovócito. A base molecular desse processo de fusão intercelular não é completamente compreendida; a tetraspanina CD9, uma proteína associada à integrina, está 106 implicada em certos tipos de fusão de membrana, mas não é sabido se ela participa na fusão dos gametas. Ativação ovocitária Imediatamente após a entrada do espermatozoide, o ovócito sofre a ativação ovocitária, que estabelece o bloqueio à fertilização polispérmica, a retomada da meiose e o início do desenvolvimento embrionário. Em todos os animais investigados, a ativação envolve aumento na concentração do íon cálcio citosólico para aproximadamente 1 mM. Dependendo da espécie, esse aumento na concentração de cálcio citosólico ocorre dentro de vários segundos a poucos minutos após a fusão da membrana dos gametas, e geralmente ocorre como uma “onda” que viaja pelo ovócito. Em mamíferos, uma oscilação de baixa frequência na concentração de cálcio citosólico persiste por várias horas e precede a entrada na primeira divisão celular embrionária. Além da indução do bloqueio à fertilização polispérmica, o aumento na concentração de cálcio citosólico encerra o bloqueio meiótico de maneira que a divisão reducional pode ser completada (Cap. 4). Em seguida, as respostas da ativação do ovócito incluem o recrutamento de RNAms maternos para a tradução e mudanças na síntese proteica (Cap. 6). O uso da injeção espermática intracitoplasmática (ICSI; Cap. 21) para fertilizar ovócitos mostrou que o contato extracelular entre espermatozoide e ovo não é necessário para ativar os ovos. De modo interessante, também não é o simples ato da injeção nem a introdução de cálcio do meio que induzem a ativação do ovo. Os componentes do núcleo espermático, possivelmente sua teca perinuclear, foram associados às atividades ativadoras de ovócitos. Entre os candidatos a essa propriedade no espermatozoide estão a oscilina (uma isomerase da glicosamina-6- fosfato) e uma forma truncada da c-Kit tirosina quinase. Bloqueio à fertilização polispérmica O bloqueio à fertilização polispérmica é estabelecido por meio da exocitose de um grupo de grânulos secretórios, os grânulos corticais, do ovócito (Fig. 5-5). Isso é referido como reação cortical (Cap. 4). O conteúdo dos grânulos corticais inclui proteases, fosfatases ácidas, peroxidase, mucopolissacarídeos e ativador de plasminogênio. Como resultado da liberação dos grânulos corticais, a membrana do ovócito e a ZP tornam-se modificadas. Em consequência, qualquer posterior penetração de espermatozoides no ovócito é evitada e o bloqueio da zona à polispermia está estabelecido. 107 Fig. 5-5 O bloqueio à fertilização polispérmica é estabelecido por meio da exocitose dos grânulos corticais (reação cortical) (A) mostra um ovócito imaturo bovino com poucos e pequenos grânulos corticais (seta), (B) a exocitose dos grânulos corticais localizados perifericamente em um ovócito maduro. 1: Mitocôndrias de um ovócito imaturo; 2: Microvilos; 3: Mitocôndria de um ovócito maduro; 4: Zona pelúcida. Retomada da meiose e formação do pronúcleo Como outra consequência da ativação ovocitária, a meiose é retomada e a segunda divisão da meiose é completada. A célula-filha que quase não recebe citoplasma é chamada de segundo corpúsculo polar (Cap. 4). A outra célula-filha é o ovócito definitivo, agora referido como o zigoto. Seu conjunto haploide de cromossomos torna-se circundado por camadas de retículo endoplasmático liso que contribui para a formação de um envelope nuclear, e um núcleo vesicular conhecido como pronúcleo feminino ou materno é formado (Fig. 5-6). O núcleo do espermatozoide passa por modificações marcantes dentro do citoplasma do ovócito. Ele torna-se inchado (“descondensado”),circundado por retículo endoplasmático liso contribuindo para um envelope nuclear, e forma o pronúcleo masculino ou paterno (Fig. 5-7). A descondensação do núcleo espermático requer a redução de muitas pontes dissulfito. O agente redutor primário é a glutationa do citoplasma do ovócito. Além disso, as protaminas pelas quais o DNA espermático é empacotado são substituídas pelas histonas do ovócito. A cauda do espermatozoide destaca-se e degenera-se. Os pronúcleos masculino e feminino aproximam-se, auxiliados pelo citoesqueleto do zigoto (Figs. 5-8, 5-9). Finalmente, eles ficam em contato próximo e perdem seus envelopes nucleares, que aparentemente se dissolve em retículo endoplasmático liso. Durante a dissolução dos envelopes nucleares, os genomas haploides masculino e feminino tornam-se unidos no centro do zigoto. Essa mistura é referida como 108 cariogamia ou sincariose. Deve-se notar que, em contraste ao que ocorre na fertilização em algumas ordens inferiores, os pronúcleos em mamíferos não se fundem realmente. Durante a migração dos pronúcleos, a fase S do primeiro ciclo celular pós-fertilização é completada e, na dissolução dos envelopes nucleares dos pronúcleos, a cromatina condensa-se para formar a prófase da primeira divisão mitótica. A clivagem subsequente completa-se normalmente dentro de 24 horas após a ovulação. Se o ovócito não é fertilizado nesse período, ele perde seu potencial de desenvolvimento. Fig. 5-6 Formação do pronúcleo feminino. Como uma consequência da ativação ovocitária, a segunda divisão meiótica é completada (A). Uma das células-filhas (2 na Fig. 5-7 C) não recebe quase citoplasma e é chamada de segundo corpúsculo polar A outra célula-filha (B) é o ovócito definitivo. Seu conjunto haploide de cromossomos torna-se circundado por camadas de retículo endoplasmático e um núcleo vesicular (3). O pronúcleo feminino está formado. 1: Conjunto haploide de cromossomos; 2: Corpúsculo polar; 3: Pronúcleo feminino. 109 Fig. 5-7 Formação do pronúcleo masculino. O espermatozoide é capturado pelo ovócito por um processo de fagocitose (A). O núcleo espermático torna-se rodeado por camadas de retículo endoplasmático liso (B) contribuindo para a formação de um envelope nuclear. Um pronúcleo paterno vesicular (descondensado) (C) é formado. 1: Núcleo espermático em descondensação; 2: Cauda espermática em degeneração; 3: Retículo endoplasmático; 4: Pronúcleo masculino. Fig. 5-8 Pronúcleo masculino (1) e feminino (2) de um zigoto bovino. 3: Zona pelúcida; 4: Espermatozoide penetrando a zona pelúcida. 110 Fig. 5-9 Visão geral da fertilização em mamíferos (modificado de Rüsse e Sinowatz, 1998). A Anáfase da primeira divisão meiótica no folículo; B: Penetração do espermatozoide no espaço perivitelínico; metáfase da segunda divisão meiótica e a ativação do ovócito resulta na liberação dos grânulos corticais; C: Primeiro o espermatozoide é capturado pelo ovócito por um processo de fagocitose; anáfase da segunda divisão meiótica; D: Formação dos pronúcleos masculino e feminino, a cauda do espermatozoide degenera-se; E: Cariogamia; F: Primeira divisão mitótica do zigoto. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Resumo Os espermatozoides são depositados no trato genital feminino durante a cópula ou inseminação artificial. Eles são transportados ao local de fertilização na região ampolar do oviduto nas sucessivas fases de transporte rápida e sustentada, das quais a última resulta na fertilização. Durante o transporte, o espermatozoide sofre a capacitação e adquire a capacidade fertilizante. A fertilização é um processo em etapas que inclui uma primeira série de interações entre o espermatozoide e a zona pelúcida, e uma segunda série de eventos em que o espermatozoide fertilizante é 111 incorporado no ovócito. O espermatozoide primeiro adere-se fracamente à zona pelúcida e esse processo é seguido por uma ligação mais firme mediada por receptor. O contato com a zona pelúcida desencadeia a reação acrossomal no espermatozoide, resultando na liberação de enzimas que auxiliam na penetração na zona pelúcida. Subsequentemente, a membrana plasmática do segmento equatorial do espermatozoide fertilizante funde-se com o ovócito internalizando-o. A fusão dos gametas induz a ativação ovocitária incluindo a reação cortical no ovócito, pela qual o conteúdo dos grânulos corticais é liberado e induz o bloqueio da zona à polispermia. A ativação do ovócito também leva à conclusão da meiose II e ao início do desenvolvimento embrionário inicial. No ovócito, o compartimento de cromossomo haploide materno é circundado por um envelope nuclear formando o pronúcleo materno e, após descondensação da cromatina no espermatozoide, seu componente cromossomal haploide também se torna circundado por um envelope nuclear para formar o pronúcleo paterno. Os pronúcleos então se movem um em direção ao outro para o centro do zigoto, seus envelopes nucleares dissolvem-se e a cromatina condensa-se para entrar na prófase da primeira divisão mitótica. A primeira clivagem geralmente é observada dentro de 24 horas após a ovulação. Quadro 5-1 A contribuição dos espermatozoides Os espermatozoides maduros possuem pouco citoplasma e não possuem qualquer síntese proteica detectável. Assumiu-se, portanto, por muito tempo que o espermatozoide contribui para um embrião pouco mais do que com os genes paternos, enquanto o ovócito, com seus abundantes RNAs e proteínas, dirige exclusivamente o desenvolvimento inicial do embrião. De maneira surpreendente, estudos recentes mostraram que defeitos no espermatozoide podem perturbar o desenvolvimento embrionário mesmo se os genes carregados pelas células germinativas masculinas forem perfeitamente normais. Tem ficado claro que além do conjunto haploide de cromossomos, o espermatozoide também contribui com um conteúdo complexo de RNA e proteínas que podem ser cruciais para o desenvolvimento inicial de um embrião. Contrário a opiniões mais antigas, o espermatozoide inteiro, incluindo a peça intermediária e a cauda, é capturado pelo ovócito. Em vários mamíferos, as estruturas da peça intermediária e da cauda persistem no embrião por várias divisões celulares. Na maioria dos mamíferos (mas não em camundongos) o espermatozoide também contribui com os centríolos, um pré-requisito para a formação do aparato do fuso e a primeira divisão mitótica. Também foi descoberto recentemente que o espermatozoide contribui com uma molécula chamada de PLC que desencadeia as ondas de íons cálcio que ativam um ovo fertilizado, e que o espermatozoide contém várias centenas de tipos diferentes de RNA mensageiro. Alguns deles são codificantes de proteínas necessárias para o desenvolvimento embrionário inicial, 112 mas a função da maioria das moléculas de RNA transferidas ainda precisa ser estabelecida. Leituras adicionais Brewis I.A., Moore H.D. Molecular mechanisms of gamete recognition and fusion at fertilization. Hum. Reprod. 1997;12:156–165. Dean J. Molecular biology of sperm-egg interactions. Andrologia. 2005;37:198–199. Dunbar B.S., Avery S. The mammalian zona pellucida: its biochemistry, immunochemistry, molecular biology, and developmental expression. Reprod. Fertil. Dev. 1994;6:331–347. Evans J.P., Florman H.M. The state of the unions: the cell biology of fertilization. Nat. Cell. Biol. 2002;4:57– 63. Farstad W., Hyttel P., Grøndahl C., Mondain-Monval M., Smith A.J. Fertilization and early embryonic development in the blue fox (Alopex lagopus). Mol. Reprod. Dev. 1993;36:331–337. Guraya S.S. Cellular and molecular biology of capacitation and acrosome reaction in spermatozoa. Int. Rev. Cytol. 2000;199:1–64. Hyttel P., Greve T., Callesen H. Ultrastructure of in-vivo fertilization in superovulated cattle. J. Reprod. Fert. 1988;82:1–13. Hyttel P., Xu K.P., Greve T. Scanning electron microscopy of in vitro fertilization in cattle. Anat. Embryol. 1988;178:41–46. Kölle S., Sinowatz F., Boie G., Totzauer I., Amselgruber W., Plendl J. Localization of the mRNA encoding the zona protein ZP3 alpha in theporcine ovary, oocyte and embryo by non-radioactive in situ hybridization. Histochem. J. 1996;28:441–447. Kölle S., Sinowatz F., Boie G., Palma G. Differential expression of ZPC in the bovine ovary, oocyte, and embryo. Mol. Reprod. Dev. 1998;49:435–443. Kölle S., Dubois C.S., Caillaud M., Lahuec C., Sinowatz F., Goudet G. Equine zona protein synthesis and ZP structure during folliculogenesis, oocyte maturation, and embryogenesis. Mol. Reprod. Dev. 2007;74:851– 859. Laurincik J., Hyttel P., Rath D., Pivko J. Ovulation, fertilization and pronucleus development in superovulated gilts. Theriogenology. 1994;41:447–452. Laurincik J., Kopecny V., Hyttel P. Pronucleus development and DNA synthesis in bovine zygotes in vivo. Theriogenology. 1994;42:1285–1293. Laurincik J., Hyttel P., Kopecny V. DNA synthesis and pronucleus development in pig zygotes obtained in vivo: An autoradiographic and ultratsructural study. Mol. Reprod. Dev. 1995;40:325–332. Lyng R., Shur B.D. Sperm-egg binding requires a multiplicity of receptor-ligand interactions: new insights into the nature of gamete receptors derived from reproductive tract secretions. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 2007;65:335–351. Moore H.D. Molecular biology of fertilization. J. Reprod. Fertil. Suppl. 2001;57:105–110. Rüsse I., Sinowatz F. Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2nd edn. Berlin: Parey Buchverlag; 1998. Sinowatz F., Wrobel K.H. Development of the bovine acrosome. An ultrastructural and cytochemical study. Cell Tissue Res. 1981;219(3):511–524. 113 Sinowatz F., Gabius H.J., Amselgruber W. Surface sugar binding components of bovine spermatozoa as evidence by fluorescent neoglycoproteins. Histochemistry. 1988;88:395–399. Sinowatz F., Volgmayr J.K., Gabius H.J., Friess A.E. Cytochemical analysis of mammalian sperm membranes. Prog. Histochem. Cytochem. 1989;19:1–74. Sinowatz F., Amselgruber W., Topfer-Petersen E., Totzauer I., Calvete J., Plendl J. Immunocytochemical characterization of porcine zona pellucida during follicular development. Anat. Embryol. 1995;191:41–46. Sinowatz F., Plendl J., Kölle S. Protein-carbohydrate interactions during fertilization. Acta Anat. (Basel). 1998;161:196–205. Sinowatz F., Topfer-Petersen E., Koelle S., Palma G. Functional morphology of the zona pellucida. Anat. Histol. Embryol. 2001 a;30:257–263. Sinowatz F., Koelle S., Topfer-Petersen E. Biosynthesis and expression of zona pellucida glycoproteins in mammals. Cells Tissues Organs. 2001;168:24–35. Sinowatz F., Wessa E., Neumueller C., Palma G. On the species specificity of sperm binding and sperm penetration of the zona pellucida. Reprod. Domest. Anim. 2003;38:141–146. Wassarman P.M. Towards molecular mechanisms for gamete adhesion and fusion during mammalian fertilization. Curr. Opin. Cell Biol. 1995;7:658–664. Wassarman P.M., Litscher E.S. Sperm–egg recognition mechanisms in mammals. Curr. Top. Dev. Biol. 1995;30:1–19. 114 Capítulo 6 Clivagem embrionária e blastulação Morten Vejlsted Após a fertilização, a meiose é concluída, a ciclicidade celular retorna ao padrão mitótico. O genoma embrionário único é estabelecido por meio da mistura dos cromossomos paternos e maternos com a dissolução dos dois pronúcleos. Este evento provê ao zigoto a genética completa para o desenvolvimento embrionário. O citoplasma do zigoto, herdado do ovócito, contém a composição molecular e estrutural completa e necessária para iniciar as primeiras clivagens e, posteriormente, ativar o genoma do embrião para a nova transcrição embrionária. Assim, a fase inicial de desenvolvimento é guiada por informações armazenadas no ovócito e passadas ao zigoto e ao embrião recém-formado. Clivagens e ativação do genoma No zigoto, a fase S é concluída durante o primeiro ciclo celular após a fertilização. Assim, quando o zigoto cliva em um embrião de duas células na primeira mitose, cada uma das duas células, denominadas blastômeros, contém uma cópia completa do genoma embrionário (Figs. 2-1, 6-1). O embrião ainda é, e continuará sendo, circundado pela zona pelúcida por alguns dias. Uma série de divisões mitóticas continuam a ocorrer. Durante esta fase de desenvolvimento, as divisões mitóticas são peculiares, pois ocorrem quase sem crescimento celular, as células vão se tornando cada vez menores, pois o citoplasma original do zigoto é dividido em porções cada vez menores. Estas divisões celulares são denominadas clivagens. Os blastômeros podem ser de tamanhos desiguais devido a uma assincronia na clivagem. Esta assincronia torna-se aparente desde o início, mesmo entre os estágios de duas e quatro células, que resulta em um temporário embrião de três células. Ao menos no camundongo, o ponto de penetração do espermatozoide pode posicionar o plano da primeira clivagem. Além disso, no estágio duas células, o blastômero que herda o local de entrada do espermatozoide tende a se dividir mais precocemente e tem a maior probabilidade de originar as células posicionadas internamente no crescente montante celular. 115 Fig. 6-1 Cortes de um zigoto bovino (A) com dois pronúcleos (setas) e de um embrião de duas células (B) com núcleos (setas). As clivagens iniciam-se durante o transporte embrionário pelo oviduto, mas em um estágio espécie específico do desenvolvimento, o embrião chega ao útero (Tabela 6-1). A égua é muito particular no que diz respeito ao transporte pelo oviduto, a entrada no utero é permitida somente para embriões, enquanto ovócitos não fertilizados, por um mecanismo ainda desconhecido, ficam retidos no oviduto. Tabela 6-1 Momento de passagem do embrião do oviduto para o útero e de formação de blastocistos, em diferentes espécies Durante o crescimento ovocitário, transcritos e proteínas são armazenados nestas células especializadas para uso futuro (Fig. 6-2). No final da fase de crescimento a transcrição diminui. No entanto, o ovócito pode ser carregado em maior ou menor grau com os transcritos e proteínas necessários para a condução do desenvolvimento embrionário inicial e que governam, ao menos, a primeira clivagem. Os transcritos e 116 as proteínas são gradualmente degradados após a fertilização e, em certo estágio de desenvolvimento, a atividade do genoma embrionário é necessária. O genoma embrionário é ativado gradualmente; a transcrição é muito limitada no início, mas aumenta em estágios espécie-específicos e em duas fases: a ativação menor e a ativação principal do genoma embrionário (Tabela 6-2). Fig. 6-2 Controle materno versus embrionário do desenvolvimento inicial do embrião. Durante a fase de crescimento ovocitário nos folículos, transcritos e proteínas são acumuladas no ovócito. Com o desenvolvimento, esses componentes são gradualmente utilizados e degradados. Em paralelo, o genoma embrionário passa inicialmente por uma ativação menor e subsequentemente pela ativação principal. Este processo ocorre no estágio de quatro células em suínos e oito células em bovinos. Tabela 6-2 Momento da ativação menor e ativação principal do genoma embrionário em diferentes espécies Espécies Ativação menor do genoma Ativação principal do genoma Camundongo Fase G2 do primeiro ciclo celular (zigoto) Segundo ciclo celular (embrião de duas células) Suíno Desconhecido Terceiro ciclo celular (embrião de quatro células) Bovino Primeiro ciclo celular (zigoto) Quarto ciclo celular (embrião de oito células) Canino Desconhecido Quarto ciclo celular (embrião de oito células) Equino Desconhecido Do quarto para o quinto ciclo celular (embrião de oito a 16 células) Ovino Desconhecido Do quarto para o quinto ciclo celular (embrião de oito a 16 células) 117 Após poucas divisões celulares, o embrião adquire a forma de uma pequena massa de células denominada mórula, nome em latim para amora. Compactação Todas as células individuais da mórula são idênticas às iniciais, suas formas esféricas dão à mórula a aparência típica de uma amora. Mais tarde, porém, as células exteriores diferenciam-se em um epitélio firmemente unido atribuindo ao embrião uma superfície mais lisa.Este processo é conhecido como compactação (Fig. 6-3). As células externas constituem o trofectoderma ou trofoblasto. Neste livro, o termo trofectoderma será utilizado quando se referir a um período anterior à placentação e trofoblasto quando estas células já estiverem comprometidas com a formação da placenta. A firme união entre as células vizinhas do trofectoderma resultam em junções intercelulares especializadas, incluindo junções do tipo oclusivas e desmossomos. Assim, um típico epitélio com compartimentos celulares apicais e basolaterais é formado. Existem algumas diferenças entre as espécies para o período de compactação: no suíno ocorre muito cedo no desenvolvimento, ao redor do estágio de oito células, enquanto que em bovinos acontece mais tarde, por volta do estágio de 16 a 32 células. 118 Fig. 6-3 Cortes de embriões de suínos. A: embrião de quatro células apresentando três blastômeros e um núcleo (seta). 1: Zona pelúcida. B: Mórula no processo de compactação. Observe a estreita ligação (seta) entre as células externas. 1: Zona pelúcida. C: Blastocisto. 1: Zona pelúcida; 2: Trofectoderma; 3: MCI. D: Blastocisto expandido. 1: Zona pelúcida; 2: Trofectoderma; 3: MCI. Do ponto de vista molecular, a diferenciação dos blastômeros mais externos, ao menos em camundongos, parece ser dependente da diminuição na expressão do fator de transcrição Oct4, seguido do aumento na expressão de outros fatores de transcrição como Cdx2 e Eomesodermina (Fig. 6-4). Concomitantemente, as células internas conservam a expressão de Oct4. 119 Fig. 6-4 Ação sequencial dos fatores de transcrição Oct4, Nanog, Cdx2 e GATA-6 durante a diferenciação celular inicial no embrião de camundongo. Na compactação celular duas linhagens são derivadas de blastômeros totipotentes: a massa celular interna pluripotente (MCI) e o trofectoderma. O epiblasto mais tarde se diferencia em hipoblasto e epiblasto. Blastulação A compactação da mórula é um pré-requisito para posterior blastulação – formação de uma cavidade repleta de líquido no centro do embrião, a blastocele. A blastulação ocorre geralmente dentro do lúmen uterino durante a primeira semana de desenvolvimento e transforma o embrião em um blastocisto (Fig. 6-5). Fig. 6-5 Blastocisto suíno no dia seis de desenvolvimento, observado em estereomicroscópio. 120 1: Zona pelúcida; 2: Trofectoderma; 3: Blastocele; 4: Massa celular interna (MCI). A blastulação é provocada principalmente pelo controle do trofectoderma sobre o transporte de fluidos para a cavidade. Ao final, os blastômeros internos posicionam-se em um polo do embrião formando a massa celular interna (MCI). Células derivadas da MCI formarão o embrião propriamente dito, enquanto que as células do trofectoderma originarão a parte embrionária da placenta (Cap. 9). A proporção entre as células MCI e trofectoderma é de cerca de 1:3. A porção do trofectoderma que recobre a MCI é conhecida como trofectoderma polar enquanto que o restante é conhecido como trofectoderma mural (Fig. 6-6). Fig. 6-6 Blastocisto bovino no dia seis de desenvolvimento. O quadro (B) refere-se à figura observada na ultraestrutura em “B”. A: Corte em microscopia de luz. Observa-se que as células planas do hipoblasto (setas) começam a formar-se da MCI. 1: MCI; 2: Trofectoderma mural; 3: Trofectoderma polar; 4: Zona pelúcida. B: Microscopia eletrônica de transmissão de duas células adjacentes do trofectoderma. 5: Junção oclusiva; 6: Desmossoma; 7: Microvilos; 8: Zona pelúcida. Com a pressão osmótica no interior da cavidade do blastocisto subindo, o embrião gradualmente se expande. No lavado uterino para a coleta e transferência de embriões é comum encontrar blastocistos em colapso com capacidade de reexpandir. No entanto, não é conhecido se tratar de um artefato in vitro ou de um fenômeno fisiológico intrauterino. Ao final, a expansão do blastocisto leva à ruptura da zona pelúcida (Fig. 6-7) e permite que o embrião escape pela abertura. Em algumas espécies, este processo, conhecido como eclosão, é auxiliado por enzimas proteolíticas liberadas pelo endométrio e que agem nas glicoproteínas que compõem 121 a zona pelúcida. Em equinos, forma-se uma cápsula “compensatória” entre o trofectoderma e a zona pelúcida antes que esta seja rompida. A cápsula desempenha um importante papel na manutenção da prenhez precoce para esta espécie (Cap. 9). Fig. 6-7 Eclosão do blastocisto suíno. Os núcleos estão marcados com o corante fluorescente Hoechst 33342 e espermatozoides supranumerários são visualizados aderidos à zona pelúcida (seta). (Foto: Wouter Hazeleger.) Próximo ao período da eclosão, a MCI diferencia-se em duas populações de células: aquelas voltadas a blastocele formando uma camada achatada denominada hipoblasto (Fig. 6-8); e aquelas remanescentes formam uma camada multicelular chamada epiblasto. Pequenas cavidades intercelulares podem surgir no epiblasto. O hipoblasto, como o trofectoderma, tem característica epitelial. Gradualmente, ele forma um completo revestimento interno abaixo não apenas do epiblasto, como também do trofectoderma. Nos equinos, o hipoblasto inicialmente forma “colônias” separadas que posteriormente unem-se em um fechado compartimento interno. Em ambos os casos, uma cavidade denominada saco vitelino primitivo é formada. Do ponto de vista molecular, ao menos em camundongos, a expressão do fator de transcrição Nanog é essencial para a formação do epiblasto (Fig. 6-4), enquanto o fator de transcrição GATA-6 é um regulador-chave na formação hipoblasto. O epiblasto mais tarde formará o embrião propriamente dito enquanto o hipoblasto vai formar o epitélio interno do saco vitelino, que dependendo da espécie, pode estar envolvido com a placentação (Cap. 9). No camundongo e no coelho, entretanto, o hipoblasto também tem demonstrado desempenhar um papel importante na regulação da proliferação, sobrevivência e diferenciação do epiblasto sobrejacente. 122 Esta regulação é, em parte, mediada pela formação de uma membrana basal entre o hipoblasto e o epiblasto. Fig. 6-8 Blastocistos bovinos aos dias 10 (A) e 12 (B) de desenvolvimento. 1: Epiblasto; 2: Trofectoderma; 3: Hipoblasto. Observa-se a camada Rauber em processo de degeneração em B (seta). Nas espécies domésticas, o trofectoderma polar que recobre o epiblasto (conhecido como camada de Rauber) gradualmente se desintegra e é perdido, expondo o epiblasto para o ambiente uterino. No entanto, antes do desprendimento da camada de Rauber, junções do tipo oclusivas são formadas entre as células mais periféricas do epiblasto com o objetivo de selar o embrião, apesar da perda do trofectoderma polar. Após a perda da camada de Rauber, o epiblasto é claramente perceptível como uma estrutura brilhante, inicialmente circular tornando-se oval. Junto com hipoblasto subjacente é conhecido como disco embrionário (Figs. 6-9, 6- 10). 123 Fig. 6-9 Blastocisto suíno no dia 10 de desenvolvimento. O disco embrionário no quadro (B) observado em uma maior ampliação em B. Fig. 6-10 Disco embrionário em embrião bovino. A: Embrião ovoide no dia 14 de desenvolvimento com pouca visualização do disco embrionário (seta). A linha (B) indica o corte exibido em B. B: Corte através do disco embrionário (1). 2: Epiblasto; 3: Trofectoderma com microvilos; 4: Hipoblasto; 5: Saco vitelino primitivo. Alongamento do blastocisto Durante a formação do disco embrionário, o blastocisto ainda está em expansão. Uma vez que o disco é formado, o trofectoderma com o hipoblasto subjacente remodelam- se e o embrião torna-se ovoide (Fig. 6-10). Em ruminantes e suínos, o processo de alongamento continua, e o embrião se torna primeiro tubular e posteriormente filamentoso (Fig. 6-11). A massa embrionária total não aumenta na mesma proporção que o comprimento, assim o embrião torna-se filiforme e tremendamente 124 longo. Este fenômeno é particularmente marcante no suíno no qual o embrião desenvolve-se de uma esfera de cerca de um centímetro de diâmetro no dia 10 para uma estrutura filamentosa de aproximadamenteum metro de comprimento no dia 13. O alongamento ocorre de modo intenso particularmente nos dias 12 e 13 (30-45 milímetros por hora!). Este aumento não pode ser explicado somente por mitoses, e envolve também a reestruturação do citoesqueleto e da forma celular. Em ruminantes, o alongamento do embrião é menos evidente; em bovinos o comprimento aumenta até 35 cm entre os dias 12 e 21 (Fig. 6-12). Fig. 6-11 Alongamento do embrião suíno. A: Embrião esférico (1) e tubular (2) no dia 11 de desenvolvimento. O embrião tubular é um pouco enovelado. B: Entremeado de embriões filamentosos no dia 13 de desenvolvimento. Observa-se o disco embrionário (3) e as extremidades terminais dilatadas do embrião (4). 125 Fig. 6-12 Alongamento de embriões bovinos ao redor de 16 (A), 18 (B), 22 (C), e 27 (D) dias de desenvolvimento. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Em contraste com os ruminantes e os suínos, nos equinos o embrião não se alonga e permanece esférico durante esta fase do desenvolvimento. Resumo No zigoto, a meiose é finalizada e o genoma embrionário único é formado. Completada a fase S do primeiro ciclo celular pós-fertilização, o zigoto entra no ciclo celular mitótico e cliva em duas células. Esta clivagem, e as várias subsequentes, ocorrem sem o crescimento celular, assim as células ficam cada vez menores. Em um estágio de desenvolvimento variável entre as espécies, ocorre a ativação principal do genoma embrionário. Após um determinado número de divisões, o embrião chega ao útero na forma de um aglomerado celular semelhante a uma amora e denominado mórula. Durante o processo de compactação, os blastômeros mais externos da mórula unem-se uns aos outros para desenvolver o trofectoderma. Uma cavidade cheia de fluido, a blastocele, desenvolve-se no interior do trofectoderma 126 enquanto as células internas reunem-se em um polo do embrião para formar a massa celular interna (MCI) e o embrião passa a receber o nome de blastocisto. Em uma fase do desenvolvimento variávels entre as espécies, o blastocisto sai da zona pelúcida com a eclosão. Próximo ao período de eclosão, as celulas internas da MCI delaminam e formam um epitélio, o hipoblasto, no interior do blastocisto. A cavidade delimitada pelo hipoblasto é denominada saco vitelino primitivo. As células externas da MCI formam o epiblasto, que mais tarde originará o embrião propriamente dito. O trofectoderma que recobre o epiblasto, a camada de Rauber, é subsequentemente perdido, assim, o epiblasto é exposto ao ambiente uterino e torna- se confluente com o trofectoderma. Nesta fase, o epiblasto e o hipoblasto formam o disco embrionário. Após a eclosão, o blastocisto mantém inicialmente a forma esférica, mas em suínos e ruminantes (não em equinos), torna-se ovoide, e alongam- se, tornando-se sucessivamente tubular e filamentoso. Quadro 6-1 Regulação molecular da blastulação Próximo ao estágio de mórula, os blastômeros perdem a totipotência e duas linhagens celulares distintas tornam-se evidentes: células internas, formando a MCI e células externas formando o trofectoderma. A formação da MCI e do trofectoderma constitui o primeiro processo de diferenciação durante o desenvolvimento embrionário. Em termos moleculares, no entanto, recentes descobertas em camundongos demonstram que o padrão molecular para essa diferenciação é estabelecido tão cedo quanto na fase de quatro células. Como mencionado no Capítulo 2, a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário são epigeneticamente controlados, uma vez que todas as células (com algumas exceções, p. ex., a linhagem de linfócitos) descendem do zigoto e compartilham as mesmas sequências de DNA. A modificação nas histonas é um desses mecanismos de controle epigenético. Em camundongos, a dependência do arranjo espacial de cada dos quatro blastômeros e a ordem em que são gerados, faz com que alguns blastômeros aparentemente fiquem com mais metilações de resíduos de arginina em histona H3 do que outros. Os blastômeros mais metilados tendem a formar as células internas e, consequentemente, a MCI; os menos metilados tendem a formar células externas, e, portanto, o trofectoderma. Em termos morfológicos, a diferenciação da MCI e do trofectoderma é inicialmente evidenciada por alterações na superfície celular que aumentam a adesão entre blastômeros. Isso é mediado pela expressão de moléculas de adesão celular transmembrana dependentes de cálcio, ovomorulina, também conhecida como E-caderina. Quando a adesão mediada pela E-caderina ocorre, todos os blastômeros têm a superfície coberta com microvilos voltados para o exterior e a superfície mais lisa voltada para o centro do embrião. Subsequentemente às adesões mediadas pela E-caderina, junções oclusivas desenvolvem-se entre as células externas, definindo claramente os domínios de membrana plasmática apical e basolateral. 127 Assim, as células exteriores tornam-se polarizadas e epiteliais. Mais tarde, bombas de Na+, K+ são estabelecidas na região basolateral do trofectoderma para conduzir a formação da blastocele durante a blastulação. Leituras adicionais Betteridge K.J. Equine embryology: An inventory of unanswered questions. Theriogenology. 2007;68S:S9–S21. Betteridge K.J., Fléchon J.–E. The anatomy and physiology of pre-attachment bovine embryos. Theriogenology. 1988;29:155–187. Degrelle A.A., Campion E., Cabau C., Piumi F., Reinaud P., Richard C., Renard J.–P., Hue I. Molecular evidence for a critical period in mural trophoblast development in bovine blastocysts. Dev. Biol. 2005;288:448–460. Denker H.–W., Eng L.A., Mootz U., Hammer C.E. Studies on the early development and implantation in the cat. I. Cleavage and blastocyst formation. Anatomischer Anzeiger. 