OP2113_a_new_drug_for_chronic_hypoxia-induced_pulm (1)

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Marilyne Campagnac1 | Bénédicte Prunet | Philippe Pasdois1,3 |
| David Benoist1,3 |Lucas Roubenne1,2 | Margaux Laisné
Pedro Vacher1 | Isabelle Baudrimont1 | Rogério Marthan1,4 | Patrick Berger1,4 |
Bruno Le Grand2 | Véronique Freund-Michel1 | Christelle Guibert
Guillaume Cardouat1 | Thomas Ducret1 | Jean-François Quignard1 |
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Resumo
OP2113, um novo medicamento para tratamento de hipertensão pulmonar 
induzida por hipóxia crônica em ratos
1
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2
parâmetros dinâmicos e tanto a PA quanto a remodelação cardíaca foram avaliados. A reatividade foi quantificada 
em anéis de PA e em cardiomiócitos do VD ou do ventrículo esquerdo (VE).
ARTIGO DE PESQUISA
Principais resultados: Em ratos CH-PH, OP2113 reduziu a pressão média de PA, a remodelação de PA,
em CH-PH, isso não foi afetado pelo OP2113.
O estresse ativo foi detectado por ressonância paramagnética eletrônica e western blotting.
Conclusão e implicações: Nosso estudo fornece evidências de uma proteção seletiva
efeitos colaterais em ratos controle.
parâmetros dinâmicos, espessura da parede do PA e do VD e reatividade do PA, no controle
ratos tratados com OP2113 ou seu veículo por meio de mini-bombas osmóticas subcutâneas. Hae-
ratos. Enquanto o estresse oxidativo foi evidenciado por um aumento na carbonilação de proteínas
Abordagem experimental: A HP foi induzida por 3 semanas de hipóxia crônica (CH-PH) em
Hiper-reatividade da PA em resposta à 5-HT, a desaceleração da contração no VD e VE e
aumentou a massa mitocondrial em RV. Curiosamente, OP2113 não teve efeito sobre he-
efeito do OP2113 in vivo nas alterações de PA e RV de ratos CH-PH sem
A massa mitocondrial e a respiração foram medidas por western blotting e oxigra-
um medicamento com efeitos benéficos em lesões cardíacas que tem como alvo ROS mitocondriais. O
Histórico e propósito: A hipertensão pulmonar (HP) é uma doença cardiovascular caracterizada por um aumento 
na resistência arterial pulmonar (AP) levando à insuficiência ventricular direita (VD). As espécies reativas de 
oxigênio (ROS) desempenham um papel importante na HP. OP2113 é
phy, respectivamente.
O objetivo do estudo foi abordar o efeito terapêutico in vivo do OP2113 na HP.
CHU de Bordeaux, Serviço de Explorações
F-33000, Bordéus, França
Recebido: 15 de novembro de 2022 Revisado: 2 de junho de 2023
Este é um artigo de acesso aberto sob os termos da Licença Creative Commons Atribuição Licença, que permite uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho 
original seja devidamente citado. © 2023 The 
Authors. British Journal of Pharmacology publicado por John Wiley & Sons Ltd em nome da British Pharmacological Society.
Fonctionnelles Respiratoires, INSERM, U
DOI: 10.1111/bph.16174
IHU Liryc, F-33000, Bordéus, França
E-mail: christelle.guibert@u-bordeaux.fr
Univ. Bordéus, INSERM, CRCTB, U 1045,
Informações de financiamento
Medicamentos OP2 SAS
Univ. Bordéus, INSERM, CRCTB, U 1045,
Correspondência 
Christelle Guibert, PhD, Centre de Recherche Cardio-
Thoracique de Bordeaux, INSERM U1045; 
Plateforme Technologique d'Innovation 
Biomédicale (PTIB) - Hôpital Xavier Arnozan, 
Avenue du Haut Lévêque, 33604 Pessac Cedex, 
França.
1045, Bordéus, França
2802 wileyonlinelibrary.com/journal/bph
Aceito: 13 de junho de 2023
Br J Pharmacol. 2023;180:2802–2821.
OP2 Drugs SAS, Pessac, França
VEH, veículo.
Véronique Freund-Michel e Christelle Guibert contribuíram igualmente para este trabalho.
CO, débito cardíaco; HES, hematoxilina-eosina-safran; VE, ventrículo esquerdo; mPAP, pressão arterial pulmonar média; N, normóxia; PA, artéria pulmonar; HAP, hipertensão arterial pulmonar; HP, hipertensão 
pulmonar; PVR, resistência vascular pulmonar; VD, ventrículo direito; RVSP, pressão sistólica do ventrículo direito; TBS, solução salina tamponada com tris; VDAC1, canal aniônico dependente de voltagem1;
Abreviações: ATT, AnethOLe tritiona; 4-HNE, 4-hidroxinonenal; CCRC, curva de concentração-resposta cumulativa; CH, hipóxia crônica; CH-PH, hipertensão pulmonar hipóxica crônica;
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https://www.guidetopharmacology.org/GRAC/LigandDisplayForward?ligandId=5
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
https://doi.org/10.1111/bph.16174
mailto:christelle.guibert@u-bordeaux.fr
http://wileyonlinelibrary.com/journal/bph
A AOL também nomeou 5-(4-metoxifenil)-3H-1,2-ditiol-3-tiona (CAS
• OP2113 tem como alvo espécies reativas de oxigênio mitocondriais
et al., 2018). Hiper-reatividade devido a um desequilíbrio entre vasoconstrição
remodelação metabólica (Piao et al., 2010; Shults et al., 2018). Atualmente, embora 
tenham sido observadas alterações no ventrículo esquerdo (VE), especialmente nas 
mitocôndrias na HP (Nouette-Gaulain et al., 2011, 2005),
Genet et al., 2017). Vários estudos também mostraram um aumento na
Levando em consideração (1) a importância dos ROS nas características de PA e RV 
associadas à PH e (2) as propriedades do OP2113 para
consertado para falha de RV.
condições fisiológicas e patológicas (PH) (Norel et al., 1996; Orii et al., 2010) e (2) 
aumentam no coração após HP (Morel et al., 2003).
opção para PH. Usando o modelo CH-PH de rato, avaliamos a resposta in vivo
A hipertensão pulmonar (HP) é uma doença cardiovascular multifatorial
alterações cardíacas na insuficiência pulmonar crônica induzida por hipóxia
• Mostramos um efeito protetor seletivo do OP2113 em
Além disso, na HP, a reprogramação metabólica também foi destacada (Agrawal et 
al., 2020; Freund-Michel et al., 2014). Em condições fisiológicas, mostramos anteriormente 
que o 5-HT estimula a produção de ROS, como o ânion superóxido (O2ÿ), por meio da 
mitocôndria.
remodelação através do aumento da proliferação de células musculares lisas arteriais 
pulmonares (Freund-Michel et al., 2013; Lee et al., 1998; Liu et al., 2006;
coração.
• O tratamento in vivo com OP2113 não tem efeito sobre a doença pulmonar
ensaios.
• A hipertensão pulmonar é caracterizada por insuficiência pulmonar
A ação do OP2113 levou a start-up “OP2 Drugs” a desenvolver novas aplicações para este 
composto, que já demonstrou eficácia em
OP2113, cujo ingrediente ativo é AnethOLe tritiona (ATT ou
espécies de oxigênio.
alterações no desempenho miocárdico associadas ao estresse oxidativo e
sintomas e qualidade de vida, sendo o transplante pulmonar a última opção quando a 
medicação falha (Humbert et al., 2014; Savale
participa da resposta contrátil ao 5-HT (Billaud et al., 2009;
532-11-6)), é um medicamento que bloqueia a produção de ROS mitocondrial por meio de 
uma inibição específica do fluxo reverso de elétrons no nível da mitocôndria.
estresse oxidativo, circulação pulmonar, hipertensão pulmonar, ventrículo direito
e tem efeitos benéficos em várias lesões cardíacas.
estritor (aumento da endotelina-1 e 5-HT) e agentes vasodilatadores (diminuição do NO e 
prostaciclina) e a remodelação da vasculatura pulmonar são as principais características da 
artéria pulmonar (AP) na HP
terapias aprovadas para o tratamento da insuficiência do VE não são recomendadas
várias lesões cardíacas (Dairatos N versus CH 
tratados in vivo
com OP2113 ou seu VEH. N, normoxia; CH + 
VEH, hipóxia crônica + tratamento in vivo com 
veículo; CH + OP2113, hipóxia crônica + tratamento 
in vivo preventivo com OP2113. Os dados 
representam médias ± SEM. n representa o número 
de ratos.
*Pcombinação com os principais medicamentos 
atualmente prescritos para pacientes com HP. Surpreendentemente, os efeitos do 
OP2113 são independentes de sua ação bem conhecida na oxidação mitocondrial
Thomas Ducret: Escrita — revisão e edição (igual). Jean-François Quignard: Escrita — 
revisão e edição (igual). Pierre Vacher: Escrita — revisão e edição (igual). Isabelle 
Baudrimont: Escrita — revisão e edição (igual). Roger Marthan: Escrita — revisão e 
edição (igual). Patrick Berger: Escrita — revisão e edição (igual). Bruno Le Grand: 
Conceitualização (igual); curadoria de dados (igual); administração de projeto (igual). 
Véronique Freund-Michel: Escrita — revisão e edição (igual). Christelle Guibert: 
Conceitualização (líder); curadoria de dados (igual); análise formal (igual); aquisição de 
financiamento (líder); investigação (igual); metodologia (igual); administração de projeto 
(líder); recursos (líder); supervisão (líder); validação (líder); visualização
o equilíbrio entre cinases e fosfatases, estimulando a resposta de cálcio do miofilamento 
em uma concentração constante de cálcio intracelular
que OP2113 reverteu significativamente a diminuição da massa mitocondrial em RV de 
ratos CH-PH. Em contraste, em PA de ratos CH-PH, mitocôndrias-
análise formal (igual); investigação (igual); metodologia (igual); visualização (igual); 
escrita—rascunho original (igual); escrita—revisão e edição (igual). Margaux Laisné: 
Análise formal (igual); investigação (igual); metodologia (igual). David Benoist: 
Metodologia (igual); validação (igual); escrita—revisão e edição (igual).
(Roubenne et al., 2021). Além disso, o H2S reverte o aumento do mPAP
sobre proteínas contráteis e/ou suas propriedades liberadoras de H2S. Paralelamente 
aos ensaios clínicos, também são necessárias investigações adicionais para aprofundar
(Egnatchik et al., 2017). Como avaliamos a massa mitocondrial de todo o PA com o 
endotélio, não se pode excluir que o
mecanismos precisam de mais investigação.
trouxe uma regulação positiva do complexo mitocondrial I, II e IV em células endoteliais 
(CE) de pacientes com HAP em comparação ao controle
ratos de controle, fortalecendo o interesse terapêutico em OP2113 para CH-PH. OP2113 é 
um medicamento em reposicionamento, podendo assim ser rapidamente usado para 
tratamento de PH em humanos. Finalmente, uma vez que (1) os tratamentos de PH são atualmente
2005). No entanto, o aumento da massa mitocondrial no PA a partir do
OP2113 na função cardíaca. Tanto no RV quanto no LV, como mostrado anteriormente
amplitude da contração. Além disso, o transporte de cálcio intracelular
a ausência de qualquer efeito do OP2113 no funcionamento mitocondrial (ou seja, 
respiração) está de acordo com os resultados de estudos anteriores
A função do VD é de grande importância clínica na HP, pois determina o desfecho 
da doença (Humbert et al., 2022).
