CASO MARÍLIA UNICAMP - Célula

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SINTOMAS INICIAIS:
Cansaço (por conta da grande produção e destruição de células)•
Emagrecimento (por conta da grande produção e destruição de células)•
Vômitos frequentes•
Dor abdominal (por conta do aumento do tamanho do baço)•
Presença de uma massa no lado esquerdo do abdômen•
AÇÃO MÉDICA INICIAL:
A Ginecologista pediu um hemograma que mostrou aumento do número de glóbulos brancos e 
anemia - por conta da redução da produção de células normais - (além do aumento do número de 
plaquetas) o que era compatível com Leucemia Mielóide Crônica: acomete células pluripotenciais da 
medula óssea responsáveis pela formação de glóbulos vermelhos, brancos e plaquetas
•
Epidemiologia:
Incidência aumenta com a idade○
Mais comum entre 45 e 50 anos de idade○
Não há padrão familiar○
•
Etiologia:
Não detectada○
Radiação ionizante (bomba atômica) aumenta a incidência○
•
Evolução:
Início insidioso (parece benigno, mas pode se tornar perigoso)○
3 a 5 anos após diagnóstico: padrão agressivo e fatal○
•
AÇÃO MÉDICA DEPOIS DO HEMOGRAMA 1:
Hematologista administrou medicamento (hidroxiureia) para reduzir a produção das células da medula 
óssea
•
Tipagem HLA para detectar doador de medula compatível
OÊtermoÊHLAÊ(doÊinglêsÊHumanÊLeukocyteÊAntigens)ÊrepresentaÊumÊcomplexoÊdeÊgenesÊqueÊcodificaÊparaÊproteínasÊ
doÊsistemaÊimunitárioÊúnicasÊparaÊcadaÊpessoa.ÊEstasÊproteínasÊirãoÊreagirÊcontraÊumÊtransplanteÊdador.ÊMuitoÊ
brevementeÊexistemÊ6ÊtiposÊdeÊHLAÊqueÊsãoÊimportantesÊparaÊoÊtransplanteÊdeÊcélulasÊestaminaisÊhematopoieticas.Ê
NoÊcasoÊdoÊtransplanteÊserÊdeÊmedulaÊósseaÊaÊcompatibilidadeÊdeveÊserÊdeÊ100%ÊouÊseja,ÊparaÊtodosÊosÊ6ÊHLAÊToÊ
learnÊmoreÊaboutÊcordÊbloodÊbanking,ÊvisitÊParent'sÊGuideÊtoÊCordÊBloodÊFoundationÊ
at https://parentsguidecordblood.org/pt/faqs/o-que-e-tipagem-hla-e-como-e-utilizada
○
•
identificaçãoÊmolecularÊdosÊgenesÊdoÊSistemaÊHLAÊdoÊindivíduo,ÊqueÊcoordenamÊaÊproduçãoÊdeÊproteínasÊ
HLA,ÊlocalizadasÊnasÊmembranasÊcelulares,ÊeÊmuitasÊvezesÊchamadasÊantígenosÊHLA.
HáÊváriosÊgruposÊdeÊgenesÊHLA:ÊA*,ÊB*,ÊC*Ê(classeÊI),ÊDQ*,ÊDR*Ê(classeÊII),ÊeÊoutros.ÊEssesÊgenes,Ê
presentesÊemÊtodasÊasÊcélulasÊnucleadasÊhumanas,ÊparticipamÊdaÊidentificaçãoÊeÊrespostaÊimunológicaÊaÊ
substânciasÊestranhasÊaoÊorganismo.ÊFormamÊumÊsistemaÊpolimórficoÊcomplexo,ÊfazendoÊcomÊqueÊosÊ
tecidosÊdeÊumÊindivíduoÊcontenhamÊgenesÊeÊproteínasÊHLAÊdiferentesÊdaquelesÊencontradosÊnosÊtecidosÊ
deÊoutraÊpessoa,ÊaÊnãoÊserÊqueÊsejamÊgêmeosÊunivitelinos.
EsseÊfatoÊéÊmuitoÊimportanteÊquandoÊumaÊpessoaÊnecessitaÊdeÊreceberÊumÊórgãoÊouÊtecidoÊdeÊoutraÊ
pessoa,ÊatravésÊdeÊumÊtransplante:ÊéÊnecessárioÊqueÊhajaÊcompatibilidadeÊentreÊosÊtecidosÊdeÊdoadorÊeÊ
receptor,ÊouÊseja, Histocompatibilidade,ÊparaÊqueÊoÊtransplanteÊtenhaÊmaisÊsucesso.
ParaÊavaliarÊoÊgrauÊdeÊhistocompatibilidadeÊentreÊduasÊpessoas,Êfaz-seÊanáliseÊgenéticaÊmolecularÊdosÊ
genesÊHLAÊ(TipagemÊHLA)ÊdeÊcadaÊuma,ÊeÊcompara-seÊoÊresultado.ÊQuantoÊmaiorÊoÊgrauÊdeÊ
histocompatibilidade,Êmelhor.
