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Expressão Gênica - Tradução O que é a tradução, quando se está falando em expressão de genes? Funcionalmente, um gene é maior do que a região que codifica a proteína Qual a estrutura de um gene que codifica proteínas Fita codificadora 5’ Fita molde 3’ RNA 5’ Qual destas fitas a RNA polimerase “lê” durante a síntese de RNA? Em qual sentido a RNA polimerase “lê” esta fita? Por definição, sempre que se apresenta a sequência de um gene, é mostrada apenas a fita codificadora (aquela que é semelhante ao RNA), a não ser que explicitamente detalhado no texto. Fita molde é aquela lida pela RNA polimerase 3’ 3’ 5’ Qual é a fita a ser lida pela RNA polimerase?? Adição do quepe (cap) de 5-metilguanosina na extremidade 5’ do mRNA Adicionado por uma ligação não usual 5’ – 5’ Funções do quepe: ➢ Proteção contra exonucleases ➢ Auxilia no transporte para fora do núcleo ➢ Papel no início da tradução Pós - transcrição - processamento Adição do cauda poli(A) na extremidade 3’ do RNA • Endonuclease cliva o RNA após a sequência AAUAAA • Poli(A) Polimerase adiciona em torno de 250 adenosinas sem a necessidade de molde • Proteínas que se ligam à cauda poli(A) protegem o RNA da degradação Pós - transcrição - processamento Mecanismo de splicing Remoção do íntron na forma de um “laço” (lariat) Pós - transcrição - processamento Exercício A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTTATGCGTACCGATCGTAGGCATTAGCATAG Exercício 3 A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTT ATG CGT ACC GAT CGT AGG CAT TAG CATAG Exercício 3 A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTT ATG CGT ACC GAT CGT AGG CAT TAG CATAG 1 Exercício 3 A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTT ATG CGT ACC GAT CGT AGG CAT TAG CATAG 2 Exercício 3 A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTT ATG CGT ACC GAT CGT AGG CAT TAG CATAG 3 Exercício 3 A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTT ATG CGT ACC GAT CGT AGG CAT TAG CATAG 4 Exercício 3 A) Quais das mutações abaixo você diria que pode ser mais deletéria para a função gênica. Explique porque: 1. Inserção de um único nucleotídeo próximo do final da sequencia codificadora. 2. Remoção de um único nucleotídeo do início da sequencia codificadora. 3. Deleção de 3 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora.. 4. Substituição de um único nucleotídeo por outro no meio da sequencia codificadora. 5. Deleção de 4 nucleotídeos no meio da sequencia codificadora. CCTT ATG CGT ACC GAT CGT AGG CAT TAG CATAG 5 Expressão Gênica - Tradução O que é a tradução, quando se está falando em expressão de genes? O que existe em comum? Bolo de chocolate Síntese de Proteínas Hieróglifos egípcios O que existe em comum? Receita de Bolo de chocolate Hieróglifos egípcios - Pedra de Roseta Jean F. Champollion RNA mensageiro para Síntese de Proteínas Processo de transcrição e tradução são compartimentalizados em células eucarióticas. Transcrição de RNAs envolvidos na síntese de proteínas Transcrição e processamento de RNA ribossômico de eucariotos RNAs envolvidos na tradução 3’ 5’ Alça-ψUAlça-D Alça do anticódon Alça variável Anticódon Sítio de ligação do aminoácido A RNA de transferência (tRNA) RNAs ribossômicos (rRNA) RNA mensageiro (mRNA) - procariotos AAAAAAAAAAAAAAAACAP 3’5’ 3’5’ RNA mensageiro (mRNA) - Eucariotos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A888/?report=objectonly Figura 4-17. O papel dos três RNA na síntese proteica Outros RNAs também contribuem para a expressão O código genético (RNA a Aminoácidos) Segunda