PH experimental já demonstrou envolver tal desen-
a massa seca foi aumentada, mas OP2113 não teve efeito. Finalmente, em RV
Amoedo et al., 2020). No entanto, deve-se notar que, em nosso estudo,
consideradas como terapias mono ou combinadas (Humbert et al., 2022)
Marilyne Campagnac: Metodologia (igual). Bénédicte Prunet: Conceitualização (apoio); 
administração de projeto (apoio).
o aumento da massa mitocondrial pode vir da contração das CEs
Em conclusão, o tratamento in vivo com OP2113 em CH-PH melhora a hemo-
sedimentação dos miofilamentos em cálcio (Fowler et al., 2015). Podemos
estresse, mas podemos especular que pode estar relacionado a um efeito direto
PAEC humano (Smolders et al., 2022) e um aumento da mitocôndria
para a membrana externa mitocondrial foi observada. Ambos os
inibir a remodelação de RVSP e PA em camundongos CH-PH (Pak et al., 2018), 
destacando um interesse especial no OP2113 como uma nova ferramenta para melhorar 
o tratamento de CH-PH. Em nosso estudo, o OP2113 reduziu significativamente a 
remodelação de PA. Consistentemente, o OP2113 diminuiu o crescimento celular e a 
migração em linhas de células de câncer de pulmão humano, enquanto a N-acetilcisteína 
(NAC), um antioxidante geral em massa, teve o efeito oposto, fortalecendo novamente 
o interesse nas propriedades do OP2113 para o tratamento de PH (Dias
e muscularização de PA em ratos CH-PH (Chunyu et al., 2003). De acordo com
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
OP2113 apresenta efeitos cardioprotetores e reduz a isquemia miocárdica
equilibrando qualquer potencial diminuição da biogênese mitocondrial no músculo liso. 
Embora o OP2113 tenha prevenido a diminuição da massa mitocondrial do RV em CH-
PH, investigações adicionais são necessárias para determinar se tal fenômeno pode ser 
responsável por seu efeito benéfico
OP2113 também é um doador de H2S (Powell et al., 2018), com H2S
diminuição da massa mitocondrial no RV do modelo CH-PH do rato e
A remodelação da AP não foi abordada em pulmões mantidos sob pressão constante, 
o que pode ser uma limitação do nosso trabalho.
O rato CH-PH é o oposto do que foi observado anteriormente
redação (líder); redação — rascunho original (líder); redação — revisão e edição (líder).
Os pacientes não foram modificados. A contração cardíaca depende de
Usando simulação computacional de modelagem molecular, Dias Amoedo et al. 
identificaram a interação do ATT com o complexo mitocondrial I
ROUBENNE E OUTROS.2818
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DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
França.
DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Esta Declaração reconhece que este artigo adere aos princípios de relatórios transparentes e 
rigor científico da pesquisa pré-clínica, conforme declarado nas diretrizes do BJP para Design 
e Análise. Imunoblotting e imunoquímica, e Experimentação Animal, e conforme recomendado 
por agências de financiamento, editoras e outras organizações envolvidas no apoio à pesquisa.
Os dados que apoiam as conclusões deste estudo estão disponíveis no autor correspondente 
mediante solicitação razoável.
Bruno Le Grand, Bénédicte Prunet e Lukas Roubenne são
DECLARAÇÃO DE TRANSPARÊNCIA E DIREITO CIENTÍFICO
A microscopia para seções de pulmão de rato coradas com HES foi feita no IHU Institut de 
Rythmologie et Modélisation Cardiaque (LIRYC) de Bordeaux. O projeto foi apoiado pela OP2 
Drugs SAS, Pessac,
Culley, MK, & Chan, SY (2018). Metabolismo mitocondrial na hipertensão pulmonar: além das 
montanhas, há montanhas. Journal of Clinical Investigation, 128(9), 3704–3715. https://
doi.org/10.1172/ JCI120847
REFERÊNCIAS
Curtis, MJ, Alexander, SPH, Cirino, G., George, CH, Kendall, DA, Insel, PA, Izzo, AA, Ji, Y., 
Panettieri, RA, Patel, HH, Sobey, CG, Stanford, SC, Stanley, P., Stefanska, B., Stephens, 
GJ, Teixeira, MM, Vergnolle, N., & Ahluwalia, A. (2022). Planejamento de experimentos: 
Orientação atualizada sobre design e análise experimental e seus relatórios III. British 
Journal of Pharmacology, 179(15), 3907– 3913. https://doi.org/10.1111/bph.15868
funcionários da OP2 Drugs.
AGRADECIMENTOS
RIGOR
Verri, T. (2021). O GUIA CONCISO DE FARMACOLOGIA2021/22: Transportadores. 
British Journal of Pharmacology, 178(S1), S412–S513. https://doi.org/10.1111/bph.15543
2819ROUBENNE E OUTROS.
Português Southan, C., Davies, JA, Aldrich, RW, Attali, B., Baggetta, AM, Becirovic, E., 
Biel, M., Bill, RM, Catterall, WA, … Zhu, M. (2021).
(2003). O efeito regulador do sulfeto de hidrogênio na hipertensão pulmonar hipóxica em 
ratos. Biochemical and Biophysical Research Communications, 302(4), 810–816. https://
doi.org/10.1016/s0006-291x (03)00256-0
(2021). O Guia Conciso de FARMACOLOGIA 2021/22: Enzimas.
de Jesus, DS, DeVallance, E., Li, Y., Falabella, M., Guimaraes, D., Shiva, S., Kaufman, BA, 
Gladwin, MT, & Pagano, PJ (2019). A ativação de CREB mediada por Nox1/Ref-1 
promove a proliferação e migração de células endoteliais induzidas por Gremlin1. Redox 
Biology, 22, 101138. https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101138 Detaille, D., Pasdois, P., 
Semont, A., Dos Santos, P., & Diolez, P. 
(2019). Um medicamento antigo como um novo medicamento para evitar que o complexo 
mitocondrial I produza radicais de oxigênio. PLoS ONE, 14(5), e0216385 . https://doi.org/
10.1371/journal.pone.0216385Alexander, SP, Mathie, A., Peters, JA, Veale, EL, Striessnig, J., Kelly, E., Armstrong, JF, 
Faccenda, E., Harding, SD, Pawson, AJ,
Revista Britânica de Farmacologia, 178(Suplemento 1), S313–S411 . https://doi.org/
10.1111/bph.15542
Billaud, M., Dahan, D., Marthan, R., Savineau, JP, & Guibert, C. (2011). Papel das junções 
comunicantes na resposta contrátil aos agonistas na artéria pulmonar de dois modelos de 
ratos com hipertensão pulmonar. Respiratory Research, 12, 30. https://doi.org/
10.1186/1465-9921-12-30 Billaud, M., Marthan, R., Savineau, JP, & Guibert, 
C. (2009). O músculo liso vascular modula o controle endotelial da vasorreatividade por meio 
da produção de espécies reativas de oxigênio por meio de comunicações mioendoteliais. 
PLoS ONE, 4(7), e6432. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0006432
Objetivos e aspectos práticos do immunoblotting e da imuno-histoquímica: Um guia para 
submissão ao British Journal of Pharmacology. British Journal of Pharmacology, 175(3), 
407–411. https://doi.org/10.1111/ bph.14112
Alexander, SP, Christopoulos, A., Davenport, AP, Kelly, E., Mathie, A., Peters, JA, Veale, EL, 
Armstrong, JF, Faccenda, E., Harding, SD, Pawson, AJ, Southan, C., Davies, JA, 
Abbracchio, MP, e colaboradores do CGTP. (2021). O GUIA CONCISO DE 
FARMACOLOGIA 2021/22: receptores acoplados à proteína G.
Dai, W., Amoedo, ND, Perry, J., Le Grand, B., Boucard, A., Carreno, J., Zhao, L., Brown, DA, 
Rossignol, R., & Kloner, RA (2022). Efeitos do OP2113 no tamanho do infarto do miocárdio 
e ausência de refluxo em um modelo de isquemia/reperfusão miocárdica em ratos. 
Cardiovascular Drugs and Therapy, 36(2), 217–227. https://doi.org/10.1007/
s10557-020-07113-7 Dalle-Donne, I., Giustarini, D., Colombo, R., Rossi, 
R., & Milzani, A. (2003).
Bonnet, S., & Boucherat, O. (2018). A controvérsia ROS na hipertensão pulmonar hipóxica 
revisitada. European Respiratory Journal, 51, 1800276. https://doi.org/
10.1183/13993003.00276-2018 Chunyu, Z., Junbao, D., Dingfang, B., Hui, 
Y., Xiuying, T., e Chaoshu, T.
Revista Britânica de Farmacologia, 178(S1), S27–S156. https://doi.org/ 10.1111/bph.15538 
Alexander, SP, Fabbro, 
D., Kelly, E., Mathie, A., Peters, JA, Veale, EL, Armstrong, JF, Faccenda, E., Harding, SD, 
Pawson, AJ, Southan, C., Davies, JA, Annett, S., Boison, D., Burns, KE, Dessauer, C., 
Gertsch, J., Helsby, NA, Izzo, AA, … Wong, SS
Carbonilação de proteínas em doenças humanas. Trends in Molecular Medicine, 9(4), 169–
176. https://doi.org/10.1016/s1471-4914(03) 00031-5
GUIA CONCISO DE FARMACOLOGIA 2021/22: Canais iônicos.
Bernal-Ramirez, J., Silva-Platas, C., Jerjes-Sanchez, C., Ramos-Gonzalez, MR, Vazquez-
Garza, E., Chapoy-Villanueva, H., Ramirez-Rivera, A., Zarain- Herzberg, A., Garcia, N., & 
Garcia-Rivas, G. (2021).
O resveratrol previne a disfunção do ventrículo direito, o manuseio incorreto do cálcio e a 
falha energética por meio da estimulação da SIRT3 na hipertensão arterial pulmonar. 
Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2021, 9912434. https://doi.org/
10.1155/2021/9912434
Revista Britânica de Farmacologia, 178(S1), S157–S245. https://doi.org/ 10.1111/
bph.15539 Alexander, 
SPH, Roberts, RE, Broughton, BRS, Sobey, CG, George, CH, Stanford, SC, Cirino, G., Docherty, 
JR, Giembycz, MA, Hoyer, D., Insel, PA, Izzo, AA, Ji, Y., MacEwan, DJ, Mangum, J., 
Wonnacott, S., & Ahluwalia, A. (2018).
Agrawal, V., Lahm, T., Hansmann, G., & Hemnes, AR (2020). Mecanismos moleculares da 
disfunção ventricular direita na hipertensão arterial pulmonar: Foco na vasculatura 
coronária, hormônios sexuais e metabolismo de glicose/lipídios. Cardiovascular Diagnosis 
and Therapy, 10(5), 1522–1540. https://doi.org/10.21037/cdt-20-404
Alexander, SP, Kelly, E., Mathie, A., Peters, JA, Veale, EL, Armstrong, JF, Faccenda, E., 
Harding, SD, Pawson, AJ, Southan, C., Buneman, OP, Cidlowski, JA, Christopoulos, A., 
Davenport, AP, Fabbro, D., Spedding, M., Striessnig, J., Davies, JA, Ahlers-Dannen, KE, 
… Zolghadri, Y. (2021). O Guia Conciso de FARMACOLOGIA 2021/22: Introdução e 
outros alvos proteicos.
British Journal of Pharmacology, 178(Supl 1), S1–S26. https://doi.org/ 10.1111/bph.15537 
Alexander, SP, Kelly, E., 
Mathie, A., Peters, JA, Veale, EL, Armstrong, JF, Faccenda, E., Harding, SD, Pawson, AJ, 
Southan, C., Davies, JA, Amarosi, L., Anderson, CMH, Beart, PM, Broer, S., Dawson, PA, 
Hagenbuch, B., Hammond, JR, Inui, K.-i., …
Machine Translated by Google
https://bpspubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/bph.14207
https://bpspubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/bph.14208
https://bpspubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bph.15232
https://doi.org/10.1172/JCI120847
https://doi.org/10.1172/JCI120847
https://doi.org/10.1111/bph.15868
https://doi.org/10.1111/bph.15543
https://doi.org/10.1016/s0006-291x(03)00256-0
https://doi.org/10.1016/s0006-291x(03)00256-0
https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101138
https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101138
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0216385
https://doi.org/10.1111/bph.15542
https://doi.org/10.1186/1465-9921-12-30
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006432
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006432
https://doi.org/10.1111/bph.14112
https://doi.org/10.1111/bph.14112
https://doi.org/10.1007/s10557-020-07113-7
https://doi.org/10.1183/13993003.00276-2018
https://doi.org/10.1111/bph.15538
https://doi.org/10.1111/bph.15538
https://doi.org/10.1016/s1471-4914(03)00031-5
https://doi.org/10.1016/s1471-4914(03)00031-5
https://doi.org/10.1155/2021/9912434
https://doi.org/10.1111/bph.15539
https://doi.org/10.1111/bph.15539
https://doi.org/10.21037/cdt-20-404
https://doi.org/10.1111/bph.15537
https://doi.org/10.1111/bph.15537
Humbert, M., Kovacs, G., Hoeper, MM, Badagliacca, R., Berger, RMF, Brida, M., Carlsen, J., 
Coats, AJS, Escribano-Subias, P., Ferrari, P., Ferreira , DS, Ghofrani, HA, Giannakoulas, 
G., Kiely, DG, Mayer, E., Meszaros, G., Nagavci, B., Olsson, KM, Pepke-Zaba, J., … o 
Grupo de Documentos Científicos ESC/ERS . (2022). Orientações ESC/ERS 2022 para o 
diagnóstico e tratamento dahipertensão pulmonar.
Egnatchik, RA, Brittain, EL, Shah, AT, Fares, WH, Ford, HJ, Monahan, K., Kang, CJ, Kocurek, 
EG, Zhu, S., Luong, T., Nguyen, TT, Hysinger, E., Austin, ED, Skala, MC, Young, JD, 
Roberts, LJ 2nd, Hemnes, AR, West, J., & Fessel, JP (2017). A sinalização disfuncional 
de BMPR2 impulsiona uma necessidade endotelial anormal de glutamina na hipertensão 
arterial pulmonar. Pulmonary Circulation, 7(1), 186–199. https://doi.org/10.1086/690236 
Fowler, ED, Benoist, D., Drinkhill, MJ, Stones, R., Helmes, M., Wust, RC, Stienen, GJ, 
Steele, DS, & White, E. (2015). A diminuição da creatina quinase está ligada 
à disfunção diastólica em ratos com insuficiência cardíaca direita induzida por hipertensão da 
artéria pulmonar. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 86, 1–8. https://doi.org/
10.1016/j.yjmcc.2015. 06.016
Karamsetty, MR, Klinger, JR, & Hill, NS (2001). Fitoestrógenos restauram o relaxamento 
mediado por óxido nítrico em artérias pulmonares isoladas de ratos cronicamente 
hipóxicos. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 297(3), 968–974.
Fowler, ED, Drinkhill, MJ, Norman, R., Pervolaraki, E., Stones, R., Steer, E., Benoist, D., Steele, 
DS, Calaghan, SC, & White, E. (2018).
(2014). Mitocôndrias: papéis na hipertensão pulmonar . Revista Internacional de Bioquímica 
e Biologia Celular, 55, 93–97. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2014.08.012 Genet, N., 
Billaud, M., Rossignol, R., Dubois, 
M., Gillibert-Duplantier, J., Isakson, BE, Marthan, R., Savineau, JP, & Guibert, C. (2017). Vias 
de sinalização ligadas à produção de ânion superóxido induzida por serotonina: Um papel 
fisiológico para mitocôndrias em artérias pulmonares. Frontiers in Physiology, 8, 76. https://
doi.org/10.3389/fphys.2017.00076 Grogan, A., Lucero, EY, Jiang, H., & Rockman, HA 
(2022). Fisiopatologia e farmacologia dos receptores acoplados à proteína 
G no coração.
Pesquisa Cardiovascular, 119, 1117–1129 . https://doi.org/10.1093/cvr/cvac171
Antagonista do receptor beta1-adrenérgico, metoprolol atenua a disfunção de manuseio 
de Ca2+ do miócito cardíaco em ratos com hipertensão da artéria pulmonar. Journal of 
Molecular and Cellular Cardiology, 120, 74–83. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2018.05.015 
Fresquet, F., Pourageaud, F., Leblais, V., Brandes, RP, 
Savineau, JP, Marthan, R., & Muller, B. (2006). Papel das espécies reativas de oxigênio e 
gp91phox na disfunção endotelial das artérias pulmonares induzida por hipóxia crônica. 
British Journal of Pharmacology, 148(5), 714–723. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706779
Lilley, E., Stanford, SC, Kendall, DE, Alexander, SPH, Cirino, G., Docherty, JR, George, CH, 
Insel, PA, Izzo, AA, Ji, Y., Panettieri, RA, Sobey, CG, Stefanska, B., Stephens, G., Teixeira, 
M., & Ahluwalia, A. (2020). ARRIVE 2.0 e o British Journal of Pharmacology: Orientações 
atualizadas para 2020. British Journal of Pharmacology, 177(16), 3611–3616. https://
doi.org/10.1111/bph. 15178
Humbert, M., Lau, EM, Montani, D., Jais, X., Sitbon, O., & Simonneau, G.
Lee, SL, Wang, WW, & Fanburg, BL (1998). Superóxido como um sinal intermediário para 
mitogênese induzida por serotonina. Free Radical Biology and Medicine, 24(5), 855–858. 
https://doi.org/10.1016/S0891-5849 (97)00359-6
Revista Americana de Fisiologia. Fisiologia Celular e Molecular do Pulmão, 286(6), L1228–
L1236. https://doi.org/10.1152/ajplung.00265.2003 Gurtler, A., Kunz, N., Gomolka, M., 
Hornhardt, S., Friedl, AA, McDonald, K., Kohn, JE, & Posch, A. (2013). Tecnologia sem manchas 
como uma ferramenta de normalização na análise de Western blot. Analytical Biochemistry, 
433(2), 105–111. https://doi.org/10.1016/j.ab.2012.10.010 Humbert, M., Guignabert, C., 
Bonnet, S., Dorfmuller, P., Klinger, JR, Nicolls, MR, Olschewski, AJ, 
Pullamsetti, SS, Schermuly, RT, Stenmark, KR, & Rabinovitch, M. (2019). Patologia e 
patobiologia da hipertensão pulmonar: estado da arte e perspectivas de pesquisa.
Maclean, MR, & Dempsie, Y. (2010). A hipótese da serotonina da hipertensão pulmonar 
revisitada. Advances in Experimental Medicine and Biology, 661, 309–322. https://doi.org/
10.1007/978-1-60761- 500-2_20
Freund-Michel, V., Khoyrattee, N., Savineau, JP, Muller, B., & Guibert, C.
(2014). Avanços em intervenções terapêuticas para pacientes com hipertensão arterial 
pulmonar. Circulation, 130(24), 2189–2208. https://doi.org/10.1161/
CIRCULATIONAHA.114.006974
Revista Respiratória Europeia, 53, 1801887. https://doi.org/10.1183/
Medvedev, R., Sanchez-Alonso, JL, Alvarez-Laviada, A., Rossi, S., Dries, E., Schorn, T., Abdul-
Salam, VB, Trayanova, N., Wojciak-Stothard, B., Miragoli, M., Faggian, G., & Gorelik, J. 
(2021). Estudo em nanoescala da remodelação do manuseio do cálcio em cardiomiócitos 
do ventrículo direito após hipertensão pulmonar. Hipertensão, 77(2), 605–616. https://
doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.120.14858
Revista Respiratória Europeia, 61, 2200879. https://doi.org/10.1183/ 13993003.00879-2022
Kass, DA, & Solaro, RJ (2006). Mecanismos e uso de agentes sensibilizadores de cálcio no 
coração em insuficiência. Circulation, 113(2), 305–315. https://doi.org/10.1161/
CIRCULATIONAHA.105.542407 Kereveur, A., Callebert, J., Humbert, M., 
Herve, P., Simonneau, G., Launay, JM, & Drouet, L. (2000). Altos níveis de serotonina 
plasmática na hipertensão pulmonar primária. Efeito da terapia de longo prazo com 
epoprostenol (prostaciclina). Arteriosclerose, Trombose e Biologia Vascular, 20(10), 2233–
2239. https://doi.org/10.1161/01.ATV.20.10.2233 Kim, C., Patel, P., Gouvin, LM, Brown, 
ML, Khalil, A., Henchey, EM, Heuck, AP, & Yadava, N. (2014). Análise comparativa 
da fisiologia mitocondrial de células beta pancreáticas. Bioenergética, 3(1), 110. https://doi.org/
10.4172/2167-7662.1000110
Ducret, T., Guibert, C., Marthan, R., & Savineau, JP (2008). Ativação induzida por serotonina 
da corrente semelhante a TRPV4 em células musculares lisas arteriais intrapulmonares 
de ratos. Cálcio celular, 43(4), 315–323. https://doi.org/10. 1016/j.ceca.2007.05.018
Freund-Michel, V., Guibert, C., Dubois, M., Courtois, A., Marthan, R., Savineau, JP, & Muller, B. 
(2013). Espécies reativas de oxigênio como alvos terapêuticos na hipertensão pulmonar. 
Therapeutic Advances in Respiratory Disease, 7(3), 175–200. https://doi.org/10.1177/ 
1753465812472940
Guibert, C., Marthan, R., & Savineau, JP (2004). 5-HT induz uma araqui-
Influxo de cálcio sensível ao ácido dônico na pequena artéria intrapulmonar do rato.
13993003.01887-2018
Humbert, M., McLaughlin, V., Gibbs, JSR, Gomberg-Maitland, M., Hoeper, MM, Preston, IR, 
Souza, R., Waxman, A., Escribano Subias, P., Feldman, J., Meyer, G., Montani, D., Olsson, 
KM, Manimaran, S., Barnes, J., Linde, PG, de Oliveira Pena, J., Badesch, DB, & PULSAR 
Trial Investigators. (2021). Sotatercept para o tratamento da hipertensão arterial pulmonar. 
New England Journal of Medicine, 384(13), 1204–1215. https://doi.org/10.1056/ 
NEJMoa2024277
Dias Amoedo, N., Dard, L., Sarlak, S., Mahfouf, W., Blanchard, W., Rousseau, B., Izotte, J., 
Claverol, S., Lacombe, D., Rezvani, HR, Pierri,CL, & Rossignol, R. (2020). Visando o 
adenocarcinoma pulmonar humano com um supressor da produção de superóxido 
mitocondrial. Anti-oxidants & Redox Signaling, 33(13), 883–902. https://doi.org/10.1089/ 
ars.2019.7892
Liu, JQ, & Folz, RJ (2004). O superóxido extracelular aumenta o 5-HT-
vasoconstrição induzida da artéria pulmonar murina. American Journal of Physiology. 
Fisiologia Celular e Molecular do Pulmão, 287(1), L111–L118. https://doi.org/10.1152/
ajplung.00006.2004 Liu, JQ, Zelko, IN, Erbynn, EM, Sham, 
JS, & Folz, RJ (2006). Hipertensão pulmonar hipóxica: Papel do superóxido e da NADPH 
oxidase (gp91phox). American Journal of Physiology. Fisiologia celular e molecular do 
pulmão, 290(1), L2–L10. https://doi.org/10.1152/ajplung.00135. 2005
ROUBENNE E OUTROS.2820
Machine Translated by Google
https://doi.org/10.1086/690236
https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2015.06.016
https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2015.06.016
https://doi.org/10.1016/j.biocel.2014.08.012
https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00076
https://doi.org/10.1093/cvr/cvac171
https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2018.05.015
https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706779
https://doi.org/10.1111/bph.15178
https://doi.org/10.1111/bph.15178
https://doi.org/10.1016/S0891-5849(97)00359-6
https://doi.org/10.1016/S0891-5849(97)00359-6
https://doi.org/10.1152/ajplung.00265.2003
https://doi.org/10.1016/j.ab.2012.10.010
https://doi.org/10.1007/978-1-60761-500-2_20
https://doi.org/10.1007/978-1-60761-500-2_20
https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.114.006974
https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.114.006974
https://doi.org/10.1183/13993003.01887-2018
https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.120.14858
https://doi.org/10.1183/13993003.00879-2022
https://doi.org/10.1183/13993003.00879-2022
https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.105.542407
https://doi.org/10.1161/01.ATV.20.10.2233
https://doi.org/10.4172/2167-7662.1000110
https://doi.org/10.1016/j.ceca.2007.05.018
https://doi.org/10.1016/j.ceca.2007.05.018
https://doi.org/10.1177/1753465812472940
https://doi.org/10.1177/1753465812472940
https://doi.org/10.1183/13993003.01887-2018
https://doi.org/10.1056/NEJMoa2024277
https://doi.org/10.1056/NEJMoa2024277
https://doi.org/10.1089/ars.2019.7892
https://doi.org/10.1089/ars.2019.7892
https://doi.org/10.1152/ajplung.00006.2004
https://doi.org/10.1152/ajplung.00135.2005
https://doi.org/10.1152/ajplung.00135.2005
Roubenne, L., Marthan, R., Le Grand, B., & Guibert, C. (2021). Metabolismo 
de sulfeto de hidrogênio e hipertensão pulmonar. Cell, 10, 1477. https://
doi.org/10.3390/cells10061477
Como citar este artigo: Roubenne, L., Laisné, M., Benoist, D.,
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N. (2018) .
Singh, N., Dorfmuller, P., Shlobin, OA, & Ventetuolo, CE (2022). Hipertensão pulmonar do grupo 
3: do laboratório à cabeceira. Circulation Research, 130(9), 1404–1422. https://doi.org/
10.1161/CIRCRESAHA. 121.319970
Smith, KA, Waypa, GB, Dudley, VJ, Budinger, GRS, Abdala-Valencia, H., Bartom, E., & 
Schumacker, PT (2020). Papel dos fatores induzíveis por hipóxia na regulação da função 
ventricular direita e remodelação durante hipertensão pulmonar crônica induzida por 
hipóxia.
(1987). Parâmetros respiratórios mitocondriais em tecido cardíaco: Um novo método de 
avaliação usando fibras revestidas de saponina. Biochimica et Biophysica Acta, 892(2), 
191–196. https://doi.org/10.1016/0005- 2728(87)90174-5
Vonk Noordegraaf, A., Chin, KM, Haddad, F., Hassoun, PM, Hemnes, AR, Hopkins, SR, Kawut, 
SM, Langleben, D., Lumens, J., & Naeije, R. (2019). Fisiopatologia do ventrículo direito e 
da circulação pulmonar na hipertensão pulmonar: uma atualização. European Respiratory 
Journal, 53, 1801900. https://doi.org/10. 1183/13993003.01900-2018
Revista Americana de Biologia Celular e Molecular Respiratória, 63(5), 652–664. https://
doi.org/10.1165/rcmb.2020-0023OC Português Smolders, V., Rodriguez, 
C., Blanco, I., Szulcek, R., Timens, W., Piccari, L., Roger, Y., Hu, X., Moren, C., Bonjoch, C., 
Sebastian, L., Castella, M., Osorio, J., Peinado, VI, Bogaard, HJ, Quax, PHA, Cascante, 
M., Barbera, JA, & Tura-Ceide, O. (2022). Perfil metabólico em células endoteliais de 
hipertensão pulmonar tromboembólica crônica e hipertensão arterial pulmonar. Scientific 
Reports, 12(1), 2283. https://doi.org/10.1038/s41598-022-06238-z
Yu, HZ, Han, SF, Li, P., Zhu, CL, Zhang, XX, Gan, L., & Gan, Y.
Produtos finais de peroxidação lipídica avançada em danos oxidativos a proteínas. Papel 
potencial em doenças e perspectivas terapêuticas para os inibidores. British Journal of 
Pharmacology, 153(1), 6–20 . https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0707395 Norel, X., Walch, L., 
Costantino, M., Labat, C., Gorenne, 
I., Dulmet, E., Rossi, F., & Brink, C. (1996). Receptores muscarínicos M1 e M3 em artérias 
pulmonares humanas. British Journal of Pharmacology, 119(1), 149–157. https://doi.org/
10.1111/j.1476-5381.1996.tb15688.x
O tratamento crônico com anetol tritiona aumenta a secreção salivar e os receptores 
muscarínicos de acetilcolina na glândula submaxilar do rato. Archives Internationales de 
Pharmocodynamie et de Thérapie, 271(2), 206–212.
Veksler, VI, Kuznetsov, AV, Sharov, VG, Kapelko, VI, & Saks, VA
Shults, NV, Melnyk, O., Suzuki, DI, & Suzuki, YJ (2018). Biologia redox da insuficiência cardíaca 
direita. Antioxidantes (Basel), 7, 106. https://doi.org/ 10.3390/antiox7080106
Impacto do antioxidante MitoQ direcionado à mitocôndria na hipertensão pulmonar 
induzida por hipóxia. European Respiratory Journal, 51, 1701024. https://doi.org/
10.1183/13993003.01024-2017 Percie du Sert, N., Hurst, V., Ahluwalia, A., 
Alam, S., Avey, MT, Baker, M., Browne, WJ, Clark, A., Cuthill, IC, Dirnagl, U., Emerson, M., 
Garner, P., Holgate, ST, Howells, DW, Karp, NA, Lazic, SE, Lidster, K., MacCallum, CJ, 
Macleod, M., … Wurbel, H. (2020). As diretrizes ARRIVE 2.0: diretrizes atualizadas para 
relatar pesquisas com animais. British Journal of Pharmacology, 177(16), 3617–3624. 
https://doi.org/10.1111/bph.15193
Morel, OE, Buvry, A., Le Corvoisier, P., Tual, L., Favret, F., Leon-Velarde, F., Crozatier, B., & 
Richalet, JP (2003). Efeitos da vasodilatação pulmonar induzida por nifedipina em 
receptores cardíacos e isoformas de proteína quinase C em ratos cronicamente hipóxicos. 
Pflügers Archiv/- European Journal of Physiology, 446(3), 356–364. https://doi.org/10. 
1007/s00424-003-1034-y Negre-Salvayre, A., Coatrieux, C., Ingueneau, C., & Salvayre, R. 
(2008).
Ukai, Y., Taniguchi, N., Takeshita, K., Kimura, K., & Enomoto, H. (1984).
Farmacologia Bioquímica, 149, 110–123 . https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.11.014
Rodat, L., Savineau, JP, Marthan, R., & Guibert, C. (2007). Efeito da hipóxia crônica no influxo 
de cálcioindependente de voltagem ativado por 5-HT em artérias intrapulmonares de 
ratos. Pflügers Archiv/European Journal of Physiology, 454(1), 41–51. https://doi.org/
10.1007/s00424-006-0178-y Rodat-Despoix, L., Aires, V., Ducret, T., Marthan, 
R., Savineau, JP, Rousseau, E., & Guibert, C. (2009). Vias de sinalização envolvidas na 
resposta contrátil à 5-HT na artéria pulmonar humana. European Respiratory Journal, 
34(6), 1338–1347. https://doi.org/10.1183/ 09031936.00143808
(2023). OP2113, um novo medicamento para tratamento de hipertensão 
pulmonar crônica induzida por hipóxia em ratos. British Journal of Pharmacology, 
180(21), 2802–2821. https://doi.org/10.1111/ bph.16174
Nouette-Gaulain, K., Biais, M., Savineau, JP, Marthan, R., Mazat, JP, Letellier, T., & Sztark, F. 
(2011). Alterações crônicas induzidas por hipóxia no metabolismo energético mitocondrial 
não são reversíveis em ventrículos cardíacos de ratos. Canadian Journal of Physiology 
and Pharmacology, 89(1), 58–66. https://doi.org/10.1139/y10-105 Nouette-Gaulain, K., 
Malgat, M., Rocher, C., Savineau, JP, 
Marthan, R., Mazat, JP, & Sztark, F. (2005). Curso temporal da adaptação do metabolismo 
energético mitocondrial diferencial à hipóxia crônica nos ventrículos direito e esquerdo. 
Cardiovascular Research, 66(1), 132–140. https://doi.org/ 10.1016/j.cardiores.2004.12.023 
Orii, R., Sugawara, Y., Sawamura, S., & Yamada, Y. (2010). Os receptores muscarínicos 
M(3) mediam a vasodilatação pulmonar 
induzida pela acetilcolina na hipertensão pulmonar. Bioscience Trends, 4(5), 260–266.
(2011). Um exame do efeito potencial dos lipídios no metabolismo de primeira passagem 
do fármaco lipofílico anetol tritiona. Journal of Pharmaceutical Sciences, 100(11), 5048–
5058. https://doi.org/10. 1002/jps.22702
Piao, L., Marsboom, G., & Archer, SL (2010). Adaptação metabólica mitocondrial na hipertrofia 
e insuficiência ventricular direita. Journal of Molecular Medicine (Berlim, Alemanha), 88(10), 
1011–1020 . https://doi.org/10.1007/s00109-010-0679-1 Powell, CR, Dillon, KM, & Matson, 
JB (2018). Uma revisão de doadores de 
sulfeto de hidrogênio (H2S) : Química e potenciais aplicações terapêuticas.
Mittal, M., Roth, M., König, P., Hofmann, S., Dony, E., Goyal, P., Selbitz, AC, 
Schermuly, RT, Ghofrani, HA, Kwapiszewska, G., Kummer, W., Klepetko, 
W., Hoda, MA, Fink, L., Hänze, J., Seeger, W., Grimminger, F., Schmidt, 
HH, & Weissmann, N. (2007). Regulação dependente de hipóxia da 
subunidade NOX4 da NADPH oxidase não fagocítica na vasculatura 
pulmonar. Circulation Research, 101(3), 258–267. https://doi.org/10.1161/
CIRCRESAHA.107.148015
Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., & Humbert, M. (2018). Medicina de 
precisão e terapia de personalização na hipertensão pulmonar: vendo a 
luz do amanhecer de uma nova era. European Respiratory Review: um 
jornal oficial da European Respiratory Society, 27, 180004. https://doi.org/
10.1183/16000617.0004-2018
2821ROUBENNE E OUTROS.
Machine Translated by Google
https://doi.org/10.3390/cells10061477
https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.121.319970
https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.121.319970
https://doi.org/10.1016/0005-2728(87)90174-5
https://doi.org/10.1016/0005-2728(87)90174-5
https://doi.org/10.1183/13993003.01900-2018
https://doi.org/10.1183/13993003.01900-2018
https://doi.org/10.1165/rcmb.2020-0023OC
https://doi.org/10.1038/s41598-022-06238-z
https://doi.org/10.1038/s41598-022-06238-z
https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0707395
https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.1996.tb15688.x
https://doi.org/10.3390/antiox7080106
https://doi.org/10.3390/antiox7080106
https://doi.org/10.1183/13993003.01024-2017
https://doi.org/10.1111/bph.15193
https://doi.org/10.1007/s00424-003-1034-y
https://doi.org/10.1007/s00424-003-1034-y
https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.11.014
https://doi.org/10.1007/s00424-006-0178-y
https://doi.org/10.1183/09031936.00143808
https://doi.org/10.1183/09031936.00143808
https://doi.org/10.1111/bph.16174
https://doi.org/10.1111/bph.16174
https://doi.org/10.1139/y10-105
https://doi.org/10.1016/j.cardiores.2004.12.023
https://doi.org/10.1016/j.cardiores.2004.12.023
https://doi.org/10.1002/jps.22702
https://doi.org/10.1002/jps.22702
https://doi.org/10.1007/s00109-010-0679-1
https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.107.148015
https://doi.org/10.1183/16000617.0004-2018et al., 2022; Detaille et al., 2019). A ATT regula positivamente 
os receptores muscarínicos (Ukai et al., 1984), que também são conhecidos por estarem 
(1) envolvidos na contração e relaxamento do PA em
reduzir ROS mitocondriais sem alterar a função mitocondrial, levantamos a hipótese de que 
OP2113 poderia ser um novo potencial terapêutico
• OP2113 tem efeitos benéficos na artéria pulmonar e
(Humbert et al., 2019). Em relação à remodelação do VD, presente em todas as formas de 
HP, observa-se hipertrofia dos cardiomiócitos em resposta
(Dai et al., 2022; Detaille et al., 2019; Dias Amoedo et al., 2020).
Produção de ROS em PH experimental, incluindo CH-PH ou SUGEN (SU5416)/modelos 
de hipóxia. ROS então estimulam a hiperreatividade do PA e
efeito do OP2113 nas principais características do PH tanto na PA como na
caracterizada por um aumento progressivo tanto na resistência arterial pulmonar (acima de 
2 Unidades Wood) quanto na pressão (acima de 20 mmHg) levando à hipertrofia do 
ventrículo direito (VD), insuficiência e, finalmente, morte prematura (Humbert et al., 2022; 
Vonk Noordegraaf et al., 2019). A HP relacionada à hipóxia crônica (HP-CH) é um importante 
fator de risco para pacientes com doença pulmonar crônica ou para pessoas que vivem em 
grandes altitudes, mas os medicamentos desenvolvidos para tratar a HP são focados na 
hipertensão arterial pulmonar idiopática (HAP), e esses medicamentos não foram 
aprovados para HP-CH (Humbert et al., 2022). Até agora, embora novas terapias 
promissoras, como o sotatercept, estejam em desenvolvimento (Humbert et al., 2021), os 
principais tratamentos melhoram apenas parcialmente
hipertensão.
hipertensão pulmonar hipóxica, estimulando a clínica
Ao contrário dos antioxidantes clássicos, que são eliminadores não seletivos de ROS e, 
portanto, podem perturbar a sinalização celular associada à produção fisiológica de ROS 
(Billaud et al., 2009), o mecanismo específico de
Liu & Folz, 2004). Um grande aumento em O2ÿ também foi demonstrado no VD de 
camundongos com HP (Pak et al., 2018).
complexo condrial I sem alterar a função mitocondrial normal
alterações arteriais e ventriculares direitas envolvendo eventos reativos
artérias e coração de ratos controle.
à sobrecarga de pressão ou volume e leva ainda a alterações adversas
complexo condrial I em células musculares lisas de PA de rato (PASMCs), e este
O que este estudo acrescenta
O que já se sabe
Qual é o significado clínico
1 | INTRODUÇÃO
2803ROUBENNE E OUTROS.
PALAVRAS-CHAVE
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https://www.guidetopharmacology.org/GRAC/LigandDisplayForward?ligandId=2509
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https://www.guidetopharmacology.org/GRAC/LigandDisplayForward?ligandId=5056
área da parede externa e os resultados foram mostrados de acordo com o diâmetro externo 
(menor que 50 ÿm, 50 a 100 ÿm ou 100 a 150 ÿm).
A microssonda (microprobe) AD Instruments, Oxford, Reino Unido) inserida na artéria 
carótida direita mediu as variações de temperatura induzidas pela injeção de solução salina 
fria, e o débito cardíaco (DC) foi então calculado automaticamente usando o software 
LabChart (v.8.1.18, AD Instruments, RRID:SCR_001620). Pressão média da artéria 
pulmonar (mPAP)
mento, os ratos foram sacrificados com overdose de isoflurano (5%), cardiorrespiratório
respectivamente). Os ratos passaram por um período de recuperação de 4 horas após a mini-bomba
as recomendações do “Comité d'éthique regional d'Aquitaine”
tratamento: N + OP2113), utilizamos cinco ratos. Para tratamento curativo,
Após 21 dias, os ratos foram anestesiados com isoflurano (3% e 1,5%
Uma microsonda de temperatura (Instrumentos Columbus, FR#1.5 Implant-
e hipóxia crônica + tratamento preventivo OP2113 (CH + OP2113)
Mini-bombas osmóticas (Durect Corporation, Alzet Modelo 2ML4) foram usadas para tratar 
subcutaneamente ratos com OP2113 (140 ÿgkg1 dia1 ) ou seu veículo (sulfobutylether beta-
ciclodextrina 40% p/p em NaCl
observado com um microscópio óptico (Axio scan Z1 ZEISS, Rueil
Dinan, França) e colocados em uma plataforma de aquecimento na posição de decúbito 
dorsal. O débito cardíaco foi avaliado usando o método de termodiluição em animais de 
tórax fechado. Resumidamente, 150 ÿl de solução salina gelada
em uma plataforma de aquecimento na posição de decúbito ventral, e mini-bombas foram 
implantadas entre as escápulas dos animais sob isoflurano.
conformidade com as diretrizes ARRIVE (Percie du Sert et al., 2020) e com as 
recomendações feitas pelo British Journal of Pharma-
ções. A hipertrofia ventricular direita induzida por CH foi estimada usando o índice de Fulton 
separando o ventrículo direito (VD) do ventrículo esquerdo (VE) + septo e então calculando 
a razão de peso VD/(VE + septo). Todos os parâmetros hemodinâmicos foram monitorados 
usando uma unidade de gravação Powerlab (AD Instruments) e o software LabChart 
(v.8.1.18, AD Instruments, RRID:SCR_001620). RVSP, CO, PVR e
analisado de forma cega. A espessura percentual da parede medial foi calculada como 
((área da parede externa) (área da parede interna)) 100/
ciclo claro/escuro. Para todos os grupos, peso, aparência física, comportamento de 
mobilidade e interações foram monitorados e pontuados a cada 2 dias.
foi medida em ratos de tórax fechado movendo um transdutor de força cheio de fluido 
(Heparina 5000 Uml1 em NaCl 0,9%) (Living systems instrumentation, Vermont, Estados 
Unidos) da veia jugular direita para o átrio direito e ventrículo direito e então para a artéria 
pulmonar principal. A resistência vascular pulmonar (PVR) foi calculada como a razão 
pressão sistólica do ventrículo direito (PSRV)/CO. No final do experimento,
parada indicando a morte do animal. Os lobos do coração e do pulmão foram então 
removidos para mais experimentos, conforme descrito na próxima seção.
os últimos 14 dias do protocolo (tratamento curativo) a uma taxa de 2,5 ÿlh1 (0,7 mgml1 ou 
2,9 mM de OP2113 na mini-bomba).
o número de ratos utilizados foi o seguinte: normóxia (N) (cinco controles
0,9%) durante toda a duração do protocolo (tratamento preventivo) ou para
Malmaison, França) (20) e analisadas usando o software ImageJ (1.52a, NIH Image, 
RRID:SCR_003070). A remodelação da parede medial do PA foi medida pela porcentagem 
de espessura medial das artérias intra-acinares com um diâmetro externo menor que 150 
ÿm; 10–20 vasos por rato foram
para as fases de indução e manutenção, respectivamente) (Centravet,
(CEEA 50) e o protocolo foi aprovado pelo mesmo comitê
(14 ratos). Para experimentos de controle (normoxia + OP2113 preventivo
Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais estavam de acordo com
O índice de Fulton dos ratos CH não foi alterado por um tratamento de 3 semanas com 
solução veicular (Figura S1a,b,c,d, respectivamente).
anestesia geral (3% e 1,5%, para fase de indução e manutenção,
O pulmão esquerdo foirapidamente removido e lavado em solução de Krebs (contendo [em 
mM]: 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 2,5 CaCl2 e 11 D-glicose, 
Sigma, Saint Quentin Fallavier, França).