AlgunsÊtiposÊespeciaisÊdeÊgenesÊHLAÊestãoÊassociadosÊaÊdoenças,ÊcomoÊespondiliteÊanquilosante,Ê
diabetesÊinsulino-dependenteÊtipoÊ1,ÊeÊdoençaÊcelíaca.ÊOutrosÊsãoÊrelacionadosÊaÊreaçõesÊaÊ
medicamentos,ÊcomoÊcarbamazepina,ÊvarfarinaÊeÊabacavir.
AÊTipagemÊHLAÊpodeÊterÊmédiaÊresolução,ÊquandoÊseÊidentificaÊoÊgrupoÊaÊqueÊo(s)Êgene(s)Êpertence(m).Ê
OuÊdeÊaltaÊresolução,ÊquandoÊseÊidentifica(m)Êo(s)Êalelo(s)Êdo(s)Êgene(s).ÊPodeÊcompreenderÊumÊgeneÊ
apenas,ÊumÊgrupo,ÊouÊváriosÊgenesÊHLA.
•
SINTOMAS PÓS MEDICAMENTO:
A redução da produção de células levou à melhora dos sintomas:
Redução do tamanho do baço○
Melhora na anemia○
Recuperação do ânimo ○
Engordou○
•
PREPARAÇÃO PARA O TRANSPLANTE:
Quimioterapia para destruir as células neoplásicas (imunussuprimida porque destrói as células normais)•
PÓS TRANSPLANTE:
Recebeu antibióticos, glóbulos vermelhos e plaquetas•
Após 9 meses: reação enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) - linfócitos do seu irmão estavam agredindo 
as células do corpo dela
•
SINTOMAS PÓS GVHD:
Pele escurecida e manchada•
Olhos secos, com lesão de conjuntiva e córnea•
Fígado sendo agredido•
AÇÃO MÉDICA PÓS GVHD:
Doses de ciclosporina (inibidor GVHD)•
WESTERN BLOTTING DE PROTEÍNAS EXTRAÍDAS DE CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA:
Lâmina do slide: WB de proteínas extraídas de células leucêmicas da paciente. •
Utilizou-se um anticorpo contra a proteína ABL, que tem peso molecular 120kD, células normais 
apresentam apenas a banda desse peso, mas as células leucêmicas também apresentam uma banda 
210kD
•
Passo a passo:
Obtém-se células da medula óssea da paciente e de um controle normala.
As células são lisadas com tampão contendo detergente SDS (acho que aqui também coloca inibidores 
de proteases) - detergente lisa membrana, deixa negativo e separa as ligações entre elas
b.
As células são centrifugadas em alta rotaçãoc.
Ocorre precipitação de restos celulares não solubilizados (tiro esses não solúveis) e pego a solução 
(sobrenadante)
d.
O sobrenatante (que contém as proteínas solubilizadas) é fervido por 5 min para inibir as proteases 
(SDS, que atua provocando a lise das membranas das hemácias, + fervura desnaturaram as proteínas e 
romperam as ligações entre elas = podem ser fracionadas separadamente)
e.
Assim, você obtém o extrato proteicof.
Adiciona agentes que impedem a agregação de diferentes proteínas (para análise individual) - eles são 
redutores de pontes dissulfeto das proteínas
g.
Para melhorar a especificidade, pode realizar, aqui, uma imunoprecipitação: incubar o extrato proteico 
com resina contendo anticorpo anti-ABL; centrifuga e esse material ficará no fundo do tubo; realiza-se a 
h.
ESTUDO DIRIGIDO 1:
Questão 17 - O que são e qual a função das proteases? a) São compostos que 
participam das reações de quebra das ligações dissulfeto. b) São enzimas que 
participam da digestão de proteínas. c) São proteínas anormais que aparecem com 
peso elevado (210kD) no resultado do Western Blotting. d) São anticorpos que 
participam da imunoprecipitação. 
Questão 18 - Dentro das etapas do Western Blotting, qual a ação do detergente SDS 
e da fervura por 5 minutos, respectivamente? E qual a importância deles para o 
processo? R: O detergente SDS atua provocando a lise das membranas das 
hemácias, já a fervura por 5 minutos tem o papel de inibir a atividade das proteases. 
A importância de ambos para o processo é promover a desnaturação de proteínas, 
rompendo diferentes ligações (no caso da fervura, há o rompimento de ligações 
dissulfeto, deixando as proteínas na estrutura primária e evitando a agregação com 
outras) e,assim, tais proteínas podem ser fracionadas separadamente e solubilizadas, 
dando sequência ao procedimento. 
Questão 19 - O que o sangue periférico da paciente mostrava? R: O hemograma da 
paciente apresentava um aumento no número de glóbulos brancos e de plaquetas, 
ao ser comparado com o sangue periférico controle. Resultado que já sugere um 
diagnóstico de Leucemia Mielóide crônica. 
Questão 20 - No Caso Marilia, qual foi o objetivo de realizar uma tipagem HLA? R: O 
teste foi realizado nos irmãos da Marilia, para que pudessem detectar um possível 
doador compatível de medula óssea. 
DÚVIDAS E CURIOSIDADES SURGIDAS NA AULA 1:
O processo a ser realizado varia de célula a célula: uma hemácia por ex tem 
poucas organelas e sem núcleo; é só colocar água que plasmoptisa, e pra 
facilitar a Hb é corada naturalmente, posso só pegar e estudar. Hb foi a 
primeira a ter sua estrutura identificada 
210kD está mais escura porque tem em maior quantidade e é maior, ent 
depende da quantidade e densidade: marília tem proteína anormal em seu 
sangue
Processo de usar anticorpo depois do azul de comacil + sequenciar genoma
Sequencia o DNA da paciente e ver quais Aas fazem e conseq onde que 
está a mudança, qual seria a proteína diferente em relação ao controle;
•
Você faz eletroforese e vê que tem uma proteína anormal, algo estranho•
Coloca em um animal e extrai o soro•
Como sabemos base de dados de DNA público posso descobrir qual gene 
codificatal proteína que quando ligada ao anticorpo vai reagir
•
No caso de doenças congenitas: vejo o erro em todos os tecidos que 
expressam aquele gene
No caso de doenças adquiridas (caso da Marília): só acho o erro no tecido que 
ela adquiriu, por isso que o erro dela só ta nas células da medula óssea (ex: ai, 
vou pegar a células da pele dela, não tem a mutação nessas células; pego 
linfocito do sangue, tb não tem. Agora vou ver megacariocitos (precursores de 
plaquetas), precurosres de hemacias: tem! Então a mutação provavelmente foi 
em alguma célula que deu origem a todas essas outras;
Óbvio que vc pode achar que tinha uma doença congÊnita pq achou células 
anormais em vários tecidos diferntes mas pode ser metastase tb; muitas vezes 
vc não sabe o primieo tecido de origem
A questão do cariotipo: uso as células da medula da marilia, não posso pegar 
células do sangue dela pq as celulas do sangue tem baixa mitose para fazer 
cariotipo (hemacia nem núcleo tem), exceto os linfocitos, que inclusive uso 
frequetemente induzindo a divisão
CasoÊMarília
domingo,Ê6ÊdeÊmarçoÊdeÊ2022 13:17
solubilização do complexo; colocaÊoÊanticorpoÊcomÊpesinhoÊ(creioÊqueÊsejaÊaÊresina)ÊnaÊsolução,ÊcentrifugoÊdeÊnovo,Ê
imunoprecipitaçãoÊ- naÊrealÊvcÊfazÊimunoprecipitaçãoÊparaÊnãoÊficarÊbagunçado,ÊdarÊumaÊlimpezaÊgrossa,ÊmasÊelaÊnãoÊéÊ
precisaÊemÊtodasÊasÊvezesÊ- anticorpoÊnãoÊseÊligaÊaÊapenasÊumaÊparteÊespecíficaÊdeÊumaÊproteínaÊapenas);ÊaíÊagoraÊvocêÊvaiÊ
pegarÊoÊqueÊprecipitouÊeÊcolocarÊnaÊeletroforese
Realiza-se o fracionamento das proteínas extraídas da resina em gel de poliacrilamida contendo SDS-
PAGE (separa de acordo com o peso molecular) - SeÊasÊproteínasÊestãoÊmuitoÊjuntinhasÊnaÊeletroforese:ÊmudaÊaÊ
intensidadeÊdaÊcorrenteÊelétrica,ÊconcentraçãoÊdeÊpoliacrilamidaÊ(quantoÊmaiorÊaÊconcentração,ÊachoÊqueÊmaisÊjuntinhasÊ
ficamÊasÊbandas)
i.
EmÊvistaÊdasÊcélulasÊdeÊmedulaÊósseaÊapresentaremÊumÊnúmeroÊenormeÊdeÊproteínasÊcomÊváriosÊpesosÊ
moleculares,ÊéÊimpossívelÊaÊidentificaçãoÊdeÊanormalidadesÊsemÊaÊutilizaçãoÊdeÊtécnicasÊimunológicas
j.
TransferirÊproteínasÊparaÊmembranaÊdeÊnitroceluloseÊatravésÊdeÊcorrenteÊelétricaÊ(k.
imunológicas. Assim, depois do fracionamento das proteínas, o gel é colocado em contato com uma 
membrana de nitrocelulose, e novamente é aplicada uma corrente elétrica, na presença de
um tampão que permitirá o equilíbrio das cargas elétricas.)
