Adesão Bacteriana ao Endotélio

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Introdução
1.1 A adesão à células do hospedeiro é o primeiro passo de uma infecção
1.2 Capacidade de aderência das bactérias às células do hospedeiro e evasão do sistema imune = Infecção bem-sucedida
1.3 Ponto inicial para colonização e replicação
2.1 O endotélio - tecido que compõe os vasos sanguíneos. 
2.2 É composto por células endoteliais e músculo liso (a depender do tipo de vaso)
2.3 Interação de microorganismos circulantes com esse tecido - nicho celular onde patógenos podem disseminar
2.4 É um sítio alvo para várias infecções bacterianas causadas tanto por bactérias G+ quanto G-
	Acinetobacter baumannii - Infecções de tecidos moles e sepse
	Bartonella henselae - Forte tropismo pelo endotélio. Doença da arranhadura do gato.
Borrelia burgdorferi - Doença de Lyme. Estudos sugerem que depende da capacidade bacteriana de interagir proximamente com os vasos sanguíneos (por internalização e indução de vias de sinalização das células endoteliais)
S. aureus - Endocardite ou sepse. Dependem da capacidade de se ligar ao endotélio das valvas cardíacas e vasos sanguíneos
2.5 Matriz extracelular do endotélio - Formada por colágeno, laminina e fibronectina
2.6 Fibronectina
É uma glicoproteína de alto peso molecular
Produzida pelos fibroblastos do tecido conjuntivo, principalmente, e o próprio endotélio
Se liga a receptores proteicos transmembrana de células chamados integrinas, ancorando as células à matriz
Função adesiva – Aderência de células à matriz, “ponte” de ligação das células
Também se liga aos outros componentes da matriz extracelular
Papel na restauração de feridas – Estrutura de deposição da MEC
3.1 Adesinas bacterianas: são mediadores para adesão célula-hospedeiro e interação com proteínas da matriz. Ligam a bactéria às células hospedeiras, ou a componentes da MEC.
	G-: Pili, proteínas de autotransporte, lipoproteinas...
	G+: MSCRAMMs
3.2 A interação das bactérias citadas anteriormente com a Fibronectina da matriz (Fn) já foi observada em estudos através de ensaios de ligação com Fn purificada
3.3 Anticorpos inibidores de Fn resultaram em menores níveis de infecção nas células endoteliais.
Objetivos:
Analisar o papel geral da Fn na adesão de bactérias às células do hospedeiro usando condições estáticas e dinâmicas para vários patógenos humanos
Metodologia
Cepas bacterianas, condições de cultura e reagentes
Tabela 1 (cepas)
A. baumanni e S. aureus cultivados em ágar CBA (ágar sangue columbia) a 37 oC. Uma única colônia foi selecionada para inoculação em cultura overnight (37 oC com agitação)
Subculturas foram então preparadas para para os experimentos de adesão às CEs. O número de bactérias viáveis foi quantificado por diluições seriadas em placas de CBA, e contagem das CFU após 1 dia de incubação a 37 oC
B. henselae foram cultivadas por 3d em meio líquido de Bartonella (BaLi), suplementado com soro fetal bovino depletado de Fn. O número de bactérias viáveis nas garrafas de cultura foi quantificado da mesma forma descrita anteriormente.
B. burgdorferi foi cultivada até o meio da fase log a 33oC em condição microaerófila, em meio BSK-H. A densidade de espiroquetas foi determinada em câmara de contagem Kova e microscopia de campo escuro.
E.coli (NEB 5 alfa competente) foi cultivada overnight em caldo lisogênico líquido ou sólido. (Usada para obtenção de plasmídeos para padrão de controle nos qPCR)
Cultura de células de mamífero
Células endoteliais de veia umbilical (HUVECs) foram usadas para sequenciamento de RNA. 
Foram cultivadas HUVECs WT e knockout para Fn1 em meio de cultura EC (ECGM)para os experimentos de adesão às células endoteliais. 
Células Hep-G2 e Caco-2 foram cultivadas em DMEM, células HeLa-229 e HaCat foram cultivadas em RPMI 1640. Essas células foram usadas para comparar os níveis de expressão de FN1 com das HUVECs.
HUVEC
Geração de anticorpos de A. baumannii – Para serem usados na fase de detecção do ELISA de célula inteira (?)
Anticorpos IgG anti-A. baumannii foram preparados. As bactérias foram cultivadas em caldo Mueller-hinton e inativadas com 10% formalina por 2h a 37 oC. Bactérias mortas quimicamente foram usadas como antígeno para a geração dos anticorpos.
Determinação da ligação de Fn com bactérias imobilizadas – ELISA de célula inteira (?)
Quantidades crescentes de Fn foram adicionadas para analisar se a adesão bacteriana era dose-dependente da substância.
Western blot – Comparação dos níveis da Fn em HUVECs com as outras células cultivadas.