1978;144:457–468. Heuser, C.H. and Streeter, G.L. (1927): Early stages in the development of pig embryos, from the period of initial cleavage to the time of the appearance of limb-buds. Contributions to Embryology, 20, Carnegie Institution of Washington, Publication number 109:1-19. Holst P.A., Phemister R.D. The prenatal development of the dog: preimplantation events. Biol. Reprod. 1971;5:194–206. Hunter R.H.F. Chronological and cytological details of fertilization and early embryonic development in the domestic pig, Sus scrofa. Anat. Rec. 1974;178:169–186. Maddox-Hyttel P, Bjerregaard B., Laurincik J. Meiosis and embryo technology: renaissance of the nucleolus. Reprod. Fertil. Dev. 2005;17:3–14. Patten B.M. Embryology of the pig, edn. New York: Blakiston; 1948. Reynaud K., Fontbonne A., Marseloo N., Viaris de Lesegno C., Saint-Dizier M., Chastant-Maillard S. In vivo canine oocyte maturation, fertilization and early embryogenesis: a review. Theriogenology. 2006;66:1685– 1693. Rüsse I., Sinowatz F. Lehrbuch der Embryologie der Haustiere, 2nd edn. Berlin: Parey Buchverlag; 1998. Schier A.F. The maternal-zygotic transition: death and birth of RNAs. Science. 2007;316:406–407. Sharp D.C. The early fetal life of the equine conceptus. Anim. Reprod. Sci. 2000;60–61:679–689. Stroband H.W.J., van der Lende T. Embryonic and uterine development during early pregnancy in pigs. J. Reprod. Fert. Suppl. 1990;40:261–277. Vejlsted M., Du Y., Vajta G., Maddox-Hyttel P. Post-hatching development of the porcine and bovine embryo – defi ning criteria for expected development in vivo and in vitro. Theriogenology. 2006;65:153–165. Watson A.J. Trophectoderm differentiation in the bovine embryo: characterization of a polarized epithelium. J. Reprod. Fert. 1998;114:327–339. Watson A.J., Barcroft L. Regulation of blastocyst formation. Frontiers in Bioscience. 2001;6:D708–730. 128 Capítulo 7 Gastrulação, dobramentos embrionários e formação do celoma Morten Vejlsted Conforme discutido no capítulo anterior, a blastulação resulta na formação de células da massa celular interna (MCI), trofoectoderma, epiblasto e hipoblasto. O hipoblasto e o trofoectoderma são linhagens extraembrionárias que participarão da formação da membrana fetal (Cap. 9), ao passo que os derivados do epiblasto incluirão todas aslinhagens celulares. Inicialmente, isto ocorre pela formação de três camadas germinativas do epiblasto: ectoderma, mesoderma e endoderma. Um derivado de destaque do endoderma é o intestino primitivo, formação da qual se dá o nome para o próprio processo de formação das camadas germinativas – a gastrulação, que deriva do termo grego gástrula, o qual significa “pequeno estômago”. Além das três camadas germinativas, a gastrulação também estabelece a linhagem germinativa, na forma de células germinativas primordiais. Apenas a formação inicial da linhagem germinativa será discutida neste capítulo, o posterior desenvolvimento das células germinativas primordiais nas cristas gonadais está descrito nos Capítulos 4 e 15. Enquanto a gastrulação prossegue, o disco embrionário gradualmente é coberto por membranas extraembrionárias para a formação da cavidade amniótica. Nas espécies domésticas, a formação do âmnio resulta dos dobramentos da região superior da trofectoderma com o mesoderma extraembrionário subjacente, conforme será descrito primeiro, seguido então para outros eventos no próprio disco. Desenvolvimento do âmnio Durante as fases iniciais da gastrulação, o trofoectoderma é delineado por uma fina camada de mesoderma extraembrionário (veja a seguir), as duas camadas em conjunto constituem o cório. Durante a gastrulação, o cório forma pregas corioamnióticas que circundam o disco embrionário (Fig. 7-1). Gradualmente, as pregas estendem-se em sentido superior até encontrarem-se e unirem-se sobre o disco embrionário, envolvendo-o, assim, em uma cavidade amniótica fechada. O termo âmnio geralmente é empregado para o conjunto da cavidade e sua parede. O 129 epitélio interior do âmnio surge do trofoectoderma e assim, no disco embrionário, é contínuo com o epiblasto e posteriormente à superfície do ectoderma embrionário (veja a seguir). A cobertura externa do âmnio é composta do mesoderma extraembrionário. Posteriormente, o âmnio será envolto por ainda outra cavidade, o alantoide (veja abaixo e no Cap. 9). Fig. 7-1 Formação do âmnio em suíno das pregas corioamnióticas no dias 13° a 15° de desenvolvimento. 1: Trofoectoderma; 2: Epiblasto; 3: Linha primitiva; 4: Células do mesentoderma; 5: Mesoderma intraembrionário; 6: Prega corioamniótica; 7: Cório; 8: Mesoderma extraembrionário; 9: Endoderma; 10: Hipoblasto; 11: Celoma; 12: Ectoderma superficial; 13: Mesoderma; 14: Sulco neural; 15: Notocorda; 16: Cavidade amniótica. O local onde as pregas corioamnióticas encontram-se e se fundem é conhecido como mesoâmnio (Fig. 7-2). No cavalo e em carnívoros, o mesoâmnio é ausente e deixa então o âmnio e o cório sem conexão. Como resultado, potros, cães e gatos nascem cobertos por um âmnio intacto, que pode ser sufocante se não for removido pela mãe ou por um assistente. Em contraste, em suínos e ruminantes, o mesoâmnio persiste; como resultado, o âmnio é removido durante o parto e as proles nascem sem a cobertura de membranas. 130 Fig. 7-2 Embrião de ovelha no 17° dia de desenvolvimento Quando os embriões são expelidos do útero, o cório é comumente destacado, deixando o mesoâmnio como uma antena sobre o âmnio. 1: Mesoâmnio; 2: Âmnio; 3: Saco vitelino; 4: Alantoide. Fases iniciais da gastrulação O começo da gastrulação tem sido tradicionalmente relacionado com a aparência morfológica da linha primitiva, um acúmulo alongado de células no polo caudal do futuro embrião. Esta estrutura é formada por células do epiblasto que se acumulam na região posterior formando uma área espessa em formato de crescente (formato de “meia-lua”) no disco embrionário – o primeiro sinal morfológico do início da gastrulação já identificado, ao menos em suínos e bovinos (Figs. 7-3, 7-4). O espessamento caudal do crescente aparece aproximadamente nos dias 10 e 11 da gestação em suínos e aproximadamente nos dias 14 a 15 em bovinos. Quando a área espessa em formato de crescente é estabelecida, inicia-se a entrada de células do epiblasto no espaço entre o epiblasto e o hipoblasto (Fig. 7-5). Em animais de laboratório, esses sinais morfológicos do início da gastrulação no epiblasto são precedidos de mudanças morfológicas e moleculares no hipoblasto que delimita o polo anterior do epiblasto (veja Quadro 7-1 em regulação molecular). Fig. 7-3 Acúmulo de células epiblásticas na porção posterior do disco embrionário resulta na 131 formação da linha primitiva (1). Fig. 7-4 Disco embrionário de suíno no 10° dia de desenvolvimento mostrando o acúmulo de células epiblásticas formando um crescente posterior. A: Disco embrionário com o crescente posterior (setas). A linha (B) indica o plano de secção mostrado em “B”. B: Seção mediana do disco embrionário mostrando um espessamento posterior (seta) do epiblasto (1). 2: Hipoblasto; 3: Saco vitelino primitivo. 132 Fig. 7-5 Disco embrionário de um embrião bovino no 14° dia de desenvolvimento mostrando de células da região crescente caudal do epiblasto ingressando no espaço entre o epiblasto e hipoblasto. A: Embrião tubular apresentando disco embrionário (seta). A linha (B) indica onde o embrião foi seccionado para então produzir a imagem em B. B: Visão interna do disco embrionário exibindo o crescimento posterior (setas). A linha (C) indica o plano de seção mostrado em C. C: Seção mediana do disco embrionário com o epiblasto (1) do qual células ingressam (2). 3: Hipoblasto; 4: Saco vitelino primitivo. Quadro 7-1 Regulação molecular: formação dos eixos do corpo O eixo embrionário dorsoventral é formado durante a blastulação quando a MCI posiciona-se em um dos polos do blastocisto com suas células externas em frente ao trofoectoderma adjacente e as células internas voltadas para a cavidade blastocística (Cap. 6). Com a diferenciação, as células internas da MCI delaminam e formam o hipoblasto ao passo que no epiblasto forma-se um eixo dorsoventral com as células dorsais voltadas para o trofoectoderma, isto é, camada de Rauber. O eixo embrionário anteroposterior (posteriormente craniocaudal) aparentemente não é formado até a gastrulação. Em espécies de laboratório, um eixo anteroposterior é inicialmente evidente quando o polo embrionário anterior torna-se marcado por uma área de células do hipoblasto expressando uma gama de fatores com propriedades de indução neural. Dentre esses fatores estão incluídos fatores de transcrição como o Otx2 e Hesx1, e moléculas sinalizadoras como a Dickkopf 1 (Dkk1) e Cerberus-like 1 (Cer I). Essa região do hipoblasto é conhecida como endoderma visceral anterior (EVA) em camundongos, e como crista marginal anterior (CMA) em coelhos. Pelo menos nessas espécies, o hipoblasto do EVA e CMA induz o epiblasto adjacente a diferenciar- 133 se de maneira neural, estabelecendo dessa forma a futura região da cabeça do embrião. Interessantemente, isto ocorre mesmo antes da formação da linha primitiva no polo posterior do disco embrionário. Depois, moléculas sinalizadoras provenientes do nó primitivo e notocorda, incluindo a Cordina (“Chordin”), Noggin e Follistatina, são importantes para a subsequente diferenciação neural. Em suínos e bovinos, a formação do espessamento caudal do epiblasto em forma de crescente, que precede a formação da linha primitiva, é até então o primeiro sinal do futuro eixo embrionário anteroposterior. O eixo embrionário final a ser estabelecido é o eixo esquerdo-direito. No camundongo, foi mostrado que a unilateralidade esquerda-direita é regulada principalmente pelas células do nó primitivo que secretam o fator 8 de crescimento do fibroblasto (fibroblast growth factor 8 ou FGF-8), iniciando uma reação em cascata de expressão de outros fatores de crescimento. O batimento de cílios na região ventral das células do nó primitivo cria um gradiente de FGF-8 que resulta em mais FGF-8 sendo fornecido para a região esquerda da linha primitiva do que na região direita. O padrão de reação em cascata da expressão gênica iniciado pela FGF-8 seletivamente define o lado esquerdo do embrião. A molécula sinalizadora Sonic hedgehog (Shh) é expressa na notocordagenomas dos animais são desvendados e analisados, a importância do desenvolvimento animal torna-se central para entender e melhorar o crescimento animal, para a manutenção da saúde e para determinar as causas subjacentes das doenças. Embora uma quantidade razoável de textos de boa qualidade acerca da embriologia humana esteja disponível (como o Langman’s Medical Embryology), o foco em uma única espécie continua a ser uma séria limitação para veterinários e outros profissionais que trabalham com animais, não permitindo uma visão abrangente das amplas e distintas variações que existem entre as espécies domésticas, com referência especial aos processos de blastogênese, implantação e placentação. Certamente, a obra referência de Bradley Patton, Embryology of the pig, publicada em inglês em 1927, proporcionou um maravilhoso relato descritivo e ilustrado deste modelo de desenvolvimento embrionário mamífero frequentemente utilizado. Uma publicação descritiva concisa do desenvolvimento em suínos, The embryonic pig: a chronological account foi posteriormente publicada por A. W. Marrable, em 1971. Em 1984, Drew Noden e Alexander de Lahunta, reconhecendo a 17 falta de um texto adequado de embriologia dos animais domésticos que fosse útil para estudantes de veterinária, publicaram The embryology of domestic animals: developmental mechanisms and malformation. Este livro, uma importante contribuição para a bibliografia veterinária por muitos anos, apresentava um material descritivo tradicional, sistema a sistema, da anatomia do desenvolvimento dos animais domésticos, incluindo aves; os autores incluíram também muitos experimentos relevantes e casos clínicos de referência ao longo do livro. Infelizmente, uma edição revisada jamais foi produzida e a obra não está mais disponível. Mais recentemente, uma obra alemã primorosamente detalhada, Lehrbuch der Embryologie der Haustiere (1991), foi publicada por Imogen Rüsse e Fred Sinowatz (coautor desta obra). Ilustrações e micrografias excelentes caracterizam essa ampla obra de referência em embriologia dos animais domésticos. Impresso apenas em alemão, a disseminação internacional da obra foi limitada. Em 2006, McGaedy e colaboradores publicaram o livro Veterinary Embryology, uma obra que está voltada para os interesses específicos dos estudantes de veterinária. Nesse mesmo sentido, a publicação de Embriologia veterinária é especialmente oportuna uma vez que constitui uma fonte de consulta até então inexistente para aqueles que desejam compreender os processos fundamentais do desenvolvimento animal, sejam eles estudantes, professores, pesquisadores ou médicos veterinários. Fazendo uma reflexão, o projeto deste livro nasceu após uma conversa que Poul e eu tivemos durante um encontro científico no ano 2000. À medida que compartilhávamos e comparávamos nossas experiências ao ministrar anatomia e embriologia animal para os estudantes de veterinária, houve uma percepção mútua de que uma obra moderna acerca do desenvolvimento dos animais doméstico era extremamente necessária para apoiar a bibliografia fundamental dos cursos de medicina veterinária e áreas afins no século XXI. Para atrair um público mais global, solicitou-se a contribuição de coautores reconhecidos internacionalmente como especialistas em seus campos. Seus capítulos foram ininterruptamente concatenados em uma obra de fácil leitura e muito informativa. Merece destaque a inclusão dos capítulos 1, 2, 20 e 21, cada um dos quais aborda um tópico específico, incluindo uma narrativa histórica do estudo da embriologia animal, uma discussão atual dos mecanismos celulares e moleculares que governam os processos relacionados ao desenvolvimento, a embriologia comparada de camundongos e galinhas, e um resumo sucinto do aparecimento, desenvolvimento e aplicação em larga escala das tecnologias de reprodução assistida para aumentar a produção dos animais domésticos, respectivamente. Autor principal, o professor Poul Hyttel é reconhecido internacionalmente como um pesquisador distinto e um educador apaixonado nas áreas de reprodução animal e 18 biologia celular na Royal Veterinary and Agricultural University, e mais recentemente, na Universidade de Copenhagen. Ele coordenou os cursos de anatomia e histologia veterinária e de biologia celular por muitos anos em Copenhagen, e recebeu reconhecimento e prêmios formais, bem como constantes elogios de seus estudantes, pelo seu compromisso dedicado e apaixonado pelo ensino. Nesse sentido, Poul reuniu um distinto grupo de colaboradores internacionais como coautores, incluindo o professor Fred Sinowatz (Munique) e o Dr. Morten Vejlsted (Copenhagen), entre outros. Keith Betteridge, professor eminente de reprodução animal na Universidade de Guelph, realizou completa revisão editorial do texto. A primeira edição apresenta uma visão lógica, contemporânea e abrangente do conhecimento atual sobre o tema. O formato propicia informações textuais sucintas muito bem apoiadas por ilustrações, fotografias e micrografias de qualidade. Acredito que tanto os estudantes, os professores e os veterinários irão adotar esta obra uma vez que ela se mostrará uma fonte de consulta inestimável para o aprendizado e para o conhecimento no campo da embriologia dos animais domésticos. Maio 2009 Worcester, Massachusetts, EUA Eric W. Overström, Ph.D Professor e Chefe do Departamento de Biologia e Biotecnologia Diretor do Centro de Ciências da Vida & Bioengenharia Instituto Politécnico de Worcester Worcester, Massachusetts 19 Prefácio Para mim, um dos mais excitantes e gloriosos momentos ensinando anatomia macroscópica dos animais domésticos aconteceu durante os dias compartilhados com os estudantes e rodeados por mesas de aço repletas de úteros gravídicos e fetos na sala de dissecção. Examinar aqueles espécimes fetais é como abrir um livro de anatomia; um livro no qual cada órgão e cada estrutura estão perfeitamente definidos e seu histórico de desenvolvimento está perfeitamente preservado – verdadeiramente uma situação ideal para uma memorável experiência anatômica tanto para alunos quanto para professores! A embriologia sempre foi um pré-requisito para o real entendimento da anatomia macroscópica e da teratologia resultante do desenvolvimento incorreto. Atualmente, entretanto, é isso e muito mais além; as pesquisas biomédicas contemporâneas requerem conhecimentos de embriologia (ou, preferencialmente, de biologia do desenvolvimento) para desempenhar um papel importante neste progresso – um papel com implicações importantes para a sociedade. As tecnologias de reprodução assistida, por exemplo, são tão utilizadas em animais domésticos como em humanos nos quais a fertilização in vitro tornou-se uma etapa ex soma comum na ligação de uma geração com a seguinte. Nos animais domésticos, técnicas como a clonagem por transferência nuclear de células somáticas tornaram possíveis modificações genéticas que abriram a possibilidade de modificar animais geneticamente de modo que eles produzam proteínas de interesse, sirvam como modelo de estudo de doenças humanas, ou, no futuro, forneçam órgãos para xenotransplantes. Todas essas possibilidades dependem de um conhecimento profundo de embriologia, muitos dos quais são controversos. A disciplina de embriologia é trazida à luz da ética, o que, na minha opinião, obriga os embriologistas contemporâneos a participar de debates de cunho científico com a sociedade. Por algum tempo, tecnologias de reprodução assistida cada vez mais sofisticadas transportaram a pesquisa embriológica “de ponta” para fora do corpo e para dentro do ambiente in vitro. No entanto, a expansão do campo da embriologia de modo a abranger as células-tronco embrionárias nos redirecionou para o embrião per se; o controle da diferenciação das células- -tronco in vitro depende absolutamente do entendimento dos processos moleculares que regulam o desenvolvimento in vivo. O próprio embrião tornou-se a chave para o sucesso – o círculo está fechado! A investigação “de ponta” é atualmente formadae pode servir como uma barreira na linha média, reprimindo a expressão de genes do lado esquerdo no lado direito do disco embrionário. Cílios das células do nó primitivo batendo aberrantemente para a direita podem estar envolvidos na condição conhecida como situs inversus, no qual todos os órgãos do corpo desenvolvem-se como uma imagem espelhada da sua posição normal. As células do epiblasto que constituem a região posterior em crescimento logo se unem na linha média do disco embrionário para formar a linha primitiva (Fig. 7-3). Nessa linha, as células começam a involuir1 do epiblasto através de sua membrana basal para formar então os precursores mesoendodermais (mesentoderma), isto é, células capazes de formar tanto mesoderma como endoderma. Este é o primeiro exemplo de transição epitélio-mesenquimal durante o desenvolvimento embrionário, processo no qual as células mudam suas características de células do epitélio (apresentando fortes conexões intercelulares) para se tornarem mais livremente organizadas e, portanto, capazes de realizar migrações. O termo mesênquima refere-se ao tecido embrionário livremente organizado, independentemente da camada germinativa de origem. O interessante é que, assim como o início da gastrulação é marcado por esta transição epitélio-mesenquimal, o final dessa fase de desenvolvimento é marcado pela supressão desse processo. Formação inicial do mesoderma e endoderma As células do mesentoderma originam o endoderma e o mesoderma. As células 134 formadoras do endoderma se integram e deslocam o hipoblasto, que está imediatamente abaixo do epiblasto, formando o endoderma (Fig. 7-6). Outras células continuam posicionadas abaixo do epiblasto e do trofoectoderma formando o mesoderma intra e extraembrionário, respectivamente. O endoderma aumenta de tamanho para formar o revestimento superior do saco vitelino primitivo abaixo do epiblasto e, na margem do disco embrionário, é contínuo com o hipoblasto (Figs. 7-6, 7-7). A porção do saco vitelino primitivo coberto pelo endoderma será posteriormente isolada no interior do embrião, desenvolvendo-se em um intestino primitivo, no qual a porção da cavidade coberta pelo hipoblasto será deslocada externamente ao embrião para formar o saco vitelino definitivo (Fig. 7-8). Fig. 7-6 Duas diferentes fases do ingresso (setas) de células através da linha primitiva e nó primitivo. A: o disco embrionário visto de cima. A linha (B) indica a seção apresentada na visão oblíqua em “B”. 1: Membrana bucofaríngea; 2: Borda do corte da trofoectoderma e hipoblasto; 3: Células do mesoderma formando a notocorda; 4: Nó primitivo; 5: Linha primitiva; 6: Membrana cloacal. B: Seção oblíqua da linha primitiva. 7: Epiblasto; 8: Nó primitivo; 9: Linha primitiva; 10: Trofoectoderma; 11: Células do mesentoderma (laranja); 12: Células do mesoderma (vermelho); 13: Células do endoderma (amarelo); 14: Células do hipoblasto (verde). C: Secção obliqua algumas horas depois. 15: Mesoderma somático; 16: Mesoderma visceral; 17: Transição entre endoderma e hipoblasto; 18: Saco vitelino primitivo; 19: Celoma; 20: Cório; 21: Parede do saco vitelino. 135 Fig. 7-7 Gastrulação em um embrião de ovelha no 13° dia de desenvolvimento. A: Embrião tubular de ovelha. O retângulo (B) está aumentado em “B”. B: Disco embrionário (1) cercado por pregas corioamnióticas (2). C: Seção longitudinal de B. 1: Disco embrionário; 3: Epiblasto; 4: Trofoectoderma; 5: Mesoderma; 6: Endoderma; 7: Mesoderma somático; 8: Mesoderma visceral; 9: Celoma; 10: Saco vitelino primitivo. Fig. 7-8 Formação das cavidades celomáticas. A, D e G: Seção mediana de embriões em diferentes estágios dos dobramentos craniocaudais. As setas indicam o sentido das dobras. B, C, E, F e H: Seções transversais de embriões em diferentes estágios de dobramentos laterais. As setas indicam o sentido dos dobramentos. O plano de seção de B é indicado em A, o plano de seção de E está indicado em D e o plano de seção de H é indicado em G. 1: Ectoderma; 2: Mesoderma; 3: Endoderma; 4: Cavidade amniótica; 5: Saco vitelino primitivo; 6: Celoma extraembrionário; 7: Sulco neural; 8: Mesoderma paraxial; 9: Mesoderma intermediário; 10: Mesoderma lateral; 11: Celoma intraembrionário; 12: Intestino posterior; 13: Saco vitelino; 14: Alantoide; 15: Mesoâmnio; 16: Somatopleura; 17: Esplâncnopleura. Modificado de Sadler (2004). 136 O desenvolvimento do mesoderma intraembrionário é similar ao do endoderma. Ele surge de uma porção de células presuntivamente mesentodermais que ingressaram pela linha primitiva, e que a partir de então permanecem no espaço entre o epiblasto e o hipoblasto. A formação do mesoderma não é restrita à área do disco embrionário, contudo; células do mesoderma migram muito além do disco como mesoderma extraembrionário (Figs. 7-6, 7-7). Cada um dos mesodermas intra e extraembrionária se divide em duas camadas: uma associando-se ao epiblasto e trofoectoderma para formar o mesoderma somático ou parietal, e a outra associando-se ao endoderma e hipoblasto para formar o mesoderma visceral ou esplâncnico (Figs. 7-6, 7-7). Juntos, o trofectoderma e o mesoderma somático extraembrionário irão formar as camadas externas da parte embrionária da placenta, o cório (Cap. 9). A cavidade formada entre os mesodermas somático e visceral é conhecida como o celoma. Inicialmente, o celoma está situado apenas fora do disco embrionário e é então conhecido como celoma extraembrionário ou exoceloma. Rapidamente, entretanto, a separação em mesoderma somático e visceral também envolve porções do mesoderma intraembrionário, estabelecendo então o celoma intraembrionário que, associado aos dobramentos crâniocaudais e laterais do embrião, darão origem posteriormente às cavidades do corpo (Fig. 7-8). Quando isso ocorre, o mesoderma somático origina as regiões parietais do peritôneo e pleura, enquanto que o mesoderma visceral origina as porções viscerais destas membranas serosas. O mesoderma intraembrionário é estabelecido no sentido anteroposterior, em parte se desenvolvendo paralelamente ao crescimento da linha primitiva. Depois da involução, as células espalham-se de ambos os lados, formando o mesoderma extraembrionário, e, cranialmente, formando o mesoderma intraembrionário. Rapidamente, a taxa de crescimento do disco embrionário ultrapassa o crescimento da linha primitiva, e o disco é alongado resultando em uma estrutura oval, e posteriormente em formato de pera (Fig. 7-9). Após estender mais da metade do comprimento do disco embrionário, a linha primitiva gradualmente vai se localizando mais posteriormente como resultado desse crescimento diferencial. 137 Fig. 7-9 Embrião suíno no 12° dia de desenvolvimento, mostrando o disco embrionário em forma de pera. A linha primitiva (setas) e nó primitivo (1) são fracamente visíveis. Juntamente com a relativa retração posterior da linha primitiva, uma estrutura da mediana, a notocorda é estabelecida – uma etapa essencial no estabelecimento do eixo embrionário anteroposterior (Figs. 7-1, 7-6). A notocorda é formada por células do epiblasto que ingressam através do nó primitivo, uma população especializada de células do epiblasto localizada na extremidade anterior da linha primitiva. As primeiras células a ingressarem pelo nó primitivo formam a placa pré- cordal, uma estrutura mesodérmica localizada imediatamente anterior à extremidade da notocorda. Durante o processo de gastrulação, a involução das células que formam o mesoderma e o endoderma ocorre por diferentes regiões organizadoras dentro da linha primitiva. No camundongo, três destas regiões organizadoras foram identificadas: uma organizadora da gástrula precoce, contribuindo principalmente para a formação do mesoderma extraembrionário; uma organizadora da gástrula intermediária, contribuindo principalmente para a formação do endoderma e mesoderma intraembrionário; e a região organizadora da gástrula tardia originando a placa pré-cordal e a notocorda. A região organizadora tardia é o nó primitivo. Anteriormente, a notocorda é delimitadapela placa pré-cordal, e anterior a ele o epiblasto é tão fortemente aderido ao endoderma recém-formado que não há espaço para o mesoderma em crescimento (Fig. 7-6). Esta área do epiblasto e o endoderma 138 originam a membrana bucofaríngea que por um tempo fecha a futura abertura entre a cavidade oral e a faringe (Cap. 14). Posteriormente, a notocorda é delimitada por uma estrutura similar, a membrana cloacal, que por um tempo fecha as aberturas em comum do intestino, órgãos urinários e trato reprodutivo na cloaca (Cap. 14). O ectoderma e seus derivados iniciais As moléculas sinalizadoras provenientes da notocorda, incluindo a Sonic hedgehog (Shh), induzem o epiblasto sobrejacente a diferenciar em neuroectoderma (Cap. 8). Por isso, por alguns instantes, tanto a linha primitiva (na região posterior) como o ectoderma neural em início de formação (na região anterior) são visíveis na superfície do disco embrionário (Fig. 7-10). Fig. 7-10 Visão da região superior do disco embrionário mostrando o desenvolvimento gradual (de B até D) do neuroectoderma em relação ao desaparecimento relativo da linha primitiva. 1: Nó primitivo; 2: Linha primitiva; 3: Borda seccionada da trofoectoderma e hipoblasto; 4: Placa neural; 5: Sulco neural; 6: Somito. Neuroectoderma Na região do disco embrionário anterior ao nó primitivo, células do epiblasto são induzidas a diferenciarem-se em neuroectoderma, em parte pela notocorda recém- estabelecida. Essa fase é reconhecida inicialmente pela formação da placa neural (Fig. 7-10). Rapidamente, as bordas laterais da placa neural elevam-se, formando as pregas neurais, que então delimitam uma depressão na linha média conhecida como sulco neural. As pregas neurais gradualmente fundem-se sobre o sulco neural até completar a formação do tubo neural. A fusão é iniciada na futura região cervical do embrião e prossegue em sentido anterior e posterior como um zíper duplo. Por isso, o tubo neural inicialmente se conecta na cavidade amniótica na região anterior e 139 posterior através dos neuroporos anterior e posterior (Fig. 7-11). Esses poros, ao final, fecham-se, primeiro o anterior e então o posterior. Este processo estabelece o primeiro sistema de órgão embrionário, o sistema nervoso central (Caps. 8 e 10). Fig. 7-11 Formação do sulco neural e tubo neural em embrião bovino no 21° dia de desenvolvimento. O cório foi removido durante a coleta do embrião e então o celoma extraembrionário não está delineado. A: os planos de seção (B e C) indicam a localização das seções transversais em “B” e “C”. 1: Somito; 2: Epitélio interno da parede do âmnio; 3: Mesoderma; 4: Neuroporo rostral; 5: Ectoderma de superfície; 6: Notocorda; 7: Endoderma; 8: Saco vitelino primitivo; 9: Tubo neural; 10: Celoma extraembrionário. Juntamente com a elevação e fusão das pregas neurais, certas células das bordas laterais ou cristas das pregas neurais destacam-se. Esta população de células, conhecidas como células da crista neural, não participará da formação do tubo neural; ao contrário, elas migram para vários locais e participam da formação de vários outros tecidos como o tegumento (melanócitos), outras partes do sistema nervoso (incluindo neurônios para o sistema nervoso central, simpático e entérico) e grande parte dos derivados do mesênquima craniofacial (Cap. 8). O mecanismo pelo qual as células da crista neural destacam-se das pregas neurais é similar ao que ocorre durante o ingresso de células do epiblasto na linha primitiva e no nó primitivo – outro exemplo de transição epitélio-mesenquimal. Conforme mencionado anteriormente, o termo mesênquima refere-se ao tecido embrionário pouco organizado, independente da camada germinativa de origem. 