IncubarÊmembranaÊcomÊanticorpoÊespecíficoÊparaÊidentificarÊasÊproteínasÊqueÊdesejamosÊestudarÊl.
Esta
membrana, de fácil manuseio, pode ser agora incubada com um anticorpo
específico para detectar a proteína que queremos estudar Após a incubação, a
membrana é incubada novamente com um anti-anticorpo universal que contém
um marcador, seja radioisotópico, quimioluminiscente ou fluorescente, e que
permitirá a identificação do complexo anticorpo-proteína em estudo.
SDS PAGE (dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida) -
O SDS-PAGE consiste em um tipo de eletroforese desnaturante em que as amostras são 
desnaturadas pelo calor na presença de desnaturantes (beta-mercaptoetanol) que destrói as 
pontes dissulfeto, e SDS para desnaturar a proteína agindo ainda na separação das cadeias 
polipeptídicas isoladas.
○
O SDS confere carga negativa às proteínas, facilitando a separação por peso molecular, essa 
mobilidade esta relacionada diretamente ao tamanho da proteína. Aqui não importa a forma, 
porque como elas foram desnaturadas pelo SDS PAGE estão com a mesma estrutura, e estão com 
a mesma carga, pois todas são envolvidas pela mesma quantidade de cargas negativas do SDS = 
separadas apenas pelo tamanho
○
Outro fator que influencia na mobilidade ante ao gel, é o tamanho dos poros do mesmo. 
Pequenas concentrações de poliacrilamida = gel de malha frouxas = grandes poros = passagem 
de grandes moléculas; grandes concentrações = pequenos poros = passagem apenas de proteínas 
de baixo peso molecular; no caso da Marília, era gel 8% poliacrilamida. 
○
A amostra de proteínas que será aplicada no gel é tratada para estar solubilizada e também é 
desnaturada com a quebra das pontes dissulfeto, forças eletrostáticas e pontes de hidrogênio. ApósÊ
aÊaplicaçãoÊdasÊproteínasÊnoÊgel,ÊoÊsistemaÊéÊsubmetidoÊaÊumaÊcorrenteÊelétrica,ÊnaÊpresençaÊdeÊtampões,ÊqueÊ
permitemÊaÊmigraçãoÊdasÊproteínasÊnesteÊsistemaÊdeÊgel.
○
1.
Uma vez separadas pelo tamanho, a posição das proteínas é definida por comparação à migração de 
um padrão de moléculas de tamanho molecular conhecido.
VÍDEO SDS: como é montado o gel em determinado aparato
Presilhas, placas de vidro, espaçador e o gel fica entre as placas○
Aperta bem para evitar vazamentos○
Coloca fita embaixo para vedar e não vazar o gel○
Na placa, colocam-se substâncias que induzem a polimerização, coloca na placa○
Coloca o pente para que forme os espaços para a aplicação○
Coloca (?) no polo negativo para correr para o polo positivo○
Coloca mais algo que eu não entendi○
Coloca corante azul de bromofenol (frente de corrida, para acompanhar sem perder a proteína que 
se quer estudar)
○
Coloca amostra no poço○
Aplica corrente elétrica para observar a migração○
O marcador azul que estava em cima foi lá pro fim, no fundo do gel. Isso é um guia, pra ver o 
tempo q ele demora entre o início e o fim. Quando ele cai, a gente tira o gel. 
○
Desmonta o sistema○
Retira a placa de vidro○
Está com gel pronto para ser utilizado: passa por coloração para visualização da bolha ou processo 
de transferência da proteína (nesse caso, para a membrana. 
○
Desidrata o gel, coloca no celofane, secador○
•
WESTERN BLOTTING OU IMMUNOBLOTTING
ela é utilizada para detectar e quantificar proteínas em amostras de células ou tecidos biológicos.○
Sua finalidade é compreender a quantidade de proteínas específicas na amostra em questão. 
Assim, é possível analisar os resultados do que se está pesquisando. Por exemplo, após a aplicação 
de uma vacina cujo objetivo é aumentar a quantidade de uma proteína X, é possível compreender 
se isso aconteceu de fato.
○
2.
Podemos resumir o processo de Western Blotting em cinco etapas. São elas:
Extração das proteínas;1.
Eletroforese em gel de poliacrilamida;2.
Utilização de membranas de transferência para isolar as proteínas;3.
Incubação da membrana com um anticorpo específico para detectar a proteína de interesse;4.
Utilização da membrana para análise dos dados.5.