As proteínas de células de mamíferos cultivadas foram obtidas e separadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de nitrocelulose e incubadas com anticorpos de coelho anti-Fn e anticorpos anti-beta-actina de camundongo. (overnight a 4 oC), e anticorpos de detecção anti IgG. A detecção foi feita com substrato quimioluminescente para western blott e sistema de imagem Fx6 EDGE
Ensaios de adesão bacteriana às células do hospedeiro
As HUVEC foram infectadas com as bactérias cultivadas
- Para a microscopia confocal de varredura à laser (CLSM), 5x10^4 células foram semeadas em placas de 24 poços com cobertura colagenisada e cultivadas por 72h sem atb. Os experimentos de adesão foram performados por 60 min.
- Para os ensaios de adesão estático, 5x10^5 céls foram semeadas em placas de 6 poços colagenisadas e cultivadas overnight. '' ''. Antes da incubação, A. baumannii e B. burgdoferi foram centrifugadas nas HUVECs por 5 min a 300 g. Após a adesão, as células foram lavadas com ECGM para remover bactérias não aderidas.
- Para o ensaio de adesão dinâmica, em condições que simulam o fluxo sanguíneo, foram semeadas 2x10^5 cels em lâmina para ensaio de cultura de células em fluxo, e cultivaram overnight. Seringas de 10-20ml com ECGM pré-aquecido basalmente, e bactéria, foram conectados a bomba de seringa para criar um fluxo constante, semelhante ao sanguíneo, do meio com bactérias durante o processo.
O meio ECGM basal foi lavado a cada 5 min para remoção de células mortas, seguido de ressuspensão bacteriana no meio ECGM basal por 40 min, e uma etapa final de meio ECGM por 10 min para remover bactérias livres.
Imunofluorescência e microscopia confocal
As HUVECs foram fixadas com PFA e permeabilizadas. Em seguida, foi feito o bloqueio das células com BSA 1% por 1h, e incubação em r.t por 1h com anticorpos primários contra as bactérias selecionadas, anti Fn celular, Anti-Fn, anti-Laminina, e anti-colageno V, e sequencialmente com acs IgG secundários. O citoesqueleto de actina foi corado com Alexa 555 phalliodina. O DNA bacteriano e de mamífero foi marcado com DAPI por 10 min.
Lâminas foram montadas com meio de montagem fluorescente.
As lâminas foram examinadas por microscopia de imunofluorescência, no micrsocópio Zeiss Axio Imager 2.
Para as lâminas de CLSM, foi usado o sistema Stellaris 8 equipado com laser de luz branca.
Aquisição de imagens e análise foram performadas com o software Las X.
Quantificação de qPCR das bactérias aderente as células
As bactérias aderentes as HUVECs foram quantificadas por copias de genes equivalentes.
Para o ensaio de adesão estáticas, as células foram removidas com um raspador, transferidas para microtubos e lavadas.
Para a adesão dinâmica, o meio ECGM basal foi removido, e um buffer de lise foi adicionado diretamente nas câmaras de fluxo. A extração de DNA foi feita por lise alcalina e buffers de neutralização.
A amplificação dos genes específicos das espécies foi feita para determinar o número de cópias de genes bacterianos e das HUVEC. O número de bactérias aderentes foi quantificado com fragmento de genes específicos para cada bactéria, e para as HUVECs. 
Os plasmídeos de E. coli NEB 5 alpha competent foram usados como controle para as qPCR do estudo.
Preparo da biblioteca de sequenciamento de RNA e análise
O RNA total das HUVEC foi isolado
1 ug do RNA total foi usado para realizar o sequenciamento. 
Análise da expressão de genes usando dados de FANTOM5
Para comparar a expressão individual de genes com todos os outros tipos de células ou tecidos, cada sinal específico de tipocelular foi obtido por CAGE FANTOM5, foi dividido pela média do sinal observado em todos os tipos de célula ou tecido e foi plotado. Os dados de expressão do CAGE FANTOM5 foram obtidos da biblioteca do site (https://fantom.gsc.riken.jp/) com buscador ZENBU.
Analisabilidade dos dados
Os dados do sequenciamento de RNA foram depositados e estão disponiveis no NCBI
Análise dos dados e estatísticas
O número de réplicas está indicado em cada figura. Para a IF e CLMS, fotos representativas de pelo menos 25 campos foram avaliadas.
As análises estatísticas foram feitas usando o software Prism V6. Valor de p <0.05
Resultados
Fig. 1. Extracellular matrix (ECM) gene expression and Fn protein levels in various human cells or cell lines. (A)Heat map showing gene expression signals obtained from FANTOM5cappedanalysis of gene expression (CAGE) for different collagens (COL), laminins (LAM), and fibronectin (FN1) across endothelial cells (EC) and smooth muscle cells (SMC) originated from different human tissues. Mature adipocytes (FN1 low-expression) served as a reference cell type. Mean signals from different donors are shown colour-coded (blue: low expression; orange: high expression). (B) RNA-Seq number of read counts of extracellular matrix (ECM) genes in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The number of reads mapped to each particular gene (counts) is represented as the mean of four replicates ± SD. (C) Analysis of Fn protein levels via Western blotting in HUVECs and epithelial cells (HaCat: human keratinocytes, Hep-G2: human liver carcinoma cells, Caco-2: human colon adenocarcinoma cells, HeLa-229: human cervix carcinoma cells). Relative signal intensity of protein bands normalised to b-actin (loading control) are depicted.