140 Assim, tanto o neuroectoderma (através das células da crista neural) como o mesoderma podem dar origem ao mesênquima. Ectoderma superficial Depois de alocar células para o endoderma, mesoderma, a linhagem germinativa e neuroectoderma, a maior parte do epiblasto que ainda permanece na região lateral irá diferenciar-se em ectoderma superficial. Uma vez que os neuroporos anterior e posterior fecham-se, dois espessamentos bilaterais do ectoderma de superfície, o placódio ótico e o placódio do cristalino, são estabelecidos no ectoderma da região cefálica do embrião (Fig. 7-12). O placódio ótico invagina-se para formar a vesícula ótica, que irá se desenvolver no ouvido interno para audição e balanço (Cap. 11), enquanto o placódio do cristalino invagina-se para formar o cristalino do olho (Cap. 11). O ectoderma superficial ainda remanescente dá origem à epiderme e glândulas associadas à pele (Cap. 17), bem como o epitélio que recobre a cavidade nasal e oral (Cap. 14) e a porção caudal do canal anal (Cap. 14). O epitélio que recobre a cavidade oral origina o esmalte dos dentes (Cap. 14) e também parte da glândula pituitária, a hipófise anterior (Cap. 10). Fig. 7-12 Embrião suíno no 12° dia de desenvolvimento apresentando placódios óptico (1) e 141 ótico (2). O mesoderma e seus derivados iniciais A formação da notocorda gera um eixo na linha média do embrião como um molde para o esqueleto axial. Inicialmente, células do mesoderma formam uma fina camada de mesênquima entrelaçado de ambos os lados da notocorda. Rapidamente, entretanto, iniciando na região occipital do embrião, o mesoderma mais próximo da notocorda (o mesoderma paraxial) prolifera e forma pares de estruturas espessas segmentadas conhecidas como somitômeros. Na região da cabeça, os somitômeros, juntamente com o mesoderma lateral (placa lateral) e células da crista neural, diferenciam-se então em tecido conjuntivo, ossos e cartilagem. Na região do corpo eles formam somitos, dos quais a derme, músculo esquelético e as vértebras desenvolvem-se (Figs. 7-8, 7-10, 7-11). Em espécies de grande porte, os somitos são formados a uma taxa média de seis pares por dia. O número de somitos formados durante esta fase de desenvolvimento, portanto, gera uma estimativa da idade do embrião. Na região mais lateral, o mesoderma permanece delgado e é, portanto, chamado de mesoderma lateral (ou placa lateral). O mesoderma lateral é contínuo com o mesoderma extraembrionário. Conforme descrito anteriormente, a formação do celoma extraembrionário divide esta parte do mesoderma em mesoderma somático e visceral (Fig. 7-8). De modo similar, com o desenvolvimento contínuo do celoma, um celoma intraembrionário divide o mesoderma lateral. No embrião, o mesoderma somático associa-se ao mesoderma de superfície para então constituir a somatopleura ao passo que o mesoderma visceral associa-se ao endoderma para formar a esplancnopleura (Fig. 7-8). Entre o mesoderma paraxial e o mesoderma lateral, encontramos o mesoderma intermediário. Mesoderma paraxial Como regra geral, o desenvolvimento ocorre em sentido anteroposterior (uma exceção à essa regra é o desenvolvimento da linha primitiva). Portanto, a formação dos somitos progride da região occipital para a região posterior. Na região da cabeça, os somitômeros, juntamente com uma segmentação similar à placa neural, formam os neurômeros (Caps. 9 e 10). Da região occipital e em sentido posterior, os somitômeros gradualmente organizam-se em somitos. Cada somito subsequentemente diferencia-se em três componentes (Fig. 7-13). A parte ventromedial do somito associa-se à notocorda formando então o esclerótomo, que 142 serve de molde para a formação da coluna vertebral (Cap. 16). A parte dorsolateral de cada somito forma precursores localizados tanto na derme quanto no tecido muscular, o dermomiótomo. Desta estrutura, populações de células localizadas na região dorsoventral e ventromedial formam o miótomo e outro grupo de células localizado dorsolateralmente dá origem ao dermátomo. O miótomo de cada somito contribui para a formação dos músculos das costas e dos membros (Cap. 16), ao passo que o dermátomo dispersa-se e forma a derme e a hipoderme da pele (Cap. 17). Fig. 7-13 Secções transversais de embriões mostrando a diferenciação gradual (A, B, C até D) dos somitos.1: Sulco neural; 2: Somito; 3: Notocorda; 4: Esclerótomo; 5: Dermamiótomo; 6: Tubo neural; 7: Aorta dorsal; 8: Dermátomo; 9: Miótomo. Modificado de Sadler (2004). Posteriormente, cada miótomo e dermátomo receberá seus próprios segmentos de componentes nervosos (Cap. 10). Clinicamente falando, é importante notar que esta inervação do segmento de origem é mantida por toda a vida. Mesoderma intermediário O mesoderma intermediário, que conecta o mesoderma paraxial e o mesoderma lateral, diferencia-se em estruturas tanto do sistema urinário como as gônadas, que conjuntamente são chamados de sistema urogenital (Cap. 15). Analogamente ao processo descrito para o mesoderma paraxial, o mesoderma intermediário localizado nas regiões torácicas cervical e cranial forma grupos segmentários de células 143 conhecidos como nefrótomos. Contudo, uma massa tecidual não segmentada é formada na região mais caudal. Esta massa é o cordão nefrogênico que forma um rim temporário, o mesonefro numa porção medial na qual as gônadas começam a se formar em um período relativamente precoce do desenvolvimento para então receber as células germinativas primordiais. As células germinativas primordiais inicialmente escapam do epiblasto durante a formação das camadas germinativas, mas posteriormente regressam para então colonizar as gônadas em desenvolvimento (Caps. 4 e 15). Mesoderma lateral e dobramento embrionário Durante uma série de dobramentos anteroposterior e laterais, as subdivisões do celoma em cavidades intra e extraembrionárias ficam mais definidas e o corpo do embrião gradualmente assume o aspecto de um tubo fechado revestindo outro tubo, as vísceras primitivas (Fig. 7-8). A somatopleura formará a parede lateral e ventral do corpo do qual o mesoderma somático formará o revestimento interno (formando o peritônio e pleura) e a ectoderma formará revestimento externo (a epiderme). A esplancnopleura formará a parede do intestino primitivo e seus derivados, no qual o endoderma formará o revestimento interno (a lamina epithelialis da túnica mucosa). O mesoderma visceral formará todos os outros componentes do intestino e seus derivados. Rapidamente, o celoma intraembrionário será dividido em cavidades peritonial, pleural e pericardial. As membranas serosas que revestem as superfícies parietais de cada uma dessas cavidades são derivadas do mesoderma somático, enquanto que as membranas serosas que revestem as superfícies viscerais (e por isso cobrindo os órgãos) são derivadas do mesoderma visceral. Formação do sangue e vasos sanguíneos Tanto o sangue quanto os vasos sanguíneos parecem surgir das células precursoras provenientes do mesoderma, os hemangioblastos. Estes se diferenciam em células- tronco hematopoiéticas (formando as células sanguíneas) e angioblastos que formam as células endoteliais que coalescem para formar os vasos sanguíneos (Cap. 12). O primeiro sinal da formação do sangue e vasos sanguíneos é visto no mesoderma visceral do esplancnopleura que recobre o saco vitelino extraembrionário. Contudo, isso parece ser apenas um fenômeno transitório; posteriormente, os primeiros indícios de hematopoiese ocorrem no fígado e no baço e então na medula óssea (Cap. 12). 144 O endoderma e seus derivados iniciais O revestimento epitelial interno do trato gastrointestinal e seus derivados são os principais componentes gerados pelo endoderma (Fig. 7-8). Inicialmente, o epitélio de cobertura do saco vitelino primitivo é formado pelo endoderma, que é contínuo com o hipoblasto e também o desloca. Com os dobramentos anteroposteriores e laterais do embrião, a porção fechada do endoderma no saco vitelino primitivo é envolta pelo embrião em formação, formando o intestino primitivo, enquanto que a porção fechada do hipoblasto passa a se localizar fora do embrião para formar o saco vitelino definitivo. O termo saco vitelino pode ser confuso, já que a cavidade não tem muita semelhança com o saco vitelino em galinhas. Conforme será descrito no Capítulo 9, o saco vitelino tem um papel apenas transitório em suínos e ruminantes. Contudo, tanto em cavalos quanto em carnívoros ele é essencial pelo menos durante a fase inicial de formação da placenta. Então, o saco vitelino dos animais domésticos é algo análogo à estrutura em galinhas, já que tem uma função nutritiva durante o desenvolvimento embrionário. O intestino primitivo compreende as partes cranial (intestino anterior), médio (intestino médio) e caudal (intestino posterior). O intestino médio comunica-se com o saco vitelino pelo ducto vitelino (Fig. 7-8). Este ducto é inicialmente amplo, mas com o desenvolvimento ele vai tornando-se longo e estreito e finalmente é incorporado no cordão umbilical (Cap. 9). O endoderma forma o epitélio do sistema gastropulmonar e o parênquima dos seus derivados. O endoderma do intestino anterior origina a faringe e seus derivados, incluindo o ouvido médio, o parênquima da glândula tireoide, as glândulas paratireoides, o fígado e o pâncreas, e o estroma reticulado das tonsilas e do timo, bem como o esôfago, estômago, fígado e pâncreas (Cap. 14). Na sua extremidade anterior, o intestino anterior é temporariamente fechado por uma membrana ectodermal-endodermal, a membrana bucofaríngea. Em um certo estágio de desenvolvimento, esta membrana rompe-se e estabelece uma comunicação entre a cavidade amniótica e o intestino primitivo. O intestino médio origina a maior parte do intestino delgado e grosso até o cólon transverso enquanto que o intestino posterior forma o cólon transverso e descendente, bem como o reto e parte do orifício anal. Neste trecho final caudal, o intestino posterior temporariamente dilata-se para formar a cloaca, uma cavidade de trânsito comum para os sistemas gastrointestinal e urogenital que estão em formação (Caps. 14 e 15). A cloaca é separada da cavidade amniótica pela membrana cloacal, composta pelo ectoderma e endoderma adjacentes, como na membrana bucofaríngea. Após a separação dos sistemas gastrointestinal e urinário, a membrana cloacal é eliminada, e ambos os sistemas são abertos na cavidade amniótica pelo ânus e pelo seio 145 urogenital, respectivamente. Formação do alantoide Durante a segunda ou terceira semana de desenvolvimento, dependendo da espécie, o alantoide é formado por um prolongamento do intestino posterior no celoma extraembrionário (Fig. 7-8). Em ruminantes e em suínos, o alantoide assume uma aparência em forma de T estando a barra superior desse T localizada como uma cavidade transversal no sentido caudal do embrião e a haste vertical desse T conectado ao intestino posterior (Fig. 7-2). Similar ao ducto vitelino, o ducto alantoide, que conecta a cavidade do alantoide ao intestino posterior, é incorporado ao cordão umbilical como consequência das dobras embrionárias. Já que o alantoide é um divertículo do intestino posterior, sua parede é revestida internamente por um epitélio de origem endodérmica e o revestimento externo é proveniente do mesoderma visceral. Com o crescimento do alantoide, a região da parede contendo mesoderma visceral junta-se com o mesoderma somático do cório e, finalmente, recobre parcialmente o âmnio. A junção das paredes do alantoide e do cório formam a parte embrionária da placenta alantocoriônica que é encontrada nos animais domésticos (Fig. 7-8; Cap. 9). A região intraembrionária proximal do ducto alantoide, que se estende do intestino posterior ao umbigo, é conhecida como úraco, e dá origem a bexiga urinária (Cap. 15). Durante a gestação inicial, a cavidade alantoide serve como um depósito de resíduos que são excretados pelo sistema urinário do embrião, que está ainda em desenvolvimento. As células germinativas primordiais Durante a formação do mesoderma e do endoderma, uma certa população de células do epiblasto é isolada para a formação a futura linhagem germinativa. Estas células germinativas primordiais não estão bem descritas nos animais domésticos, mas, ao menos em suínos e em bovinos, elas parecem ser reconhecidas pela primeira vez na borda posterior do disco embrionáriodurante a gastrulação. Ao passo que as camadas germinativas são formadas, as células germinativas primordiais são deslocadas da região do disco embrionário para a parede do saco vitelino definitivo e, de certa forma, para o alantoide (Cap. 4). Como isso ocorre ainda é desconhecido, mas provavelmente envolve transporte passivo com o endoderma. As células germinativas primordiais multiplicam-se na parede do saco vitelino e então, por meios ativos ou passivos, deslocam-se para região das cristas genitais já que estas se desenvolvem do mesoderma intermediário (Cap. 4). A rota de migração, pelo menos em suínos, passa pelo mesoderma visceral conectando os pedúnculos tanto do saco 146 vitelino e do alantoide no intestino posterior. Com a chegada nas cristas genitais, as células germinativas primordiais multiplicam-se por certo período (o tempo varia entre as espécies) até que seja iniciada a meiose (em fêmeas) ou entrar em bloqueio da mitose até a puberdade (no caso de machos; Cap. 4). Resumo Durante a gastrulação, o epiblasto forma a linha primitiva, por meio do qual as células involuem para formar o endoderma, o mesoderma e as células germinativas primordiais. O epiblasto remanescente origina o ectoderma. O primeiro órgão a formar-se no embrião em desenvolvimento é o sistema nervoso central, proveniente do ectoderma. Durante a neurulação, o neuroectoderma é formado e origina o tubo neural que ao final diferencia-se em vesículas cerebrais e a medula espinhal. Antes do fechamento do tubo neural, uma população de células da crista neural é destacada. Esta população de células especializadas participa da formação de diversos tecidos dentre eles componentes do sistema nervoso central, entérico e periférico. Após a diferenciação do neuroectoderma, a região da camada germinativa do ectoderma ainda remanescente forma o ectoderma superficial dando origem à epiderme que inclui cabelos, chifres, garras, cascos e glândulas subcutâneas. O endoderma origina o trato gastrointestinal, trato respiratório, partes do sistema urinário, partes do ouvido médio, o parênquima da glândula tireoide, as glândulas paratireoides, o fígado e pâncreas, e o estroma reticular das tonsilas e timo. O mesoderma é dividido em mesoderma paraxial, intermediário e mesoderma lateral. Na região cranial, o mesoderma paraxial forma pares de somitômeros que mais tarde irão participar da formação da cabeça. Mais caudalmente, os somitômeros formam somitos. Cada somito origina um esclerótomo, um miótomo e um dermátomo. O esclerótomo forma a base do esqueleto axial (a coluna vertebral). Do miótomo formam-se a parede do corpo, os membros e a musculatura epaxial. O dermátomo origina a derme e a hipoderme da pele. O sistema urogenital é derivado do mesoderma intermediário. Essenciais para a o sistema genital são as células germinativas primordiais; formadas no início da gastrulação, essas células são alocadas para o saco vitelino e alantoide durante a formação da camada germinativa, e são finalmente incorporadas nas cristas genitais provenientes do mesoderma intermediário. O mesoderma lateral divide-se nas camadas somática e visceral formando assim o celoma intraembrionário. O mesoderma somático associa-se ao trofoectoderma, formando o cório, e também ao 147 ectoderma superficial para formar a somatopleura. Do mesmo modo, o mesoderma visceral associa-se ao endoderma, formando a esplâncnopleura. A somatopleura forma a membrana parietal serosa das cavidades do corpo, incluindo o peritônio, pleura e pericárdio, enquanto que a esplâncnopleura origina as membranas serosas que recobrem os órgãos internos. O sangue e vasos sanguíneos, a região cortical das adrenais e baço também são derivados do mesoderma. Leituras adicionais Barends P.M.G., Stroband H.W.J., Taverne N., te Kronnie G., Leën M.P.J.M., Blommers P.C.J. Integrity of the preimplantation pig blastocyst during expansion and loss of polar trophectoderm (Rauber cells) and the morphology of the embryoblast as an indicator for developmental stage. J. Reprod. Fert. 1989;87:715– 726. Degrelle A.A., Campion E., Cabau C., Piumi F., Reinaud P., Richard C., Renard J.–P., Hue I. Molecular evidence for a critical period in mural trophoblast development in bovine blastocysts. Dev. Biol. 2005;288:448–460. Fléchon J.–E., Degrouard J., Fléchon B. Gastrulation events in the prestreak pig embryo: ultrastructure and cell markers. Genesis. 2004;38:13–25. Gilbert S.F. Developmental Biology, 8th edn. Sinauer Associates, Inc., Publishers: Sunderland, Massachusetts, 2006. Maddox-Hyttel P., Alexopoulos N.I., Vajta G., Lewis I., Rogers P., Cann L., Callesen H., Tveden-Nyborg P., Trounson A. Immunohistochemical and ultrastructural characterization of the initial post-hatching development of bovine embryos. Reproduction. 2003;125:607–623. Ohta S., Suzuki K., Tachibana K., Tanaka H., Yamada G. Cessation of gastrulation is mediated by supression of epithelial-mesenchymal transition at the ventral ectodermal ridge. Development. 2007;134:4315–4324. Robb L., Tam P.P.L. Gastrula organiser and embryonic patterning in the mouse. Semin. Cell Dev. Biol. 2004;15:543–554. Sadler T.W. Langman’s Medical Embryology, 10th edition. Lippincott Williams and Wilkins: Baltimore, Maryland, USA, 2006. Stern C.D. Gastrulation. From cells to embryo. Cold Spring Harbor, New York: Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2004. Vejlsted M., Du Y., Vajta G., Maddox-Hyttel P. Post-hatching development of the porcine and bovine embryo – defining criteria for expected development in vivo and in vitro. Theriogenology. 2006;65:153–165. 1 Nota da Revisão Científica: O processo de involução consiste na interiorização de uma camada externa em expansão de modo a recobrir a superfície interna das células externas remanescentes. 148 Capítulo 8 Neurulação Fred Sinowatz A neurulação é um evento fundamental da embriogênese. Ela leva à formação do tubo neural, o precursor do sistema nervoso central, incluindo o cérebro e a medula espinhal. Este sistema de órgãos é o primeiro a iniciar seu desenvolvimento; funcionalmente, contudo, este é ultrapassado pelo desenvolvimento do sistema vascular, o qual é o primeiro sistema de órgãos a ganhar função. Formação do tubo neural: neurulação primária e secundária Durante a neurulação, a qual é convencionalmente dividida em fases primária e secundária, o epiblasto é induzido a formar o ectoderma neural (Fig. 8-1). O primeiro sinal morfológico da neurulação primária é um espessamento dorsal do ectoderma anterior, concomitante com a regressão da linha primitiva. Esta região elíptica de ectoderma espessado especializado é referida como placa neural. Subsequentemente, a placa neural passa por uma remodelagem, a qual a converte em uma estrutura mais alongada e com formato de buraco de fechadura, com a região anterior mais larga e a posterior mais estreita. A principal força motriz da remodelagem da placa neural parece vir das extensões convergentes que causam um movimento relativo dirigido medialmente de células, com intercalação na linha média. Isto leva a um alongamento e estreitamento da placa neural. A modelagem da placa neural é seguida pelo desenvolvimento de duas elevações laterais, as pregas neurais, em cada lado de uma região medial referida como sulco neural. Em suínos e bovinos, as pregas neurais tornam-se evidentes durante a terceira semana de desenvolvimento. O desenvolvimento das pregas neurais anteriores parece ser altamente dependente do mesênquima subjacente, o qual se prolifera e expande pronunciadamente, com um notável aumento em seus espaços extracelulares, à medida que a elevação das pregas inicia-se. Na porção espinhal do tubo neural, a expansão da elevação da prega neural paraxial não é acompanhada pela elevação do mesênquima. 149 Fig. 8-1 Desenvolvimento do tubo neural e da crista neural. Os bordos laterais da placa neural são elevados e tornam-se as pregas neurais. A região média deprimida da placa neural é chamada sulco neural. As pregas neurais continuam a se elevar, justapõem-seà linha média e fundem-se para criar o tubo neural, o qual se torna coberto pelo futuro ectoderma epidérmico. À medida que as pregas neurais elevam-se e fundem-se, as células nos bordos laterais do neuroectoderma (células da crista neural) começam a se dissociar de seus vizinhos, passando por uma transição epitélio-mesenquimal e deixam o neuroectoderma. 1: Ectoderma superficial; 2: Placa neural; 3: Sulco neural; 4: Crista neural; 5: Tubo neural; 6: Gânglio espinhal; 7: Neuróporo anterior; 8: Neuróporo posterior; 9: Notocorda; 10: Nodo primitivo; 11: Linha primitiva; 12: Somitos. As pregas neurais continuam a elevar-se, justapostas à linha média e, por fim, fundem-se para criar o tubo neural, o qual se torna coberto pelo ectoderma superficial que irá desenvolver-se na futura epiderme. Este processo é facilitado pelo citoesqueleto (microfilamentos e microtúbulos) das células da placa neural e por forças extrínsecas dos tecidos paraxiais e notocordal subjacentes. Esta neurulação primária cria o cérebro e a maior parte da medula espinhal. No bulbo caudal, o tubo neural é formado pela neurulação secundária. Este é um mecanismo diferente, sem dobramentos neurais, no qual a medula espinhal inicialmente forma uma massa sólida de células epiteliais e um lúmen central desenvolve-se secundariamente por cavitação. A transição da neurulação primária para a secundária ocorre no futuro nível sacral superior. Dobramento da placa neural e aposição das pregas neurais 150 O dobramento da placa neural, o qual é observado durante a neurulação primária, ocorre em três sítios principais: o ponto de articulação mediano (MHP), sobrejacente à notocorda, e os pontos de articulação dorsolaterais pareados (DLHP) nos pontos de junção do ectoderma superficial à porção externa de cada prega neural. O ponto de articulação mediano é induzido por sinais da notocorda e é o único sítio de dobramento na placa neural espinhal superior. Gradualmente, as pregas neurais aproximam-se uma da outra na linha média, onde elas finalmente se fundem. Os filamentos de actina das células neuroepiteliais desempenham um papel significativo na neurulação anterior. Isto se tornou aparente com dados de camundongos transgênicos e de estudos usando citocalasina (uma droga que despolimeriza os microfilamentos de actina) a qual, em diversas espécies, mostrou que o fechamento do tubo neural, especialmente na porção anterior, é altamente dependente do citoesqueleto de actina. A neurulação espinhal, por sua vez, é mais resistente à ruptura dos microfilamentos de actina. Protrusões celulares estendem-se das células apicais das pregas neurais à medida que elas se aproximam umas das outras na linha média dorsal e se interdigitam à medida que as pregas entram em contato. Isto possibilita um primeiro reconhecimento célula a célula e fornece uma adesão inicial, seguido do estabelecimento posterior de contatos celulares permanentes. Fusão das pregas neurais A fusão inicia-se na região cervical e procede anterior e posteriormente deste ponto. Esta fusão é mediada por glicoconjugados de superfície celular. Como resultado destes processos, o tubo neural é formado e separado do folheto ectodérmico sobrejacente. Até que a fusão esteja completa, as extremidades anterior e posterior do tubo neural comunicam-se com a cavidade amniótica por duas aberturas, os neuróporos anterior e posterior. O fechamento do neuróporo anterior ocorre no embrião bovino aproximadamente ao dia 24 (estágio dos somitos 18 a 20), enquanto que o neuróporo posterior fecha-se dois dias depois (estágio do somito 25). A neurulação está então completa. O sistema nervoso central é representado neste momento por uma estrutura tubular fechada com uma porção posterior estreita, o primórdio da medula espinhal e uma porção cefálica muito mais larga, o primórdio do encéfalo. Durante a neurulação, o neuroepitélio é totalmente proliferativo; as células deixam o ciclo celular e iniciam a diferenciação neuronal somente após o completo fechamento do tubo neural. Apoptose durante a neurulação 151 Durante a neurulação, a proliferação celular também é acompanhada por algum grau de apoptose no neuroepitélio. A taxa de apoptose parece estar precisamente ajustada e parece ser igualmente prejudicial se a intensidade da apoptose está aumentada ou diminuída. A apoptose excessiva perturba a neurulação anterior deixando poucas células com funcionamento normal para a morfogênese, mas também existem dados que indicam que a redução da morte celular devido à pouca apoptose pode levar a defeitos do fechamento do tubo neural. A apoptose nas extremidades das pregas neurais pode desempenhar uma função especial. Após as pregas neurais opostas terem feito contato e aderido uma à outra, o remodelamento epitelial da linha média por apoptose quebra a continuidade entre o neuroepitélio e o ectoderma superficial. A inibição da apoptose produz defeitos de tubo neural, provavelmente prevenindo este remodelamento da linha média dorsal. Crista neural Formação da crista neural À medida que as pregas neurais elevam-se, células do bordo ou da crista lateral do neuroepitélio, a crista neural, passam por uma transição epitélio-mesenquimal à medida que elas deixam o neuroectoderma em direção ao mesoderma subjacente através de migração ativa (Fig. 8-1). A indução de células da crista neural requer interações entre o ectoderma neural e o ectoderma superficial sobrejacente. A especificação das células da crista neural é resultado de uma instrução indutiva do ectoderma superficial. A instrução é possivelmente mediada por um gradiente da proteína morfogenética óssea 4 (BMP4), BMP7 e Wnt. As proteínas morfogenéticas ósseas secretadas pelo ectoderma superficial iniciam este processo. Uma vez estimuladas, as células da crista neural expressam a proteína Slug, um fator de transcrição da família das Zinc Finger que caracteriza as células que se separam da camada de células embrionárias para migrar como células mesenquimais. A migração de células da crista neural e a neurulação estão temporal e espacialmente relacionadas nas porções anteriores do tubo neural, mas no mesencéfalo e no rombencéfalo as células da crista neural começam a se separar dos ápices das pregas neurais e começam a migrar muito à frente do fechamento do tubo neural. Em contraste, na região da medula espinhal, a migração de células da crista neural inicia-se após várias horas após o completo fechamento do tubo neural espinhal. Migração de células da crista neural 152 As vias pelas quais as células da crista neural deixam o tubo neural depende da região. As células da crista em migração dão origem a um arranjo de células e tecidos heterogêneos. As células da crista neural que deixam as porções anteriores das pregas neurais, antes do fechamento do tubo neural nesta região, contribuem com o esqueleto craniofacial e outros derivados mesenquimais, mas também podem diferenciar-se em diversos outros tipos celulares incluindo neurônios dos gânglios craniais, células de Schwann e melanócitos (Tabela 8-1). Tabela 8-1 Principais derivados da crista neural cranial e circunfaringeal Sistema nervoso sensorial Gânglios do nervo trigeminal (V), nervo facial (VII), glossofaríngeo (gânglio superior), nervo vago (gânglio jugular) Sistema nervoso autônomo Gânglios parassimpáticos; ciliar, etmoidal, esfenopalatino, submandibular, visceral Células satélite dos gânglios sensoriais, células de Schwann dos nervos periféricos, leptomeninges do prosencéfalo e parte do mesencéfalo Células endócrinas Corpo carotídeo, células parafoliculares da tireoide Células pigmentadas Melanócitos Células mesectodérmicas Calota craniana (escamoso e parte do osso frontal), ossos nasal e orbital, parte da cápsula ótica, palato, maxila, cartilagem visceral, parte da cartilagem auricular externa Tecido conjuntivo Derme e adipócitos da pele, córnea do olho, odontoblastos, estroma das glândulas (tireoide, paratireoide, timo, salivar, lacrimal), vias de saída do coração, valvas cardíacas semilunares,paredes da aorta e artérias derivadas do arco aórtico Músculos Músculos ciliares; músculos lisos dérmicos, músculos lisos cardíacos As células da crista neural separam-se da placa neural ou do tubo neural mudando sua forma e alterando as propriedades típicas de células neuroepiteliais para aquelas típicas de células mesenquimais. Na região da cabeça, células incipientes da crista neural emitem processos que penetram a lâmina basal subjacente ao epitélio neural. Após a degradação adicional da lâmina basal, as células da crista neural, neste momento com aparência mesenquimal, atravessam os remanescentes da lâmina basal e migram para o mesênquima circunjacente. Uma alteração significante que acompanha a transição epitélio-mesenquimal é sua perda de adesividade celular devido à perda de moléculas de adesão (CAMs), características do tubo neural (p. ex., a N-CAM e a N-caderina). Após deixar o neuroepitélio, as células da crista neural encontram um ambiente relativamente pobre em células, mas rico em moléculas de matriz extracelular. Neste ambiente especializado, as células da crista neural migram ao longo de diversas vias bem definidas a ponto de serem influenciadas tanto por propriedades intrínsecas das células como pelo ambiente no qual elas se encontram. 153 A migração é sustentada pelos componentes da matriz extracelular: moléculas encontradas na lâmina basal, tais como a fibronectina, a laminina e o colágeno tipo IV. A ligação com este substrato de moléculas e a migração sobre este é mediada pela ação de integrinas (uma família de moléculas de adesão) sobre as células em migração. Equilibrando esse processo, outras moléculas da matriz extracelular, tais como os proteogliganos de sulfato de condroitina, inibem a migração de células da crista neural. Crista neural anterior As células da crista neural na cabeça e no tronco em desenvolvimento (Fig. 8-2) seguem vias de migração diferentes. A crista neural anterior é um importante componente da extremidade encefálica do embrião em desenvolvimento. Pesquisas comparativas da anatomia e do desenvolvimento sugerem que a crista neural anterior é o principal substrato morfológico para a evolução da cabeça dos vertebrados. Deixando o neurotubo nascente muito antes da fusão das pregas neurais, as células da crista neural anterior migram em correntes difusas pelo mesênquima anterior para alcançar sua destinação final na cabeça em desenvolvimento, seus trajetos controlados por diferenças locais na matriz extracelular. Fig. 8-2 Vias migratórias das células da crista neural na região da cabeça (modificado de Sadler, 2006) As células que deixam a crista neural migram e formam estruturas da face e do pescoço. 1-6: Arcos faríngeos; V, VII, IX e X: Placódios epibranquiais. Reproduzido com permissão de Lippincott Williams & Wilkins. As origens da crista neural no rombencéfalo anterior influenciam significativamente suas destinações finais dentro dos arcos faríngeos (Cap. 14), e a expressão de certos produtos gênicos. As células da crista neural dos rombômeros 1 e 2 migram para o primeiro arco faríngeo e formam a maior parte de seu mesênquima. As células da crista neural do rombômero 4 migram para o segundo arco e aqueles dos rombômeros 6 e 7 para o terceiro arco. Uma correlação estreita 154 pode ser demonstrada entre os padrões de migração das células da crista neural rombomérica e a expressão de produtos do complexo de genes HoxB (Cap. 14). Os produtos dos genes HoxB-2, HoxB-3 e HoxB-4 são expressos em uma sequência regular tanto no tubo neural quanto no mesênquima derivado da crista neural do segundo, terceiro e quarto arcos faríngeos, mas não no rombômero 2, nem no mesênquima do primeiro arco faríngeo. Após os arcos faríngeos terem sido povoados com células da crista neural, o ectoderma sobrejacente aos arcos também expressa um padrão similar de produtos gênicos HoxB. Estas interações entre as células da crista neural e o ectoderma superficial dos arcos faríngeos pode influenciar como o ectoderma dos arcos diferenciam-se. Assumiu-se por muito tempo que, em contraste com as células da crista neural do tronco, as células da crista neural anterior eram pré-programadas, já tendo recebido instruções morfogenéticas distintas antes que elas deixassem o tubo neural. Entretanto, experimentos recentes mostraram que fatores ambientais desempenham um papel decisivo na determinação do destino das células da crista neural anterior: muitas das influências regionais sobre sua diferenciação hoje são reconhecidas como o resultado de interações encontradas durante a migração. As células da crista neural anterior diferenciam-se em uma ampla variedade de tipos celulares e teciduais (Tabela 8-2; Caps. 14 e 16), incluindo o tecido conjuntivo e esquelético da cabeça. Tabela 8-2 Principais derivados da crista neural do tronco Sistema nervoso sensorial Gânglios espinhais Sistema nervoso autônomo Gânglios da cadeia simpática, gânglios celíacos e mesentéricos, plexos visceral e pélvico, células de Schwann de nervos periféricos, células satélites de gânglios sensoriais, células gliais entéricas Células endócrinas Medula adrenal, células neurossecretórias do coração e dos pulmões Células pigmentadas Melanócitos Células mesectodérmicas Nenhum Tecido conjuntivo Nenhum Músculos Nenhum Crista neural circunfaringeana A crista neural circunfaringeana surge da região rombencefálica posterior e da 155 porção inferior da faringe. As células desta região migram em direção aos intestinos (células da crista neural vagal parassimpática, que se originam no nível dos somitos um a sete) e do coração (células da crista neural cardíaca, que se originam do rombencéfalo anterior no nível do somito cinco), onde eles contribuem significativamente com as vias de saída cardíacas (Cap. 12). As células da crista neural vagal migram para os intestinos em desenvolvimento como precursores dos neurônios parassimpáticos do trato digestivo. Eles migram posteriormente até que, junto com células da crista neural da região sacral, povoem a total extensão dos intestinos. Estas células formam os plexos submucoso e mioentérico. As células da crista neural cardíaca contribuem maciçamente com as pregas troncoconais que separam as vias de saída do coração para os segmentos aórtico e pulmonar, com os folhetos das valvas semilunares na base das vias de saída e com as paredes das artérias coronárias proximais próximas de suas junções com a aorta ascendente (Cap. 12). Elas também podem modificar os sinais que levam à diferenciação normal das células miocárdicas. As células da crista neural cardíaca também podem diferenciar-se nas células de Schwann dos nervos craniais. Uma fração significativa da população da crista neural cardíaca torna-se associada a outros órgãos, incluindo o timo e as glândulas paratireoide e tireoide. Diversas anomalias severas destes órgãos resultam de deficiências da crista neural cardíaca. Uma destas é a síndrome de DiGeorge, causada por uma deleção do cromossomo 22 em humanos. Esta síndrome é caracterizada por hipoplasia e função reduzida do timo, das glândulas tireoide e paratireoide, assim como defeitos cardiovasculares, tais como tronco arterioso persistente e anomalias dos arcos aórticos. As células da crista neural circunfaringeana também migram ventralmente à faringe. Ali elas acompanham os mioblastos derivados dos somitos que migram anteriormente para formar os músculos intrínsecos da língua e os músculos hipofaríngeos e também contribuem com o tecido conjuntivo destes músculos. Um distúrbio das células da crista cardíaca nesta região pode resultar em defeitos septais cardíacos (septo aorticopulmonar) assim como malformações glandulares e craniofaciais. Crista neural do tronco A crista neural do tronco estende-se do sexto somito aos somitos mais posteriores. Dentro do tronco, três principais vias migratórias das células da crista neural podem ser discernidas. Uma delas é uma via dorsolateral entre o ectoderma e os somitos. As células que seguem esta via dispersam-sesob o ectoderma e por fim o adentram 156 como células pigmentadas (melanócitos). Na segunda via ventromedial, células da crista neural inicialmente movem-se para o espaço entre os somitos e o tubo neural na metade anterior do embrião. A via continua por sob a superfície ventromedial dos somitos, levando as células em migração à aorta dorsal. As células que usam este ramo pertencem à linhagem simpatoadrenal e contribuem com o sistema nervoso simpático e com a medula adrenal. Uma terceira via ventrolateral segue para as metades anteriores dos somitos. As células que seguem esta via formam os gânglios espinhais e sensoriais arranjados por segmentos. A linhagem simpatoadrenal é derivada de células