A técnica de Western Blotting pode ser usada em diversas situações, como:
Análise do tamanho e quantidade de uma determinada proteína;•
Diagnóstico de doenças em humanos e animais;•
Teste confirmatório para o HIV, detectando anticorpos anti-HIV no soro do paciente.•
Detecção de proteínas defeituosas.•
VÍDEO WB:
Transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose•
As proteínas são reveladas através de anticorpos•
Coloca a membrana por aprox. 5 min•
Coloca-se uma esponja, papel de filtro bem úmido sem bolha•
Coloca o gel com as proteínas já separadas•
A membrana é colocada sobre o gel•
Coloca outro papel, outro papel e outra esponja (fica um sanduíche esponjas, dois filtros, 
membrana e gel)
•
Vai para cuba de transferência•
Coloca corrente elétrica , na presença de um tampão para equilíbrio das cargas elétricas (por 
aproximadamente 2 horas)
•
Então as proteínas do gel vão ser transferidas para a membrana•
(tem um marcador para guiar se foi transferido mesmo - no caso colocou dois marcadores de 
pesos moleculares para indicar que todas as proteínas, de todos os pesos, foram transferidas); 
muito melhor manusear a membrana do que o gel
•
Coloca solução de anticorpo para detectar a proteína específica que você quer estudar•
Depois tem que colocar um anticorpo secundário (acho que um anti-anticorpo universal que 
contém um marcador (radioisotópico, quimioluminiscente ou fluorescente), para facilitar a 
identificação do complexo anticorpo-proteína em estudo.
•
Coloca no filme de Rx, revelando a proteína de estudo•
•
No final só usa dois anticorpos pq é caro mesmo; é caro fazer o anticorpo específico já 
marcado; o anticorpo secundárioé genérico então ele gruda em todos anticorpos 
específicos
Imagem das proteínas que tem nas células do sangue dela - imagem da chapa: para 
identificar as diferenças nas proteínas usamos um dos vários métodos, western blotting; 
identificar o que queremos por meio de anticorpos. Anticorpo capaz de reconhecer uma 
parte das proteínas e isso pode dar uma impressão no sistema (aquele anticorpo tem 
que procurar a proteína e depois coloca em um filme/aparelho que vai emitir um sinal)
Ok, mas vou tirar a célula, mas o que faço? Nesse caso faremos uma eletroforese, como 
vamos separar a proteína
Precisa passar em um detergente: precisa abrir a célula e liberar o conteúdo dela; 
se toda a célula é formada por bicamada lipídica, o detergente consegue 
emulsificar essa membrana (existem outros métodos
•
Podemos usar o detergente SDS que vai negativar várias cargas das proteínas 
fazendo com que haja separação delas
•
E uso agentes redutores que impedem a formação de pontes que geralmente 
apareceriam em Aas com sulfeto; ligde H já tinha desfeito
•
Cada célula tem múltiplas proteínas, pq todas as células tem os mesmos genes, 
mas as proteínas variam de célula para célula a depender do estímulo que cada 
célula tem para fazer certa função, então diferentes genes serão transcritos para 
trdadurizr diferentes proteínas
•
Só que como tenho muitas proteínas faço duas limpas: na bagunça, centrifugo e 
tiro parte do material - imunoprecipitação (óbvio que existem proteínas da mesma 
família, mas já dei uma bela limpada, só as proteínas que tenham identificação 
com o anticorpo + resina que coloquei agora.
•
Anotações aula 2: bases moleculares da LMC
Na década de 1960 descobriu a técnica de se visualizar os cromossomos, algo que ainda 
é utilizado hoje, mesmo que mais automatizado (definir prognóstico e terapia para 
paciente) - precisa que os cromossomos esteja em uma configuração possível de 
visualizar 
Análise do cariótipo
A célula precisa estar em mitose•
Explodir a célula com solução hipotônica - fica com cromossomos dispersos, 
podemos fotografar e o equipamento faz o pareamento
•
Para a mitose na metáfase - foram décadas de pesquisa para saber que esse era o 
ponto
•
Existem diferentes tamanhos de cromossomos e recebemos um de cada pai•
Toda a descoberta da nossa quantidade de cromossomos, formato, caracterização 
etc
23 pares○
2X para mulher e XY para homem○
•
Bandeamento dos cromossomos
As bandas são denominadas de acordo com o centrômero (região de DNA 
mais constrito)
○
•
Propiciou descoberta de diversas doenças, proteínas, genes alterados, etc - foi uma 
revolução, avanço grande
•
Precisa entrar em mitose: consigo fazer isso com o sangue da pessoa; se a pessoa 
tem doença já de nascimento, nas células germinativas, posso pegar sangue e usar 
o linfócito (fitohematoglutinina vai ativar divisão do linfócito, pq ele está 
quiescente; coloco soro fetal bovino para criar ambiente para a célula não morrer, 
preciso de nutrientes, e muitos desses nutrientes estão no soro fetal bovino); já em 
células que estão em multiplicação normal mesmo, já pega o da medula mesmo; 
posso analisar células de feto, líquido amniótico mas ai tenho que ativar a mitose
•
Em caso de doenças adquiridas, como Marília, só pode pegar na medula, onde tá a 
doença, o linfócito não tem (linfócito só usa em casos quiescentes)
•
As células da medula são provenientes de uma célula tronco que veio lá do 
embrião (mas se linfócito não tem, é pq afetou alguma célula que vem depois do 