3.1 As células endoteliais e musculares lisas expressam predominantemente o gene FN1, que codifica a fibronectina, proteína chave na matriz celular.
A análise de RNA-Seq em HUVECs mostrou que FN1 é também o gene mais expresso entre as ptns da matriz extracel.
Níveis de ptn Fn é predominante em HUVECs, em comparação com outras células.
A adesão das bactérias patogênicas humanas às células endoteliais é facilitada pela interação com a fibronectina.
Fig. 2. Bacterial adherence to fibronectin (Fn) deposited on endothelial cells (HUVECs) surface and Fn-coated wells. (A) Bacterial adherence to cellular Fn deposited on the cell surface of HUVECs. Cells were infected with different bacterial genera and bacterial adhesion was analysed using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Projection of 3D images (insert) and XZ-sections (dotted line) show close interaction between bacteria and cellular Fn (bacteria: green, nuclei: blue, beta-actin: red, Fn: cyan). Scale bar: 5 mm. (B) Determination of Fn-binding to immobilised bacteria by whole-cell ELISA. Microtiter wells were coated with bacteria and exposed to increased concentrations of Fn. For control, bacteria were omitted (blank). Bound Fn was detected using mouse anti-Fn antibodies. Bacterial adherence to the plates was controlled in parallel using specific bacterial antibodies (not shown).
3.2 Bactérias colocalizam com as fibras de Fn nas células endoteliais, conforme observação por microscopia confocal. As bactérias parecem ser "capturadas" nas e entre as fibras. 
A interação das bactérias com a Fn se demonstrou dose-dependente, a fibronectina purificada de plasma foi adicionada em diferentes concentrações ao ELISA para avaliar a interação dose-dependente entre as bactérias e essa substância. A menor ligação foi entre A. baumannii e Fn, e a maior entre B. henselae e Fn.
Fig. 3. Bacterial adherence to FN1-expressing and FN1 knockout endothelial cells (HUVECs). Bacteria were evaluated for their adhesion capacity to control HUVEC (expressing FN1) and Fn HUVEC (FN1 knockout). Bacterial adherence was evaluated via qPCR by absolute quantification of HUVEC-bound bacteria [bacteria: housekeeping gene equivalents (A. baumannii: rpoB, B. henselae: glyA, B. burgdorferi:16SrDNA, and S. aureus: rpoB); HUVECs: hmbs gene equivalents]. (A) For static infection, HUVECs were infected with bacteria on six-well plates for 60 min. (B) For dynamic infection under shear stress conditions, HUVECs were infected with bacteria in flow chambers for 40 min under constant flowconditions (shear stress 0.125 dyne/cm2). The mean and SD of replicates are depicted. Statistical significance was determined using two-tailed paired Student's t test comparing control and Fn HUVEC for each bacterial strain (ns: no significant; *p < 0.02; **p < 0.0099; ***p < 0.0009; ****p < 0.0001).
Fig. 1S Immunofluorescence microscopy of CRISPR Cas-mediated Fn knockout endothelial cells (HUVECs). Control HUVEC (cells expressing FN1) and Fn- HUVEC (FN1 knockout HUVEC, EC 3) were used. Cellular Fn, collagen V, and laminin were stained in control HUVEC and Fn- HUVEC to exclude an impact on collagen and laminin arrangement in the pericellular environment (Fn or laminin: green; collagen V: orange; nuclei: blue). Scale bar: 10 µm.
3.3 Adesão bacteriana às céls endot. é facilitada pela interação com a Fn;
A adesão bac. foi avaliada em condições estáticas e dinâmicas, e em ambos os casos, houve uma tendência menor de todas as bactérias aderirem na ausência de Fn, com redução estatisticamente significativa no número de bactérias aderentes nas célullas HUVEC Fn- em 12/15 cepas para o ensaio estático, e houve tendência no ensaio dinâmico em comparação com o controle, com somente S. aureus apresentando resultado significativo. Esses dados demonstram que a remoção da Fn do ambiente da matriz extracel. diminuiu a aderencia bacteriana.
Para confirmar que a interação das adesinas bacterianas realmente estava relacionada com a Fn, foram feitas comparações com o arranjo proteico da matriz extracel de HUVEC controle e Fn-, demonstrando que o colágeno V e laminina não eram afetados em ambos os tipos celulares, confirmando que a adesão era correlacionada com a Fn, e não com outros componentes da matriz.
Discussão
A interação entre as adesinas bacterianas e a Fn pode ser o passo crucial para a adesão de bactérias G- e G+ que visam células endoteliais como nicho de infecção.
A remoção da Fn da matriz extracel. reduziu a aderência bacteriana, tanto estaticamente quanto dinamicamente.
Os resultados desse estudo sugerem que a Fn pode ser um alvo potencial para estratégias antiadesão.
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