letra U C A G P ri m e ir a l e tr a U UUU Fenilalanina UCU Serina UAU Tirosina UGU Cisteína U T e rc e ir a l e tr a UUC UCC UAC UGC C UUA Leucina UCA UAA Parada UGA Parada A UUG UCG UAG UGG Triptofano G C CUU Leucina CCU Prolina CAU Histidina CGU Arginina U CUC CCC CAC CGC C CUA CCA CAA Glutamina CGA A CUG CCG CAG CGG G A AUU Isoleucina ACU Treonina AAU Asparagina AGU Serina U AUC ACC AAC AGC C AUA ACA AAA Lisina AGA Arginina A AUG Metionina ACG AAG AGG G G GUU Valina GCU Alanina GAU Ácido Aspártico GGU Glicina U GUC GCC GAC GGC C GUA GCA GAA Ácido Glutâmico GGA A GUG GCG GAG GGG G Códon Código Universal Código não usual Ocorrência UGA Stop Trp Mycoplasma, Spiroplasma,mitocôndria de várias espécies CUG Leu Thr Mitocôndria de leveduras UAA, UAG Stop Gln Acetabularia, Tetrahymena, Paramecium, etc. UGA Stop Cys Euplotes (Ciliado) S. Osawa et al., 1992, Microbiol. Rev.56:229. Tabela 4-3. Códons não usuais em genes nucleares e mitocondriais “Codon usage” : códons mais comuns para cada espécie : importante na predição de genes O código genético pode ser lido de até 3 formas diferentes Evento raro Pode ocorrer em eucariotos, procariotos e vírus onde uma mesma sequência pode gerar mRNA diferentes O código genético não é sobreposto RNA transportador (tRNA) 3’ 5’ Alça-ψUAlça-D Alça do anticódon Alça variável Anticódon Sítio de ligação do aminoácido A Alça-ψU Alça-D Anticódon CCA 3’ 5’ B Aminoacil-tRNA sintetase se acopla ao aminoácido específico e em seguida, e por meio de uma ligação de alta energia (quebra de ATP) liga o aminoácido ao tDNA correspondente. A P A P P P Aminoácido A P P P ATP Aminoácido e ATP entram no sítio ativoda enzima Pi Pi AMP é ligado ao aminoácido como liberação de pirofosfato AMP é trocado pelo tRNA, criando o aminoacil tRNA AMP tRNA Aminoacil tRNA sintetase Sítio do ATP Sítio do aminoácido Sítio do tRNA Aminoacil tRNA é liberado da enzima Aminoacil tRNA Sítio do ATP Sítio do ATP Sítio do tRNA Sítio do aminoácido Sítio do tRNA Ativação do tRNA ➢ As bases do tRNA são variáveis de forma a dar especificidade ao aminoácido. ➢ A extremidade 3’ apresenta a sequência CCA, onde será acoplado o Aminoácido; ➢ As bases podem ser modificadas em regiões específicas do tRNA. RNA transportador (tRNA) D: dihydrouridina I: inosina T: ribotimidina Ψ: pseudouridina m: grupo metil http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A878/?report=objectonly ➢Pareamento não usual. ➢O tRNA reconhece mais de um códon; ➢O códon reconhece mais de um tRNA. ➢ A 1a. e 2a. posição do códon e 2a. e 3a. do anticódon formam pareamento Watson-Crick ➢A 1a. Posição do tRNA é chamada de posição oscilante ou variável (wobble) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A880/?report=objectonly Table 4-22. Componentes dos ribossomos eucarióticos e procarióticos Similaridades funcional e estrutural sugerem origem evolutiva comum Svedberg (S): medida de coeficiente de sedimentação de macromoléculas. RNA Ribossômico (rRNA) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A888/?report=objectonly ➢A molécula do rRNA apresenta regiões variáveis e conservadas. ➢Permite estudos evolutivos. ➢Estruturalmente são muito similares entre diferentes espécies. Figure 4-33. Estrutura secundária da subunidade 16S do rRNA de bactérias Cloroplastos e mitocôndrias também apresentam 16S rRNA – Origem procariótica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A889/?report=objectonly ➢ A biogênese do ribossomo é altamente coordenada, sendo regulada a síntese dos peptídeo (citoplasma) e do rRNA (nucléolo, exceto 5S rRNA)e exportação