linfócito, acho)
•
Embrionária:
Blastocisto transforma em todas as outras células - cada célula precisa de 
estímulos, moléculas, ambiente para induzir a diferenciação daquela célula da 
forma adequada ao ambiente
○
Tem uma célula que dá tanto linfócitos quanto as células hematopoiéticas; no 
caso é uma célula tronco chamada de "linfo hematopoiéticas" (dá o tecido 
linfoide e hematopoiético)
O tecido hematopoiético tem marcadores (um antígeno chamado de 
marcador CD34+) que tem a célula hematopoiética que vai dar origem a:
Plaquetas - plaqueta não tem núcleo não dá para induzir a mitose, 
mas seu megacariócito tem erro tb
□
Granulócitos - tem núcleo mas tão muito diferenciados ent não dá 
para induzir a mitose (igual a linfócito)
□
Hemácias - hemácias não tem núcleo não dá para induzir mitose, 
mas no seu precursor tb tem erro
□
Então a alteração da LMC vai afetar essa célula hematopoiética 
precursora dessas outras 3 (esses 3 estarão alterados), por isso não 
vai afetar o linfócito para usar ele no cariótipo pq uma célula é 
precursora do hematopoiético (a afetada) e outra do linfoide 
□

○
•
Translocação BCR-ABL
Cromossomo Filadélfia era um cromossomo pequeno (22), "perdeu um pedaço" e 
tinha outro cromossomo que ficou aumentado (9): "alteração 9 22" (não confunda 
translocação com adição!); a parte do 9 que foi para o 22 é menor que a parte do 
22 que foi para o 9
Se ver no slide, o 22 perdeu desde a banda 11 (pedação perdido), enquanto o 
9 perdeu só sua pontinha
○
•
Cromossomo Filadélfia é nada mais do que o cromossomo 22 reduzido que dá 
origem à LMC
•
Descobrir que genes estão alterados, quais genes estão nessa região que foi 
perdida para o 9 - para saber de onde vem a LMC
•
BCR - breaking point.... - o gene BCR pouco se sabe sobre•
ABL - a pontinha do 9 que foi para 22, descobriu que essa pontinha era um gene 
que dava câncer em aves acho, e quem descobriu foi Abelson, por isso esse gene 
nessa pontinha foi chamada de ABL (a hora que descobriu que ABL estava 
relacionada a LMC, já tinha descoberto antes sua relação com leucemia em ave, 
ABL já tinha sido transcrito, investigado)
Esse gene conseguiu clonar, identificar, estudar e descobriu que estava 
relacionado a leucemia
○
•
FISH
Método para identificar, sem precisar estimular a divisão•
Quando esquento DNA rompo as pontes de hidrogênio•
Quando sintetizo pedaços complementares ao DNA esse complementar chamado 
de sonda se liga ao DNA ("a sonda vai sondar o DNA")
Pelo que eu entendi não é colocar o DNA em uma sopa cheio de bases ○
•
Embrião célula tronco hematolinfoide
Tecido linfoide
Tecido hematopoiético (CD34+)
O erro/alteração cromossômica 
é aqui, na célula tronco dessa 
etapa!! (a célula tronco 
hematopoiética, a qual possui o 
marcador CD34+)
plaquetas
granulócitos
hemácias
Só é considerada doença 
congênita quando o erro é 
no embrião, aí todas as 
células terão defeito; a 
partir daí é adquirida, 
adquirida não afeta todas 
as suas células
Câncer depende do estágio que você pega, pq sempre parte de uma célula que possui 
grande capacidade de sobrevivência e divisão: ela sobrevive mais, divide mais, dá 
origem a muitas células; e sobreviver mais, dá mais chance dessa única célula dar mais 
defeito, dar mais mutação; uma pessoa com defeito de reparo pode ter vários tipos de 
câncer
Se eu estivesse estudando leucemia linfoide: ia afetar a célula progenitora da porção 
linfoide e se já estiver se espalhado pelo corpo posso usar os próprios linfócitos do 
sangue pq eles serão afetados, e nesse caso nem preciso enriquecer com 
fitohematoglutinina porque se é câncer, é anormal, e a célula vai estar em divisão 
mesmo, não vai estar "normalmente" quiescente
A mutação que deu origem a LMC pode ter acontecido em 
outras células, por ex na célula tronco hematolinfoide, mas o 
que não se sabe é pq nessa célula CD34+ essa mutação 
perpetuou, não foi corrigida e deu origem ao câncer; como 
essa alteração cromossômica tá acontecendo, que proteínas 
estão envolvidas, isso nós não sabemos; tem evidências que 
patógenos, bactérias podem estar associados ao câncer 
também. Outra coisa, ninguém nasce com câncer, você pode 
nascer com tendência de ter câncer, por exemplo, se você 
nascer com defeito nos mecanismos de reparos (aí você 
pode ter inclusive mais chance de vários tipos de câncer); o 
que está nas suas células germinativas determina tudo, se 
pais tinham defeito, você terá também
*a sonda não é do cromossomotodo NÃO! A sonda é só do ABL ou do BCR, ou seja, ela 
é só para a sequência/gene ABL ou BCR; é feita uma sonda específica para eu achar essa 
translocação
BCR e ABL são nomes dos genes, dos pedacinhos dos cromossomos, não dos 
cromossomos em si. Na translocação o que acontece é que o ABL (o gene) que estava 
no cromossomo 9 vai para o 22, sendo que o 22 já tem o BCR ( o gene). A parte do 22 
que vai para o 9 não é o BCR, é um outro, e eu não fiz uma sonda para esse outro; por 
isso que na fluorescência eu não vejo o cromossomo 9 translocado, porque não to 
pondo sonda para a parte que ele recebeu do 22 na translocação. Pelo que entendi! 
*A proteína anormal tem peso molecular aumentado!!
Método para identificar, sem precisar estimular a divisão•
Quando esquento DNA rompo as pontes de hidrogênio•
Quando sintetizo pedaços complementares ao DNA esse complementar chamado 
de sonda se liga ao DNA ("a sonda vai sondar o DNA")
Pelo que eu entendi não é colocar o DNA em uma sopa cheio de bases 
nitrogenadas livres, você precisa criar uma sonda, uma fita, pronta, na ordem 
certa: fez uma sonda compatível com BCR e uma sonda compatível com ABL 
para as sondas procurarem seus DNA compatíveis
○
•
Ai se ficar amarelo: ambas as sondas se ligaram ao mesmo, tanto a sonda para BCR 
(a fita sintética complementar ao BCR) quanto a sonda para ABL se ligaram: é o 
cromossomo com translocação
•
Aí fica o gene BCR-ABL "híbrido"•
Transcreve em RNA•
Tira os íntrons•
Traduz na proteína: se a proteína vinda apenas do ABL tinha 120kD, agora a 
proteína que vem do RNAm que une BCR - ABL tem 210kD
•
RT-PCR
Técnica barata•
Esquento em banho maria•
Vai separar o DNA•
Mando fazer uma sonda que seja complementar a um lado da fita e uma outra ao 
outro lado da fita; essa sonda chamamos de iniciador/primer acho
•
Então coloco: iniciador, a fita de DNA, a enzima polimerase que seja resistente a 
temperatura elevada, conjunto de nucleotídeos ACGT
•
A sonda liga (o iniciador) e a DNA polimerase vai colocando os nucleotídeos para 
terminar de fazer a fita complementar
•
Aí de novo:
Esquento, abre, coloco o iniciador (que pega só a pontinha inicial) e faz a 
polimerase terminar de criar a fita complementar
○
•
Usamos RNA para COVID e Marília pq se for usar DNA tem íntrons, aí ficaria muito 
grande, e íntron dificulta o processo. Então por isso melhor usar RNAm que já não 
tem íntron mais
•
O meu iniciador/sonda acho que é específico para o híbrido BCR-ABL, para não 
acabar marcando células normais
No caso da marília, a sonda dela tinha 304 pares de bases (você escolhe a 
região iniciadora/sonda que você vai criar e tem que ser uma boa que por 
acaso não exista em outros genes pq vai que detecta outros genes pq 
reconhece a sequência dessa sonda)
○
•
O DNA vindo da transcrição reversa do RNAm acho que chama de cdDNA•
BCR e ABL são nomes dos genes, dos pedacinhos dos cromossomos, não dos 
cromossomos em si. Na translocação o que acontece é que o ABL (o gene) que estava 
no cromossomo 9 vai para o 22, sendo que o 22 já tem o BCR ( o gene). A parte do 22 
que vai para o 9 não é o BCR, é um outro, e eu não fiz uma sonda para esse outro; por 
isso que na fluorescência eu não vejo o cromossomo 9 translocado, porque não to 
pondo sonda para a parte que ele recebeu do 22 na translocação. Pelo que entendi! 