progenitoras simpatoadrenais comprometidas que já passaram por uma série de pontos de restrição de forma que eles não formam mais neurônios sensoriais, glia ou melanócitos. Estas células progenitoras dão origem a quatro tipos de progênie celular: (1) células cromafins adrenais, (2) células pequenas, intensamente fluorescentes encontradas nos gânglios simpáticos, (3) neurônios simpáticos adrenérgicos e (4) uma pequena população de neurônios simpáticos colinérgicos. Um tanto mais abaixo nesta linhagem celular, uma célula progenitora bipotencial que pode dar origem tanto a células cromafins adrenais ou neurônios simpáticos é encontrada. As células progenitoras bipotenciais já possuem alguns traços neuronais, mas a diferenciação final depende de seu ambiente. Na presença de fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento de nervos (NGF) nos primórdios dos gânglios simpáticos, estes precursores diferenciam-se em neurônios simpáticos definitivos. Por sua vez, se as células precursoras na medula adrenal em desenvolvimento encontram glicocorticoides secretados por células corticais adrenais, eles perdem suas propriedades neuronais e diferenciam-se em células adrenais cromafins. Contudo, esta escolha não é absoluta, as células cromafins podem ser estimuladas após o nascimento para se transdiferenciarem em neurônios se elas forem expostas a NGF in vitro. Toda a extensão dos intestinos é povoada por neurônios parassimpáticos derivados da crista neural e células associadas, a glia entérica. Estes surgem de células da crista neural nos níveis cervical (vagal) e sacral, os quais, sob influência do fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), migram extensivamente ao longo dos intestinos em desenvolvimento. As células da crista neural sacral colonizam o intestino distal, mas mesmo ali elas formam somente uma pequena porção dos neurônios entéricos; a maior parte é derivada de células da crista neural vagal. Dentro dos intestinos, as células da crista neural formam o sistema nervoso entérico, o qual em muitos aspectos atua como um componente independente do sistema nervoso. O número de neurônios entéricos praticamente equivale ao número 157 de neurônios na medula espinhal e a maioria deles não está diretamente conectado ao cérebro ou à medula espinhal. Esta independência explica como o intestino consegue manter a atividade reflexa na ausência de estímulos oriundos do sistema nervoso central. As células da crista neural não estão comprometidas com a formação do tecido nervoso associado às vísceras antes de deixar a medula espinhal. Experimentalmente, caso a crista neural vagal seja substituída pela crista neural do tronco (que normalmente não dão origem a derivados associados aos intestinos), o intestino é colonizado pelas células transplantadas da crista neural do tronco. Evidências de que as vias de migração afetam a diferenciação são observadas nos neurotransmissores produzidos por estas células da crista transplantada. Dessa forma, os neurônios parassimpáticos diferenciados de células da crista do tronco ectopicamente transplantado produzem serotonina, e não catecolaminas, nos intestinos. Caso eles tivessem se diferenciado em seus sítios normais no tronco, estes neurônios iriam produzir catecolaminas, e não serotonina. Apesar da forte influência do ambiente do intestino na diferenciação das células da crista neural, as células mantêm um surpreendente nível de flexibilidade de seu desenvolvimento. Caso células derivadas da crista que já estivessem no intestino de embriões de aves sejam retransplantadas para a região do tronco de embriões mais jovens, elas aparentemente perdem a memória de sua associação prévia com o intestino. Elas adentram a via comum para todas as células da crista do tronco (com a exceção das vias das células pigmentadas) e diferenciam-se de acordo. A maior parte dos precursores da crista neural dos neurônios parassimpáticos associados a intestinos expressam o fator de transcrição hélice-alça-hélice, Mash 1, o qual também é expresso nos precursores dos neurônios simpáticos, mas não nos sensoriais. A expressão do Mash 1, a qual aparentemente mantém a competência das células pós-migratórias no intestino em se diferenciarem em neurônios, é estimulada pelo fator de crescimento BMP2 e BMP4. Outros fatores ambientais são necessários para o total comprometimento destas células para formarem neurônios autonômicos. Comparados com a crista neural anterior, a crista neural do tronco possui uma variedade relativamente limitada de opções de diferenciação. Os derivados da crista neural do tronco estão resumidos na Tabela 8-2. Origens filogenéticas da crista neural Filogeneticamente, a crista neural é uma característica típica dos vertebrados. Seus derivados são geralmente considerados como homólogos com os plexos nervosos epidermais e viscerais encontrados em não vertebrados. Desse modo, é assumido que a crista neural surgiu como resultado da centralização dos sistemas nervosos 158 observados nos vertebrados. Durante a evolução, os vertebrados também desenvolveram órgãos sensoriais especiais e estruturas locomotoras. Para proteger e sustentar estas “novas” aquisições, estruturas esqueléticas também se desenvolveram. Dessa maneira, pode se assumir que a crista neural dos vertebrados evoluiu como o resultado de alterações no sistema nervoso e da necessidade de se proteger estruturas para os órgãos sensoriais especiais e os músculos. Com isto em mente, não é surpreendente que as células da crista neural possuam dois destinos de desenvolvimento: eles formam elementos ganglionares e estruturas de suporte do sistema nervoso periférico e eles podem se diferenciar em mesênquima (ectomesênquima). Dependendo do nível no qual as células da crista neural começam a migrar, os destinos de desenvolvimento diferem: crista neural anterior, formada anterior ao somito sete, pode formar neurônios e ectomesênquima. Crista neural do tronco, posterior ao somito sete, forma estruturas neurais e somitos mas, sob condições fisiológicas, não formam ectomesênquima. Resumo Durante a neurulação primária, a placa neural é formada na porção anterior do epiblasto. Subsequentemente, as pregas neurais definem o sulco neural e o tubo neural. A porção posterior do tubo neural é formada por neurulação secundária onde um cordão neural sólido desenvolve um lúmen secundariamente. As extremidades anterior e posterior do tubo neural comunicam-se com a cavidade amniótica pelos neuróporos anterior e posterior que se fecham posteriormente. À medida que as pregas neurais se elevam, as células do bordo lateral da crista do neuroepitélio, a crista neural, passam por uma transição epitélio- mesenquimal à medida que elas deixam o neuroectoderma para adentrar o mesoderma subjacente por migração ativa. A crista neural é agora considerada uma população de células-tronco pluripotentes que promove contribuições vitais para uma ampla variedade de sistemas de órgãos neuronais e não neuronais. As células da crista neural migram para sítios periféricos por todo o corpo. Elas se diferenciam em muitos tipos celulares, tais como neurônios, células gliais do sistema nervoso periférico, melanócitos e células adrenais medulares. As células da crista neural cranial e circunfaringeal também se diferenciam em células cartilagíneas, ósseas,dentina, fibroblastos dérmicos, células musculares lisas, estroma de glândulas faríngeas e diversas estruturas do coração e dos grandes vasos. Células da crista neural no tronco tomam três principais vias para sua migração: uma via dorsolateral para os melanócitos, uma via ventral para células da linhagem 159 simpatoadrenal e uma via ventrolateral passando pelas metades anteriores dos somitos para células que formam os gânglios sensoriais. Em contraste com as células das cristas neurais cranial e circunfaringeal, as células da crista neural do tronco não são capazes de diferenciar-se em elementos esqueléticos. Quadro 8-1 Formação da crista neural e migração das células da crista neural A formação da crista neural é induzida por interações da placa neural com o mesoderma paraxial ou com o ectoderma não neural. Diversas vias de sinalização estão presentes na região entre o ectoderma neural e o não neural onde a crista neural é estabelecida. Entre as moléculas identificadas neste processo estão membros das famílias de sinalização BMP, Wnt, FGF e Notch. A ação orquestrada destes sinais e seus alvos posteriores definirão a identidade da crista neural. Apesar de a crista neural ser uma inovação dos vertebrados, resultados de genômica comparada sugerem que suas propriedades migratórias evoluíram pela utilização de programas que já estavam presentes em ancestrais comuns aos vertebrados e aos invertebrados. Vários mecanismos controlam a migração de células da crista neural nas diferentes regiões do corpo. No tronco, interações célula-célula predominam e os somitos mesodérmicos controlam o padrão rostro-caudal das células da crista neural. A notocorda impede que células da crista neural cruzem a linha média. No rombencéfalo, a migração segmental de células da crista neural é influenciada tanto pela informação inerente aos rombômeros e os sinais ambientais dos tecidos adjacentes, como pela vesícula ótica. Existe claramente uma relação íntima entre as células da crista neural em migração, o tubo neural dos quais elas emergem e tecidos pelos quais elas se movem. O programa de desenvolvimento que determina o destino das células da crista neural é tanto fixo quanto plástico: fixo no sentido de que um grupo de células da crista neural carrega informações que dirigem o padrão axial e a morfologia espécie-específica da cabeça e da face; plástico porque, como células individuais, as células da crista neural são responsivas a sinais umas das outras, assim como de tecidos não oriundos da crista neural presentes no ambiente. Leituras adicionais Anderson D.J. Cellular and molecular biology of neural crest cell lineage determination. Trends Genet. 1997;13:276–280. Barrallo-Gimeno A., Nieto M.A. Evolution of the neural crest. Adv. Exp. Med. Biol. 2006;589:235–244. Basch M.L., Bronner-Fraser M. Neural crest inducing signals. Adv. Exp. Med. Biol. 2006;589:24–31. Bronner-Fraser M. Patterning of the vertebrate neural crest. Perspect. Dev. Neurobiol. 1995;3:53–62. Dupin E., Creuzet S., Le Douarin N.M. The contribution of the neural crest to the vertebrate body. Adv. Exp. Med. Biol. 2006;589:96–119. 160 Farlie P.G., McKeown S.J., Newgreen D.F. The neural crest: basic biology and clinical relationships in the craniofacial and enteric nervous systems. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 2004;72:173–189. Kee Y., Hwang B.J., Sternberg P.W., Bronner-Fraser M. Evolutionary conservation of cell migration genes: from nematode neurons to vertebrate neural crest. Genes Dev. 2007;21:391–396. Maschoff K.L., Baldwin H.S. Molecular determinants of neural crest migration. Am. J. Med. Genet. 2000;97:280–288. Noden D.M., Schneider R.A. Neural crest cells and the community of plan for craniofacial development: historical debates and current perspectives. Adv. Exp. Med. Biol. 2006;589:1–23. Patterson P.H. Control of cell fate in a vertebrate neurogenic cell lineage. Cell. 1990;62:1035–1038. Sandell L.L., Trainor P.A. Neural crest cell plasticity. Size matters. Adv. Exp. Med. Biol. 2006;589:78–95. Trainor P.A., Krumlauf R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 2001;13:698–705. 161 Capítulo 9 Placentação comparada Morten Vejilsted Na cavidade uterina, o embrião é nutrido, inicialmente, pela secreção das glândulas uterinas. Estes produtos são conhecidos como histotrofos ou leite uterino. Entretanto, no decorrer do desenvolvimento, esta nutrição torna-se inadequada. Para contrabalancear a insuficiência nutricional o próprio embrião estabelece uma conexão entre os tecidos embrionários, os quais são vascularizados pelo próprio embrião, e pelo sistema circulatório materno. Este fato permite ao embrião importar nutrientes maternos do sangue, hemotrofo, e exportar seus próprios dejetos. Juntos, histotrofos e hemotrofos são denominados embriotrofo. Para realizar as trocas materno-fetais um órgão temporário, a placenta, é formado pela contribuição dos tecidos embrionários e maternos. Como será explicado a seguir, a formação da placenta (placentação) necessita sincronizar os locais de receptividade uterina e do desenvolvimento embrionário. Em roedores e primatas, os blastocistos eclodidos fixam-se no epitélio endometrial e, devido à invasão natural do trofoectoderma nestas espécies, o embrião penetra no epitélio e invade o tecido conjuntivo no qual ele se torna completamente embebido. Este processo, pelo qual o embrião deixa o lúmen uterino, é conhecido como implantação. Nos animais domésticos, entretanto, o embrião permanece fixado à superfície endometrial interna ao longo de toda a gestação e, exceto nos carnívoros, a placentação é não invasiva. Desenvolvimento do concepto peri-implantação Na maioria dos animais domésticos, o embrião alcança a cavidade uterina antes da blastulação (Cap. 6). No fim da blastulação, o embrião consiste em uma esfera de trofoectoderma circundando a massa celular interna e a cavidade blastocística (Fig. 9-1). Quando atrelado à formação da placenta, o trofoectoderma é denominado trofoblasto. Como a maioria dos tecidos extraembrionários, o trofoblasto é essencial durante a vida intrauterina, entretanto, ele é expelido no parto como parte da placenta. 162 Fig. 9-1 Desenvolvimento das membranas extraembrionárias apresentadas em seções longitudinais progressivas dos embriões (A a F). 1: Massa celular interna; 2: Trofoectoderma; 3: Cavidade blastocística; 4: Epiblasto; 5: Hipoblasto; 6: Mesoderma intrauterino; 7: Endoderma; 8: Mesoderma extraembrionário somático; 9: Mesoderma extraembrionário visceral; 10: Saco vitelino primitivo; 11: Intestino primitivo; 12: Alantoide; 13: Saco vitelino definitivo; 14: Celoma extraembrionário; 15: Cório; 16: Esplanopleura; 17: Fusão entre a parede do saco vitelino e o cório permitindo a formação da placenta coriovitelina; 18: Cavidade amniótica: 19: Mesoâmnio; 20: Corioalantoide permitindo a formação da placenta corioalantoide. G: Em bovinos e suínos, o cório e a porção dorsal da parede do âmnio permanece fusionada no mesoâmnio. H: Em equinos e cão, o alantoide circunda completamemte o âmnio. 163 No momento da eclosão da zona pelúcida, a massa celular interna diferencia-se em epiblasto e hipoblasto (Fig. 9-1). O hipoblasto gradualmente forma um revestimento interno do epiblasto e do trofoectoderma. Quando formada, a cavidade fechada pode ser denominada saco vitelino primitivo, análogo ao saco vitelino encontrado nos embriões de aves. O processo de gastrulação resulta no estabelecimento das três camadas germinativas: endoderma, mesoderma e ectoderma (Cap. 7). Durante este processo, o endoderma gradualmente desloca o hipoblasto sob o epiblasto. Entretanto, o mesoderma extraembrionário divide-se nas lâminas somática (ou parietal) e visceral (ou esplâncnica) revestindo o celoma extraembrionário. O mesoderma somático extraembrionário associado a trofoectoderma origina o cório, enquanto o mesoderma visceral juntamente com o hipoblasto e endoderma formam a esplancnopleura. Por fim, do saco vitelino primitivo (Cap. 7),as dobras do corpo do próprio embrião resultam na formação do intestino primitivo e do saco vitelino definitivo. A parede do saco vitelino definitivo estabelece uma fusão com o cório em algumas espécies para formar a placenta coriovitelina. O alantoide se desenvolve da evaginação do intestino posterior (Fig. 9-1). A evaginação ocorre após a formação do saco vitelino definitivo e, devido a sua origem no intestino posterior, sua parede é composta internamente pelo endoderma e externamente pelo mesoderma visceral, as duas camadas juntas formam a esplancnopleura. Os vasos sanguíneos são formados, incialmente, no mesoderma visceral do saco vitelino, e este desenvolvimento permitirá posteriormente a vascularização do mesoderma visceral associado ao alantoide (Cap. 12). Em contrapartida, o mesoderma somático, incluindo aquele do cório, permanece inicialmente avascular. Com o desenvolvimento embrionário, o alantoide gradualmente expande-se no celoma extraembrionário, ocupando a maior parte da cavidade embrionária. O corioalantoide é formado da junção da parede do cório e do alantoide, o qual se torna gradualmente vascularizado dos vasos no mesoderma visceral alantoico originando a placenta corioalantoide. Mudanças no endométrio e reconhecimento materno da prenhez Durante o período de livre movimentação do embrião na cavidade uterina, o útero prepara-se para a placentação. Os estrógenos e a progesterona são os principais hormônios produzidos nos ovários (Cap. 3). Os altos níveis de estrógenos são secretados no sangue circulante durante o proestro e o estro (a fase folicular do ciclo estral); a progesterona predomina durante os períodos subsequentes de metaestro e diestro (fase luteal) quando o embrião move-se da tuba uterina para o útero. É nesta 164 fase do ciclo de produção de hormônios ovarianos que são estimuladas mudanças marcantes no endométrio, o revestimento interno do útero. Durante o proestro e o estro, o aumento dos níveis de estrógenos induz a proliferação das glândulas uterinas e ingurgitamento do estroma uterino com sangue (resultante de hiperemia e congestão) e fluido extracelular (edema). A genitália externa, notavelmente a vulva, torna-se edemaciada, a qual pode ajudar no diagnóstico do cio. Durante o metaestro, o edema endometrial diminui e alguns vasos congestos rompem-se. Este fenômeno denominado metrorragia pode conter sangue e corrimento vulvar, indicando, na vaca, que o estro já passou. A proliferação das glândulas endometriais continua durante o metaestro, e durante o diestro as glândulas alcançam um estado máximo de atividade secretória. Consequentemente, a secreção de glândulas uterinas é maior durante os primeiro onze dias de diestro, promovendo nutrição histotrófica ao embrião. Se a prenhez não ocorrer, segue a involução do endométrio, resultando na regressão do corpus luteum ou corpo lúteo. A luteólise deverá ser evitada se a prenhez continuar. A manutenção do corpo lúteo é baseada no reconhecimento materno da prenhez, no qual uma série de eventos depende do desenvolvimento sincronizado do embrião e de um endométrio receptivo. Para sinalizar a sua presença no útero, o embrião previne a luteólise enquanto se sobrepõe, e, então, adere-se ao endométrio. A eficiência da sinalização depende do grau de contato entre o trofoblasto e o endométrio, assegurado pelo alongamento do concepto nos ruminantes e suínos e por migração intrauterina nos equinos. Em ruminantes, o corpo lúteo produz ocitocina assim como progesterona. A ocitocina estimula o endométrio a sintetizar prostaglandina (PGF2α; Cap. 30) a qual tem sido identificada como a principal causa da luteólise em ruminantes (assim como em suínos e equinos). Nos ruminantes, o interferon-tau (IFN-t) é produzido pelo trofoectodema, inibindo a formação de receptores de ocitocinas. Portanto, na presença do embrião, a ocitocina não pode estimular a síntese de PGF2α e a luteólise é evitada. Além disso, o IFN-t estimula a produção de histotrofo das glândulas endometriais. Os suínos utilizam outras estratégias para interromper os caminhos da luteólise. Embora a ocitocina também seja produzida pelo corpo lúteo no suíno e promova síntese de PGF2α endometrial. O estradiol é produzido pelo trofoectoderma entre os dias 11 e 12 do desenvolvimento embrionário causando liberação de PGF2α no lúmen uterino em vez do fluxo sanguíneo materno. No lúmen, a PGF2α é rapidamente degradada. Além de modificar a secreção de PGF2α endócrina (circulação materna) para exócrina (lúmem uterino), acredita-se que o estrógeno também estimule as 165 contrações miometriais facilitando a distribuição dos embriões dentro dos longos cornos uterinos. Foi demonstrado que pelos menos quatro embriões devem estar presentes a fim de evitar a luteólise no suíno. Outra estratégia para a manutenção da prenhez é vista na égua. O contato direto célula a célula entre o trofoblasto e o endométrio é evitado até o dia 21 pela cápsula (veja a seguir) e é lentamente estabelecida após isto. A cápsula é capaz de tornar o concepto esférico do equino para migração ao longo de toda a superfície do endométrio entre 12 e 14 vezes por dia durante os dias 6 a 17 da prenhez a fim de evitar a luteólise. Esta migração tem se mostrado essencial para a manutenção da prenhez, entretanto, a natureza e o papel das trocas sinalizadoras com a égua ainda não estão completamente identificados e compreendidos. Considerando que a égua já reconhece a diferença entre o embrião e o ovócito não fertilizado na tuba uterina (“permitindo” apenas os embriões passarem no útero), pode ser inapropriado aplicar o termo reconhecimento da prenhez para equinos como até então é utilizado para ruminantes e suínos. Em carnívoros, também, um sinal para o reconhecimento materno da prenhez foi identificado. Nos caninos os períodos de metaestro e dietro são longos. Em condições normais estas fases do ciclo estral podem levar de 20 a 30 dias e, em muitos casos, a cadela não prenhe desenvolve uma síndrome denominada pseudoprenhez na qual o corpo lúteo mantém sua produção de progesterona por longos períodos. Na maioria dos casos há uma reversão do quadro, mas algumas vezes há uma necessidade de tratamento. Devido ao longo período do corpo lúteo, os sinais embrionários para o reconhecimento da prenhez podem ser menos importantes ou até desnecessários em cães. Portanto, o aumento dos níveis de hormônio pituitário luteotrófico, a prolactina, parece ser responsável pela manutenção do corpo lúteo no final da gestação de cadelas. Classificação da placenta Há grandes diferenças entre as espécies em relação ao início da placentação e, portanto, como sua arquitetura final se desenvolve. Várias formas diferentes de classificações da placenta, baseadas em uma variedade de critérios, foram propostas ao longo dos anos. Uma delas é baseada na natureza dos tecidos extraembrionários que contribuem para a formação da placenta, levando esta a ser classificada como coriovitelina ou corioalantoide. Na placenta coriovitelina, a parede do saco vitelino justapõe-se com o cório para formar uma área de trocas (Fig. 9-1). Nos animais domésticos uma placenta coriovitelina funcional é vista somente nos carnívoros e equinos. A placenta corioalantoide, considerada funcional primária 166 em todas as espécies domésticas, é estabelecida pela fusão entre a parede do alantoide e do cório estabelecendo assim o corioalantoide. Nos suínos e ruminantes, o saco vitelino involui 3 a 4 semanas após a concepção e nunca forma uma placenta funcional. Outra forma de classificação é baseada na estrutura da superfície corioalantoide e suas interações com o endométrio. As áreas onde o corioalantoide interage com o endométrio e se envolve na formação da placenta são denominadas cório frondoso. Por sua vez, as áreas onde o corioalantoide está livre, não envolvido na formação da placenta, de superfície lisa, são conhecidas como cório liso. Em suínos e equinos, o cório frondoso é difuso, distribuído completamente na superfície coriônica e, portanto, a placenta é categorizadacomo difusa. A área de superfície corioalantoide suína é aumentada por dobras reveladas com pregas primárias e rugas secundárias, e por isto denominada pregueada. Nos equinos, os vilos coriônicos são aglomerados em numerosas “microzonas” especializadas, conhecidas como microcotilédones, que se estendem nas criptas do endométrio, a placenta é também denominada vilosa. Em ruminantes, o cório frondoso é organizado em vilos coriônicos arborizados semelhantes a grandes tufos visíveis macroscopicamente denominados cotilédones. Sendo assim, a placenta é conhecida como cotiledonária, múltipla ou vilosa. Os cotilédones combinados com projeções do endométrio denominadas carúnculas, formam os placentônios, nos quais os vilos corioalantoides deste se estendem nas criptas das carúnculas. O cório liso está presente entre os cotilédones. Em carnívoros, o cório frondoso é organizado em uma ampla faixa estendida ao redor do eixo longitudinal do embrião onde se formam lamelas. Este tipo de placenta pode ser denominada zonária ou lamelar. Uma terceira forma de classificação é baseada no número de camadas teciduais que separam a circulação fetal e materna, deste modo, formando a barreira placentária (Fig. 9-2). Existem três camadas de membranas extraembrionárias na placenta corioalantoide: o endotélio revestindo os vasos sanguíneos alantoides; o mesênquima corioalantoide, originado da fusão somática (coriônico) e visceral (alantoico) do mesoderma; e o epitélio coriônico, ou seja, o trofoblasto. Entretanto, o número de camadas retidas na porção materna da placenta varia com a espécie. Antes da placentação, o endométrio apresenta três camadas que contribuirão para a formação da barreira placentária: o epitélio endometrial, o tecido conjuntivo e o endotélio vascular. 167 Fig. 9-2 A barreira placentária A: A placenta epiteliocorial na porca. B: A placenta sinepiteliocorial da vaca. C: A placenta endoteliocorial da cadela. D: A placenta hemocorial da camundonga. F: Componentes fetais da placenta; M: Componentes maternos da placenta; 1: Epitélio endometrial; 2: Vasos fetais; 3: Endotélio fetal; 4: Trofoblasto; 5: Mesênquima; 6: Vasos maternos; 7: Células binucleadas; 8: Células sanguineas vermelhas. A barreira placentária é indicada pelas setas duplas. Nos animais domésticos, o número de camadas maternas na barreira placentária resulta em duas principais classes de placenta: a epiteliocorial e a endoteliocorial. A primeira é encontrada em suínos, equinos e ruminantes. Os epitélios coriônico e endometrial estão sobrepostos, e não há perdas de tecidos maternos. A placenta epiteliocorial em ruminantes é modificada com células trofoblásticas especiais que estabelecem uma fusão com as células do endométrio. A placenta também é denominada sinepiteliocorial. Em carnívoros, por seu turno, a placenta é endoteliocorial, pois o epitélio endometrial e o tecido conjuntivo são perdidos durante a placentação, levando a um contato direto do trofoblasto com o endotélio vascular materno. Em roedores e humanos, a redução da barreira placentária materna é completa, levando um contato direto do trofoblasto com o sangue, sendo assim denominada placenta hemocorial. O número de camadas de tecidos que separam a circulação fetal e materna tem importantes implicações nas transferências de imunoglobulinas e outras proteínas maternas para o feto e, consequentemente, para o desenvolvimento do sistema imunitário no útero (Cap. 13). Em carnívoros, a placenta endoteliocorial resulta da aderência entre os componentes fetais e maternos da placenta. Como resultado, uma porção do endométrio é lesada quando as membranas fetais e a placenta são expulsas no nascimento. A porção lesada do endométrio é denominada decídua e este tipo de placenta deciduada. A placenta em roedores e humanos também é deciduada. Em contrapartida, a placenta de ruminantes, suínos e equinos é adeciduada. 168 Diferenças entre as espécies Suínos Os embriões passam para o estágio de 4 células no útero aproximadamente 2 dias após a ovulação. O blastocisto eclodido sofre uma fase de extremo alongamento durante os dias 10 a 14 do desenvolvimento coincidindo com a distribuição dos embriões dentro dos longos cornos uterinos. O estradiol secretado pelo trofoblasto leva ao reconhecimento materno da prenhez por volta dos dia 11 a 12 e a implantação tem início por volta dos dias 13 a 14 no lado mesometrial do útero. O saco vitelino é transitoriamente presente, mas involui em torno dos 20 dias sem a formação de uma placenta coriovitelínica. Portanto, a placenta corialantoide do suíno é difusa, pregueada, epiteliocorial e adeciduada. As áreas de trocas da placenta são aumentas por dobras na forma de pregas (macroscópicas) primárias e rugas (microscópicas) secundárias (Figs. 9-3, 9-4). Nas extremidades das membranas fetais, o alantoide não se estende até o fim do cório, o qual forma extremidades necróticas. A placenta difusa cobre inteiramente a superfície endometrial incluindo a abertura das glândulas endometriais. Consequentemente, para a liberação das secreções histotróficas acontecer, o corioalantoide forma cavidades semelhantes a rosetas, aréolas, sobre a abertura das glândulas (Fig. 9-5). 169 Fig. 9-3 A placenta difusa na porca. 1: Corioalantoide; 2: Mesoâmnio; 3; Endométrio; 4: Âmnio; 5: Alantoide; 6: Prega corioalantoide com rugas secundárias; 7: Miométrio. Fig. 9-4 Placenta em baixa (A) e (B) em alta resolução. 1: Alantoide; 2: Epitélio endometrial do alantoide; 3: Mesênquima; 4: Prega corioalantoide; 5: Endométrio; 6: Miométrio; 7: Perimétrio; 8: Ruga corioalantoide; 9: Glândulas uterinas; 10: Vasos fetais; 11: Vasos maternos. 170 Fig. 9-5 Aréola na placenta de suínos. 1: Mesênquima; 2: Ruga corioalantoide; 3: Aréola; 4: Endométrio; 5: Glândulas uterinas. A formação do âmnio é seguida de uma persistência do mesoâmnio (Cap. 7), Desse modo, os leitões são, em geral, nascidos descobertos de membrana fetal. O alantoide começa a se formar por volta do dia 15, e devido à involução do saco vitelino, ocupa o celoma extraembrionário, exceto pela área do mesoâmnio. Ruminantes Em geral, o embrião ruminante entra no útero no estádio de 8 a 16 células, 3 a 4 dias após a ovulação. O blastocisto rapidamente elonga-se após a eclosão da zona pelúcida. Nos bovinos, o concepto estende-se igualmente em ambos os cornos por volta do dia 22 (Cap. 6). Uma maior quantidade de embriões parece estar localizada no corno direito, reforçando o fato que a ovulação é mais comum no ovário direito e que a migração embrionária não é tão pronunciada como nos suínos e equinos. O reconhecimento materno da prenhez ocorre por volta do dia 12 a 13 (ovelha) e 16 a 17 (vaca), como um resultado da secreção de IFT-t pelo trofoblasto, e é seguido da implantação nos dias 15 a 20 (ovelha) e 16 a 18 (vaca). O saco vitelino está apenas transitoriamente presente, degenera-se brevemente após a implantação ter iniciado. Desse modo, a placenta corioalantoide é cotiledonária ou múltipla, vilosa, sinepiteliocorial e adeciduada. A placentação ocorre pelo desenvolvimento dos vilos coriônicos em aposição às proeminências endometriais carunculares formando cotilédones semelhantes a 171 botões, correspondendo à forma da carúncula. A carúncula e o cotilédone formam o placentônio (Figs. 9-6, 9,7). Em vacas, 75 a 120 carúnculas estão presentes; na ovelha entre 80 a 100. Fig. 9-6 A placenta cotiledonária dos ruminantes. 1: Corioalantoide (cotilédone) formando vilo; 2: Carúncula com criptas envolvendo os vilos; 3: Miométrio. 172 Fig. 9-7 Placentônio de vaca em baixa (A) e em alta (B) resolução. 1: Alantoide; 2: Epitélio endodermal do alantoide; 3: Placentônio; 4: Endométrio; 5: Miométrio; 6: Mesênquima; 7: Ramificação dos vilos corioalantoides. Os placentônios são convexos em vacas, côncavos em ovelhas, e planos em cabras. O trofoblasto cobre os cotilédones dando origem a uma única população de células binucleadas gigantes produtoras de hormônio que migram e fusionam-se com as células do epitélio endometrialpor uma conjunção de 20 embriologia convencional, genômica, transcriptômica e epigenômica aplicada à investigação dos mecanismos moleculares da biologia do desenvolvimento. A informação está aumentando exponencialmente, e combinar o conhecimento molecular avançado com a embriologia como um todo é um desafio – um desafio que se tornou claro ao escrever um livro sobre os fundamentos da embriologia dos animais domésticos! Durante anos, o ensino de embriologia veterinária era dificultado pela falta de livros sobre o tema, e livros sobre embriologia médica eram utilizados com baixo aproveitamento. Em 2006, quando McGaedy et al. publicaram seu bem-vindo livro sobre embriologia veterinária, nós já havíamos iniciado o projeto deste livro com o objetivo de transformar nosso próprio material de pesquisas, coletado ao longo de várias décadas, em algo palatável e estimulante para os estudantes. Trabalhar com esse intuito foi uma grande experiência para nós, e esperamos que você, leitor, considere que tenhamos realizado, ao menos em parte, aquilo que pretendíamos. As melhorias futuras, é claro, dependerão muito do retorno e opiniões recebidas, e serei grato em receber críticas construtivas. Enquanto isso, é meu desejo sincero que a leitura deste livro possa levá-lo a pelo menos um “Aha-Erlebnis” no maravilhoso mundo da embriologia! Poul Hyttel Vidiekjaer Valby, Dinamarca 3 de junho de 2009 Minha pintura (2003) do horizonte de Skagen, Dinamarca, onde cresci e fui “imprinted”. Vejo a embriologia do mesmo prisma: uma vista com potenciais infinitos que estão apenas aguardando para serem realizados. 