Aula 6

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CURSO: MEDICINA 
MÓDULO I 
 
UNIDADE I: Bases 
Morfofisiológicas do 
Sistema Digestório e do 
Trato Urinário 
 
EIXO TEMÁTICO: 
Bioquímica e Biofísica 
PROCEDIMENTO 
OPERACIONAL PADRÃO (POP) 
 
FATORES QUE AFETAM A 
ATIVIDADE DAS ENZIMAS: 
CONCENTRAÇÃO DO 
SUBSTRATO 
 
6ª AULA PRÁTICA 
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POP: Bioquímica 
e Biofísica 
 
Profa. Dra Renata 
B. A. Soares 
 
FATORES QUE AFETAM A ATIVIDADE DAS ENZIMAS: CONCENTRAÇÃO DO 
SUBSTRATO 
 
OBJETIVOS 
- Reconhecer a concentração do substrato ([S]) como um dos fatores que podem influir na 
atividade enzimática. 
- Identificar a ligação transitória da enzima ao substrato (complexo E .S) como um fator 
condicionante da velocidade de reação. 
- Reconhecer a fase ascendente da curva de velocidade de reação contra [S] como de excesso 
de poder catalítico. 
- Reconhecer a fase platô, na curva de velocidade de reação contra [S] como de poder 
catalítico máximo. 
- Entender o significado da constante de Michaelis Menten (KM) e sua importância. 
MATERIAL 
a. Equipamentos e materiais e reagentes 
- Espectrofotômetro. 
- Banho maria a seco (100oC) 
- Tubos de ensaio. 
- Pipetas volumétricas. 
- Pipetas automáticas 
- Ponteiras. 
 b. Reagentes 
- Suspensão de invertase 0,20g/dL. 
- Soluções de sacarose a 0,02M, 0,03M, 0,05M, 0,1M e 0,3M. 
- Tampão ácido acético – acetato de sódio 0,05M pH 4,7. 
- Reativo do ácido 3,5-dinitrosalicílico (RA-3, 5-DNS) 
- Água destilada. 
PRECAUCÕES E CUIDADOS ESPECIAIS 
- Considerando que o manuseio com reagentes químicos deve ser cuidadoso, logo se faz 
necessário adotar os critérios de biossegurança estabelecidos pelo laboratório durante a 
manipulação e descarte destes produtos. 
 
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MÓDULO I 
 
UNIDADE I: Bases 
Morfofisiológicas do 
Sistema Digestório e do 
Trato Urinário 
 
EIXO TEMÁTICO: 
Bioquímica e Biofísica 
PROCEDIMENTO 
OPERACIONAL PADRÃO (POP) 
 
FATORES QUE AFETAM A 
ATIVIDADE DAS ENZIMAS: 
CONCENTRAÇÃO DO 
SUBSTRATO 
 
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e Biofísica 
 
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FATORES QUE AFETAM A ATIVIDADE DAS ENZIMAS: CONCENTRAÇÃO DO 
SUBSTRATO 
 
PROCEDIMENTO TÉCNICO 
- Identificar 6 tubos de ensaio da seguinte maneira B (Branco), 1, 2, 3, 4 e 5. 
- Distribuir os reagentes conforme indicado a seguir: 
 B 1 2 3 4 5 
Tampão acetato 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 
RA-3,5-DNS 0,5 - - - - - 
Sacarose 0,02M 0,25 0,25 - - - - 
Sacarose 0,03M - - 0,25 - - - 
Sacarose 0,05M - - - 0,25 - - 
Sacarose 0,1M - - - - 0,25 - 
Sacarose 0,3M - - - - - 0,25 
Invertase 0,20g/dL 50l 50l 50l 50l 50l 50l 
- Obs: Agitar o frasco da invertase antes de pipetar 
- Agitar e incubar, em temperatura ambiente por 10 minutos após adição da enzima. 
- Interromper a reação por adição de 0,5ml do RA-3,5-DNS nos tubos de 1 a 5. 
- Colocar todos os tubos em banho seco a 1000C por 5 minutos. 
- Esfriar os tubos em água corrente e acrescentar 5ml de água destilada em cada tubo. 
- Misturar (agitando) e ler em 540nm (filtro verde) contra o tubo B. 
- Anotar os valores de DO no quadro abaixo: 
Tubos 1 2 3 4 5 
[sacarose] 0,02 0,03 0,05 0,10 0,30 
DO 
- Caso alguma leitura ultrapasse a DO de 1,0, diluir todos os tubos pela adição de 
5ml de água destilada e ler novamente. 
 - Construir um gráfico, correlacionando a velocidade (reação) e concentrações da 
sacarose. 
 
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ATIVIDADE DAS ENZIMAS: 
CONCENTRAÇÃO DO 
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POP: 
Bioquímica e 
Biofísica 
 
Profa. Dra Renata 
B. A. Soares 
 
FATORES QUE AFETAM A ATIVIDADE DAS ENZIMAS: CONCENTRAÇÃO 
DO SUBSTRATO 
 
LEITURA E/OU INTERPRETAÇÃO 
- Fazer um gráfico colocando na ordenada (que corresponde a v) as DO obtidas e na 
abscissa (que corresponde a [S]) as concentrações da sacarose. 
- Determinar o KM e a VMAX (em DO). 
- Repetir o gráfico com os itens inversos 1/v (1/DO) vs. 1/[S] e determinar o KM e a VMAX 
(em DO) - Método de Lineweaver-Burk. 
- Comparar os valores obtidos com os dois métodos. 
SIGNIFICADO CLÍNICO 
Entende-se por especificidade de substrato e concentração de substratos as substâncias 
que reagem sob o estímulo enzimático. 
As enzimas são específicas para um determinado substrato, isto é, as enzimas que atuam 
sobre um substrato não têm ação sobre outros substratos diferentes. Dessa maneira, as 
amilases, enzimas que degradam o amido, não têm ação sobre nenhum outro substrato 
que não seja o amido; as proteases, por sua vez, são enzimas que degradam apenas as 
proteínas; e as lipases são enzimas que só degradam os lipídios; e assim por diante. Se a 
concentração da enzima for constante, à medida que se eleva a concentração do 
substrato, aumenta a velocidade da reação, até se atingir um determinado ponto, a partir 
do qual, novos aumentos na concetração do substrato não elevam a velocidade da 
reação. A velocidade máxima é alcançada quando todas as moléculas de enzima estão 
em atividade, ligadas ao substrato. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
1. STRYER, L. Bioquímica. 6ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 
2. CHAMPE, P. C.; et al. Bioquímica Ilustrada. 4ª ed. Rio de Janeiro: Art Med, 2009. 
3. LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 2ª ed. 
São Paulo: Sarvier, 1995. 
4. MOTTA, V. T. Bioquímica Clínica para o Laboratório: princípios e interpretações. 5ª 
ed. São Paulo: Medbook, 2009. 
5. REMIÃO, J.O.R.; SIQUEIRA, A.J.S.; AZEVEDO, A.M.P. Bioquímica: Guia de Aulas 
Práticas. São Paulo: EDIPUCRS. 2003. 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima