Aula 6 - Controle da expressão gênica

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<p>Aula 5 e 6: Controle da expressão gênica e Epigenética;</p><p>Prof. Dr. Adriano Felipe Perez Siqueira</p><p>Diferenciação celular</p><p>Morfologia e função</p><p>Irreversível</p><p>Antigamente – perdia genes;</p><p>Diferenças X semelhanças</p><p>Muitas coisas são comuns entre as células;</p><p>Vários produtos gênicos;</p><p>Utilizam de 30 a 60% dos genes;</p><p>Comuns:</p><p>Proteínas da estrutura da cromatina;</p><p>Maquinário de replicação, transcrição e tradução;</p><p>Maquinário de reparo de DNA;</p><p>Proteínas do citoesqueleto (actina)</p><p>Diferenças X semelhanças</p><p>Alguns produtos são exclusivos</p><p>Hemoglobina – hemácias</p><p>Tirosina aminotransfersase – fígado</p><p>Os genes que são comuns, apesar de expressos em vários tipos celulares, o nível de expressão é distinto;</p><p>Diferença qualitativa X quantitativa;</p><p>O que seria mais preciso para avaliar a diferença entre células?</p><p>Genoma X Transcriptoma X Proteoma X metaboloma?</p><p>Fenótipo</p><p>O que é fenótipo?</p><p>Genótipo X Meio</p><p>Msm tipo cellular: duas condições</p><p>Msm expressão?</p><p>Figado c/ ou s/ glicocorticóide?</p><p>Excercício intenso ou jejum;</p><p>Produção de ATP a partir de outras moléculas (aa)</p><p>⬆️tirosina aminotransferase;</p><p>Adipócito⬇️ tirosina aminotransferase c/cortisol;</p><p>Outras células não tem receptores para cortisol;</p><p>Fenótipo</p><p>Algumas características da célula são moduláveis</p><p>Outra são intrínsecas e não mudam;</p><p>Formas de controle do produto final:</p><p>Transcricional – quanto é transcrito</p><p>Processamento – splicing</p><p>Transporte e localização – exportação citoplasma;</p><p>Traducional – quais mRNA e quanto;</p><p>Degradação do mRNA;</p><p>Atividade protéica: des/ativando, compartimentalizando/ (zimogênios?)</p><p>Transcricional: importante – economia, pq?</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Proteínas – reconhecem sequências específicas do DNA (5-10 pb) – sequências reguladoras</p><p>Sequências reguladoras cis-atuantes (msm cromossomo)</p><p>Geralmente próxima ao gene – regiões intergênicas</p><p>10% dos genes = proteínas reguladoras de transcrição</p><p>Reconhecem as sequências por fora, como?</p><p>Pelos componentes químicos e opções de ligações</p><p>Semelhante a H-R chave-fechadura</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Em geral reconheceriam sequências de 6pb</p><p>Probabilidade = 46 = 1 a cada 4.096 nucleotídeos;</p><p>Muitas possibilidades no genoma eucarioto = 732.875</p><p>Como reduzir?</p><p>Dímero de proteínas = 12 pb = 412 =16.777.216 =178</p><p>Dímero de proteínas iguais (homodímeros) ou diferentes (heterodímeros);</p><p>Empacotamento e remodelamento da cromatina, interferem no acesso ao DNA</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Bactérias: sem nucleossomos mais simples</p><p>Genes expressos em grupos = óperons</p><p>1 região promotora – 1 mRNA = várias genes/proteínas</p><p>Eucariotos óperons são raros</p><p>Regulação e expressão individual;</p><p>Repressor triptofano:</p><p>Opéron codifica 5 enzimas da síntese de triptofano;</p><p>Região promotora tem um sítio de reguladores</p><p>Sem triptofano promotor ativo – polimerase liga</p><p>Triptofano liga no regulador – ativa e bloqueia POL</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Podem ligar ou desligar genes</p><p>Reduzindo a afinidade da polimerase ou bloqueando sua ligação</p><p>Aumentando a afinidade ou permitindo sua ligação (⬆️1000X a expressão de um gene)</p><p>Proteína CAP ligada ao AMPc ativa genes para digestão de outros sacarídeos além da glicose;</p><p>Mais de um regulador para um óperon</p><p>Operon Lac: CAP ( atv na ausência de glicose) e ausência do repressor LAC ( presente na ausência de lactose)</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Regiões reguladoras em procariotos próximas, ou até dentro do promotor;</p><p>Mas podem estar distantes;</p><p>DNA deverá fazer uma alça para a interação;</p><p>Lembra estruturas de quem?</p><p>Eucariotos;</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Eucariotos;</p><p>Há 5 fatores gerais de transcrição (procarioto 1 𝛔)</p><p>Vários reguladores, que podem estar muito distantes e fazem ligações indiretas para ativar ou inibir a região promotora</p><p>Coativador e correpressor – não liga direto no DNA, liga em reguladores</p><p>Como está a organização do DNA nos eucariotos?</p><p>Cromatina (eu e hetero)</p><p>Proteínas de remodelação da cromatina são necessárias – acesso dos fatores as regiões reguladoras e promotora</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Alteração cromatina durante transcrição;</p><p>Após?</p><p>Retorna ao anterior ou permanece;</p><p>Memória de curto ou longo prazo;</p><p>Se retornar – genes que precisam ativar e desativar rápido em resposta a estímulos;</p><p>Algumas alterações permanecem e são passadas para a próxima geração, como chama?</p><p>Herança epigenética?</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Como estimulam a transcrição?</p><p>Atraindo novos reguladores</p><p>Atraindo a polimerase</p><p>Liberando a polimerase do promotor</p><p>Liberando polimerases pausadas na transcrição</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Múltiplos fatores reguladores, como interagem?</p><p>A soma da função isolada?</p><p>Ação sinérgica: resultado final pode ser muito diferente/superior a simples soma das ações isoladas</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Só tem ativadores?</p><p>Nãão, há repressores tbm!</p><p>Como atuam?</p><p>Competem com ativadores, se ligam a ativadores;</p><p>Se ligam aos fatores gerais;</p><p>Alteram a estrutura da cromatina deixando menos acessível</p><p>Maior compactação, remove acetilações e coloca metilações;</p><p>Reguladores de transcrição</p><p>Pq um ativador ou repressor de um gene não influencia outro próximo?</p><p>Segregação da cromatina em domínios funcionais independentes</p><p>Sequências barreiras – impedem a difusão da heterocromatina;</p><p>Proteínas isoladoras – separam a cromatina de genes distintos, criando domínios específicos</p><p>Tipos celulares</p><p>Como as células se especializam virando tipos celulares distintos?</p><p>Expressão gênica específica/controle da expressão;</p><p>Mitose de célula especializada, célula filha?</p><p>Especializada (musc liso, hepatócito)</p><p>Células muitos especialiazadas?</p><p>Não dividem</p><p>Memória celular do padrão de expressão</p><p>Herança, genética?</p><p>Molecular e EPIGENÉTICA</p><p>A combinação de reguladores de transcrição resulta no tipo celular</p><p>Tipos celulares</p><p>A manipulação desses reguladores pode alterar o tipo celular;</p><p>Ativaram 3 reguladores específicos do sistema nervoso em hepatócitos, o que aconteceu?</p><p>Ativaram reguladores do desenvolvimento dos olhos nas células que davam origem as patas nas drosófilas, o que aconteceu?</p><p>Ativação de reguladores de células troncos, em células adultas especializadas, o que virou?</p><p>iPS</p><p>Tipos celulares</p><p>Apesar dos reguladores de determinados tipos celulares e do seu padrão de expressão gênica</p><p>Essas células podem e devem mudar esse padrão em resposta ao meio;</p><p>Sinalização hormonal atua dessa forma;</p><p>Hormônios podem mudar rapidamente os reguladores transcricionais nas células alvo;</p><p>Principalmente os lipídicos;</p><p>Cortisol, testosterona, progesterona;</p><p>Tipos celulares</p><p>Como a memória celular funciona na mitose?</p><p>Retroalimentação: reguladores estimulam sua própria síntese diretamente ou indiretamente</p><p>Direto: A estimula produção de A</p><p>Indireto: A estimula B, que estimula A;</p><p>Mitose: cel. filha herda metade do citoplasma, proteínas/reguladores irão juntos e se auto estimular</p><p>Memória molecular;</p><p>Mas se em vez de herdar proteínas, herdar modificações covalentes do DNA e o estado da cromatina?</p><p>EPIGENÉTICA;</p><p>Epigenética</p><p>Metilação da citosina</p><p>Citosina da sequência CG é metilada, pq?</p><p>Na fita filha vira GC, e esta tbm será metilada;</p><p>Padrão de metilação será herdado;</p><p>Metiltransferase de manutenção;</p><p>Padrão pode ser apagado;</p><p>Supressão metiltranferase de metilação ou enzima de desmetilação</p><p>Após fecundação:</p><p>Onda de desmetilação;</p><p>Epigenética</p><p>Metiltransferase de novo;</p><p>Cria novos padrões de metilação;</p><p>Metilação em geral é repressor de transcrição;</p><p>Interfere na ligação de fatores gerais e reguladores;</p><p>Epigenética</p><p>Proteínas reconhecem a citosina metilada e se ligam;</p><p>Atraem enzimas modificadoras de histona;</p><p>Tornam a estrutura da cromatina mais repressiva;</p><p>Bases CG se unem formando ilhas, pq?</p><p>C desaminada – U: reconhecida (quem?) e corrigida;</p><p>Uracil DNA glicosilase > nuclease AP> DNA polimerase> ligase;</p><p>Metil C desaminada – T: difícil reconhecer acabava sendo substituída;</p><p>Resulta numa substituição e perda do pb CG;</p><p>Essas ilhas CG preservadas</p><p>Epigenética</p><p>20 mil ilhas CG no genoma humano</p><p>60% dos genes de proteínas tem promotores embebidos em ilhas CGs;</p><p>Incluem genes de manutenção;</p><p>Codificam proteínas fundamentais a função celular;</p><p>PQ?</p><p>Se são fundamentais estão metiladas?</p><p>NÃÃÃÃO, nem nas células germinativas;</p><p>Se não estão metiladas, sofrem mutação?</p><p>Nãããão</p><p>Imprinting genômico</p><p>Quantos alelos temos de cada gene?</p><p>De quem foram herdados? Qual deles está ativo?</p><p>Quando apenas a cópia de um é ativa é chamado de imprinting genômico;</p><p>300 genes em humanos, só existe em mamíferos placentados e em genes de desenvolvimento fetal;</p><p>Qual o impacto disso?</p><p>Importa se é homo ou heterozigoto?</p><p>Como será o fenótipo?</p><p>E a herança? Mendeliana?</p><p>Briga entre mãe e pai no desenvolvimento fetal?</p><p>Controle epigenético!</p><p>Epigenética</p><p>Cromossomos sexuais, como era?</p><p>Cariótipos</p><p>Epigenética</p><p>X é grande e tem 1000 genes</p><p>Y é pequeno e tem 100 genes</p><p>Macho tem um de cada</p><p>Fêmea tem 2 X, como equilibrar?</p><p>Inativação de um cromossomo X;</p><p>Qual? Do pai ou da mãe?</p><p>Aleatório no desenvolvimento embrionário;</p><p>Algumas células o P outras M;</p><p>E as células filhas?</p><p>Herdarão o padrão, fêmea é um mosaico;</p><p>Interação gênica:</p><p>Cor de pelagem básica</p><p>Pelagem dos gatos</p><p>Loco B</p><p>Intensidade da eumelanina</p><p>B preto</p><p>b marrom</p><p>B > b</p><p>Interação gênica:</p><p>Cor de pelagem básica</p><p>Interação loco B e loco O</p><p>Epigenética</p><p>Esses dois X, não vivem no mesmo ambiente?</p><p>Não são expostos aos mesmo reguladores?</p><p>Como inativar um cromossomo inteiro?</p><p>Começa no centro de inativação do X (XIC)</p><p>Codifica um RNA não codificador longo (Xist)</p><p>Fica preso ao DNA molde e atrai enzimas modificadoras de histona e metilação de DNA</p><p>10% dos genes (incluindo Xist) ficam ativos no X;</p><p>Cromossomo X, imprinting genômico e outros 1-2 mil genes (alelo ativo aleatório – mas mantido nas cels filhas) tem esse padrão de expressão monoalélica;</p><p>Herança epigenética</p><p>Epigenética</p><p>Vamos fazer um ()?</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Reguladores de transcrição, fatores de alongamento e marcas epigenéticas, o q regulam?</p><p>Transcrição de um gene, mas se já começou?</p><p>Controle pós-transcricional;</p><p>Quais vantagens e limitações de cada?</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Atenuação de transcrição:</p><p>Transcrito é abortado pela RNA pol antes do fim;</p><p>Para encerrar a transcrição precisa de uma proteína que se liga no mRNA;</p><p>Virus do HIV usa isso, só é transcrito completamente quando as condições são ótimas para o vírus;</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Ribocontrolador</p><p>Próximo a extremidade 5’do mRNA</p><p>Associa-se a pequenas moléculas que podem bloquear ou permitir a síntese completa;</p><p>Comum em bactérias</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Splicing alternativo</p><p>Já vimos</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Alteração do sítio de clivagem e poliA</p><p>Altera a porção C-terminal da proteína</p><p>Anticorpos de membrana no linfócito B</p><p>Anticorpos secretados qdo plasmócito ativado s/ a porção transmembrana</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Modificações do mRNA</p><p>Desaminação da A – I (inosina) e da C - U;</p><p>Mecanismos regulado</p><p>Enzimas específicas, desaminases</p><p>Bases em sequências específicas</p><p>= danos?</p><p>Altera a base:</p><p>Sequência de aa;</p><p>Código de terminação</p><p>Pareamento com ncRNAs</p><p>Splicing</p><p>Ausência desse processo = doenças</p><p>Canal de Ca SN e epilepsia</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Exportação do mRNA</p><p>Maior parte (95%) dos transcritos fica no núcleo</p><p>tRNA, rRNA, íntrons, cauda poli A;</p><p>Mas há mecanismos para controlar a exportação</p><p>HIV – retrovírus, como funcionava?</p><p>Qdo transcrito:</p><p>Splicing para formar 30 mRNAs</p><p>mRNA inteiro para novo genoma;</p><p>Como sabe qual?</p><p>Fase I – produz e processa</p><p>Uma das proteínas sintetizadas (REV)</p><p>Liga ao mRNA inteiro e impede processamento</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Exportação do mRNA</p><p>Interage com um receptor de exportação nuclear</p><p>Permite a exportação do mRNA inteiro</p><p>Para ser encapsulado (capsídeo)</p><p>Formar novas formas infectantes de vírus;</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Envio e restrições a locais específicos do citosol</p><p>Proteínas citoplasmáticas – Ribossomos livres</p><p>Proteínas para secreção – RL – RER;</p><p>Vários locais do citoplasmas – próximos a região de necessidade</p><p>Células grandes e polarizadas;</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Controle da tradução</p><p>1-Proteínas se ligam ao quepe e AUG iniciador e inibem ou até bloqueiam o início da tradução</p><p>2-Fosforilação do fator de início de tradução eIF2</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Controle da tradução</p><p>Iniciar no segundo AUG em vez do primeiro</p><p>Varredura frouxa</p><p>Forma duas proteínas com variações na porção N-Terminal</p><p>Localização diferente:</p><p>Citosol</p><p>Mitocondria</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Degradação do mRNA</p><p>Meia vida varia de 10 h a poucos minutos;</p><p>RNA de interferência</p><p>Pequenos/micros RNAs complementares a mRNA</p><p>Ao se ligarem ao alvo, bloqueiam a tradução</p><p>Catalisam a destruição dos alvos;</p><p>Mais de 1 mil no genoma humano</p><p>Regulam 1/3 dos genes</p><p>Se associa a proteínas formando RISC</p><p>Complexo de silenciamento induzido por RNA</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Qual vantagem de ter proteínas que detectam RNA de fita dupla e fragmentam?</p><p>O que fazia RNA de fita dupla?</p><p>Virus e transposons;</p><p>Proteção celular</p><p>Biotecnologia, como?</p><p>Dicer encontra RNA fita dupla e cliva;</p><p>Junta com argonauta e forma RISC</p><p>Argonauta cliva o alvo</p><p>iRNA pode ser passada para a próxima geração</p><p>Memória molecular;</p><p>Pode ser passada via GAP junctions;</p><p>Controle pós transcricional</p><p>Os iRNAs podem se ligar em mRNAs durante a síntese pela polimerase;</p><p>Atraem proteínas de remodelação de cromatina e modificação de histonas;</p><p>O que farão?</p><p>Repressão da expressão – HETEROCROMATINA</p><p>O que é isso?</p><p>Epigenética;</p><p>Esse mecanismo é usado para manter a heterocromatina dos centrômeros</p><p>Produz iRNAs das regiões do centrômero e ativa o mecanismo de manutenção da heterocromatina</p><p>Bactérias</p><p>Grande parte da biomassa da terra;</p><p>Virus, quem é o principal hospedeiro?</p><p>:0</p><p>Tiveram que desenvolver estratégias antivirais;</p><p>CRISPR</p><p>Qdo vírus infecta – faz vários pequenos fragmentos do DNA viral se inserir no DNA genômico = vacina;</p><p>Passa para a próxima geração</p><p>Esse DNA será transcrito – pequeno RNA (crRNA)</p><p>Se associará a proteína e destruirá o alvo, mas será DNA dupla fita diferente de iRNA (RNA fita simples)</p><p>Bactérias</p><p>Detalhadamente: fragmentos de DNA viral são inseridos no locus CRISPR;</p><p>CRISPR = clustered regularly interspersed short palindro-mic repeat</p><p>Regiões palindrômicas intercaladas por pequenas porções de DNA viral de infecções anteriores;</p><p>Infecções recentes extremidade 5’ (pq?)</p><p>Primeira a ser transcrita</p><p>O gene CRISPR será transcrito – longo RNA</p><p>Processado em RNAs menores crRNAs</p><p>Associados a enzimas cas (CRISPR associated)</p><p>Procuram alvos e clivam – nucleases;</p>