das subunidades montadas para o citoplasma. ➢ Tradução: Fatores de iniciação (eIF) eIF2, eIF3, tRNA e GTP se juntam ao 40S rRNA para formar o complexo 43S. O eIF4E se junta ao 43S para formar o complexo 48S com o mRNA. Finalmente a subunidade 60S e a 48S se juntam para formar o complexo 80S. Sequência Shine-Dalgarno reconhecida em Escherichia coli Ligação do Ribossomo ao mRNA em procariotos Ligação do Ribossomo ao mRNA em eucariotos IRES (Internal Ribosomal Entry Site): elemento de RNA que permite a iniciação da tradução de maneira independente do cap ➢ O complexo eIF4F (incluindo o IF4E), a proteína citoplasmática de ligação ao CAP (CBC) se junta ao 43S para formar o complexo 48S com a extremidade 5’ do mRNA. ➢ O complexo 43S desliza sobre o mRNA até o códon AUG. IF5 hidroliza GTP, dissociando os fatores de iniciação e juntando com o 60S ➢ A subunidade 40S do rRNA se liga fator de iniciação eIF2 ao GTP e ao tRNAmet para formar o complexo 43S. ➢ A proteína de ligação à cauda poli-A (PAB) se liga ao poli-A e facilita à ligação com IF4G,juntando as extremidades 5' e 3' do mRNA. Formação do complexo de tradução A tradução começa com a montagem do ribossomo (80S) e o posicionamento do tRNAi met no síto P. N-formyl-metionina Bactérias Metionina ➢ O ribossomo forma um túnel por onde passa a proteína nascente (NC). ➢ O centro da peptidil-transferase (PTC) do 50S é ocupado pelo sítio P. ➢ O túnel é, principalmente constituído de rRNA e em menor proporção das proteínas L4 (violeta), L22 (verde) e L23 (laranja). ➢ A peptidil transferase é uma função do rRNA – subunidade maior (23S e 28S). ➢ O fator de elongação eEF1A coloca o aminoacyl-tRNA no sítio A do ribossomo. ➢ Ocorre formação da ligação peptídica, transferindo o aminoácido do tRNA do sítio P para o aminoácido do sítio A. ➢ A translocase e o eEF2 transfere o peptidyl-tRNA do sítio A para o sítio P e desacetila o tRNA do sítio E, liberando o sítio A para outro aminoacyl-tRNA. Elongação do peptídio Ação da peptidil transferase para formação das ligações peptídicas Transferência do aminoácido do aminoacil-tRNA do sítio P para o aminoacil-tRNA do sítio A. ➢ A tradução é concluída quando o códon de terminação encontra-se no sítio A. ➢ Fatores de liberação (RF) coordenam a terminação da tradução. ➢ eRF1 (RF1 ou RF2 em procariotos) reconhece o códon de terminação e se ligam ao ribossomo (sítio A). ➢ O eRF3 (RF3) se liga a um GTP, o complexo eRF3-GTP atua coordenado com o eRF1 para clivar a ligação peptidyl- tRNA . Terminação da tradução http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21653/figure/A913/?report=objectonly Tradução do mRNA em ribossomos acoplados ao retículo endoplasmático e no citoplasma. São eventos semelhantes? Tradução do mRNA em ribossomos acoplados ao retículo endoplasmático. O peptídeo sinal se liga ao SRP (signal recognition particle) e é removido com quebra de um GTP por uma peptidase A proteína será maturada e poderá ser exportada. Mas isso é uma outra história..... https://www.youtube.com/watch?v=1b-bRVgqof0 https://www.youtube.com/watch?v=2BwWavExcFI https://www.youtube.com/watch?v=2BwWavExcFI https://www.youtube.com/watch?v=2BwWavExcFI Slide 1 Slide 2 Slide 3 Slide 4 Slide 5 Slide 6 Slide 7 Slide 8 Slide 9 Slide 10 Slide 11 Slide 12 Slide 13 Slide 14 Slide 15 Slide 16 Slide 17 Slide 18 Slide 19 Slide 20 Slide 21 Slide 22 Slide 23 Slide 24 Slide 25 Slide 26 Slide 27 Slide 28 Slide 29 Slide 30 Slide 31 Slide 32 Slide 33 Slide 34 Slide 35 Slide 36 Slide 37 Slide 38 Slide 39 Slide 40 Slide 41 Slide 42 Slide 43 Slide 44 Slide 45 Slide 46