21 Capítulo 1 História da embriologia Poul Hytell, Gábor Vajta Embriologia, o estudo do desenvolvimento da fertilização até o nascimento sempre intrigou filósofos e cientistas. Ao longo dos anos o fascínio universal, entre os embriologistas, pela maneira pela qual a “vida” se desenvolve deu origem a diversas discussões acerca da complexidade deste processo. Em 1899, Ernst Haeckel (1834- 1919) considerou que “a ontogenia é uma recapitulação da filogenia”. Em outras palavras, ontogenia (o desenvolvimento de um organismo do ovo fertilizado até sua forma madura) reflete, em questão de dias ou meses, a origem e evolução das espécies (filogenia), um processo contínuo que pode ser medido em milhões de anos. Esta afirmação não pode ser considerada totalmente verdadeira, pois, basta analisar um embrião ovino de 19 dias de idade para entender a perspectiva de Haeckel; como, por exemplo, os arcos faríngeos similares a guelras e os somitos (Fig. 1-1) são comuns aos embriões de todos os cordados. Embora formado como um médico, Haeckel abandonou a profissão após ler A origem das espécies de Charles Robert Darwin (1809-1882) publicado em 1859 (e disponível à época por quinze xelins!). Sempre desconfiado das explicações teológicas e místicas da vida, Haeckel utilizou a teoria de Darwin como munição para atacar dogmas religiosos arraigados bem como para elaborar seus próprios entendimentos. No entanto, ao projetar a filogenia na ontogenia, Haeckel cometeu um erro: o mecanismo de mudança requer que a formação de novos caracteres e diagnósticos de novas espécies ocorra da sua origem até o esquema básico de desenvolvimento. Por exemplo, devido à maioria dos metazoários passarem por um estágio de desenvolvimento chamado gástrula (um aglomerado de células com desdobramentos que, em seguida, formará o intestino) Haeckel considerou que em um determinado momento um organismo chamado “gastraea” tivesse existido, assemelhando-se com o estágio de gástrula da ontogenia. Nesta hipótese, o ancestral metazoário, pensou ele, deu origem a todos os animais multicelulares. A concepção de um “único segmento” da filogenia, ou seja, todos os seres antecedem uma única linhagem, foi abandonada; a filogenia divide-se em uma infinidade de linhas. 22 Fig. 1-1 Embrião de ovelha no dia 19 do desenvolvimento. A maioria dos antigos filósofos gregos se interessavam pela embriologia. De acordo com Demócrito (455–370 a.C.) o sexo de um indivíduo era determinado pela origem do espermatozoide: os machos proviam do testículo direito (Claro!) e as fêmeas do testículo esquerdo. Esta hipótese foi modificada por Pitágoras, Hipócrates e Galeno. No entanto, para a ciência, a definição do sexo sempre foi privilégio do homem; a maioria dos filósofos colocavam as fêmeas entre os homens e os animais, portanto, os machos eram originados de um forte espermatozoide do testículo direito. O primeiro embriologista conhecido foi o filósofo grego Aristóteles (384-322 a.C.). Na obra A geração dos Animais (350 a.C.) ele descreveu as diferentes formas que os animais nasciam: dos ovos (oviparidade, como os pássaros, sapos e maioria dos invertebrados), pelo nascimento (vivíparos, como em animais placentários e alguns peixes) ou por produção de ovos que eclodiam dentro do corpo (ovoviparidade, como ocorre em certos répteis e cobras). Foi também Aristóteles que observou os dois principais padrões de divisão celular do desenvolvimento: clivagem holoblástica na qual o ovo é dividido progressivamente em células menores (como em sapos e mamíferos) e o padrão meroblástico no qual a parte do ovo destinado à formação do embrião se divide, e o restante tem a função de nutrição (como nas aves). Aristóteles descobriu que as membranas fetais e o cordão umbilical em bovinos possuíam funções importantes para a nutrição fetal. Ainda, fez a mais importante descoberta de estudos sequenciais de ovos fertilizados de galinhas. O embrião desenvolve seus sistemas de órgãos gradualmente – eles não estão pré-formados. Este conceito de nova (de novo) formação de estruturas embrionárias, o qual é denominado epigênese, permanece controverso por mais de 2.000 mil anos, antes de ser 23 completamente aceito; Aristóteles estava muito a frente do seu tempo. O enigma da reprodução sexuada também o intrigava. Ele notou que ambos os sexos eram necessários para a concepção e percebeu que o sêmen do macho não contribuía fisicamente para a concepção, mas promovia uma desconhecida interação com o sangue menstrual no útero da fêmea e, desse modo, a materialização de um embrião. Neste caso, Aristóteles estava errado. Ironicamente, ao contrário de seu ponto de vista não aceito sobre a epigênese, seu erro acerca da concepção prevaleceu por 2.000 anos, e levou quase cem anos para ser corrigido! Durante esses 2.000 anos, a ciência da embriologia desenvolveu-se muito lentamente paralela à anatomia descritiva. Uma das primeiras descrições anatômicas de útero prenhe de porcas foi feita por Kopho (ano de nascimento e morte desconhecidos) no início do século XIII em seu trabalho Anatomio Porci. Kopho trabalhou em uma famosa escola de medicina de Salerno usando porcos como modelos, pois cadáveres humanos não poderiam ser dissecados por questões religiosas. No início do renascimento, os famosos e incomparáveis estudos artísticos e anatômicos de Leonardo da Vinci (1452–1519) incluíram investigações de úteros prenhes de uma vaca. Seus desenhos de um útero bicórneo prenhe e de fetos e membranas fetais liberados do útero estão reproduzidos na Figura 1-2. Em um de seus desenhos, Leonardo evidencia um útero humano aberto e “revela” não uma placenta humana, mas uma placenta de ruminante multivilosa e vilosa (Cap. 9)! Certamente, para Leonardo, não foi possível estudar a gestação humana. As estruturas são descritas baseadas nas anotações de Leonardo, que trabalhou principalmente em Florença. 24 Fig. 1-2 Desenhos de Leonardo da Vinci. A: Em cima: Um corno uterino gestante de vaca. Embaixo: Feto e membranas fetais mostrando os cotilédones da placenta (Cap. 9). B: Útero simples aberto de ser humano mostrando o feto e o cordão umbilical. Observe que a placenta é de um ruminante, do tipo multivilosa com vários placentônios desenhados no corte da parede do útero e, em cima do lado direito, um cotilédone simples desenhado em alta resolução mostrando as superfícies dos vilos. Desde o século XIII ao XV, o Renascimento foi um grande(Fig. 9-2). Em pequenos ruminantes este fenômeno de fusão, que origina a placenta sinepiteliocorial, ainda que mais pronunciado, resulta em um sincício que substitui o epitélio materno. A carúncula não possui abertura de glândulas uterinas, pois, o cório que parte por entre os cotilédones não está fixado ao endométrio e não forma aréola. As placas amnióticas, as quais são elevações epiteliais estratificadas ricas em glicoproteínas no epitélio do âmnio, e os cálculos alantoicos, massas esbranquiçadas ou acastanhadas de debris celulares circundados por mucoproteínas e minerais provavelmente originados do intestino posterior fetal e do sistema urinário em desenvolvimento, são comumente encontrados em vacas e ovelhas. Como nos suínos, um mesoâmnio persiste, portanto, o bezerro nasce sem cobertura de membranas. As membranas fetais são normalmente expulsas dentro de 6 a 12 horas, e mantidas após o nascimento – a retenção das membranas por longos períodos – não é um fato incomum. Durante uma gestação clinicamente normal, a quantidade de fluido presente na cavidade amniótica e alantoide é firmemente regulada. Entretanto, uma quantidade excessiva de fluidos pode, algumas vezes, acumular em ambas as cavidades, especialmente em vacas, resultando em hidroâmnio ou hidroalantoide. Assim, o volume de fluido normal no âmnio e alantoide em vacas é de aproximadamente 15 a 20 litros respectivamente, em casos de hidroalantoide (a condição mais frequente) 173 um total de 100 a 200 litros pode acumular no alantoide. As razões para esta condição incluem distúrbios vasculares na placenta em geral associados a malformações gemelares e embrionárias. O interessante é que anormalidades placentárias, incluindo hidroalantoide, são encontradas com frequência em prenhezes resultantes de transferência de embriões clonados por transferência nuclear de células somáticas (Cap. 21). Equino O embrião equino entra no útero, nos estágios de mórula ou blastocisto, aproximadamente 6 dias após a ovulação. Somente embriões entram na cavidade uterina; ovócitos não fecundados são retidos nas tubas uterinas por meio de reações ainda não completamente elucidadas. A eclosão da zona pelúcida ocorre por volta do dia 7 e 8 do desenvolvimento. Entretanto, mesmo antes da eclosão dentro da zona pelúcida, uma cápsula glicoproteica elástica produzida em grande parte pelo trofoectoderma circunda o blastocisto. Diferente de outras espécies, o concepto, devido à presença da cápsula, permanece esférico durante a gastrulação até o vigésimo primeiro dia quando a cápsula é perdida. A cápsula permite que o embrião esférico atravesse todo o lúmen uterino do dia 6 ao décimo sétimo, promovendo os sinais essenciais para a manutenção da prenhez. Esta extensa mobilidade é finalizada pela fixação do embrião – um aumento do tônus uterino fixando o embrião na base do corno uterino. O mesmo processo ocorre com o concepto equino no que se refere ao tempo de fixação que este tem para posicionar-se adequadamente (orientar-se) no útero, no qual o próprio embrião reveste a parede mesometrial, ou posiciona-se “para baixo” como visto na ultrassonografia transretal antes do dia 40. A placenta coriovitelina do equino se forma de uma estrutura proeminente, o saco vitelino, que funciona como base para as trocas materno-fetais até aproximadamente o quadragésimo segundo dia de gestação. A partir desta data o saco vitelino involui e a placenta corioalantoide assume a função até o final da gestação. A involução do saco vitelino persiste a termo e, devido a este fato, o cordão umbilical torna-se mais longo no cavalo, medindo entre 50 a 100 cm ao nascimento. O desenvolvimento da placenta é necessário para a formação da cinta coriônica na junção entre o corioalantoide e o saco vitelino em torno do trigésimo quarto dia (Figs. 9-8, 9-9). Esta estrutura consiste em uma faixa espessa de células trofoblásticas que invade o endométrio, atravessa a barreira placentária e forma as taças endometriais no endométrio. Estes agregados de células produzem o hormônio gonadotrofina coriônica equina (eCG), conhecido como gonadotrofina sérica da égua prenhe (PMSG). A eCG age como um estimulante luteotrófico 174 mantendo tanto o corpo lúteo primário, quanto a formação do corpo lúteo suplementar (acessório) (Cap. 3). Fig. 9-8 Embrião equino durante a presença da cinta coriônica. A: Vista da ramificação vascular. B: Seção do embrião. 1: Saco vitelino; 2; Seio terminal; 3: Cinta coriônica; 4: Alantoide; 5: Âmnio; 6: Mesoderma com vasos; 7: Celoma extraembrionário. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Fig. 9-9 Embrião equino aos 25 dias de prenhez, antes da formação da cinta coriônica. 1: Seio terminal; 2: Local de formação da cinta; 3: Cobertura corioalantoide da cavidade alantoide. Foto: Keith Betteridge. 175 O desenvolvimento do âmnio se completa por volta do vigésimo primeiro dia. Não há persistência de um mesoâmnio. Consequentemente, os potros podem nascer recobertos pelo âmnio, fato que vem a potencializar riscos de sufocamento caso a membrana não seja removida rapidamente. Entre o vigésimo ao quadragésimo dia o alantoide expande-se na cavidade celomática extraembrionária (Figs. 9-8, 9-9). O corioalantoide forma-se, e gradualmente desenvolve tufos de vilos corioalantoides, microcotilédones, distribuídos difusamente, projetando-se nas reentrâncias endometriais, as criptas. Todo o processo de placentação completa-se antes do centésimo vigésimo primeiro dia. Os microcotilédones fetais e as criptas maternas podem ser descritas como microplacentônios, ligeiramente semelhantes aos arranjos vistos nos ruminantes. Como no suíno, no equino não há perda de endométrio ao nascimento. A placenta do cavalo é difusa, vilosa, epiteliocorial e adeciduada. Numerosas aréolas estão espalhadas entre os microcotilédones, facilitando o aproveitamento do histotrofo (Figs. 9-10, 9-11). 176 Fig. 9-10 Placenta difusa na égua. 1: Corioalantoide; 2: Endométrio, 3: Âmnio; 4: Alantoide; 5: Saco vitelino; 6: Microcotilédones corioalantoicos com vilos; 7: Taças endometriais; 8: Endométrio com criptas envolvendo os vilos. 9: Miométrio. 177 Fig. 9-11 Placenta de égua em baixa (A) e em alta (B) resolução. 1: Alantoide; 2: Microcotilédones; 3: Endométrio; 4: Glândulas uterinas; 5: Epitélio endodermal do alantoide; 6: Vasos fetais. Quando a égua concebe gêmeos, há uma redução da área endometrial disponível para cada embrião durante a placentação. Este fato representa um problema, pois a expansão de uma das placentas restringe o crescimento da outra resultando na morte de um dos gêmeos ou de ambos. Portanto, o diagnóstico inicial da prenhez é comumente realizado a fim de possibilitar a retirada de um dos gêmeos por redução embrionária (ruptura transretal manual). Como nos ruminantes, os cálculos alantoicos são frequentemente encontrados flutuando na cavidade alantoide. No cavalo eles são particularmente grandes e denominados hipomanes. As placas amnióticas ou pústulas também são bastante observadas no âmnio. Carnívoros É difícil prever, precisamente, o tempo no qual ocorrem os eventos da gestação em cadelas, pois a cópula ocorre antes da ovulação, e os espermatozoides permanecem viáveis por longo tempo no trato genital feminino (Cap. 3). Na gata, ao contrário, o momento da fecundação pode ser estimado precisamente, pois a ovulação é induzida na cópula. Para ambas as espécies, os embriões parecem entrar no útero no estágio de blastocisto, cerca de 6-8 dias póscópula. Os embriões de carnívoros não emergem de seus revestimentos do mesmo modo que se expandem os blastocistos de ruminantes e suínos claramente “eclodidos” da ainda óbvia zona pelúcida. Em vez disso, o blastocisto de gatos, por exemplo, permanece envolvido em uma membrana extremamente atenuada, muito parecida com a cápsula do equino, 178 entre os dias 12 e 15 após a cópula. Se este revestimento é muito modificado na zona pelúcida, ou substituído por ela, ainda não foi estabelecido. O revestimento é provavelmente um suporte à extensa migração doblastocisto no corno uterino no qual permite o espaçamento do próprio embrião. O reconhecimento materno da prenhez nestas espécies é provavelmente desnecessário pela prevenção da regressão do corpo lúteo. A placentação começa em torno do décimo sétimo ao décimo oitavo dia na cadela e no décimo segundo ao décimo quarto dia na gata. O saco vitelino inicialmente forma uma ampla placenta coriovitelina. Mais tarde, a área central da placenta coriovitelina degenera-se resultando em uma placenta coriovitelina transitória na periferia da estrutura inicial. A placenta corioalantoide, entretanto, serve como principal base para as trocas materno-fetal. Devido à aparência de uma cinta do cório frondoso, a placenta coriovitelina em carnívoros é referida como sendo zonária (Fig. 9-12). No cório frondoso, o trofoblasto origina duas diferentes populações de células: as células localizadas basalmente denominadas células do citotrofoblasto e as células localizadas superficialmente denominadas células do sinciotrofoblasto, as quais são formadas pela fusão de muitas células trofoblásticas. O sinciotrofoblasto é altamente invasivo e destrói tanto o epitélio endometrial como o tecido conjuntivo subjacente, aproximando o trofoblasto ao endotélio materno, tornando a placenta dos carnívoros endoteliocorial (Fig. 9-2). Além disso, como o tecido materno é perdido no parto, a placenta é classificada como decídua. Como no suíno, a área de superfície do cório frondoso é aumentada pelas dobras lisas denominadas lamelas. Estas estruturas podem, dependendo da espécie de carnívoro, ser mais ou menos ramificada e destorcida, resultando na formação do labirinto. A zona placentária é organizada no interior da zona lamelar com a lamela corioalantoide, uma zona de junção intermediária contendo a parte terminal da lamela, vasos maternos, debris celular e secreções glandulares, e uma zona glandular contendo as projeções das glândulas uterinas (Fig. 9-13). Em resumo, a placenta de carnívoros é zonária, lamelar ou labiríntica, endoteliocorial e deciduada. 179 Fig. 9-12 Placenta zonária da cadela. 1: Perimétrio; 2: Endométrio e miométrio; 3: Corioalantoide; 4: Alantoide; 5: Saco vitelino; 6: Corioalantoide formando lamelas na zona placentária; 7: Hematoma marginal. Fig. 9-13 Placenta de marta. A: A área do quadrado está ampliada em “B”. 1: Alantoide; 2: Zona lamelar; 3: Zona juncional; 4: Edométrio; 5: Hematoma marginal; 6: Zona glandular; 7: Lamela individual da zona lamelar. Nas margens da zona placentária, parte do endotélio materno degenera. No cão e em martas, esta degeneração resulta na formação de um hematoma denominado 180 hematoma marginal. Na gata, os hematomas são posicionados mais irregulares. Em ambas as espécies, o sangue contido serve como fonte de ferro. Devido a diferenças na quebra de hemoglobina, os hematomas são verdes na cadela e marrom na gata. As áreas periféricas à zona placentária, conhecidas como paraplacenta, são consideradas não funcionais. A aréola não ocorre em carnívoros. Como nos equinos, um mesoâmnio não persiste e então os recém-nascidos são normalmente cobertos pelo o âmnio. Roedores e primatas A placenta de roedores e primatas será brevemente descrita por razões comparativas. Nestas espécies, o trofoectoderma é altamente invasivo e então o blastocisto penetra no epitélio endometrial localizando-se no tecido conjuntivo endometrial. O termo implantação é bem adequado nestas espécies. Ao longo do desenvolvimento do embrião, o trofoblasto diferencia-se em um citotrofoblasto interno e um sinciotrofoblasto externo. O alantoide não se desenvolve e, portanto, não há formação de uma placenta corioalantoide. Entretanto, a migração do mesoderma visceral resulta em ampla vascularização da placenta, a qual toma a forma de um disco, formando a placenta discoidal (Fig. 9-14). O termo “placenta” dá-se devido á semelhança deste disco esponjoso com um bolo (placenta = bolo plano em latim). 181 Fig. 9-14 Placenta discoidal de primatas. 1: Perimétrio; 2: Endométrio e miométrio; 3: Âmnio; 4: Cavidade uterina; 5: Espaço interviloso com sangue materno; 6: Endométrio; 7: Miométrio. No disco, o trofoblasto forma vilos com um núcleo de citotrofoblasto e uma camada externa de sinciotrofoblasto. Mais tarde, o núcleo é invadido pelo mesoderma carreando vasos sanguíneos. Devido à natureza invasiva do sinciotrofoblasto, o tecido conjuntivo materno e o endotélio são removidos e os vilos fetais cobertos de trofoblasto estão diretamente circundados pelo sangue materno contido nos espaços intervilosos. Assim é estabelecida a placenta hemocorial (Fig. 9- 2). A placenta discoidal e a decídua são expulsas com o nascimento. Dessa forma, as placentas de roedores e primatas são discoidais, vilosas, hemocorial e deciduada. Prenhez ectópica 182 As gestações que ocorrem fora da tuba uterina são denominadas ectópicas. Embora rara e fatal, a condição ocorre principalmente na tuba uterina e na cavidade abdominal. As prenhezes tubáricas podem acometer mais de 95% de todas as prenhezes ectópicas em humanos; ao contrário, este tipo de prenhez não ocorre nos animais domésticos. Existe uma especulação se é devido ao ambiente tubárico espécie-específica não favorável ao desenvolvimento embrionário ou interrupção dos caminhos que conduzem ao reconhecimento materno da prenhez. O tipo abdominal de prenhez ectópica pode ocorrer como resultado de um zigoto que entra na cavidade abdominal e fixa-se no mesentério ou vísceras abdominais (forma abdominal primária) ou, mais frequentemente, pela ruptura da tuba uterina ou útero seguido de expulsão do embrião/feto (forma abdominal secundária). Na maioria dos casos, o embrião/feto torna-se calcificado e é frequentemente encontrado por acaso. Entretanto, tanto em ovelhas, quanto em gatas, a prole viva resultante da forma secundária pode ser recuperada por cesariana, indicando que o desenvolvimento completo a termo é possível de ocorrer fora da cavidade uterina. Resumo No interior do útero, o embrião é inicialmente nutrido pelo histotrofo das glândulas uterinas. A placentação estabelece a base para uma absorção de nutrientes via circulação sanguínea, o hemotrofo. Um importante evento de pré-implantação é o reconhecimento materno da prenhez, mediado pelos sinais produzidos pelo embrião. Próximo do momento da implantação, o embrião desenvolve múltiplas membranas e cavidades. O revestimento externo do embrião consiste no trofoectoderma com um revestimento interno do mesoderma extraembrionário somático, construindo o cório. As dobras do cório resultam na formação do âmnio envolvendo o embrião. O hipoblasto, recoberto com o mesoderma extraembrionário visceral, fecha a cavidade denominada saco vitelino primitivo. O celoma extraembrionário é encontrado entre o mesoderma embrionário somático e o visceral. O endoderma está inserido na porção do saco hipoblástico e, com as dobras anteroposterior e lateral do embrião, a porção do endoderma que reveste o saco vitelino primitivo, forma o intestino primitivo, ao passo que a porção revestida com hipoblasto forma o saco vitelino definitivo. Finalmente, o alantoide desenvolve-se como uma consequência do intestino posterior e vem a ocupar a maior parte do celoma extraembrionário. Com o tempo, o alantoide passa a circundar suavemente o âmnio. Entretanto, em bovinos e suínos, um mesoâmnio, onde o âmnio e cório são fixados, persiste. Uma placenta coriovitelina temporária é formada pela interação da fusão do 183 saco vitelino e o cório com o endométrio no equino e no cão. A placenta corioalantoide permanente é formada pela fusão entre o alantoide, o cório e o endométrio. A placenta é classificada de acordo com sua aparência anatômica (difusa, múltipla, zonária ou discoidal), suas características de superfície (vilos, dobras, lamelas/labirinto), e pela espessura de barreias (epiteliocorial, sinepitelicorial, endotelicorial ou hemocorial). No suíno, a placenta é difusa, pregueada, epiteliocorial e adeciduada. Nos ruminantes, a placenta é cotiledonária ou múltipla,vilosa, sinepitelicorial e adeciduada. No equino, a placenta é difusa, vilosa, epiteliocorial e adeciduada. Nos carnívoros, a placenta é zonária; lamelar ou labiríntica, endoteliocorial e deciduada. Em roedores e primatas, a placenta é discoidal, vilosa, hemocorial e deciduada. Leituras adicionais Allen W.R. Maternal recognition and maintenance of pregnancy in the mare. Anim. Reprod. 2005;2:209–223. Allen W.R., Stewart F. Equine placentation. Reprod. Fert. Dev. 2001;13:623–634. Cencic A., Guillomot M., Koren S., La Bonnardière C. Trophoblastic interferons: Do they modulate uterine cellular markers at the time of conceptus attachment in the pig? Placenta. 2003;24:862–869. Concannon P., Tsutsui T., Shille V. Embryo development, hormonal requirements and maternal responses during canine pregnancy. J. Reprod. Fert. Suppl. 2001;57:169–179. Corpa J.M. Ectopic pregnancy in animals and humans. Reproduction. 2006;131:631–640. Dantzer V. Scanning electron microscopy of exposed surfaces of the porcine placenta. Acta Anat. 1984;118:96–106. Dantzer V. Electron microscopy of the initial stages of placentation in the pig. Anat. Embryol. 1985;172:281– 293. Dantzer V., Leiser R. Initial vascularisation in the pig placenta: I. Demonstration of nonglandular areas by histology and corrosion casts. Anat. Rec. 1994;238:177–190. Dantzer V., Winther H. Histological and immunohistochemical events during placentation in the pig. Reproduction Suppl. 2001;58:209–222. Denker H.-W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 2000;166:180–207. Denker H.-W., Eng L.A., Hammer C.E. Studies on the early development and implantation in the cat. II. Implantation: Proteinases. Anat. Embryol. 1978;154:39–54. Lee K.Y., DeMayo F.J. Animal models of implantation. Reproduction. 2004;128:679–695. Leiser R., Dantzer V. Structural and functional aspects of porcine placental microvasculature. Anat. Embryol. 1988;177:409–419. Leiser R., Dantzer V. Initial vascularisation in the pig placenta: II. Demonstration of gland and areola-gland subunits by histology and corrosion casts. Anat. Rec. 1994;238:326–334. Leiser R., Krebs C., Ebert B., Dantzer V. Placental vascular corrosion cast studies: a comparison between 184 ruminants and humans. Microsc. Res. Tech. 1997;38:76–87. Rüsse I., Sinowatz F. Lehrbuch der Embryologie der haustiere, 2nd edn. Berlin: Parey Buchverlag; 1998. Spencer T.E., Johnson G.A., Bazer F.W., Burghardt R.C. Implantation mechanisms: insights from the sheep. Reproduction. 2004;128:657–668. Swanson W.F., Roth T.I., Wildt D.E. In vivo embryogenesis, embryo migration, and embryonic mortality in the domestic cat. Biol. Reprod. 1994;51:452–464. 185 Capítulo 10 Desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico Fred Sinowatz O sistema nervoso central (SNC) desenvolve-se do ectoderma assim que este se diferencia em ectoderma superficial e neuroectoderma. Algumas das características mais precoces do desenvolvimento do sistema nervoso já foram abordadas em relação à neurulação (Cap. 8) e serão brevemente recapituladas aqui, mais especificamente na discussão do desenvolvimento do SNC. O sistema nervoso periférico (SNP) se desenvolve em associação do SNC como o sistema de comunicação entre o SNC e o restante do corpo. Placa neural O desenvolvimento da placa neural, um espessamento do ectoderma que representa o primórdio do sistema nervoso, é induzido pela notocorda (Cap. 8), um grande centro axial de sinalização do tronco do embrião inicial. Subsequentemente, a placa neural se dobra e forma o tubo neural. Alguns dos mecanismos moleculares que norteiam este processo foram recentemente esclarecidos em camundongos. A notocorda, a qual está próxima da placa neural da linha média durante este estágio, libera a sonic hedgehog (Shh). Grande parte do ectoderma superficial de um embrião durante a gastrulação produz a Proteína Morfogenética Óssea 4 (BMP4). Esta proteína de sinalização previne o ectoderma dorsal de formar o tecido neural. Sob a influência do Fator Nuclear Hepático 3beta (HNF-3beta), as células da notocorda em desenvolvimento secretam noguina e cordina. Estas duas moléculas são potentes indutores neurais que bloqueiam a influência inibitória de BMP4 e então possibilitam que o ectoderma dorsal à notocorda forme tecido neural. Tubo neural O tubo neural é uma estrutura proeminente que domina a porção anterior (futuramente cefálica) do embrião. No texto que se segue iremos observar como o tubo neural precoce se desenvolve nos principais componentes morfológicos e funcionais do sistema nervoso maduro (Fig. 10-1). Antes da neurogênese, a placa 186 neural e o tubo neural são compostos por uma única camada de células neuroepiteliais (neuroepitélio). As células neuroepiteliais são altamente polarizadas ao longo do seu eixo apical-basal. Isto se reflete, por exemplo, na organização de suas membranas plasmáticas: certas proteínas transmembrana como a prominina-1 (CD133) são encontradas seletivamente na membrana plasmática apical. Fig. 10-1 Formação do tubo neural e cristas neurais. As áreas demarcadas com quadros em A–C estão aumentadas à direita (modificado de Rüsse e Sinowatz, 1998). A: 1: Notocorda; 2: Ectoderma superficial; B: 1: Notocorda; 2: Ectoderma superficial; 3: Sulco neural; 4: Placa 187 neural. C: 1: Notocorda; 2: Epitélio do sulco neural; numerosas mitoses ocorrem no epitélio neural; 3: Sulco neural; 4: Crista neural; D: 1: Notocorda; 2: Ectoderma superficial; 3: Tubo neural; 4: Cristas neurais, as quais neste estágio ainda são uma folha contínua de células. E: 1: Notocorda; 2: Ectoderma superficial; 3: Tubo neural; 4: Cristas neurais, as quais são segmentadas em grupos de células que dão origem a diversos tipos celulares. E: Células ependimárias; ZV: zona ventricular; ZM: zona marginal. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Pouco após a indução, o epitélio da placa neural e do tubo neural inicial se organiza em um epitélio pseudoestratificado no qual os núcleos parecem estar localizados em várias camadas separadas por que eles se encontram em diferentes alturas no interior das células neuroepiteliais alongadas. Os núcleos se deslocam extensivamente no citoplasma conforme o ciclo celular progride (Fig. 10-2). A síntese de DNA (a fase S) ocorre nos núcleos localizados próximos à membrana limitante externa (a lâmina basal ao redor do tubo neural). Conforme estes núcleos se preparam para entrar em mitose eles migram através do citoplasma em direção ao lúmen do tubo neural, onde a mitose é completada. A orientação do fuso mitótico durante esta divisão é importante para o destino das células filhas. Se o plano de clivagem é perpendicular à superfície apical (interna) do tubo neural, as duas células filhas migram lentamente em direção à periferia do tubo neural, onde elas se preparam para uma nova rodada de síntese de DNA. Se, por sua vez, o plano de clivagem corre paralelamente à superfície interna do tubo neural, as duas células filhas têm destinos completamente diferentes. A célula filha mais próxima da superfície interna migra para longe muito vagarosamente e permanece como uma célula progenitora que ainda é capaz de fazer mitose. A célula filha que ficar mais próxima da superfície basal (membrana limitante externa) herda uma alta concentração do receptor Notch em sua superfície e pode agora ser chamada de neuroblasto. Os neuroblastos são células precursoras dos neurônios e começam a produzir processos celulares que finalmente se tornam os axônios e dendritos. 188 Fig. 10-2 Migração nuclear intercinética no interior do tubo neural. Dentro do epitélio pseudoestratificado do tubo neural, os núcleos que sintetizam DNA (fase S) estão localizados próximos da membrana limitante externa (MLE), mas depois se movem em direção à margem interna do tubo neural, onde ocorre a mitose. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). A migração nuclear intercinética no neuroepitélio é acompanhada por uma mudança na morfologia nuclear: o núcleo adota uma forma alongadaatravés do eixo apical-basal quando a migração se inicia e se torna arredondado quando a migração para. Isto é consistente com a ideia de que o núcleo seja puxado por alguma maquinária citoesquelética. Os trabalhos iniciais sobre a migração nuclear intercinética indicavam o envolvimento de microtúbulos, uma ideia que é corroborada pela observação de que o posicionamento nuclear é um processo dependente de microtúbulos em muitos tipos celulares. Estudos recentes do gene lisencefalia 1 (LIS1) também apoiam esta ideia. Mutações no gene LIS1 humano são responsáveis pela lisencefalia tipo 1 (cérebro liso), uma grave malformação do cérebro com causa genética. A proteína LIS1 forma um complexo com a dineína e dinactina citoplasmáticas o qual se liga aos microtúbulos e perturba a dinâmica dos mesmos. Camundongos com expressão reduzida de LIS1 apresentam defeitos na migração nuclear intercinética das células neuroepiteliais e migração neuronal anormal. Adicionalmente aos microtúbulos, os filamentos de actina e miosina estão também provavelmente envolvidos com a migração nuclear intercinética das células neuroepiteliais. A citocalasina B, uma droga que inibe a polimerização de actina, bloqueia o processo, e a ablação da cadeia pesada II-B da miosina não muscular resulta em migração nuclear desordenada nas células. Linhagens celulares do sistema nervoso central 189 Durante o desenvolvimento, as células-tronco neurais dão origem a todos os neurônios do SNC de mamíferos (Figs. 10-3, 10-4, 10-5) e também a dois tipos de células macrogliais, os astrócitos e os oligodendrócitos. Geralmente, dois critérios são aplicados para definir uma célula como uma célula-tronco: autorrenovação e pluripotência (ou pelo menos multipotência). A autorrenovação indica que uma célula é capaz de se dividir por número ilimitado de vezes, cada qual resultando ou em duas células-tronco ou em uma célula-tronco e uma célula comprometida. A pluripotência ou multipotência implica que a célula pode dar origem a numerosos tipos de células diferenciadas – todos os tipos celulares do organismo de mamíferos no caso de pluripotência (Cap. 2). No entanto, este conceito deve ser de certa maneira modificado quando aplicado ao SNC: “células-tronco” neste contexto são células neurais que são autorrenovadoras, mas não necessariamente por um número ilimitado de divisões celulares e elas podem ser multipotentes ou unipotentes. Fig. 10-3 Linhagens celulares no sistema nervoso central em desenvolvimento. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 190 Fig. 10-4 Origens de neurônios e vários tipos de células gliais. Neurônios, oligodendrócitos, astrócitos fibrilares e protoplasmáticos, e células ependimárias se originam de células neuroepiteliais. A micróglia (glia Hortega) se desenvolve de células mesenquimais. Fig. 10-5 A: Durante este desenvolvimento inicial, o epitélio do tubo neural consiste na zona ventricular (ZV), onde células neurais epiteliais sofrem mitoses, e na zona marginal (ZM), a qual contém processos alongados das células. B: Secção pelo tubo neural em estágio um pouco mais avançado que em A. As células neuroepiteliais, que já deixaram o ciclo mitótico, migram para longe do lúmen do tubo neural e formam uma camada celular intermediária (ZI: zona intermediária). As células neuroepiteliais que podem ser consideradas as células-tronco do SNC passam primeiro por divisões proliferativas simétricas, cada qual gerando duas células-tronco filhas. Estas divisões são seguidas por numerosas divisões assimétricas autorrenovadoras, cada qual resultando em uma célula-tronco filha e uma célula mais diferenciada tal qual uma célula progenitora. As células progenitoras neurais são tipicamente submetidas a divisões simétricas diferenciadoras que geram duas células pós-mitóticas prontas para a diferenciação terminal. As origens da maioria das células encontradas no SNC maduro podem ser rastreadas até as células-tronco multipotentes no interior do neuroepitélio precoce. Estas células sofrem muitas divisões mitóticas antes de amadurecerem em células progenitoras bipotentes, as quais dão origem ou a células progenitoras neuronais ou gliais. Esta bifurcação do desenvolvimento é acompanhada por uma alteração significativa na expressão gênica. Por exemplo, células-tronco 191 multipotentes expressam uma proteína do filamento intermediário chamada nestina. A expressão de nestina é regulada negativamente conforme descendentes das células progenitoras bipotentes se separam em células progenitoras neuronais, as quais expressam neurofilamentos e células progenitoras gliais, que expressam a proteína glial fibrilar ácida. As células progenitoras neuronais originam uma série de neuroblastos. Os mais precoces neuroblastos bipolares possuem dois processos citoplasmáticos delgados que entram em contato tanto com a membrana limitante externa quanto com o bordo luminal central do tubo neural. Ao retrair o processo interno, um neuroblasto bipolar perde o contato com a borda luminal interna e se torna um neuroblasto unipolar. Os neuroblastos unipolares acumulam uma grande quantidade de retículo endoplasmático rugoso (substância de Nissl) em seu citoplasma e então começam a emitir vários processos citoplasmáticos. Neste ponto, eles são conhecidos como neuroblastos multipolares, e suas atividades principais de desenvolvimento são enviar processos axonais e dendríticos e fazer conexões com outros neurônios e órgãos finais. Outra importante linhagem que se origina das células progenitoras bipotentes é a das células progenitoras gliais. As células progenitoras gliais continuam a passar por mitoses e sua progênie se separa em várias linhagens. Uma delas, a célula progenitora O-2A, é precursora de duas importantes linhagens de células gliais que por fim formam os oligodendrócitos e os astrócitos tipo 2, estes últimos são distinguidos pelo seu fenótipo antigênico dos astrócitos tipo 1, derivados de outra linhagem glial. Anatomicamente, os astrócitos podem ser divididos em astrócitos protoplasmáticos, encontrados na substância cinzenta, e astrócitos fibrosos encontrados na substância branca. A origem dos oligodendrócitos foi por muito tempo assunto de debates, mas estudos demonstraram que eles provavelmente provêm de células progenitoras localizadas na zona ventricular ventral ao lado da placa do assoalho. Desta região, eles se disseminam por todo o cérebro e medula espinhal, formando então as proteções de mielina ao redor de axônios na substância branca do SNC. A formação de precursores de oligodendrócitos depende de sonic hedgehog (Shh), produzida pelas células na notocorda, como um sinal indutor. Uma terceira linhagem glial possui uma história mais complexa. As células progenitoras radiais dão origem às células da glia radial, as quais atuam como fio-guia no cérebro para a migração de neurônios jovens. Quando os neurônios estão migrando ao longo das células da glia radial do feto, no período intermediário da gestação, eles inibem a proliferação das células da glia radial. Após a migração de células neuronais, as células da glia radial, agora livres da influência inibitória dos neurônios, reentram no ciclo mitótico e produzem uma progênie que pode se 192 transformar em um número de tipos celulares: algumas podem aparentemente cruzar por séries de linhagens e se diferenciar em astrócitos tipo 1. Outras se diferenciam em vários tipos de células gliais especializadas. Enquanto algumas podem até se tornar células ependimárias e neurônios. Outro tipo de célula glial do SNC não se origina do neuroepitélio. Estas células microgliais, as quais atuam como macrófagos com motilidade em seguida a lesões no SNC, são células derivadas do mesoderma que entram no SNC em conjunto ao sistema vascular e não são encontradas, portanto, no SNC em desenvolvimento até que este seja infiltrado por vasos sanguíneos. Se as células-tronco neurais e suas células progenitoras proliferam (por divisões simétricas) ou se diferenciam (pela divisão assimétrica) está proximamente relacionado às suascaracterísticas epiteliais, especialmente sua polaridade apical- basal e duração do ciclo celular. Geralmente, o período de produção de neurônios precede aquele de gliogênese. O momento no qual o precursor de um neurônio passa por sua última divisão é caracterizado seu “aniversário”. As células neurogênicas na parte ventral da medula espinhal e do rombencéfalo são normalmente as primeiras a pararem de se dividir, seguidas pelos neurônios dorsais e intermediários. Os neurônios corticais no cérebro e cerebelo são as últimas populações a serem formadas. Eles continuam a proliferar até o terceiro ou quarto mês pós-parto no cão e o terceiro ano de vida em humanos. Em espécies precoces, incluindo gado e cavalos, a maioria dos neurônios corticais já está formada no momento do nascimento. Diferenciação histológica do sistema nervoso central Células nervosas Os neuroblastos surgem por divisão das células neuroepiteliais e, uma vez formados, perdem a capacidade de se dividirem (Fig. 10-4). Inicialmente, os neuroblastos desenvolvem dois processos e se estendem do lúmen do tubo neural até a membrana limitante externa. Quando eles começam a migrar para a camada intermediária, o processo central é retraído e os neuroblastos parecem temporariamente unipolares. Durante a diferenciação, mais adiante, vários processos citoplasmáticos pequenos se estendem do seu corpo celular. Um destes processos se prolonga rapidamente, formando o axônio primitivo, enquanto a arborização dos outros dá origem aos dendritos primitivos. Estas células podem ser chamadas agora de neuroblastos multipolares, os quais por fim se tornam neurônios multipolares maduros. Os axônios de neurônios na placa basal, os quais deixam a zona marginal no aspecto lateroventral da medula, formam a raiz ventral eferente da medula 193 espinhal. Os axônios de neurônios na placa alar penetram através da zona marginal da medula, de onde eles ascendem para níveis mais altos ou mais baixos para formarem os neurônios de associação. Células gliais A outra importante linhagem que se origina das células progenitoras bipolares é a das células progenitoras gliais (glioblastos), que são formadas por células neuroepiteliais após a produção de neuroblastos ser encerrada, e sua progênie se divide em vários tipos celulares. Um deles, a célula progenitora O-2A é a precursora de dois tipos de células gliais que por fim se diferenciam em astrócitos tipo 2 e oligodendrócitos. Foi demonstrado recentemente que os oligodendrócitos são derivados de células progenitoras localizadas na zona ventricular ventral. Deste local eles migram por toda a medula espinhal e cérebro, formando a bainha de mielina ao redor de processos neuronais. A formação de oligodendrócitos depende da molécula de sinalização sonic hedgehog (Shh) produzida por células da notocorda. Em contraste às células de Schwann do sistema nervoso periférico, as quais só podem envolver apenas um axônio, os processos achatados de uma única célula oligodendroglial no sistema nervoso central podem mielinizar várias fibras nervosas. As bainhas de mielina começam a se formar na medula espinhal durante o período fetal tardio. Em geral, os tratos das fibras são mielinizados por volta do período que eles se tornam funcionais (Tabela 10-1). Tabela 10-1 Início da formação das bainhas mielínicas no sistema nervoso central e periférico Espécie Tecido Estágio da gestação Felino N. vestibular Dia 53 p.c. N. coclear Dia 57 p.c. N. óptico Dia 1-2 p.n. Suíno Medula espinhal Semana 8 p.c. (cervical) Semana 9 p.c. (lombar) Ovino N. oculomotor Dia 63 p.c. N. troclear N. vestibular N. hipoglosso N. trigêmeo (sens.) Dia 66 p.c. N. glossofaríngeo N. vago N. acessório 194 N. óptico Dia 78 p.c. N. trigêmeo (mot.) Dia 60 p.c. N. facial Dia 78 p.c. N. troclear N. abducente N. vestibular Dia 80 p.c. Medula espinhal Dia 60 p.c. Medula oblonga Mesencéfalo Cerebelo Dia 80 p.c. Telencéfalo Dia 100 p.c. Bovino Medula oblonga Semana 21 p.c. Medula espinhal Semana 16 p.c. N. abducente Semana 20 p.c. N. intermediofacial (mot.) N. coclear N. glossofaríngeo N. vago N. hipoglosso N. trigêmeo Semana 21 p.c. N. vestibulococlear Semana 16 p.c. N. acessório N. óptico Semana 24 p.c. p.n. = pós-natal; p.c. = pós-coito. Nem todas as células gliais da medula espinhal se originam do neuroepitélio. As células microgliais, que surgem na segunda metade do desenvolvimento fetal, são células altamente fagocíticas derivadas da mesoderme. Quando as células neuroepiteliais param de produzir neuroblastos, elas se diferenciam em células epiteliais ependimárias revestindo o canal central da medula espinhal. Com a geração de neurônios, o neuroepitélio é transformado em um epitélio com diversas camadas celulares. Com a mudança para neurogênese, as células neuroepiteliais regulam negativamente certas características epiteliais (em especial sua expressão de proteínas tight junctions) simultaneamente ao aparecimento de marcos astrogliais. Em essência, após o estabelecimento da neurogênese, as células neuroepiteliais dão origem a um tipo celular distinto, mas relacionado: as células da glia radial, que podem exibir propriedades residuais neuroepiteliais assim como astrogliais. As células da glia radial representam progenitores com destino mais restrito do 195 que as células neuroepiteliais e gradualmente as substituem. Como consequência, muitos dos neurônios no sistema nervoso central são derivados das células da glia radial. As propriedades neuroepiteliais que são mantidas pelas células da glia radial incluem a expressão de marcadores neuroepiteliais (tais como a proteína de filamento intermediário nestina) e a manutenção de uma superfície apical e características importantes de polaridade apical-basal (tal como uma localização apical de centrossomos e prominina-1). Assim como as células neuroepiteliais, as células da glia radial apresentam migração nuclear intercinética, com seus núcleos em processo de mitose na superfície apical da zona ventricular e migrando basalmente para completar a fase S do ciclo celular. No entanto, em contraste às células neuroepiteliais, as células da glia radial demonstram diversas propriedades da astroglia, tal como a expressão do transportador de glutamato específico de astrócitos (GLAST), proteína ligante de Ca2+ S100β e proteína glial fibrilar ácida. Ao contrário das células neuroepiteliais precoces, a maioria das células da glia radial possui um potencial de desenvolvimento limitado. Normalmente, elas geram apenas um tipo celular, ou astrócitos ou oligodendrócitos, ou mais comumente neurônios. Desenvolvimento da medula espinhal Com o início da diferenciação celular no tubo neural, o neuroepitélio se espessa e parece possuir camadas (Fig. 10-6). A camada mais próxima do lúmen do tubo neural é chamada de ventricular ou camada neuroepitelial. Ela permanece epitelial e exibe atividade mitótica. No entanto, conforme avança o desenvolvimento, a população de células proliferantes na camada neuroepitelial torna-se exausta e as células restantes diferenciam-se para formar o epêndima do canal central e o sistema ventricular do cérebro. 196 Fig. 10-6 Quatro estágios sucessivos no desenvolvimento da medula espinhal. A e B: 1: Neuroepitélio; 2: Canal central; 3: Notocorda; 4: Ectoderma superficial; 5: Placa basal; 6: Placa do teto; 7: Placa do assoalho; 8: Zona marginal; 9: Gânglio espinhal; 10: Corno dorsal (sensorial); 11: Nervo espinhal. C: 1: Neuroepitélio; 2: Canal central; 3: Notocorda; 4: Ectoderma superficial; 5: Placa basal; 6: Placa alar; 7 e 8: Corno intermediário; 9: Zona marginal; 10: Placa do teto; 11: Placa do assoalho; 12: Gânglio espinhal; 13: Raiz dorsal; 14: Nervo espinhal; D: 1: Epêndima; 2: Canal central; 3: Corno dorsal (sensorial); 4: Corno intermediário; 5: Corno ventral (motor); 6: Raiz dorsal (sensorial); 7: Nervo espinhal; 7’: Raiz ventral (motora); 8: Septo dorsal; 9: Fissura mediana; 10: Substância branca; 11: Gânglio espinhal. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 197A zona ventricular é rodeada pela camada intermediária ou do manto (Figs. 10-1, 10-5) a qual contém os corpos celulares dos neuroblastos pós-mitóticos e prováveis células gliais. Durante o amadurecimento da medula espinhal, a camada intermediária se torna a substância cinzenta, onde os corpos celulares dos neurônios estão localizados (Fig. 10-7). Fig. 10-7 Embrião porcino, Dia 16, secção transversa. 1: Primórdio da medula espinhal; 2: Notocorda; 3: Aorta dorsal; 4: Miótomo; 5: Dermátomo. Como os neuroblastos continuam a desenvolver axônios e dendritos, uma camada marginal (zona marginal) periférica é formada. Ela contém processos neurais, porém não corpos celulares e mais tarde forma a substância branca da medula espinhal. A adição contínua de neuroblastos à camada intermediária espessa o tubo neural ventral e dorsalmente em cada um dos lados (Figs. 10-6, 10-8). Os espessamentos ventrais são denominados placas basais. Eles contêm neurônios motores (fibras nervosas eferentes somáticas gerais) e neurônios autonômicos (fibras nervosas eferentes viscerais; Tabela 10-2). Os espessamentos dorsais, as placas alares, formam a área sensorial com neurônios recebendo estímulos da pele, articulações e músculos (fibras nervosas aferentes somáticas gerais), da faringe (fibras nervosas aferentes viscerais especiais), e das vísceras e coração (fibras nervosas aferentes 198 viscerais gerais). Um pequeno sulco longitudinal, o sulco limitante, marca o limite entre estas duas áreas (Fig. 10-6). As placas alares direita e esquerda estão conectadas dorsalmente sobre o canal central pela delgada placa do teto, as duas placas basais estão conectadas pela placa do assoalho, ventral ao canal central. As placas do teto e do assoalho não contêm neuroblastos, sendo que suas fibras nervosas servem primariamente para interligar um lado ao outro. Fig. 10-8 Embrião felino, 17 mm CCN. 1: Placa do teto; 2: Canal central; 3: Zona ependimária; 4: Zona marginal; 5: Placa do assoalho; 6: Gânglio espinhal; 7: Placa basal; 8: Placa alar. Tabela 10-2 Origem das estruturas no sistema nervoso central 199 A medula espinhal madura é organizada de forma semelhante ao padrão embrionário, exceto que as placas basais e alares se tornam subdivididas em componentes somáticos e viscerais. A transformação da medula espinhal embrionária para a madura (Fig. 10-9) resulta da proliferação, movimento celular assimétrico de neurônios imaturos na camada intermediária e o desenvolvimento de processos neuronais. Neste decurso, a camada intermediária adquire uma forma de borboleta, com cornos cinza proeminentes dorsal e ventralmente, ao redor do canal central. Adicionalmente aos cornos eferentes ventrais e aos aferentes dorsais, uma pequena projeção lateral de substância cinzenta pode ser observada entre as colunas dorsal e ventral na região espinhal da torácica 1 (T1) até a lombar 2 (L2). Este é o corno lateral, que contém corpos celulares de neurônios autonômicos simpáticos (eferentes viscerais). 200 Fig. 10-9 Cão adulto, secção transversal através da medula espinhal. 1: Corno dorsal (sensorial); 2: Corno ventral (motor); 3: Funículo dorsal; 4: Funículo ventral; 5: Canal central; 6: Dura-máter; 7: Funículo lateral. A camada marginal evolui para a substância branca da medula espinhal, denominada desta forma em razão de seu aspecto esbranquiçado que resulta da predominância de axônios mielinizados. Esta camada externa contém tratos de axônios ascendentes e descendentes que são agrupados em feixes (funículos). Os funículos dorsais, laterais e ventrais estão separados pelas raízes nervosas espinhais eferentes que emergem da medula e raízes aferentes que penetram na medula (Fig. 10-9). Gânglios da raiz dorsal e nervos espinhais Assim como o descrito mais amplamente no Capítulo 8, as células da crista neural migram dos bordos das pregas neurais e dão origem a gânglios espinhais (gânglios da raiz dorsal) ou sensoriais dos nervos espinhais, assim como muitos outros tipos celulares, incluindo outros tipos de células dos gânglios (gânglios sensoriais, gânglios eferentes viscerais gerais do sistema simpático e parassimpático), células de Schwann, melanócitos, odontoblastos e mesênquima dos arcos faríngeos. Os neuroblastos dos gânglios espinhais desenvolvem dois processos, os quais prontamente se unem em formato de T (neurônios pseudounipolares). Ambos os 201 processos das células de gânglios espinhais possuem características estruturais de axônios, mas os processos periféricos podem ser funcionalmente classificados como um dendrito na maneira em que a condução no seu interior ocorre em direção ao corpo celular. Os processos que se estendem centralmente entram na porção dorsal do tubo neural e constituem a raiz dorsal aferente da medula espinhal. Na medula espinhal, eles formam sinapses com interneurônios dos cornos dorsais aferentes ou ascendem pelas camadas marginais para um dos centros cerebrais altos. Os processos que crescem perifericamente se unem às fibras da raiz ventral para formar o tronco do nervo espinhal, pelo qual eles terminam em receptores sensoriais. O tronco comum do nervo espinhal quase imediatamente se divide em um ramo dorsal e um ventral. Os ramos dorsais dos nervos espinhais inervam a musculatura axial dorsal, articulações vertebrais e a pele do dorso. Os ramos primários ventrais inervam os membros e a parede ventral do corpo, e formam os dois principais plexos nervosos, os plexos braquial e o lombossacral. Alterações posicionais da medula espinhal: ascensão da medula espinhal Inicialmente, a medula espinhal percorre toda a extensão do embrião com os nervos espinhais passando pelos forames intervertebrais nos níveis de sua origem. Mais adiante, no entanto, a coluna vertebral e a dura crescem mais rapidamente do que a medula espinhal, deixando a extremidade posterior da medula com o término gradualmente em um nível mais alto na coluna vertebral (Fig. 10-10). Este fenômeno é chamado de ascensão da medula espinhal. O crescimento desproporcional também força os nervos espinhais a percorrerem obliquamente da medula espinhal para os seus forames vertebrais correspondentes. 202 Fig. 10-10 Porção terminal da medula espinhal bovina em relação ao final da coluna vertebral em dois estágios (A: 3 meses de gestação, B: adulto) do desenvolvimento. 1: Segmentos da coluna espinhal, de cranial até caudal; 1-6: Parte lombar; I-VI: Parte sacral; 1-3: Parte coccígea; 2: Nervo espinhal; a: coluna vertebral; b: sacro; c: vértebras coccígeas; d: cauda eqüina. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Em animais adultos a medula espinhal termina ao nível L2 até L3, dependendo da espécie. O saco dural circundante e o espaço subaracnoide se estendem mais posteriormente, geralmente até a sacral 2 (S2). Da extremidade posterior da medula espinhal, uma extensão glial e ependimária em forma de linha corre posteriormente, o fio terminal, o qual se liga ao periósteo das primeiras vértebras coccígeas. Os feixes de fibras nervosas que percorrem posteriormente no interior na coluna vertebral formam a cauda equina. Para se coletar fluido cerebroespinhal durante uma punção lombar, a agulha deve ser inserida nos níveis lombares inferiores, de 203 forma a se evitar atingir a porção mais baixa da medula espinhal. Desenvolvimento do cérebro Os dois terços anteriores do tubo neural desenvolvem o cérebro. A fusão das pregas neurais na região anterior e o fechamento do neuroporo anterior resultam na formação das três vesículas cerebrais primárias (Figs. 10-11, 10-12) das quais o cérebro evolui. Uma expansão na extremidade mais rostral do tubo neural forma a primeira vesícula cerebral, o prosencéfalo ou encéfalo anterior. As vesículas ópticas crescem como evaginações de cada lado do prosencéfalo. As duas regiões aumentadas do cérebro posteriores a esta se tornam o mesencéfalo e o rombencéfalo (segunda e terceira vesículas primárias cerebrais). O prosencéfalo se divide parcialmente em duas vesículas, o telencéfalo e o diencéfalo (Figs. 10-13, 10-14). Asparedes laterais do telencéfalo logo se tornam abobadadas, antecipando os futuros hemisférios cerebrais. O diencéfalo permanece não dividido, localizado na linha média e conectado às vesículas ópticas que se expandem lateralmente. O rombencéfalo também se divide em porções rostral e posterior: o metencéfalo e o mielencéfalo, respectivamente (Figs. 10-14, 10-15). O metencéfalo dará origem à ponte e ao corpo trapezoide ventralmente, e ao cerebelo dorsalmente. O mielencéfalo forma a medula oblonga, a qual é a parte mais posterior do tronco encefálico e o conecta à medula espinhal (Figs. 10-14, 10-16). 204 Fig. 10-11 Embrião ovino com três vesículas cerebrais. 1: Prosencéfalo; 2: Mesencéfalo; 3: Rombencéfalo; 4: Placode ótico; 5: Coração; 6: Mesonefro; 7: Parede do corpo. 205 Fig. 10-12 Embrião felino, 10 mm CCN, secção longitudinal, estágio de três vesículas cerebrais. 1: Prosencéfalo; 2: Mesencéfalo; 3: Rombencéfalo com flexura pontina (seta); 4: Flexura cefálica; 5: Flexura cervical; 6: Primórdio da neuro-hipófise; 7: Bolsa de Rathke, primórdio da adeno-hipófise; 8: Cavidade oral primária; 9: Língua; 10: Coração; 11: Pulmão; 12: Mesonefro; 13: Intestino. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 206 Fig. 10-13 Desenvolvimento do cérebro felino ao dia 18 (A), dia 22 (B) e dia 25 (C). A: 1: Prosencéfalo; 2: Mesencéfalo; Rombencéfalo; 4: Medula espinhal; 5: Vesícula óptica. B: 1: Telencéfalo; 2: Diencéfalo; 3: Mesencéfalo; 4: Rombencéfalo; 5: Infundíbulo; 6: Pedúnculo da vesícula óptica. C: 1: Primórdio do corpo mamilar; 2: Infundíbulo; 3: Hipotálamo; 4: Quiasma óptico; 5: Lâmina terminal; 6: Placa comissural; 7: Bulbo olfatório; 8: Hemisfério cerebral; 9: Teto do 3° ventrículo; 10: Tálamo; 11: Primórdio da epífise; 12: Comissura caudal; 13: Metatálamo; 14: Corpos quadrigêmeos; 15: Cerebelo; 16: Membrana tectória; 17: Flexura cervical; 18: Cruz cerebral; 19: Ponte; 20: Medula oblonga. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Fig. 10-14 Embrião felino, 17 mm CCN, estágio do desenvolvimento cerebral em cinco vesículas, secção longitudinal, obtido de Rüsse e Sinowatz, 1998. 1: Telencéfalo; 2: Diencéfalo; 3: Mesencéfalo; 4: Metencéfalo; 5: Mielencéfalo; 6: Hipófise; 7: Língua; 8: Esôfago. Cortesia de Sinowatz e Rüsse (2007). 207 Fig. 10-15 Embrião porcino, dia 21.5, secção longitudinal através do metencéfalo e do mielencéfalo. 1: Placa do teto do 4° ventrículo; 2: Neurômeros do rombencéfalo; 3: Mielencéfalo. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Fig. 10-16 Desenvolvimento do cérebro felino ao dia 33. 1: Bulbo olfatório; 2: Hemisfério cerebral; 3: Epitálamo; 4: Primórdio dos corpos quadrigêmeos; 5: Colículos caudais; 6: Cerebelo; 7: Membrana tectória; 8: Flexura cervical; 9: Medula oblonga; 10: Ponte; 11: Cruz cerebral; 12: N. óptico. 208 Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). As flexuras cerebrais O crescimento diferencial das cinco vesículas cerebrais secundárias (telencéfalo, diencéfalo, mesencéfalo, metencéfalo e mielencéfalo) dá origem às flexuras (Fig. 10- 12). Conforme ocorre o dobramento da cabeça, o mesencéfalo se dobra ventralmente para produzir a flexura mesencefálica (flexura cefálica). Uma segunda dobra ventral mais gradual entre o encéfalo posterior e a medula espinhal é denominada flexura cervical. No rombencéfalo, ocorre um pequeno dobramento dorsal, a flexura pontina. A flexura pontina está localizada na futura região pontina e causa um adelgaçamento do teto do encéfalo posterior. A princípio, o cérebro em desenvolvimento apresenta a mesma estrutura básica da medula espinhal, mas as flexuras produzem variações consideráveis no traçado de secções transversais em diferentes níveis do cérebro e nas posições relativas da substância branca e cinzenta. O sulco limitante se estende anteriormente apenas até a junção do mesencéfalo e diencéfalo. Portanto, as placas alares e basais, que são separadas pelo sulco limitante, são apenas reconhecíveis posteriormente a esta junção. No diencéfalo e telencéfalo, porém, as placas alares se tornam acentuadas e a placa basal regride. Rombencéfalo (encéfalo posterior) O rombencéfalo consiste no mielencéfalo, a vesícula cerebral mais posterior, e o metencéfalo, o qual se estende da flexura pontina para o istmo rombencefálico. Posteriormente, a flexura cervical demarca o mielencéfalo da medula espinhal em desenvolvimento. Mais adiante, esta junção é definida como o nível das raízes do primeiro nervo espinhal cervical, aproximadamente no forame magno. Mielencéfalo O mielencéfalo se assemelha à medula espinhal tanto em relação ao seu desenvolvimento quanto estruturalmente e se desenvolve na medula oblonga – a parte posterior do tronco encefálico. A medula oblonga funciona como um canal para os tratos entre a medula espinhal e as regiões mais altas do cérebro e também contém importantes centros para a regulação da respiração e batimentos cardíacos. O arranjo fundamental das placas alares e basais, as quais são separadas pelo sulco limitante como observado na medula espinhal, é mantido quase sem alteração, mas as paredes laterais são invertidas. Isto ocasiona uma expansão pronunciada da 209 placa do teto, fechando o canal central dorsalmente, e um alargamento do canal do quarto ventrículo. A placa do teto do mielencéfalo é reduzida a uma camada única de células ependimárias que está coberta por células mesenquimais formando a pia- máter. A proliferação ativa do mesênquima vascular produz numerosas invaginações em fundo de saco para o quarto ventrículo subjacente. Elas formam o plexo coroide, que produz o fluido cerebroespinhal. Como resultado, em vez de estarem arranjadas dorsoventralmente, as placas alares e basais passam a ficar dispostas no assoalho do encéfalo posterior como as páginas de um livro aberto, de modo que as áreas eferentes das placas basais tornam- se dispostas medialmente às áreas aferentes das placas alares. A cavidade desta parte do mielencéfalo (parte posterior do futuro quarto ventrículo) adquire um formato romboide. As placas basais, assim como na medula espinhal, contêm os núcleos (agregados de corpos celulares de neurônios) de nervos eferentes. De cada lado, estes núcleos estão arranjados em três grupos (Tabela 10-3). O primeiro é o grupo eferente somático geral medial, representado pelos neurônios dos nervos hipoglosso (XII) e acessório (XI), uma continuação cefálica do corno ventral da medula espinhal. Este grupo eferente somático geral se expande rostralmente para o mesencéfalo e é também denominado coluna motora eferente somática geral. O segundo grupo é o grupo eferente visceral especial intermediário, representado por neurônios que inervam músculos derivados dos arcos (branquiais) faríngeos (os nervos glossofaríngeo (IX), vago (X) e acessório (XI) que inervam a musculatura do terceiro e quarto arcos faríngeos). O terceiro, o grupo eferente visceral geral, é representado pelos neurônios do nervo vago (X) e glossofaríngeo (IX). Os axônios dos neurônios do vago suprem as vísceras torácicas e abdominais e o coração, enquanto os axônios dos neurônios do glossofaríngeo suprem a glândula parótida. Tabela 10-3 Regiões funcionais do cérebro e medula espinhal Placa alar (aferente ou sensorial) Aferente somático geral Estímulo da pele, articulações e músculos Aferente visceral especial Estímulo de papilas gustativas e faringe Aferente visceral geral Estímulo das vísceras e coração Placa basal (eferente motor ou autonômico) Eferente visceral geral Ligação autonômica entre o corno intermediário e as vísceras Eferente visceral especial Nervos motores para músculos estriados dos arcos branquiais Eferente somático Nervos motores para os outros músculos estriados que não os dos nervos 210 geral do arco branquial Os neuroblastos das placas alares no mielencéfalo migram para a zona marginal e formam áreas isoladas de substância cinzenta, os núcleos gráceis medialmente e os núcleos cuneiformes lateralmente. Estes núcleos estão associados aos tratos ascendentes correspondentes da medula espinhal no interiordo funículo dorsal. Outro grupo de neuroblastos das placas alares migra ventralmente e forma os núcleos olivares. Ainda, outros neuroblastos das placas alares agrupam-se em núcleos que estão arranjados em quatro colunas de cada lado. Estas são, em ordem de lateral até medial: (1) aferente somática especial, recebendo impulsos da orelha interna; (2) aferente somática geral, que recebe estímulos da superfície da cabeça; (3) aferente visceral especial, recebendo estímulos das papilas gustativas, e (4) aferente visceral geral, a qual recebe impulsos das vísceras. Metencéfalo O metencéfalo representa a porção anterior do rombencéfalo (Figs. 10-17, 10-18). Ele se desenvolve em duas partes principais: a ponte, uma estrutura transversa que demarca a extremidade anterior da medula oblonga, e o cerebelo, uma estrutura de desenvolvimento recente do ponto de vista filogenético, mas tardia ontogeneticamente, que atua como centro de coordenação de postura e movimento. Foi demonstrado em camundongos que o desenvolvimento destas estruturas depende da expressão do gene engrailed-1 nesta área durante o início do desenvolvimento. 211 Fig. 10-17 Desenvolvimento pré-natal do cérebro e cerebelo bovino. A: dia 60; B: dia 65; C: dia 80; D: dia 120; E: dia 180. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 212 Fig. 10-18 Desenvolvimento do metencéfalo bovino do dia 65 até o dia 120 da gestação; secções medianas. A: dia 65. 1: Ponte; 2: Medula oblonga; 3: Vermis; 4: Fissura pós-culminata; 5: Fissura uvulonodular; 6: Lobo floculonodular; 7: Plexo coroide do 4° ventrículo; 8: 4° ventrículo. B: dia 80. 1: Ponte; 2: Medula oblonga; 3: Lobo rostral; 4: Fissura pós-culminata; 5: Lobo caudal; 6: Fissura pós-piramidal; 7: Fissura floculonodular; 8: Lobo floculonodular; 9: 4° ventrículo; 10: Véu medular rostral; 11: Véu medular caudal; 12: Plexo coroide. C: dia 120. 1: Ponte; 2: Medula oblonga; 3: Gânglio trigêmeo; 3’: Núcleo sensitivo pontino dos n. trigêmeos; 3”: Núcleo do trato mesencefálico; 3’: Núcleo do trato espinhal dos n. trigêmeos; 4: Véu medular rostral; 5: Véu medular caudal; 6: Fissura pós-culminata; 7: Fissura pós-piramidal; 8: Pirâmide; 9: Úvula; 10: Fissura uvulonodular; 11: Lobo floculonodular. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 213 O metencéfalo, tal qual o mielencéfalo, é caracterizado pelas placas basais e alares, mas com destinos diferentes de desenvolvimento. Assim como nas partes anteriores do mielencéfalo, a flexura pontina causa uma divergência das paredes laterais e, portanto, as placas alares novamente se situam laterais às placas basais, no lugar de estarem arranjadas dorsoventralmente. Cada placa basal do metencéfalo contém três grupos de neurônios motores: (1) o grupo eferente somático geral medial, que forma o núcleo do nervo abducente (VI); (2) o grupo eferente visceral especial intermediário, que dá origem aos núcleos dos nervos trigêmeo (V) e facial (VII), inervando a musculatura do primeiro e segundo arco faríngeo; e (3) o grupo eferente visceral geral que origina o núcleo do nervo facial (VII), suprindo as glândulas mandibulares e sublinguais. Alguns neurônios da placa alar migram ventralmente para formar os núcleos pontinos. Os axônios que partem dos neurônios no córtex cerebral terminam nos núcleos pontinos. Ventralmente, os axônios destes neurônios pontinos formam uma faixa superficial de fibras nervosas conhecidas como as fibras transversas da ponte. O cerebelo, um derivado da placa alar, é formado no teto do metencéfalo e é tanto estrutural quanto funcionalmente muito complexo (Fig. 10-17). Ele surgiu filogeneticamente como uma especialização do sistema vestibular e adquiriu outras funções importantes (como a orquestração da coordenação geral, e envolvimento nos reflexos auditivos e visuais) durante sua evolução. Tanto a morfologia do cerebelo quanto o arranjo espacial dos seus neurônios foram altamente conservados durante a evolução. As falhas do desenvolvimento do cerebelo causam anormalidades de locomoção e postura (Cap. 19). Os primórdios do cerebelo são os lábios rômbicos, regiões dorsolaterais das placas alares do metencéfalo. Foi descrito em camundongos que os lábios rômbicos se estendem entre os rombômeros 1–8, mas o próprio cerebelo é derivado apenas do lábio rômbico anterior (r1). As porções mais posteriores dos lábios rômbicos (r2–r8) dão origem às células precursoras migratórias que formam uma variedade de núcleos localizados ventralmente, incluindo-se os núcleos olivares e pontinos. Observados de cima, os lábios rômbicos parecem ser estruturas em formato de “V”. Sendo assim, os lábios rômbicos estão próximos uns aos outros na região anterior e mais afastados posteriormente, onde eles se unem ao mielencéfalo. Rostralmente, as extensões mediais dos lábios rômbicos estão fusionadas por um istmo. Como resultado de um maior aprofundamento da flexura pontina, os lábios rômbicos se comprimem anteroposteriormente e formam a placa cerebelar. Durante o período fetal precoce, o cerebelo em desenvolvimento se expande dorsalmente, formando uma estrutura semelhante a um haltere com uma fissura transversa dividindo-o em uma porção grande anterior e uma porção menor 214 posterior. A parte medial da região anterior dá origem ao vermis, e as áreas laterais se desenvolvem nos hemisférios do cerebelo. A região anterior cresce consideravelmente e mais tarde se torna o componente dominante do cerebelo maduro. Este aumento é caracterizado por um dobramento marcante da superfície, resultando em pregas próximas, transversas e paralelas – as folhas cerebelares. A porção posterior evolui para os lobos floculonodulares pareados. Eles são considerados como as estruturas filogeneticamente mais antigas do cerebelo e estão associados ao desenvolvimento do aparato vestibular. Inicialmente, a placa cerebelar consiste em camadas neuroepiteliais, intermediárias e marginais. Durante o início do período fetal as células do neuroepitélio migram pelas camadas intermediária e marginal para a superfície do cerebelo, onde elas são arranjadas em uma segunda camada germinal, a camada granular externa (Fig. 10-19). As células desta camada ainda são capazes de se dividir mitoticamente e mais adiante dão origem a vários tipos celulares, entre os quais células granulosas, células em cesto e células estreladas. As células granulosas são com grande vantagem a maior população formada pela camada granular externa. Fig. 10-19 Diferenciação histológica do cerebelo (secção sagital). A e B: Os neuroblastos migram do neuroepitélio (1) para a superfície do cerebelo e formam uma camada granular externa (2). As células desta camada retêm sua capacidade de se dividirem e formam uma zona proliferativa na superfície do cerebelo. C: Mais adiante no desenvolvimento, as células da camada granular externa dão origem a vários tipos celulares que migram em direção ao interior e passam pelas células de Purkinje em diferenciação (3). Elas dão origem às células granulares do córtex cerebelar definitivo. As células em cesto e estreladas são produzidas pelas células em proliferação na substância branca cerebelar. 