(1C, NaCl 0,9%) foi injetado na corrente sanguínea por meio de um cateter de polietileno 
de 2,5 Fr (Biotrol, PE-5) inserido na veia jugular direita.
ecologia (Lilley et al., 2020). Ratos Wistar machos (Janvier Laboratories, Saint Berthevin, 
França) pesando 300–350 g foram distribuídos aleatoriamente e cegamente em 43 grupos 
projetados para serem de tamanho igual para o tratamento preventivo (18 ratos para cada 
grupo); no entanto, em alguns casos, os grupos eram desiguais devido à perda inesperada 
de animais: Normoxia (N) (16 ratos de controle), hipóxia crônica + veículo (CH + VEH) (17 
ratos)
(CH-PH) foi induzido pela exposição de ratos ao CH usando câmaras hipobáricas (50 kPa) 
por 21 dias (grupos CH), enquanto ratos normóxicos (N) foram expostos ao ar ambiente da 
instalação animal (grupos N). O modelo de rato CH demonstrou induzir um PH estável, 
reproduzindo algumas das características fisiopatológicas arteriais cardíacas e pulmonares 
observadas no PH humano devido à exposição a altas altitudes ou a doenças pulmonares 
hipoxêmicas e/ou hipóxia (Humbert et al., 2022; Singh et al., 2022).
com hematoxilina, eosina e safran (HES) (VWR). As seções foram então
ratos), hipóxia crônica + veículo (CH + VEH) (oito ratos) e hipóxia crônica + tratamento 
curativo OP2113 (nove ratos). PH hipóxica crônica
(protocolo n APAFIS#23042). Os procedimentos com animais são declarados como estando em
Mini-bombas foram preenchidas em um ambiente estéril. Os animais foram colocados
Os pulmões de ratos foram fixados em formalina tamponada neutra a 4% (VWR, Rosny-
sous-Bois, França) e desidratados em etanol de grau crescente. Após a deslipidação com 
xileno, os pulmões foram incluídos em parafina e cortados em secções transversais (4 ÿm) 
que foram coradas
implantação antes do alojamento em câmara hipobárica. As câmaras hipobáricas eram 
abertas três vezes por semana para cuidados com os animais, limpeza e fornecimento de 
comida/água. Os animais eram alojados em grupos de dois ou três por gaiola em uma 
instalação para animais monitorada por temperatura e umidade com um período de 12 horas.
2804 ROUBENNE E OUTROS.
2.3 | Medição da remodelação da AP
2.2 | Medidas hemodinâmicas e avaliação da 
hipertrofia ventricular direita
2.1 | Animais
2 | MÉTODOS
2.4 | Medição da reatividade arterial pulmonar
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2.6 | Análise de Western blotting
2.5 | Medição do ânion superóxido por ressonância 
paramagnética eletrônica (EPR)
2805ROUBENNE E OUTROS.
ratos de cada grupo foram incubados por 45 min a 37 °C com uma solução de 
armadilha de centrifugação contendo 500 ÿM de 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,- 2,5,5-
tetrametilpirrolidina (CMH, Noxygen, Elzach, Alemanha), 25-
Artérias intrapulmonares de primeira ordem foram dissecadas em Krebs
efeitos agudos, OP2113 foi diluído em DMSO e os tecidos foram pré-
função, ou seja, nem atividade da NADH oxidase sensível à rotenona
CCRCs para relaxamentos induzidos por 5-HT e carbacol em PA de ratos CH
(Substrato HRP Immobilon Western, Millipore, Sigma). ChemiDoc
solução dos tecidos conjuntivos circundantes sob microscópio binocular e dividida em 
segmentos tubulares curtos com um diâmetro externo de 1,5 a 2 mm. Os anéis 
arteriais foram então montados em sistemas de banho de órgãos isolados (EMKA 
Technologies, Paris, França) contendo solução de Krebs continuamente aquecida (37 
°C) e borbulhada (5% de CO2 e 20% de CO2).
DMSO era 1/10000) ou veículo, onde indicado. O OP2113 con-
também foram obtidos por Dai et al. (2022) para uma concentração de 15 ÿM.
não foram alterados significativamente por um tratamento de 3 semanas com solução 
veicular (Figura S1e,f respectivamente).
anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano correspondente
Conforme descrito anteriormente (Rodat et al., 2007), uma carga inicial de 0,8 g (para 
PA de ratos N) ou 1,6 g (para PA de ratos CH) foi aplicada aos anéis arteriais antes 
da medição da tensão isométrica. As propriedades contráteis passivas e ativas dos 
anéis arteriais foram avaliadas usando sistemas transdutores, acoplados ao software 
IOX2 (EMKA Technologies) para facilitar a aquisição e análise de dados. Os tecidos 
foram deixados em equilíbrio
a concentração utilizada estava dentro da faixa de seus efeitos dependentes da 
concentração observados anteriormente in vitro (5 a 80 ÿM) com um pico máximo de metade
(Santa Cruz, Heidelberg, Alemanha). As amostras lisadas foram então centrifugadas 
a 15.000 g por 10 min a 4 °C. A concentração de proteína foi avaliada usando o 
método de Lowry. Após desnaturação por calor por 10 min a 95 °C em tampão de 
amostra Laemmli suplementado com
Cat# 14309, RRID: AB_2665545, 1/1000, Ozyme, Saint-Cyr-L'école,
anti-coelho Cat# PI-1000, RRID: AB_2336198, 1/5000 em TBS 0,1%
10 dB, modulação de amplitude: 5 G, tempo de varredura: 60 s, ganho: 200 e três 
varreduras. Os sinais foram quantificados medindo a amplitude total do sinal, após 
correção da linha de base e normalizados para a concentração de proteína da 
amostra em mgml1 , determinada usando o método Lowry (Bio-Rad, Marnes-la-
Coquette, França). O nível de O2ÿ foi expresso como unidades arbitrárias (UA)/
(mgml1 ) de proteínas.
ÿ-mercaptoetanol, quantidades iguais de proteínas (ou seja, 8 ÿg para o canal aniônico 
dependente de voltagem 1 (VDAC1) e citrato sintase (CS), 20 ÿg para 4-hidroxinonenal 
(4-HNE) ou 30 ÿg para acetilcolina M3 receptor muscarínico foram submetidos à 
eletroforese em gel de acrilamida sem corantes a 10% e transferidos para membranas 
de nitrocelulose. Após 1 h de bloqueio com solução salina tamponada com Tris (TBS) 
suplementada com 0,1% de Tween e 5% de leite em pó, as membranas foram
efeito igual a 10 ÿM para fluxo reverso de elétrons induzido por succinato
ab46545, ID do RRR: AB_722490, 1/1000) ou receptor anti-muscarínico M3
Tween, Eurobio Scientific, Les Ulis, França). De acordo com as instruções do 
fabricante, as proteínas imunorreativas foram detectadas por
anéis arteriais foram avaliados usando uma alta concentração de solução de KCl (80 
mM) para obter uma contração de referência. Anéis arteriais que produziram uma 
contração menor que 0,1 g foram excluídos da análise. A responsividade contrátil foi 
testada construindo curvas de concentração-resposta cumulativas (CCRC) para 5-HT 
e PGF2ÿ. Para
incubados durante a noite a 4 °C com um dos seguintes anticorpos primários: 
anticorpos monoclonais de camundongo anti-VDAC1 (Abcam, Cat#
Além disso, tais concentrações não afetam as mitocôndrias cardíacas
11129778, 1/1000). As membranas foram então incubadas com corre-
detecção quimioluminescente com substrato de peroxidase de raiz-forte
ÿM deferoxamina (Sigma) e 5-mM N,N-dietilditiocarbamato (DETC, Sigma, Saint 
Quentin Fallavier, Françae Magnettech, Berlim, Alemanha), solução de bicarbonato 
de Krebs–Hepes (KHB) (contendo [em mM]: 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO4, 4 
NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 2 CaCl2, 10 Hepes e 6 D-glicose, pH 7,4 com NaOH - Sigma). 
A reação foi interrompida pelo congelamento rápido das amostras em nitrogênio 
líquido. As amostras foram então analisadas por espectrometria de ressonância 
paramagnética eletrônica usando um miniscópio espectrômetro de banda X de mesa 
(MS200, Magnet-tech). Os espectros do produto oxidado de CMH (CM•) foram 
registrados
cubado por 30 min com OP2113 (10 ÿM—concentração final de
nem fosforilação oxidativa (Detaille et al., 2019). Resultados semelhantes
ab14734, ID do RRR: AB_443084, 1/1000, Paris, França), anticitrato
O2ÿ foi medido usando ressonância paramagnética eletrônica (Magnet-tech, Berlim, 
Alemanha) conforme descrito anteriormente (Billaud et al., 2009;
O2 para PA de ratos N e 5% de CO2 e 10% de O2 para PA de ratos CH).
ortovanadato de sódio e fluoreto de fenilmetilsulfonila (1/100)
anticorpos monoclonais de coelho sintase (Tecnologia de Sinalização Celular,
(Vector Laboratories, anti-rato Cat# PI-2000, RRID: AB_2336177,
a 77K usando um frasco Dewar. As configurações instrumentais de ressonância 
paramagnética eletrônica para varredura de campo foram as seguintes: campo Bo: 
3339 ± 150 G, frequência de micro-ondas: 100 kHz, potência de micro-ondas:
Para experimentos de western blotting, artérias intrapulmonares de primeira ordem ou 
VD ou VE ou pulmão direito foram lisadas e homogeneizadas em tampão de lise 
RIPA gelado suplementado com coquetel inibidor de protease,
A contração foi expressa como uma porcentagem da contração máxima da PA em 
ratos controle (ratos N). O efeito relaxante do OP2113 foi avaliado
França), anticorpos policlonais de coelho anti-4-HNE (Abcam, Cat#
Genet et al., 2017). PA de primeira e segunda ordem ou RV ou LV de
brate por 1 h com solução de Krebs e lavagem a cada 15 min. Viabilidade de
inibição ao nível do complexo mitocondrial I (Detaille et al., 2019).
aplicando OP2113 (10 ÿM) em fenilefrina (Phe) (30 nM)- anéis PA pré-constritos de 
ratos N ou CH. O relaxamento foi expresso como uma porcentagem da pré-contração 
para Phe. A integridade endotelial foi avaliada usando o relaxamento induzido por 
carbacol (10 ÿM) em anéis de PA pré-constritos com Phe (30 nM). Os CCRCs para 
Phe (0,1 nM a 100 ÿM) não foram significativamente diferentes em PA de ratos N 
versus CH (Figura S2), demonstrando que CH não tem efeito na contração de Phe.
anticorpos policlonais de coelho (Abcam, Cat# 126168, RRID: AB_
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https://scicrunch.org/resolver/RRID:%20AB_2336198
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2.10 | Isolamento de cardiomiócitos
2.8 | Preparação de fibras cardíacas permeabilizadas
2.7 | Detecção de carbonilação de proteínas
2.9 | Medição da respiração mitocondrial
ROUBENNE E OUTROS.2806
O sistema XRS + (Bio-Rad) foi usado para imagens de western blot. A expressão de 
proteína foi analisada usando o software Image Lab (Bio-Rad) e foi normalizada para o 
sinal de proteína de carga total obtido graças à tecnologia sem manchas (Gurtler et al., 
2013). Os resultados foram expressos como porcentagem da expressão de proteína em 
condições de controle (N).
homogeneizado em tampão de lise RIPA gelado suplementado com coquetel inibidor de 
protease, ortovanadato de sódio fenilmetilsulfonil
ativação do estado de fosforilação oxidativa determinado pela adição
dano à membrana na presença de ADP pela aplicação de citocromo c (10 ÿM) (Sigma), 
conforme descrito anteriormente na literatura (Kim et al., 2014). O dano à membrana 
externa mitocondrial foi estimado como uma porcentagem do aumento do fluxo de O2 
fosforilante após a adição de citocromo c exógeno.
então separados, cortados em pequenos pedaços e agitados em um Erlenmeyer a 37C 
por 5 min em tampão de isolamento complementado com colagenase e protease e 
filtrados usando uma gaze de náilon. A solução resultante foi centrifugada suavemente 
com uma centrífuga operada manualmente (JP Selecta, Barcelona, Espanha) por 1 min 
e o pellet foi suspenso em tampão de isolamento. Este pro-
foram realizadas a 4C.
Clinisciences, Nanterre, França) para prevenir a oxidação de proteínas que pode
expressa como porcentagem de proteínas carboniladas em condições de controle (N).
(FCCP) (0,4 a 1,2 ÿM) (Sigma). As variações do consumo de oxigênio foram registradas 
com o software DatLab (DatLab 7.4.0.4) e expressas em
pH 7,1 - Sigma). RV e LV foram separados e cortados em pedaços na solução A sob 
controle de microscópio binocular. As fibras cardíacas foram então
Os detalhes experimentais que fornecemos para o experimento de western blotting
(BASAL) avaliado pela adição de uma mistura de glutamato (5 mM), malato (2,5 mM) e 
succinato (5 mM) (Sigma) para garantir o fornecimento de elétrons aos complexos I e II 
da cadeia respiratória mitocondrial; o estado 3 é o
A afinidade pelo citocromo c foi avaliada como um índice de uma mitocôndria externa
saponina (Sigma) e lavada duas vezes por 10 min com solução B (contendo [em mM]: 
1,9 CaK2EGTA, 8,1 K2EGTA, 20 imidazol, 0,5 DTT, 3 KH2PO4, 4 MgCl2, 100 ácido 
morfolinoetanossulfônico
O registro ao vivo do consumo de oxigênio por fibras cardíacas permeabilizadas foi 
avaliado a 37 °C usando um oxígrafo com temperatura controlada (Oxygraph-2K, 
Oroboros Instrument, Innsbruck, Áustria) com um tampão de respiração sob agitação 
contínua e contendo [em mM]: 0,5 EGTA, 3 MgCl2, 60 K-lactobionat, 20 taurina, 10 
KH2PO4, 20 HEPES, 110 sacarose, 0,1% BSA, pH 7,1 (Sigma). Os diferentes estados 
respiratórios (quatro estados) (Detaille et al., 2019) foram determinados sucessivamente
o estado de oxidação da proteína (devido à produção de radicais livres derivados do 
oxigênio), os grupos carbonila foram detectados com o OxyBlot™
amostras de proteína foram então submetidas à eletroforese em um gel de acrilamida 
contendo 10% de corante livre e transferidas para membranas de nitrocelulose para 
análise de western blotting. Após 1 h de bloqueio com TBS suplementado com 0,1% de 
Tween e 5% de leite em pó,
As fibras cardíacas do VD ou VE foram permeabilizadas como anteriormente
As artérias intrapulmonares de primeira ordem ou VD ou VE foramlisadas e
França). As amostras de proteína foram preparadas de acordo com as instruções do 
fabricante. Resumidamente, 5 ÿg de proteínas foram desnaturadas com SDS 10% e os 
grupos carbonil na proteína foram derivatizados para 2,4-dinitrofenilhidrazona por reação 
com 2–4 dinitrofenilhidrazona.
As membranas foram então incubadas com o anticorpo secundário correspondente de 
cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de raiz-forte (Merck, parte nº 90452, 1/300). 
As proteínas carboniladas foram então
4 min para parar a contração cardíaca. Finalmente, os corações foram perfundidos com 
tampão de isolamento complementado com colagenase tipo II (1 mgml1 , Worthington, 
Serlabo, Entraigues sur la sorgues, França) e protease tipo XIV de Streptomyces (0,1 
mgml1 , Sigma) por 10 a 15 min para dissociar enzimaticamente os cardiomiócitos 
ventriculares. RV e LV foram
monohidrato, 20 taurina, 0,2% BSA, pH 7,1 - Sigma). Todos os procedimentos
flúor (1/100) e DTT (50 mM) (Santa Cruz Biotechnology,
ing ADP (2 mM) (Sigma) para ativar a ATP sintase; o estado 4 é o vazamento ou estado 
não fosforilante (LEAK) avaliado pela adição de oligomicina (12 ÿM) (Sigma) para inibir a 
ATP sintase; o estado 5 é o estado desacoplado ou máximo (MÁXIMO) determinado pela 
aplicação de concentrações crescentes de cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenil-
hidrazona
10 ml de solução A (contendo [em mM]: 2,77 CaK2EGTA, 7,23 K2EGTA, 20 Imidazol, 
0,5 DTT, 6,56 MgCl2, 53,3 ácido 2-morfolinoetanossulfônico monohidratado; 20 taurina, 
5,3 Na2-ATP, 15 Na2-fosfocreatina,
em uma base cumulativa da seguinte forma: O estado 2 é o estado respiratório basal
1 mg1 . pmols Em paralelo, a permeabilidade da membrana externa mitocondrial
Corações recentemente removidos foram perfundidos na configuração de Langendorff 
(a 12 mlmin1 ) com um tampão de isolamento (contendo [em mM]: 130 NaCl, 5,4 KCl, 1,4 
MgCl2, 0,4 NaH2PO4, 5 HEPES, 10 glicose, 10 creatina, 20 taurina, 0,75 CaCl2, pH 7,4 
- Sigma) por 4 min para lavar o tecido. Os corações foram então perfundidos com tampão 
de isolamento sem
permeabilizado por 30 min com solução A complementada com 50 ÿM de
os documentos estão em conformidade com as Diretrizes do BJP (Alexander et al., 2018).
ocorrem após a lise da amostra. Devido à presença de alta concentração de DTT, a 
concentração de proteína foi determinada usando Pierce™ 660 nm Protein Assay 
(Thermo Scientific, Illkirch, França). Para avaliar
zina (DNPH) por 15 min. 2,4-Dinitrofenil-hidrazona-derivatizada
CaCl2 e complementado com 100 ÿM Na2EGTA por aproximadamente
O processo foi repetido quatro ou cinco vezes, e a integridade dos cardiomiócitos
Kit de detecção de oxidação de proteínas (Merck, Saint Quentin Fallavier,
as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com um anticorpo primário 
direcionado à 2,4-dinitrofenil-hidrazona (Merck, parte nº 90451, 1/150).
descrito (Veksler et al., 1987). O coração recém-removido foi enxaguado com
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2.12 | Dados e análise estatística
2.14 | Nomenclatura de alvos e ligantes
2.13 | Materiais
2.11 | Medição simultânea do encurtamento dos 
cardiomiócitos e dos transientes de cálcio intracelular
2807ROUBENNE E OUTROS.
anticorpos clonais foram adquiridos da Abcam. Anti-citrato sintase
Informações sobre outros produtos são fornecidas no texto.
nenhuma variância significativa não homogeneidade. O limite para significância 
estatística foi estabelecido em PNikon), e a proporção de luz emitida em resposta à excitação de 340 e 380 nm 
(proporção 340/380) foi usada como um índice de variações do sinal de Ca2+ 
intracelular. O encurtamento do sarcômero do cardiomiócito foi medido por análise de 
contraste em tempo real na imagem da célula fornecida por uma câmera CCD (Myocam-
S, Ionoptix, Amsterdã, Holanda). Os sinais foram registrados e analisados com o 
IonWizard 6.6 (IonOptix). O encurtamento do sarcômero e o sinal dos transientes 
[Ca2+]i foram monitorados simultaneamente na mesma célula. Essa análise de 
contração e transientes de cálcio forneceu os seguintes parâmetros: amplitude 
transiente, tempo para atingir a contração máxima
Ca T50, respectivamente) e constante de tempo de decaimento exponencial para cálcio
dações do British Journal of Pharmacology sobre desenho e análise experimental 
(Curtis et al., 2022). A análise de dados foi realizada às cegas sempre que possível. 
Todos os dados são representados como
formado seguindo um resultado de teste de normalidade. Para comparações múltiplas, 
ANOVA unidirecional não paramétrica (Kruskal–Wallis) ou paramétrica
experimentos, normalizamos os dados e expressamos os resultados como um
usando o teste de normalidade de Kolmogorov–Smirnov. Para dois grupos
(temperatura ambiente). As células foram estimuladas em campo usando eletrodos de 
platina a uma frequência de 1 Hz para investigar transientes de [Ca2+]i e encurtamento 
fracionário do sarcômero. Os cardiomiócitos foram excitados alternadamente com luz 
de excitação a 340 e 380 nm usando um sistema espectrofotômetro monocroma-tor 
(Optoscan, Cairn Research, Faversham,
pico de cálcio (Contração T100 e Ca T100, respectivamente),
miócitos (ver Seção 2.11) e é especificado nas legendas das figuras correspondentes. 
O tamanho da amostra declarado (n) é o número de valores independentes e a análise 
estatística foi feita usando esses valores independentes. Todos os dados foram 
verificados para distribuição normal
França); 5-HT, Phe, carbacol, deferoxamina, DETC, saponina, tipo XIV
foram armazenados a 20–23 °C e usados dentro de 10 h.
A análise foi realizada apenas para estudos em que o tamanho de cada grupo era igual
França). As mini-bombas osmóticas foram adquiridas da Durect Corpora-
expressa como uma porcentagem da contração máxima da PA em ratos controle.