4: Neurônios do núcleo dentado. 215 Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). As células remanescentes na camada neuroepitelial se dividem e formam a camada germinativa interna. Os neuroblastos que se originam da camada germinativa interna migram para o hemisfério cerebelar onde eles se estabelecem em três grupos pareados logo acima do epêndima do quarto ventrículo, como precursores dos núcleos cerebelares (o núcleo dentado, núcleo interposto e núcleo fastigial), que são responsáveis por retransmitir sinais do e para o córtex cerebelar. As células da camada germinativa interna também migram em direção da camada granular externa, onde elas se diferenciam em células de Purkinje. Os corpos celulares das células de Purkinje se tornam alinhados em uma camada única abaixo da camada granular externa. Cada um destes neurônios desenvolve uma ampla arborização dendrítica superficial, em um plano único transversal ao eixo longitudinaldo fólio. Em fetos bovinos, a camada de células de Purkinje já está desenvolvida no dia 100 da gestação. Após sua última divisão mitótica, as células granulares externas se tornam neurônios bipolares imaturos, e seus axônios correm em paralelo ao eixo longitudinal do fólio. Concomitantemente, os corpos celulares das células granulares externas sofrem uma segunda migração orientada para o centro, em direção ao interior do futuro cerebelo. No trajeto, estas células passam pela camada de precursores das grandes células de Purkinje e estabelecem inúmeras sinapses com eles (Fig. 10-19). Quando elas passam, as células de Purkinje formam uma espessa camada no córtex cerebelar denominada camada granular, a qual é mais larga sobre o centro de cada fólio e mais delgada ao redor dos sulcos entre eles. De cada célula granular, um único axônio percorre superficialmente e se bifurca na região dos dendritos das células de Purkinje. Estes axônios, chamados de fibras paralelas, atravessam as folhas cerebelares perpendicularmente ao plano das árvores dendríticas das células de Purkinje. Cada célula de Purkinje faz contato sináptico com centenas de milhares de fibras paralelas. Os mecanismos exatos que controlam a migração celular no cerebelo são amplamente desconhecidos, mas já foi estabelecido que um tipo especial de célula da glia (células da glia radial) guia a migração radial das células de Purkinje. A migração para o interior feita pelas células granulares externas esvazia a zona exterior do córtex cerebelar, a qual passa a ser referida como camada molecular. Desta maneira, na sua forma final o córtex cerebelar apresenta três camadas claramente separadas: uma camada molecular externa, a camada de células de Purkinje e uma camada granular interna (Fig. 10-20). 216 Fig. 10-20 Secção histológica do córtex cerebelar diferenciado de um cão adulto. 1: Camada molecular; 2: Camada de células de Purkinje; 3: Camada granular. O quanto o cerebelo se encontrará desenvolvido ao nascimento se correlaciona com a idade na qual o animal se torna capaz de ficar em pé e se locomover. Em carnívoros, grande parte da diferenciação do córtex cerebelar ocorre no período pós- natal. Filhotes de gatos e cães não andam de forma coordenada até cerca de 3 semanas pós-parto. Na época do nascimento, há apenas alguma estratificação da camada intermediária e na camada germinativa externa, onde as células ainda estão se dividindo ativamente. As outras camadas são formadas durante as duas primeiras semanas pós-natais, conforme se inicia a migração para o interior da camada germinativa externa. O pico de desenvolvimento da camada germinativa externa ocorre por volta de 7 dias e ela começa a se reduzir em tamanho por volta de 14 dias pós-natais, assim que a camada granular definitiva se estabelece. A diferenciação da camada de células de Purkinje em gatos e cães é completada no vermis ao final do dia 30 pós-parto e no restante do cerebelo por volta de 10 semanas. Em bezerros e potros (precoces e capazes de permanecerem em pé e andarem cerca de uma hora após o nascimento) o cerebelo é muito mais diferenciado e funcional ao nascimento. Em fetos bovinos a camada germinativa externa surge por volta do dia 57 da gestação e alcança espessura máxima próximo ao dia 183. Embora a camada germinativa externa ainda seja reconhecível no momento do nascimento destas espécies, as três camadas definitivas do cerebelo maduro já estão aparentes. A camada germinativa externa se torna gradualmente ausente de células durante os primeiros meses pós-natais e por fim desaparece. Durante esse período, a capacidade funcional do cerebelo amadurece, evidenciada pelo aparecimento dos reflexos “aprendidos” (p. ex., reflexos posturais) e locomoção mais bem coordenada. 217 Mesencéfalo (encéfalo médio) O mesencéfalo (encéfalo médio) permanece como uma estrutura relativamente simples e as relações fundamentais entre as placas basais e alares são essencialmente preservadas. A parte do mesencéfalo dorsal ao aqueduto se torna o teto e forma os corpos quadrigêmeos, derivados das placas alares. Ventralmente ao aqueduto as placas basais formam o tegmento, o qual contém os núcleos eferentes dos nervos oculomotor (III; eferente somático geral e eferente visceral geral) e troclear (IV; eferente somático geral). Seus axônios suprem a maioria dos músculos extrínsecos que movem o globo ocular. Um núcleo eferente visceral especial relativamente pequeno, o núcleo de Edinger-Westphal, inerva o músculo do esfíncter pupilar do olho pelo nervo oculomotor (III). Ainda não está claro se os núcleos vermelhos e a substância negra são derivados da placa basal ou por migração dos neurônios da placa alar. Os neurônios da camada intermediária tanto das placas alares como basais contribuem para a formação reticular, um agregado de células nervosas concentradas em núcleos ao redor do aqueduto que se estende do mielencéfalo para o diencéfalo e está relacionado ao estado de consciência do animal. A camada marginal, associada a cada placa basal, cresce consideravelmente e forma a cruz cerebral. As cruzes (pedúnculos cerebrais) servem como vias para os axônios descendo do córtex cerebral para centros mais baixos no metencéfalo e medula espinhal. Estas fibras são corticonucleares e corticoespinhais (piramidais), respectivamente. Os neuroblastos das placas alares migram para o teto do mesencéfalo e formam protuberâncias longitudinais proeminentes, separadas por uma depressão medial rasa. Estas elevações são separadas por um sulco transversal que divide cada uma em colículos rostrais e caudais. Os colículos caudais são relativamente simples em sua estrutura e possuem funções auditivas. Os colículos rostrais apresentam uma arquitetura de estratificação mais complexa e são parte integral do sistema visual. Em vertebrados inferiores, os colículos rostrais atuam como centros de integração primários dos estímulos visuais. Em mamíferos os neurônios dos colículos rostrais enviam seus axônios para núcleos motores apropriados via os tratos tetoespinhais e tetobulbares. Os colículos rostrais estão envolvidos em movimentos oculares subconscientes. Em mamíferos superiores, a função dos colículos rostrais também depende de estímulo vindo do córtex visual. Lesões corticais produzem cegueira total aparente. Em pássaros, o lobo óptico, o equivalente dos colículos rostrais, provém todas as funções visuais. As conexões entre os colículos rostrais e caudais coordenam os reflexos visuais e auditivos. 218 Prosencéfalo (encéfalo anterior) O prosencéfalo é a mais anterior das três vesículas cerebrais primitivas. A parte anterior do prosencéfalo, o telencéfalo, forma os hemisférios cerebrais e os bulbos olfatórios. A parte posterior do prosencéfalo, o diencéfalo, dá origem ao epitálamo incluindo-se a glândula pineal, tálamo, metatálamo e hipotálamo, assim como a neuro-hipófise e os cálices ópticos. A cavidade que se desenvolve no interior do diencéfalo é o terceiro ventrículo. As cavidades no telencéfalo formam os ventrículos laterais. Todas as estruturas prosencefálicas (telencéfalo e diencéfalo) são consideradas derivadas das placas alares e do teto altamente modificadas, sem representação significativa das placas basais. Isto é corroborado pelo fato de o sulco limitante, o qual separa as placas alares e basais em vesículas cerebrais mais posteriores, não se estender anteriormente além do mesencéfalo. O interessante é que estudos moleculares em camundongos demonstraram que a sonic hedgehog (Shh), marcadora da linha média ventral, é expressa em partes ventrais do diencéfalo, denotando possível existência de uma placa basal, pelo menos nesta espécie. Diferenciação da região prosencefálica Os distintos padrões de expressão gênica influenciam fortemente a organização regional básica do prosencéfalo. Seis dos chamados prosômeros se estendem da junção prosencefálica-mesencefálica para a ponta anterior do prosencéfalo. Os prosômeros 1 até 3 (p1– p3, o mais posterior), tornam-se incorporados ao diencéfalo, e p2 e p3 contribuemsignificativamente com o tálamo. P4 até p6 contribuem tanto para estruturas diencefálicas quanto telencefálicas. A área basal de p4 até p6 se desenvolve nas principais regiões que integram as funções nervosas autonômicas e controlam a liberação de hormônios pela pituitária. As placas alares destes domínios se desenvolvem em estruturas que incluem o córtex cerebral, gânglios da base e vesículas ópticas. Conforme o desenvolvimento avança, a combinação de p2 e p3 realiza uma dobra acentuada posteriormente, para cima de p4 a p6. Em humanos foi demonstrado que um enorme crescimento da placa alar de p4 até p6 forma as vesículas encefálicas, as quais envolvem os demais prosômeros e formam, mais tarde, o córtex cerebral. Diencéfalo O desenvolvimento do diencéfalo é caracterizado pelo aparecimento de três pares de intumescências no aspecto medial da parede lateral do diencéfalo (Fig. 10-21). Elas 219 formam um primórdio epitalâmico dorsal, um talâmico intermediário e um hipotalâmico ventral de cada lado. O maior par de massas está representado pelo tálamo em desenvolvimento, que está separado por um canal, o sulco hipotalâmico, do hipotálamo situado ventralmente (Fig. 10-22). As massas hipotalâmicas, originalmente pareadas, se fundem mais adiante para formar uma única estrutura que se torna um grande centro regulatório. Ela se diferencia em várias áreas nucleares que controlam muitas funções homeostáticas básicas como o sono, temperatura corpórea, fome, balanço de fluidos e eletrólitos, comportamento emocional e atividade da pituitária. Os núcleos subtalâmicos pareados, os corpos mamilares, podem ser observados como protuberâncias distintas da superfície medioventral do hipotálamo. Fig. 10-21 Embrião porcino, dia 21,5. 1: Diencéfalo; 2: Retina; 3: Lente; 4: Epitélio pigmentado da retina; 5: Estomódeo. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). 220 Fig. 10-22 Embrião canino, 35 mm CCN, secção coronal. I e II: ventrículos laterais; III: terceiro ventrículo. 1: Tálamo; 2: Hipotálamo; 3: Corpo estriado; 4: Hemisférios cerebrais; 5: Plexo coroide; 6: Olho; 7: Cavidade nasal; 8: Sutura dos processos palatinos laterais; 9: Cavidade oral; 10: Língua; 11: Botões dentários; 12: Mandíbula. Cortesia de Rüsse e Sinowatz (1998). Os primórdios talâmicos altamente proliferativos gradualmente se projetam para o lúmen do diencéfalo. Em animais domésticos esta expansão é geralmente tão grande que as regiões talâmicas de ambos os lados se fusionam na linha média, formando a adesão intertalâmica ou massa intermédia. A região central do canal neural ventricular expandido do diencéfalo consequentemente se torna obliterada resultando em um terceiro ventrículo em formato de anel (Fig. 10-22). Ventralmente à adesão, o terceiro ventrículo forma uma fenda vertical entre as paredes do hipotálamo em desenvolvimento que se estende em direção ventral para o pedúnculo da neuro-hipófise. Dorsalmente à adesão intertalâmica, o terceiro ventrículo está coberto pela placa do teto (reduzida a uma única camada de células ependimárias) e por mesênquima vascular. Esta camada combinada forma o plexo coroide do terceiro ventrículo e ventrículos laterais. No tálamo, tratos neurais de centros cerebrais mais altos fazem sinapses com aqueles de outras regiões do cérebro e tronco encefálico. Desta forma, o tálamo atua como um centro importante para retransmitir impulsos sensoriais (auditivos, visuais e táteis), em conjunto com sinais dos gânglios da base e cerebelo, para as áreas correspondentes do córtex cerebral. 221 No aspecto dorsolateral dos primórdios talâmicos, o metatálamo forma os corpos geniculados medial e lateral, estruturas que fazem conexão com os colículos rostrais e caudais, respectivamente, para retransmitir impulsos visuais e auditivos. Epífise (glândula pineal) A porção mais posterior da placa do teto do diencéfalo desenvolve um pequeno divertículo. No interior dele, a proliferação celular produz a epífise (incluindo a glândula pineal) como uma estrutura em formato de cone. O cone permanece aderido ao teto do diencéfalo pelas habênulas, dois finos pedúnculos de fibras nervosas que também contêm alguns aglomerados de neurônios (núcleos habenulares). As células neuroepiteliais se diferenciam em dois tipos celulares, os pinealócitos e as células gliais. Os pinealócitos desenvolvem processos celulares e liberam um hormônio, a melatonina, para os capilares ao seu redor ou para o fluido cerebroespinhal do terceiro ventrículo. A glândula pineal está envolvida no controle do ritmo circadiano. Na ausência de luz, ela produz melatonina, a qual possui atividade antigonadotrópica e inibe a função do eixo pituitário-gonadal em algumas espécies, como as éguas, mas tem efeito oposto em outras espécies, como em ovelhas (Cap. 3). A produção de melatonina pela glândula pineal está sob a influência do núcleo supraquiasmático do hipotálamo, que recebe informações da retina sobre o padrão diário de luz e escuridão. Dados recentes em animais de experimentação sugerem que é principalmente o núcleo supraquiasmático que controla o ciclo diário, e não o sinal da melatonina, como foi postulado anteriormente. Hipófise (glândula pituitária) A hipófise se desenvolve de duas partes consideravelmente separadas: (1) uma protrusão ectodérmica do estomódeo imediatamente à frente da membrana bucofaríngea, conhecida como bolsa de Rathke, formando a adeno-hipófise, e (2) um crescimento inferior ventral do diencéfalo, o infundíbulo, formando a neuro-hipófise. Quando o estomódeo é formado inicialmente, o ectoderma do seu aspecto dorsal está próximo do neuroectoderma ventral do diencéfalo (Fig. 10-23). No local da aposição, o ectoderma do estomódeo se espessa e invagina, formando a bolsa de Rathke (ou adeno-hipofisária). A extremidade distal desta bolsa cresce em direção do primórdio infundibular, dorsal e adjacente à bolsa de Rathke. Uma vez em contato próximo com a borda anterior do infundíbulo em formação, a bolsa se achata novamente enquanto ainda está anexada ao revestimento do estomódeo por um pedúnculo epitelial. A conexão é perdida alguns dias mais tarde e o epitélio na borda anterior da bolsa prolifera e passa a formar cordões e blocos de células. Observa-se uma menor proliferação na porção da bolsa de Rathke que está em 222 contato com a neuro-hipófise em desenvolvimento. A proliferação celular na borda rostral continua em grau variável, dependendo da espécie, e forma a adeno-hipófise. As células da adeno-hipófise circundam àquelas da neuro-hipófise em extensões variáveis, muito intensamente em suínos. Fig. 10-23 Desenvolvimento da hipófise felina (áreas delimitadas por quadros). A: 5 mm CCN. 1: Prosencéfalo; 2: Membrana bucofaríngea; 3: Estomódeo; B: 11 mm CCN. 1: Telencéfalo; 2: Diencéfalo; 3: Evaginação do infundíbulo do diencéfalo: primórdio da neuro- hipófise. 4: Bolsa de Rathke: primórdio da adeno-hipófise. C: 14 mm CCN. 1: Telencéfalo; 2: Diencéfalo; 3: Adeno-hipófise; 4: Neuro-hipófise; 5: Canal craniofaríngeo; 6: Osso esfenoide. Telencéfalo O desenvolvimento do telencéfalo é dominado por uma enorme expansão das vesículas telencefálicas, as quais dão origem aos dois hemisférios cerebrais que crescem superando completamente as partes anteriores do tronco encefálico (Figs. 10-17, 10-24). As paredes das vesículas telencefálicas rodeiam os ventrículos laterais em expansão, os quais são protrusões do terceiro ventrículo, comunicam-se com ele via os forames interventriculares. 223 Fig. 10-24 Embrião porcino, dia 21,5, secção sagital do telencéfalo. 1: Hemisfério cerebral; 2: Ventrículo lateral; 3: Gânglios da base; 4: Plexo coroide. Embora os hemisférios cerebrais se expandam muito durante o início da gestação, sua superfície externa permanece lisa. Mais adiante, eles são submetidos a dobramentos em vários níveis de organização e diversos sulcos e fissuras principais começam a aparecer. Ao término da gestação a superfície de cada hemisfério se torna dobrada e desenvolve sulcos (fendas) e giros (elevações) espécie-específicos, característicosmomento para estudos anatômicos e, felizmente, coincidiu com a invenção da impressão de livros por Johann Gutenberg. Assim, a principal publicação importante em embriologia comparada foi De Formato Foetu em 1600 pelo o anatomista italiano Hieronymus Fabricius de Acquapendente (1533-1619). Fabricius descreveu e ilustrou a anatomia macroscópica de embriões e suas membranas nesse livro, mas não foi o primeiro a fazer isso; outro anatomista italiano, Bartolomeu Eustáquio (1514- 1574), tinha previamente publicado ilustrações de embriões de cães e ovelhas em 1552. Portanto, podemos reconhecer o nome de Fabricius, no termo bursa Fabricii (porção imunologicamente competente do intestino de aves), e de Eustáquio na trompa de Eustáquio. Os trabalhos de Eustáquio e Fabricius e outros autores forneceram uma ideia de como os órgãos desenvolvem a sua forma imatura para a maturidade, mas deixa sem resposta o enigma básico de como e onde os embriões mamíferos se originam. No entanto, o desenvolvimento do microscópio por Zacarias Janssen, fabricante de óculos holandês, em 1590, deu início a uma nova era da ciência embriológica para 25 lidar com essa questão de 2.000 anos. O domínio holandês no campo óptico não foi apenas uma coincidência; as ambições navais de seu império necessitavam de excelentes telescópios e sistemas de lentes. O microscópio de Janssen em sua forma original, na verdade, não era apropriado para pesquisas com células e tecidos. O microscópio media 2 metros de comprimento, tinha uma resolução de apenas 10 a 20 vezes, e seu principal uso era atrair atenções em feiras de exposição! Em 1672, o médico italiano Doutor Marcelo Malpighi (1628-1694) publicou os primeiros relatos microscópicos do desenvolvimento de galinhas, identificando o sulco neural, os somitos e a circulação de sangue nas artérias e veias do vitelo. Malpighi observou ovos de galinhas não incubados consideravelmente estruturados, levando-o a acreditar que uma versão pré-formada residia no ovo. Mais tarde (1722), o oftalmologista francês Antoine Maître-Jan (1650-1730) demonstrou que embora o ovo examinado por Malpighi fosse tecnicamente “não incubado”, este foi deixado exposto ao sol de agosto da cidade de Bologna e, portanto, foi previamente “aquecido”. Consequentemente, as noções de Malpighi sobre o embrião pré-formado deram início a grandes debates em embriologia ao longo dos séculos XVII e XVIII. A questão era: os órgãos de embriões eram formados de novo (epigênese), ou eles já estavam presentes em formato de miniatura no ovo (ou no espermatozoide quando estas células foram descobertas), um conceito referido como pré-formação. Iremos retornar a este debate em outro momento. A nova técnica de microscopia também propôs uma vigorosa pesquisa para os gametas de mamíferos. O ovo de galinha e suas transformações iniciais em pintos eram óbvias, como tinha descrito Aristóteles, mas o que intermediava a formação de embriões em mamíferos? Onde era encontrado o ovo nos mamíferos? Um dos maiores precursores e influentes nomes da fascinante história da descoberta do ovo de mamíferos foi William Harvey (1578-1657), médico particular dos reis ingleses James I e Charles I, e famoso por suas descrições da circulação sanguínea. Em 1651, Harvey publicou De Generatione Animalium (Discussões abordando a Geração de Animais) exibindo, na capa, Zeus libertando todas as criaturas de um ovo que trazia a inscrição Ex ovo omnia (Todas as coisas vem do ovo). Entretanto, deve-se, de fato, considerar que as observações de Harvey em alguns pontos impediram o progresso dos conhecimentos de reprodução e embriologia até o século XVII. Depois de ter estudado com Fabricius, Harvey foi imbuído com a visão de Aristóteles de que o sêmen provinha de forças que interagiam com o sangue menstrual para materializar-se como um embrião. Harvey também tentou entender estes processos analisando os materiais no início da concepção em fêmeas de cervos sacrificadas durante a estação de caça do rei Charles I em sua floresta e parques Reais por um período de mais de 12 anos. Nos veados e gamos estudados, verificou-se 26 que a atividade sexual dos machos começava na metade de setembro, então, Harvey dissecou os úteros ao longo dos meses de setembro a dezembro. Acreditando, erroneamente, que a cópula coincidia com o início do cio, Harvey ficou confuso e nada encontrou ao que ele reconhecia como um embrião até metade de novembro, uns dois meses depois. Isso o induziu ao erro, exceto a conclusão absolutamente lógica que “nada após o coito foi encontrado no útero por muitos dias”. Quando ele encontrou o concepto, no qual, para Harvey, era o ovo: “A definição de Aristóteles para um ovo se aplica a ele, isto é, o ovo é aquilo que está fora da parte a qual animal é gerado e o restante é o alimento para que ele seja gerado.” Três fatores de interesse veterinário conduziram este brilhante homem para caminhos desnorteantes. Primeiro, ele não compreendeu que as fêmeas não entravam no cio até o início de outubro e então suas estimativas sobre os dados reprodutivos estavam erradas. Segundo, ele descartou os ovários (“testículo da fêmea”) como parte da concepção, pois eles não cresciam como os testículos dos machos durante a cópula. Terceiro, esperando encontrar um ovo com forma de concepto, ele confundiu a “substância purulenta… friável… e amarelada”, observada logo após o acasalamento, nitidamente descrita como o filamento de blastocisto característico dos ruminantes. Se Harvey tivesse utilizado o microscópio para realizar suas pesquisas em diferentes conceptos (como, coelho ou cavalo) a descoberta do verdadeiro embrião teria avançado consideravelmente! Certamente, é fácil criticar retrospectivamente os fatos, porém, é importante ressaltar que Harvey fez importantes contribuições para a Embriologia. Suas descrições do desenvolvimento inicial foram impecáveis: ele foi o primeiro a observar o blastoderma de embriões de galinhas (a pequena região do ovo continha gema livre de citoplasma que origina o próprio embrião), e a indicar que as ilhas de sangue formam-se antes do coração; ele descreveu o desenvolvimento gradual do embrião, subscrevendo a escola da epigênese como fez Aristóteles. As observações de Harvey e suas pesquisas sobre o ovo dos mamíferos continuaram com Regnier de Graaf (1641-1673) o qual promoveu estudos detalhados dos órgãos reprodutivos femininos, especialmente o ovário. De Graaf, como seu amigo Leeuwenhoek, trabalhou em Delft. Comparando os ovários de mamíferos com os de galinhas, De Graaf considerou o folículo ovariano antral de mamíferos como sendo os ovos. A suposição foi confirmada por degustação! Sua contribuição para a ciência foi reconhecida posteriormente pelo médico alemão doutor Theodor Ludwing Wilhelm Bischoff (1807–1882) que introduziu a nomenclatura “folículo de Graaf”. De Graaf também notou algumas conexões entre a maturação folicular e o desenvolvimento de ovócitos, mas sem um microscópio apropriado, não foi possível afirmar tais fatos e suas observações foram por um bom 27 tempo esquecidas. Provavelmente, se ele tivesse vivido um pouco mais (morreu tragicamente cedo, aos 32 anos de idade), a descoberta do ovo dos mamíferos poderia ter evitado um atraso de cerca de 150 anos! Na verdade, o primeiro cientista a ver o ovo do mamífero (o qual todos acreditavam existir, mas ninguém tinha visto) foi o médico estoniano doutor Karl Ernst von Baer (1792-1876). Ao abrir o “Ovo de Graaf”, como o folículo era conhecido naquele tempo, encontrou um pequeno ponto amarelo e o examinou sob um microscópio (Baer, 1827). A primeira vista, Baer ficou supresso e mal podia acreditar que tinha encontrado o que muitos cientistas famosos como Harvey, De Graaf, Purkinje e outros não conseguiram encontrar. Ele ficou tão entusiasmado que retornou ao microscópico uma segunda vez. O ovo dos mamíferos tinha sido identificado. E quanto ao espermatozoide? Anton van Leeuwenhoek (1632-1723), um comerciante holandês e cientista de Delft, foi o primeiro a relatar o espermatozoidedo cérebro maduro. O padrão externo de sulcos e giros é produzido por um crescimento desigual do córtex e sua substância branca associada. Uma vastidão de eventos celulares internos determina como o telencéfalo funciona. Os detalhes vão além do escopo deste livro e apenas os princípios gerais serão discutidos aqui. Geralmente, o desenvolvimento funcional do telencéfalo se inicia com uma regionalização precoce seguida pela geração e migração direcionada de precursores neurais. A migração é radial e seu padrão é estabelecido em estágios bastante precoces do desenvolvimento embrionário. Os neuroblastos migram da camada ventricular, onde eles são formados, para a superfície externa das vesículas telencefálicas. Existem locais geneticamente predeterminados na camada ventricular do tubo neural que equivalem a áreas particulares da superfície dos hemisférios. Os neuroblastos que se originam em um determinado local e tempo de desenvolvimento irão se estabelecer em pontos definidos do futuro córtex. Esta equivalência depende de células especiais da glia (células da glia radial) que se estendem da camada ventricular do tubo neural para a área correspondente da superfície do hemisfério. Os neuroblastos em migração seguem os processos gliais para atingirem suas destinações específicas. Além da posição no interior do tubo neural, o tempo de migração influencia 224 fortemente o posicionamento de neurônios no córtex cerebral. No córtex maduro, os primeiros neurônios a se organizarem na superfície serão encontrados na camada mais profunda. Conforme mais neurônios deixam a camada ventricular, eles devem migrar pelas camadas de neurônios já presentes. Os últimos neurônios a compor são encontrados nas camadas mais superficiais do córtex cerebral (estratificação de dentro para fora do córtex cerebral). Assim que as células neuronais atingem sua posição final, processos axonais (e, um pouco depois, processos dendríticos) crescem delas para células-alvo específicas ao longo de caminhos estreitamente guiados. Os axônios de células piramidais, por exemplo, passam como grupos longos de fibras (a cápsula interna) entre os gânglios basais e percorrem até células eferentes somáticas gerais da medula espinhal. Na superfície ventral da medula oblonga, eles são observados como pirâmides, que são uma manifestação grosseira dos tratos corticoespinhais. Sendo assim, a posição tangencial de um neurônio no córtex cerebral é determinada pela sua origem na camada ventricular e, por sua vez, a camada na qual a célula por fim se localiza é fortemente influenciada pelo tempo tomado durante sua migração. O padrão de migração neuronal geneticamente predeterminado durante a formação do córtex cerebral provavelmente contribui significativamente para o desenvolvimento das colunas neuronais organizadas em módulos que compreendem a unidade funcional e organizacional do córtex cerebral do cérebro maduro. Conforme o córtex cerebral se desenvolve, os axônios de seus neurônios fazem sinapses com outros neurônios nas seguintes formas: (1) com neurônios no interior do mesmo hemisfério, (2) com neurônios de outro hemisfério e (3) com neurônios de outras regiões do cérebro e medula espinhal. Os neurônios que fazem sinapses com neurônios do mesmo hemisfério são denominados neurônios de associação. Seus processos percorrem entre giros adjacentes (neurônios de associação curta) ou a giros mais distantes (neurônios de associação longa). Os neurônios com axônios que conectam regiões correspondentes dos dois hemisférios são classificados como neurônios comissurais. Aqueles com axônios que conectam o córtex a regiões mais profundas do SNC são chamados de neurônios de projeção. Baseando-se no seu desenvolvimento filogenético, o córtex cerebral pode ser subdividido em alocórtex, evolucionariamente mais antigo, e no mais recente neocórtex (Fig. 10-25). O alocórtex compreende o arquicórtex e o paleocórtex. O alocórtex apresenta uma ampla variedade de padrões histológicos em regiões diferentes, mas está caracterizado geralmente por três camadas histológicas (molecular, piramidal ou granular e polimórfica). O neocórtex, por sua vez, apresenta uma mais complexa estrutura histológica de cinco ou seis camadas. 225 Fig. 10-25 Embrião porcino, dia 21,5, secção coronal do telencéfalo. 