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http://www.guidetopharmacology.org/
O tratamento preventivo com 140 ÿgkg1 dia1 de OP2113 por 3 semanas reduziu 
significativamente a mPAP e a RVSP (redução de 54% e 57%, respectivamente 
[Figura 1a,b]). No entanto, o aumento da PVR e a hipertrofia do VD não foram 
significativamente afetados pelo OP2113 (Figura 1c,d). A frequência cardíaca 
permaneceu inalterada em ratos N versus CH e o tratamento com OP2113 não teve 
efeito (Figura 1f). O tratamento preventivo com OP2113 não alterou os parâmetros 
hemodinâmicos acima mencionados (ou seja, mPAP, RVSP, débito cardíaco
vasos (Figura S4).
Como o CH induz a remodelação do PA, usamos a coloração de hematoxilina-
eosina de fatias de pulmão para determinar a espessura da parede do PA (Figura 
2). A exposição ao CH por 3 semanas aumentou significativamente a espessura da 
parede do PA de pequenos vasos com diâmetros menores que 50 ÿm (Figura 2a,b), 
entre 50 e 100 ÿm (Figura 2a,c) e entre 100 e 150 ÿm (Figura 2a,d). O tratamento 
preventivo in vivo com OP2113 reduziu significativamente o espessamento medial 
do PA induzido por CH, independentemente do diâmetro dos vasos (Figura 2a–d). 
Em contraste, a espessura medial de pequenos PA em ratos N não foi afetada pelo 
OP2113, independentemente do diâmetro do
FIGURA 1 O tratamento preventivo com OP2113 in vivo melhorou o aumento induzido por hipóxia crônica (HC) na pressão arterial pulmonar média (mPAP), sem afetar a hipertrofia do ventrículo direito (VD). (a) 
mPAP, (b) pressão sistólica do ventrículo direito (PSVD) (c) resistência vascular pulmonar (RVP), estimada pela razão PSVD/CO expressa em mmHgml1 min1 , (d) Índice de Fulton (ventrículo direito (VD)/
(ventrículo esquerdo (VE) + peso do septo)), (e) débito cardíaco (DC) e (f) frequência cardíaca expressa em batimentos por minuto (bpm). N, normóxia; CH + VEH, hipóxia crônica + veículo; CH + 
OP2113, hipóxia crônica + tratamento preventivo com OP2113. Os dados são expressos como média ± SEM. n representa o número de ratos. *Pa contração de PA induzida por 5-HT.
mPAP e RVSP, investigamos o efeito do OP2113 na PA
vasorreatividade medindo a tensão isométrica em anéis de PA de ratos tratados 
preventivamente in vivo com OP2113 (140 ÿgkg1 dia1 por 21 dias) ou em anéis de PA 
tratados agudamente ex vivo com OP2113 (10 ÿM por 30 min) (Figura 4a). Conforme já 
demonstrado na literatura (Billaud et al., 2011; Fresquet
Esses resultados sugerem que o OP2113 tem ações de curto e longo prazo na 
reatividade do PA aos agonistas contráteis.
em ratos N (Figura 4b). O tratamento agudo com OP2113 também inibiu significativamente 
a hiperreatividade de PA induzida por CH a 5-HT ou PGF2ÿ (Figura 4d,e). No entanto, 
em contraste com o tratamento preventivo, o tratamento agudo com OP2113 reduziu 
fortemente a reatividade de PA em resposta a 5-HT (mas não a PGF2ÿ) em ratos N 
(Figura 4d,e).
et al., 2006; Rodat et al., 2007), os anéis de PA mostram uma hiper-reatividade contrátil 
significativa às concentrações cumulativas de 5-HT ou PGF2ÿ
Uma elevação acentuada de mPAP (Figura 3a) e Índice de Fulton (Figura 3b) 
demonstrou desenvolvimento de HP. A frequência cardíaca permaneceu inalterada em 
ratos N versus CH e o tratamento curativo com OP2113 não teve efeito (Figura 3c).
Para determinar a integridade e a função endotelial, examinamos o relaxamento 
ao carbacol (10 ÿM), um endotélio e dependente de NO.
agonista, em anéis de PA pré-constritos com fenilefrina (Phe, 30 nM).
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3.5 | O tratamento in vivo com OP2113 melhorou a 
dinâmica contrátil dos cardiomiócitos do RV induzidos por CH
ROUBENNE E OUTROS.2810
tratamento in vivo nas contrações e homeostase do cálcio no RV e
observou que os CCRCs para Phe (0,1 nM a 100 ÿM) não foram significativamente 
diferentes em PA de ratos N versus CH (Figura S2) , indicando
+ peso do septo)), (c) frequência cardíaca
hipóxia crônica + veículo; CH + OP2113,
(Figura 4c) e o tratamento preventivo com OP2113 não apresentou efeito significativo
pressão arterial (mPAP), (b) Índice de Fulton
100 ÿm (f), bem como entre 100 e
(relaxamento de 19, 53 e 65% da contração máxima de Phe em
que a diferença no efeito relaxante do OP2113 não foi devido a uma diferença
hipertrofia e artéria pulmonar (AP)
mostrado para vasos com diâmetros externos
remodelação. *Pnormoxia + tratamentos preventivos in vivo ou 
ex vivo agudos com OP2113; CH, hipóxia crônica; CH + VEH, hipóxia crônica + tratamentos preventivos in vivo ou ex vivo agudos com veículo; CH + OP2113, hipóxia crônica + 
tratamentos preventivos in vivo ou ex vivo agudos com OP2113. Os dados representam médias ± SEM. n representa o número de anéis PA. *PConsequentemente, os efeitos do OP2113 observados in vitro a 10 ÿM podem
Tratamento in vivo com OP2113 (Figura 7e). Similarmente ao RV, o LV de ratos CH também 
exibiu alterações na respiração mitocondrial, como diminuições significativas no estado de 
fosforilação oxidativa e MÁXIMO
OP2113 (Figura 8). Em ratos com CH-PH, a expressão do receptor M3 permaneceu inalterada 
em homogeneizados de pulmão (Figura 8a), enquanto aumentou significativamente em PA 
(Figura 8b) e RV (Figura 8c). No entanto, o tratamento preventivo com OP2113 não afetou a 
expressão do receptor M3.
OP2113 em PA e coração principais características associadas com CH-PH em
não refletem de perto aqueles observados in vivo.
fluxo de O2 associado , com o tratamento in vivo com OP2113 não tendo efeito sobre essas 
alterações (Figura S7c). A membrana externa mitocondrial não foi danificada no RV ou LV 
de ratos CH em comparação com ratos N, e o tratamento in vivo com OP2113 não teve efeito 
significativo sobre esse parâmetro (Figuras 7f e S7d). Esses resultados estão de acordo com 
a ausência de efeitos do OP2113 sobre a função mitocondrial, como demonstrado 
anteriormente.
atividade contrátil do PA induzindo então a reversão do aumento do mPAP associado ao CH-
PH. Tal hipótese poderia ser apoiada
O tratamento preventivo in vivo com OP2113 não aumentou os receptores muscarínicos M3 
responsáveis pelo relaxamento da PA (Norel et al., 1996;
remodelação (espessura da parede), hiperreatividade da AP, contração do VD e do VE 
(tempo para pico de contração - Contração T100) e diminuição da
*
demonstrou que qualquer atenuação de CH-PH pode reduzir as alterações de PA
não envolvido no efeito do OP2113 no mPAP.
A ATT regula positivamente os receptores muscarínicos (Ukai et al., 1984) e o receptor 
muscarínico M3 está envolvido tanto no relaxamento quanto na contração.
ous, podemos esperar que algum ATT também possa estar presente nos tecidos
ratos.
demonstrado por vários estudos recentes (Detaille et al., 2019; Dias Amoedo
são no pulmão, AP e VD (Figura 8).
em PA de ratos com CH-PH. No entanto, deve-se ressaltar que
aumentando assim toda a quantidade de ATT vista pelos órgãos.
O ATT é um medicamento autorizado para uso em terapia humana por suas propriedades 
coleréticas e sialogógicas, com um excelente perfil de segurança medicamentosa. Sugerimos 
que o OP2113 pode ser usado com segurança para tratar CH-PH.
carga (Grogan et al., 2022). Assim, avaliamos a expressão do receptor muscarínico M3 em 
homogeneizados de pulmão, PA e RV de ratos N, ratos CH tratados com veículo e ratos CH 
tratados preventivamente com
Nosso estudo demonstra, pela primeira vez, o efeito protetor da
contração e relaxamento em ratos N tratados com OP2113 in vivo. Desde
Devido à vasoconstrição excessiva do PA e à proliferação celular, a pul-
que o OP2113 atuaria no PA e não no coração, modificando-
visão completa sobre o que ocorre in vivo devido à diferença tanto na concentração quanto 
na duração do tratamento com OP2113. Além disso,
ratos. Em particular, parâmetros hemodinâmicos (mPAP e RVSP), PA
FIGURA 6 Efeito de um tratamento preventivo in vivo com OP2113 sobre o estresse oxidativo induzido por hipóxia crônica (CH) na artéria pulmonar (AP) e no ventrículo direito (VD). (a) 
Quantificação da produção de O2ÿ em AP e (b) VD de ratos N versus CH tratados in vivo com OP2113 (140 ÿgkg1 dia1 ) ou seu veículo (VEH). (c) Peroxidação lipídica avaliada por western 
blotting visando 4-hidroxinonenal (4-HNE) em AP e (d) VD de ratos N versus CH tratados in vivo com OP2113 ou seu VEH. (e) Carbonilação de proteínas avaliada por western blotting 
visando grupos carbonila de proteínas carboniladas em AP e (f) VD de ratos N versus CH tratados in vivo com OP2113 ou seu VEH. Imagens representativas de experimentos de western 
blotting para peroxidação lipídica ou carbonilação de proteínas são mostradas em c, d, e e f, respectivamente. N, normóxia; CH + VEH, hipóxia crônica + tratamento in vivo com veículo; CH + 
OP2113, hipóxia crônica + tratamento in vivo preventivo com OP2113. Os dados representam médias ± SEM. N representa o número de
A resistência vascular primária aumenta no PH, aumentando assim a pós-carga do VD, 
levando à remodelação adaptativa do VD. No entanto, embora o OP2113 tenha efeitos 
benéficos significativos tanto no mPAP elevado quanto no RVSP, ele não altera a hipertrofia 
do VD. Da mesma forma, Smith et al. recentemente
pelos nossos resultados mostrando uma diminuição da hiper-reatividade da PA induzida por 
5-HT após um tratamento preventivo com OP2113 in vivo (2,9 mM de OP2113 na mini-bomba 
ou 140 ÿgkg1 dia1 por 3 semanas) ou um tratamento agudo com OP2113 ex vivo (10 ÿM por 
30 min)
Orii et al., 2010). Portanto, é provável que os receptores muscarínicos M3 sejam
massa mitocondrial em RV, foram todos melhorados pelo tratamento in vivo com OP2113
P