1: Ventrículo lateral direito; 2: Ventrículo lateral esquerdo; 3: Neopálio; 4: Plexo coroide; 5: Arquipálio. Em carnívoros, as conexões principais entre os hemisférios estão completas a partir da terceira semana pós-natal, mas o amadurecimento total é prolongado até a sexta semana ou até depois, quando a mielinização das vias principais é completada. As vias eferentes somáticas gerais e as vias para propriocepção são as últimas a serem mielinizadas. As evidências anatômicas e funcionais mais claras dos processos de maturação pós-natal do cérebro advêm de um rápido crescimento dos hemisférios, ao aumento das proeminências dos giros e o aumento de complexidade do comportamento motor do animal durante as seis primeiras semanas pós-natais. Nas espécies precoces (ruminantes e cavalos) o córtex já atingiu maturidade funcional ao momento do nascimento. Arquicórtex (arquipálio) (Fig. 10-25) O arquicórtex consiste em giro geniculado, giro supracaloso, giro para- hipocampal assim como o giro hipocampal e o giro dentado, os quais são chamados coletivamente de formação hipocampal. O primórdio da formação hipocampal aparece cedo no desenvolvimento, na parede dorsomedial do telencéfalo, onde uma área restrita da parede ventricular evagina para o lúmen ventricular. A formação hipocampal passa então a ficar externa à fissura coroide. A continuação do desenvolvimento é postergada e a fase migratória dos neuroblastos não se inicia até mais tardiamente do período embrionário. Durante o período fetal, quando o neocórtex e a grande comissura, o corpo caloso, se desenvolvem, a formação 226 hipocampal retrai posteriormente, ao longo da parede dorsomedial dos hemisférios. Apenas pequenos resquícios, o indúsio gríseo e as estrias longitudinais permanecem no interior do sulco hipocampal. O hipocampo é deslocado no lobo temporal onde ele forma uma eminência que se projeta dorsalmente para o corno inferior do ventrículo lateral. O sistema eferente do hipocampo é o fórnix, o qual se curva sobre o tálamo para atingir os corpos mamilares ventralmente. Paleocórtex (paleopálio) O paleocórtex está localizado nos aspectos basais e mediais dos hemisférios. Ele compreende os bulbos olfatórios, tratos olfatórios, tubérculo olfatório e lobo piriforme. Expansões das regiões rostrais do telencéfalo formam os bulbos olfatórios. Eles recebem axônios de neurônios na mucosa olfatória, os quais formam sinapses complicadas com as células mitrais do bulbo olfatório, chamadas glomérulos olfatórios. Os axônios dos neurônios do bulbo formam o trato olfatório e fazem sinapses com os neurônios do córtex olfatório do hemisfério cerebral. Neocórtex (neopálio) O neocórtex compõe a maior parte do córtex cerebral. Ele é distinguido do alocórtex por possuir mais células nervosas em seis camadas histológicas. Durante sua formação, as células da camada ventricular migram superficialmente para formar a camada intermediária e mais tarde, uma camada subventricular adicional e a placa cortical. A placa cortical é estabelecida pela migração de neuroblastos formados na camada ventricular. As camadas 2 até 6 do córtex maduro são derivadas da placa cortical. Embora a estratificação do córtex seja completada durante o desenvolvimento fetal, o córtex cerebral não se torna funcional e morfologicamente maduro até mais tardiamente. Isto é especialmente evidente em carnívoros, mas também é verdadeiro em ungulados e equinos. A maturação funcional pós-natal envolve a chegada de fibras aferentes, mielinização de tratos importantes no SNC e preenchimento de conexões sinápticas intracorticais necessárias. Comissuras Conforme o córtex cerebral se desenvolve, processos neuronais fazem sinapses com neurônios no interior do mesmo hemisfério,em movimento. Ele construiu um microscópio de lente simples que tinha capacidade de aumentar 300 vezes. Tecnicamente, este microscópio foi uma conquista espantosa – era menor que um selo de correio e semelhante a um micromanipulador primitivo. Era usado perto dos olhos como uma lupa. Com esta inovação, Leeuwenhoek desenhou espermatozoides de diferentes espécies. Inicialmente, o interesse de Leeuwenhoek não era estudar os espermatozoides, mas sim escrever sobre sêmen e coito. Ao analisar, pela primeira vez, sob o microscópio, o sêmen, observou que estava tomado de glóbulos. Entretanto, não era de seu agrado discutir seus achados e rapidamente retomou a outros assuntos. Três ou quatro anos depois, em 1677, um estudante da escola de medicina em Leiden lhe trouxe uma amostra de sêmen na qual tinha encontrado pequenos animais com caudas, os quais Leeuwenhoek podia observar bem. Consequentemente, Leeuwenhoek retomou suas observações e, em seu próprio sêmen (adquirido não por profanação, mas como uma consequência natural do coito conjugal, salientou), observou uma grande quantidade, porém menor que um milhão, de “animalcules” do tamanho de um grão grosso de areia e com uma cauda fina, ondulante e transparente. Um mês depois, Leeuwenhoek descreveu estas observações em uma carta ao Lord Brouncker, presidente da Sociedade Real em Londres. Ainda preocupado sobre o assunto, ele pediu a Brouncker que não a publicasse, caso a considerasse uma ofensa. As observações de Leeuwenhoek promoveram fervorosos debates e controvérsias sobre o que significavam aqueles vivos objetos. Primeiro, pensava-se que as criaturas semelhantes a girinos eram parasitas. Leewennhoek pode ter sido tendencioso, uma vez que já estava engajado em estudos paralelos de parasitas, ele foi o primeiro a ver a giárdia, um parasita protozoário que infecta o trato gastrointestinal. Giárdias são flagelados e podem, em 28 baixa resolução microscópica, ter a aparência de espermatozoides. Outros cientistas consideravam as ações giratórias dos objetos como uma forma do sêmen não sofrer solidificação. Na escola da pré-formação, entretanto, as observações de Leewennhoek incentivaram a ideia que a cabeça dos espermatozoides tivesse miniaturas de bebês, como potros, bezerros etc. Estes cientistas tornaram-se conhecidos como espermitas. Os dois gametas de mamíferos tinham sido identificados. No entanto, em vez de criar uma plataforma comum de novas ideias, este novo conhecimento provocou um delicado conflito, se o embrião originava do ovo ou do espermatozoide! Em paralelo com as pesquisas dos gametas dos mamíferos, as disputas entre a escola da epigênese e da pré-formação tornaram-se cada vez mais intensas. A última tinha o respaldo de 18 séculos de ciência, religião e filosofia por várias razões. Primeiro, se o corpo é pré-formado e apenas necessita desenvolver-se, nenhum mistério seria necessário para iniciar o desenvolvimento embrionário. Este foi um conveniente ponto de vista religioso e de respeito à criação da humanidade por Deus. Segundo, se o corpo era pré-definido nas células germinativas, as gerações seguintes já seriam pré-definidas nas células germinativas, semelhante a bonecas russas Matrioshcas. Este conceito também era conveniente, e assegurava que a forma das espécies seria permanentemente constante. O fato de que em certo ponto as bonecas Matrioshcas não poderiam ficar menores seria uma objeção óbvia do conceito hoje em dia. Entretanto, não havia uma escala de tamanho biológico no momento daquelas argumentações, pois, a teoria celular de Theodor Schwann (1810-1882) apenas teria sido proposta em 1847. Assim, os preformistas poderiam alegar, como definido em 1764 pelo naturalista, filósofo e escritor suíço Charles Bonnet (1720– 1793), que “A natureza trabalha o menor que deseja”. Basicamente, o preformismo foi uma teoria conservacionista, e foi incapaz de responder algumas questões suscitadas pelo limitado conhecimento da variação genética daquela época. Era sabido, por exemplo, que o cruzamento entre brancos e negros resultaria em bebês com cor de pele intermediária, um resultado incompatível com a pré-formação dos gametas. No final do século XVIII, Caspar Friedrich Wolff (1734-1794), um embriologista alemão que trabalhou em São Petersburgo, realizou observações detalhadas em embriões de galinhas que resultou no primeiro argumento forte para a epigênese. Ele demonstrou como o intestino originava-se de dobras de um tecido simples indiferenciado e interpretou seus achados como evidência da epigênese quando, em 1767, escreveu que “A formação do intestino foi devidamente ponderada, desta forma, não tenho qualquer dúvida da verdade da epigênese”. O termo “Ducto de Wolff” para os ductos mesonéfricos vem do nome de Caspar Friedrich Wolff. Apesar das contribuições de Wolff, a teoria do preformismo persistiu até 1820 29 quando novas técnicas de colorações de tecidos e microscopia permitiram um avanço na ciência da Embriologia. Três amigos, Christian Pander (1794-1865), Karl Ernst von Baer e Martin Heinrich Rathke (1793-1860), vindos da região Báltica, estudaram na Alemanha e formularam conceitos de grande importância para a embriologia contemporânea. Pander expandiu as observações de Wolff e também, apesar de estudar embriões de galinhas por apenas 15 meses antes de se tornar paleontologista, descobriu as camadas germinativas (Pander, 1817). A denominação geral “camada germinativa” foi derivada do latim germen (“brotar” ou “germinar”) onde as três camadas individuais são de origem grega: ectoderma do ectos (“fora”) e derma (‘pele”), mesoderma do mesos (“meio”) e endoderma do endon (“dentro”). Pander também notou que os órgãos não eram formados de uma única camada germinativa. Uma notável característica do livro de Pander de 1817 é a qualidade das ilustrações do anatomista e artista alemão Eduard Joseph d’Alton (1772–1840); ele retratou magnificamente detalhes que ainda não tinham sido definidos (Fig. 1-3). Este trabalho clássico realça as observações precisas e a habilidades em Embriologia. 30 Fig. 1-3 Desenho de um embrião de galinha de dois dias de Eduard Joseph d’Alton mostrado em Pander (1817). Rathke estudou comparativamente a embriologia de sapos, salamandras, peixes, aves e mamíferos e demonstrou similaridades no desenvolvimento entre todos estes grupos de vertebrados. Ele descreveu pela primeira vez os arcos faríngeos comuns no desenvolvimento destes animais. A “bolsa de Rathke” – a contribuição ectodermal da glândula pituitária – o recorda. Além de identificar o óvulo de mamífero, von Baer ampliou as observações de Pander em embriões de galinhas e descreveu a notocorda pela primeira vez. Entretanto, von Baer novamente apreciou os princípios comuns que norteiam o desenvolvimento embrionário inicial independente da espécie. Em 1828, ele escreveu: “Tenho dois embriões pequenos conservados em álcool que me esqueci de marcar. No momento, sou incapaz de determinar o gênero ao qual eles pertencem. Eles podem ser lagartos, pequenas aves ou até mamíferos.” Técnicas de colorações e microscopias continuaram melhorando durante o século XIX, o que permitiu observações mais detalhadas nos estágios de clivagem pelo biólogo alemão Theodor Ludwig Wilhelm von Bischoff (1807–1882) em coelhos, e pelo anatomista e fisiologista suíço Rudolph Albert von Kölliker (1817–1905) no homem e vários animais domésticos. Kölliker também publicou o primeiro livro-texto de embriologia do homem e animais superiores em 1861. Graças as contribuições de Pander, von Baer e Rathke, a escola preformista radical cessou suas atividades em 1820. Entretanto, o conceito desta escola persistiu por mais 80 anos devido a um grupo de cientistas o qual consideraram as células do estágio de clivagem de embriões como representantes das metades direita e esquerda do corpo quando formado. Isso significava que a construção do corpo tem origem na segregação do ovo. Em 1893, August Weismann (1834-1914) propôs a teoria celular germinativa como uma extensão dessa ideia. Baseadono escasso conhecimento de fertilização disponível naquela época, ele teve uma grande visão e propôs que o ovo e o espermatozoide contribuíam igualitariamente em termos cromossômicos, tanto qualitativa como quantitativamente, ao novo organismo. Ele afirmou que os cromossomos transportavam os potenciais herdados deste novo organismo, e foi considerado naquele momento que os cromossomos ainda não tinham sido identificados como transportadores de material genético. Entretanto, Weismann acreditava que nem todas as informações cromossômicas eram passadas para cada célula do embrião, mas que diferentes informações iam para diferentes células, explicando sua diferenciação. Weismann claramente entendeu os princípios de como as características eram herdadas através da fertilização, mas ele estava errado 31 sobre os mecanismos da diferenciação. A teoria de diferenciação de Weismann foi posta à prova praticamente pelo embriologista alemão Wilhelm Roux (1850-1924), que já havia publicado os resultados de seu experimento em 1888, no qual as células individuais de embriões de sapos com 2 a 4 células foram destruídas com uma agulha quente. Como previsto pela teoria de Weismann, Roux observou a formação de embriões nos quais somente um lado desenvolveu normalmente. Estes resultados inspiraram outro embriologista alemão Hans Adolf Eduard Driesch (1867-1941) a realizar experimentos usando células separadas em vez da técnica de destruição de Roux. Para sua enorme surpresa, Driesch obteve resultados que foram bastante diferentes daqueles de Roux. Usando células separadas de diferentes estágios de clivagem de ouriço-do-mar ele demonstrou que cada uma das células era capaz de desenvolver pequenos embriões e larvas (Driesch, 1892). Ele repetiu o mesmo experimento com embriões de 4 células e obteve resultados similares; as larvas eram menores mas em compensação pareciam completamente normais. A evidência final contra a teoria de Roux-Weismann foi realizada pelos elegantes experimentos publicados por outro embriologista alemão, Hans Spemann (1869- 1941). Originalmente, como Driesch, sua teoria experimental foi estabelecida em salamandras. Portanto, separando as células nos estágios de clivagem por meio de uma ligadura (um fio de cabelo retirado de seu filho recém-nascido), ele demonstrou que as células separadas eram capazes de formar pequenos embriões – e eram totipotentes. Em 1928, Spemann conduziu o primeiro experimento com transferência nuclear: transferiu o núcleo de células de embrião de salamandra para uma célula sem núcleo. Usando um fio de cabelo, como tinha feito em 1902 ao separar embriões de salamandra, Spemann dividiu a célula ovo fertilizada, forçando o núcleo para um lado e o citoplasma para o outro. Ele esperou o núcleo dividir e crescer até a um embrião de 16 células. Em seguida, desamarrou o fio de cabelo e possibilitou que o núcleo do embrião se dividisse no citoplasma. Spemann apertou completamente o laço, separando fisicamente a esfera citoplasmática e seus novos núcleos permaneceram longe do resto do embrião de 16 células. Desta célula simples cresceu um embrião de salamandra normal, provando que o núcleo de células embrionárias seria capaz de conduzir o desenvolvimento completo da salamandra. Spemann criou o primeiro clone por transferência nuclear. Ainda, publicou seus resultados em 1938, no seu livro Embryonic Development and Induction, o qual ele chamou de “fantástico experimento” de clonagem das células diferenciadas ou adultas e teoricamente preparou o caminho para os conhecimentos de hoje. Infelizmente, Spemann não via nenhuma saída prática para realizar tais experimentos na época. O pesquisador foi vencedor do prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1935 devido a sua descoberta, agora conhecida como indução embrionária – influência exercida 32 por várias partes do embrião conduzindo ao desenvolvimento de grupos de células em determinados tecidos e órgãos. Os trabalhos de Driesch e Spemann finalmente puseram fim ao conceito de que informações hereditárias eram divididas entre as células durante o desenvolvimento embrionário. A localização do material genético não tinha sido determinada entre o final do século XIX e inicio do século XX quando um grupo de embriologistas americanos descobriu que a hereditariedade residia no citoplasma ou no núcleo do ovo fertilizado. Edmund Beecher Wilson (1856–1939) acreditava que o material genético estava no núcleo; enquanto, Thomas Hunt Morgan (1866–1945) acreditava que o citoplasma era o responsável por abrigá-lo. Wilson e o biólogo alemão Theodor Heinrich Boveri (1862-1915) trabalharam na Estação Zoológica de Nápoles. Boveri contribuiu para a hipótese cromossômica da hereditariedade dos ovos fecundados do ouriço-do-mar com dois espermatozoides. Na primeira clivagem, os ovos produziram quatros polos mitóticos e dividiram-se em quatro células em vez de duas. Posteriormente, Boveri separou as células e demonstrou que elas desenvolviam anormalidades, de uma maneira particular, devido ao fato de carregarem diferentes cromossomos. Assim, Boveri afirmou que cada cromossomo era diferente e controlava diferentes processos vitais. Wilson e Nettie Maria Stevens (1861–1912), uma das primeiras mulheres americanas a ser reconhecida por suas contribuições à ciência, continuaram os trabalhos de Boveri. Eles demonstraram a relação entre o cromossomo e o sexo: o desenvolvimento de embriões XO ou XY em machos e embriões XX em fêmeas (Wilson, 1905; Stevens, 1905a, b). Pela primeira vez, uma característica fenotípica particular tinha sido correlacionada como uma propriedade dos núcleos. Por fim, Morgan encontrou mutações correlacionadas com o sexo e com o cromossomo X. Isto o convenceu que suas observações sobre a hereditariedade no citoplasma estavam erradas e que os genes estavam ligados uns aos outros no cromossomo. Sendo assim, um grupo de embriologistas realizou um grande marco ao descobrir que os cromossomos alojados nos núcleos de células eram os responsáveis pelo desenvolvimento e características hereditárias. No início do século XX, a Embriologia e a Genética não eram consideradas ciências separadas. Elas divergiram no final dos anos 1920 quando Morgan redefiniu Genética como a ciência que estuda a transmissão de características hereditárias, enquanto que a Embriologia estuda a ciência da expressão destas características. Esta divisão não ocorreu sem hostilidade; geneticistas consideravam os embriologistas antiquados, enquanto embriologistas olhavam os geneticistas como desinformados sobre como o organismo na verdade se desenvolve! Felizmente, hoje em dia, observa- se uma reaproximação de geneticistas e embriologistas em várias situações profícuas de simbiose. Dois cientistas defenderam o sinergismo entre embriologistas e 33 geneticistas na atualidade: Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora Gluecksohn- Waelsch; 1907-2007) e Conrad Hal Waddington (1905-1975). Gluecksohn- Schoenheimer recebeu seu doutorado no laboratório de Spemann, no entanto, fugiu da Alemanha de Hitler para os Estados Unidos. Sua pesquisa corajosa demonstrou que as mutações no gene Brachury de camundongos causava desenvolvimento anormal na porção posterior do embrião, ela localizou o defeito na notocorda (Gluecksohn-Schoenheimer, 1938, 1940), promovendo exemplos da proximidade entre a Embriologia e a Genética. O interessante é que passaram-se 50 anos para seus resultados serem confirmados pelo método de hibridização do DNA após a clonagem do gene Brachyury (Wilkinson et al., 1990). Wadington, por sua vez, abordou a conexão casual entre a Embriologia e a Genética pelo isolamento de genes que causavam malformação em moscas da fruta. Além do mais, suas interpretações e conceitos visuais sobre o “cenário epigenético” afetaram a diferenciação celular no embrião ainda presentes nas conferências contemporâneas de células-tronco embrionárias e suas diferenciações (Waddington, 1957, Fig. 1-4). Fig. 1-4 Em cima: Descrições do cenário epigenético feita por C. H. Waddington com uma 34 esferarepresentando a célula e os vales representando as diferentes vias de diferenciação. Embaixo: Descrição pouco comum do cenário epigenético ilustrando como a tensão de diferentes genes controlam o destino da bola. De Waddington (1957). A questão da totipotência, inicialmente abordada por Driesch e Spemann, foi posteriormente revista em níveis mais detalhados. Embora, Driesch e Spemann tivessem demonstrado a totipotência das células nos estágios embrionários iniciais de clivagem, experimentos realizados nos anos de 1950 por Robert Briggs (1911-1983) e Thomas King (1921-2000) testaram a totipotencialidade do núcleo, ou melhor, do genoma. Seu modelo de transferência nuclear foi exatamente a realização exata do “fantástico experimento” proposto por Hans Spemann, embora nunca tivessem ouvido falar sobre as suas ideias. Para atingir seus objetivos eles tinham desenvolvido métodos pelos quais removeriam o genoma de um ovo sem destruí-lo (enucleação), retiravam um núcleo doador de uma outra célula, e transferiam este núcleo para o ovo enucleado. Como suas abordagens eram extremamente não ortodoxas, os primeiros projetos submetidos ao Instituto Nacional de Câncer foram recusados com uma ideia “tresloucada”. Entretanto, eles por fim obtiveram algum apoio, e após meses de experimentos eles produziram o primeiro blastocisto por transferência nuclear. O sucesso inicial foi temporário. No entusiasmo, eles se reuniram aos funcionários do instituto para lhes mostrar os blastocistos. Após várias observações no microscópio, seguidas de aplausos e parabéns, eles reavaliaram as placas e encontraram somente embriões destruídos. Felizmente, embora os primeiros embriões estivessem mortos, o sistema de transferência nuclear funcionou; em 1952, Briggs e King demonstraram com sucesso que o núcleo doador no estágio de blástula de sapos poderia direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferidos em ovos enucleados. Esta pesquisa prepara o caminho para transferência nuclear de células somáticas que hoje são usadas para a clonagem de mamíferos. Briggs e King também descobriram que quando as células de estágios mais avançados (girinos com caudas, por exemplo) eram usadas como núcleos doadores, o desenvolvimento normal não ocorria a menos que o núcleo viesse de células germinativas. Assim, as células somáticas pareciam perder sua habilidade para conduzir o desenvolvimento com o seu grau de diferenciação aumentado. Este ponto mais tarde foi seguido por John B. Gurdon que trabalhou com outras espécies de sapos, Xenopus, em vez de Rana de Briggs e King. Gurdon et al. (1975) observaram que quando núcleos de células cultivadas de pele de sapos adultos foram transferidos para ovos enucleados, o desenvolvimento de clones nunca progredia além da formação do tubo neural. Entretanto, quando eram realizadas transferências nucleares seriadas dos embriões 35 clonados para outros ovos enucleados, era possível gerar numerosos girinos; a totipotência genômica das células somáticas estava então comprovada. Convém, contudo, salientar que o experimento com sapos nunca conseguiu fechar o ciclo do desenvolvimento pela produção de um organismo adulto por transferência de células somáticas de outros organismos adultos. O fechamento do ciclo não aconteceu até a transposição da técnica de transferência nuclear aos mamíferos, pelo veterinário dinamarquês Steen Malte Willadsen, em Cambridge, durante os anos 1980. Willadsen (1986) conseguiu transferir não apenas o núcleo, mas a célula inteira de um embrião ovino no estágio de mórula para ovos enucleados por fusão celular elétrica. Seu trabalho resultou no primeiro mamífero clonado nascido após clonagem por transferência nuclear. Em 1996, esta tecnologia foi um passo importante para Keith H. Campbell trabalhar no Instituto Roslin na Escócia no grupo de pesquisa liderado por Ian Wilmut. Campbell et al. (1996) conseguiram produzir ovelhas após a transferência de núcleos de células cultivadas, e coletadas da massa celular interna, para ovos enucleados. O segredo para esse sucesso foi a meticulosidade de Campbell na experimentação do ciclo celular que demonstrou a necessidade de certo grau de sincronismo do ciclo celular entre o núcleo doador e o citoplasma receptor. A capacidade das células cultivadas dos clones mamíferos representou um grande avanço em ciências biomédicas, facilidade na manipulação de células antes da transferência nuclear e abriu um caminho para a produção de animais transgênicos (animais nos quais um gene diferente, o transgênico, foi adicionado). Assim, Angelika Schnieke, que trabalhou no mesmo grupo de pesquisadores, foi capaz de anunciar o nascimento da ovelha transgênica Polly, uma ovelha clonada de cultivos de fibroblasto fetais de ovelhas na qual o gene humano para o fator de coagulação IX foi inserido como um promotor que possibilitou a expressão da transgênese na glândula mamária (Schnieke et al., 1997). Com este evento surgiu o conceito de “biofármacos” (produção de proteínas valiosas na transgênese animal). O relato de Polly foi precedido por outro do grupo de Rolin; uma publicação que surpreendeu não somente a comunidade científica, mas todas as leis da sociedade mundial: a notícia do nascimento da ovelha clonada Dolly (Wilmut et al. 1997). Dolly foi criada por Wilmut e seu grupo por transferência de células cultivadas da glândula mamária de uma ovelha de 6 anos de idade em óvulos enucleados. Novamente, o sucesso dependeu do controle do ciclo celular; as células doadoras nucleares da glândula mamária foram mantidas em cultivo, o que suprimiu sua atividade mitótica, provocando um estado de senescência celular, bloqueando até o estágio G1 do ciclo celular ou G0. Pesquisas, desde então, resultaram na clonagem de muitos animais (incluindo bovinos, camundongos, caprinos, suínos, gatos, coelhos, equinos, cães e ratos) e, também, foi demonstrado que “silenciar” o núcleo das células 36 doadoras não é necessário. Em associação da genética, a embriologia é uma ciência em desenvolvimento exponencial. A forma como continuará a se desenvolver somente o tempo poderá dizer. A embriologia fez seu caminho no currículo de Medicina Veterinária na metade do século XIX quando se tornou incorporada ao ensino da Anatomia. Em 1924, o primeiro livro-texto de Embriologia publicado por Zeitzschmann e outros (embora poucos) surgiu. A obra Embryology of the Pig de Bradley M. Patten merece especial atenção, pois é uma fonte admirável de inspiração para os autores deste livro. Do mesmo modo, “a bíblia” da Embriologia Comparada Biologia do Desenvolvimento de Scott F. Gilbert é admirável por sua representatividade e pelo seu estilo imitável. Como a Embriologia foi originalmente baseada na tradição da Anatomia Descritiva e nos currículos de Medicina e Veterinária, a nomenclatura é baseada no latim e no grego. Para facilitar a leitura, “anglicamos” alguns termos mais usados na forma latina ou grega. Leituras adicionais Aristotle (ca. 350 BC): The generation of animals. A.L. Peck (trans.). eBooks@Adelaide, 2004 (see http://etext.library.adelaide.edu.au/a/aristotle/generation/). Baer K.E.V. De ovi mammalium et hominis genesi. Leipzig: Voss; 1827. Bonnet C. Contemplation de la Nature. Amsterdam: Marc-Michel Ray; 1764. Briggs R., King T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’ eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1952;38:455–464. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 1996;380:64–66. Darwin C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle for Life. London: John Murray; 1859. Fabricius, H. of Aquapendente (1600): De formato foetu. Pasquala, Padova. Gilbert S.F. Developmental biology, 7th edn. Sinauer Associates: Sunderland, Massachusetts, 2003. Gluecksohn-Schoenheimer S. The development of two tailless mutants in the house mouse. Genetics. 1938;23:573–584. Gluecksohn-Schoenheimer S. The effect of an earlylethal (t0) in the house mouse. Genetics. 1940;25:391– 400. Gurdon J.B., Laskey R.A., Reeves O.R. The developmental capacity of nuclei transplanted from keratinized cells of adult frogs. J. Embryol. Exp. Morphol. 1975;34:93–112. Harvey W. Excitationes de generatione animalium. Amsterdam: Elzevier; 1651. Kölliker A. Entwiklungsgeschichte des Menschen und der höhere Thiere. Leipzig: Engelmann; 1881. Maître-Jan A. Observations sur la formation du poulet. Paris: L. d’Houdry; 1722. 37 Malpighi M. De formatione pulli in ovo (London). Reprinted in HB Adelmann ‘Marcello Malpighi and the evolution of embryology’. Ithaca, NY: Cornell University Press; 1672. 1966 Pander H.C. Beitrage zur Entwiklungsgeschichte des Hühnchens in Eye. Wüzburg: Brönner; 1817/18. Patten B.M. Embryology of the pig, 3rd edn. Blakiston Company: New York, Toronto, 1948. Roux W. Contributions to the developmental mechanisms of the embryo. On the artificial production of half embryos by destruction of one of the first two blastomeres and the later development (postgeneration) of the missing half of the body. In: Willier B.H., Oppenheimer J.M. 1974 ‘Foundations of experimental embryology’. New York: Hafner; 1888:pp. 2–37. Schnieke A., Schnieke A.E., Kind A.J., Ritchie W.A., Mycock K., Scott A.R., Ritchie M., Wilmut I., Colman A., Campbell K.H. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997;278:2130–2134. Schwann T., Schleyden M.J. Microscopical researches into the accordance in the structure and growth of animals and plants. London: Printed for the Sydenham Society; 1847. Stevens N.M. Studies in spermatogenesis with special reference to the ‘accessory chromosome’. Washington. D.C.: Carnegie Institute of Washington; 1905. Stevens N.M. A study of the germ cells of Aphis rosae and Aphis oenotherae. J. Exp. Zool. 1905;2:371–405. 507–545 Waddington C.H. The strategy of the genes. London: Geo Allen & Unwin; 1957. Weismann, A. (1893): The germ-plasm: A theory of heredity. Translated by W. Newton Parker and H. Ronnfeld. Walter Scott Ltd., London. Wilkinson D.G., Bhatt S., Herrmann B.G. Expression pattern of the mouse T-gene and its role in mesoderm formation. Nature. 1990;343:657–659. Willadsen S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature. 1986;320:63–65. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K. Viable offspring from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997;385:810–814. Wilson E.B. The chromosome in relation to the determination of sex in insects. Science. 1905;22:500–502. Wolf K.F. De formatione intestorum praecipue. Novi Commentarii Academine Scientarum Imperialis Petropolitanae. 1767;12:403–507. 38 Capítulo 2 Mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento embrionário Morten Vejilsted Desenvolvimento embrionário inicial e períodos gestacionais O desenvolvimento embrionário abrange todos os processos nos quais uma única célula – o óvulo fertilizado ou zigoto – origina primeiro um embrião e, posteriormente, um feto que ao nascimento é capaz de adaptar-se à vida pós-natal. Esses processos ocorrem de maneira contínua, mas, por conveniência, podem ser arbitrariamente divididos em períodos sucessivos. Dessa forma, o desenvolvimento intrauterino é comumente dividido em período embrionário, quando a maioria dos sistemas é formada, e período fetal, que consiste majoritariamente no crescimento e maturação dos órgãos (Cap. 18). No entanto, o desenvolvimento do organismo não para ao nascimento; os órgãos continuam a crescer e maturar ao menos até a puberdade e muitos tecidos necessitam de reposição contínua ao longo da vida. Portanto, o envelhecimento e a morte podem também ser incluídos no processo natural de desenvolvimento do organismo. O período embrionário é iniciado pela fertilização quando o ovócito, recoberto pela zona pelúcida, é fecundado pelo espermatozoide resultando no desenvolvimento do pronúcleo feminino (derivado do ovócito) e do pronúcleo masculino (derivado do espermatozoide) e na formação do embrião de uma célula chamado zigoto (Fig. 2- 1; Cap. 5). Na primeira mitose após a fertilização o zigoto transforma-se em um embrião de duas células. Essas duas, e as subsequentes células embrionárias iniciais, são denominadas blastômeros. Durante as divisões mitóticas iniciais dos blastômeros, o aumento no número de células não é acompanhado de aumento de volume celular, de tal modo que o volume total do embrião permanece constante à medida que o tamanho dos blastômeros vai sendo reduzido à metade após cada divisão. Este modo de divisão celular, que ocorre exclusivamente neste período, é conhecido como clivagem (Cap. 6). Em seguida, simultaneamente à fase em que as células atingem um determinado tamanho mínimo decorrente das clivagens sucessivas, inicia-se uma fase de crescimento celular durante os ciclos celulares, com as células-filhas crescendo até atingirem o tamanho aproximado das células-mães. A 39 manutenção do tamanho celular relativamente constante, juntamente com a intensa proliferação celular e deposição de material extracelular, leva ao aumento do tamanho do embrião como um todo. Tanto a proliferação celular como o crescimento celular são fundamentos de biologia celular geral que não serão abordados em profundidade neste livro. Fig. 2-1 Desenvolvimento inicial do embrião mamífero. A: Zigoto; B: embrião de 2 células; C: embrião de 4 células; D: mórula inicial; E: mórula compacta; F: Blastocisto; G: Blastocisto expandido; H: Blastocisto eclodindo da zona pelúcida; I: Blastocisto ovoide com disco embrionário; J: Blastocisto elongado; K: Disco embrionário no processo de gastrulação. 1: 40 Massa celular interna; 2: Trofectoderma; 3: Epiblasto; 4: Hipoblasto; 5: Disco embrionário; 6: Pregas amnióticas; 7: Ectoderma; 8: Mesoderma; 9: Endoderma. Por fim os blastômeros formam um pequeno agregado celular, similar a uma amora arredondada, chamado de mórula (Fig. 2-1; Cap. 6). Inicialmente, a mórula é caracterizada por blastômeros protuberantes individualizados; posteriormente, estas células aderem-se firmemente umas às outras e formam a mórula compacta, com superfície mais uniforme. Este processo é conhecido como compactação. As células da camada externa originam o trofectoderma. Subsequentemente, durante o processo de blastulação, forma-se no interior do trofectoderma uma cavidade preenchida por líquido, denominada blastocele, bem como um conjunto de células internas, denominado massa celular interna (MCI), reunidas em um dos polos do embrião, que neste momento é denominado blastocisto. O trofectoderma participará da formação da placenta (Cap. 9) enquanto que a MCI originará o embrião propriamente dito. O blastocisto expande-se, eclode da zona pelúcida e, posteriormente, ao final da blastulação, a MCI forma duas camadas celulares, uma interna e outra externa, denominadas hipoblasto e epiblasto, respectivamente, estabelecendo o disco embrionário bilaminar. Nos animais domésticos, a formação do disco embrionário bilaminar está associada ao desaparecimento da camada de trofectoderma que recobre o epiblasto (Cap. 6). Concomitantemente, o formato do embrião muda de esférico para ovoide e posteriormente para tubular e filamentoso, exceto nos equinos. O período compreendido entre a fertilização e a blastulação completa dura cerca de 10 a 12 dias em suínos, caprinos, ovinos e felinos, 14 dias em bovinos e equinos e 16 dias nos cães. Durante a fase subsequente do período embrionário, o disco embrionário bilaminar é transformado em um disco embrionário trilaminar pelo processo de gastrulação (Fig. 2-1; Cap. 7). A gastrulação leva à formação das três folhetos germinativos, ectoderme, mesoderme e endoderme, e à formação das células germinativas primordiais, as progenitoras das células da linhagem germinativa. No início do processo de gastrulação, a porção do trofectoderma localizada ao redor do disco embrionário, juntamente com o mesoderma extraembrionário subjacente, dá origem às pregas amnióticas que se fundem
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