*OBS: na verdade a parte do 22 que foi para o 9 também é BCR, mas a sonda para BCR 
que eu fiz é só até a parte do BCR que ficou no 22 mesmo! Ou seja, todo o gene ABL do 
9 foi translocado para o 22; mas o gene BCR foi quebrado no meio durante a 
translocação, e a sonda que eu fiz para BCR é só para a parte do BCR que continuou no 
22, mas não pega a parte do BCR que foi para 9
Aula 3: bases funcionais da LMC
É uma aula árdua, longa: entender porque essa proteína dá essa doença!•
Tem um artigo sobre: vai mostrar que tem paciente que começa a não responder o 
remédio 
No slide tem figura do artigo○
Acho que é para ler o artigo inteiro○
•
Acho LMC primeira doença com remédio alvo específico, algo assim!•
LMC sempre causada por essa translocação BCR ABL•
O que são tirosina quinases (PTKs)
São enzimas que transferem grupos fosfatos de ATP para resíduos de tirosina em 
proteínas ---> isso é a base da transmissão de sinais celulares, é finamente 
regulada e modula todas as propriedade de um proteína:
Atividade enzimática○
Estabilidade proteica○
Localização subcelular○
Atividade transcricional○
Modifica interação entre proteínas (porque cria sítios de ligação com outras 
proteínas)
○
•
Estrutura das proteínas cinases da família ABL 
N cap: aas que protegem região amino terminal (impede a degradação)•
Miristoilação: modificação lipídica que garante a ancoragem à membrana (ácido 
mirístico é ácido graxo saturado com 14C "tetradecanoico") na região 
aminoterminal
•
Domínio SH3 (Scr homology 3 domain): 60 aas que estão presentes em proteínas 
adaptadoras, proteínas de sinalização que regulam o citoesqueleto, fosfolipases e 
proteína tirosina cinase citoplasmáticas: possui efeito negativo sobre a tirosina 
quinase
Esse domínio não tem todas as cinases; faz adaptação com outras moléculas 
(adaptadoras), ele é meio que o adaptador mesmo
○
•
Domínio SH2 (Scr homology 2 domain): conservado em oncoproteínas Src, 
relacionada na interação proteína-proteína e possui alta afinidade por resíduos de 
tirosina fosforilados, assim se liga a resíduos de fosfotirosina e tem efeito positivo 
na transformação celular
*Scr é proteína que foi observado em protéinas que causavam cancer 
(oncoproteínas), inclusive descobrir o gene para Scr foi prêmio nobel; SH2 
presente em várias cinases
○
•
Linker de SH2 com quinase•
Domínio SH1 de tirosina quinase: responsável pela atividade de PTK•
Longo éxon •
Domínio de ligação de actina C-terminal (ABD)•
Tudo isso forma uma proteína globular com uma bolsa no meio, um vazio no 
meio, e nesse vazio vai entrar o ATP (a estrutura terciária dela) = essa proteína tem 
que captar sinais que vem do exterior pela membrana, por isso que ela tem Myr 
para ela ficar ligada a membrana (essa cinase não é receptor, nem transmembrana, 
ela fica para dentro da célula mesmo)
•
Estrutura BCR ABL
A proteína BCR-ABL é uma tirosina quinase constitutivamente ativa, expressa nas 
leucemias positivas para o cromossomo Ph. (ATP fica ligado ali "para sempre"
•
A fusão N-terminal com sequências BCR remove grande parte do N-cap, assim, a 
associação da proteína à membrana é comprometida
A perda da miristoilação pode causar problemas na adesão celular = permite 
metástase e induz independência de fatores de crescimento
○
•
A porção derivada do BCR inclui um domínio de oligomerização de bobina espiral 
(CC) N-terminal
essencial para a transformação oncogênica de ABL ○
promove a associação de BCR-ABL com fibras de actina○
Faz que a proteína dobre mais○
•
Também inclui domínios de homologia Dbl e pleckstrina (DH/PH)
DH é fator de troca de nucleotídeos guanina = vai ativar GTPases○
PH possui cerca de 100 aa e interage com fosfolipídeos ou outras proteínas, ○
•
Então proteína BCR-ABL
Possui atividade tirosina quinase mais ativa •
Encontrada apenas no citoplasma (associada a proteínas de citoesqueleto)•
ATP fica mais preso•
Continuamente fosforilada e ativada•
Fosforilação de substratos celulares•
Autofosforilação da própria proteína •
Liga a proteínas adaptadoras = ativa várias vias de sinalização
Interage com no mínimo 20 proteínas = fosforila elas = estimula proliferação 
celular = inibe apoptose (estimula a proliferação inapropriada das células 
precursoras hematopoiéticas que contêm a proteína = um número excessivo 
de células sanguíneas se acumulam na corrente circulatória)
○
Células neoplásicas sobrevivem (multiplica muito + morre menos = acumula; 
e não só acumula células, acumula mutações = + mutações, - chance de 
apoptose
○
•
1
Essa estrutura já estava sendo estudada desde a descoberta da leucemia da galinha:
essencial para a transformação oncogênica de ABL ○
promove a associaçãode BCR-ABL com fibras de actina○
Faz que a proteína dobre mais○
Também inclui domínios de homologia Dbl e pleckstrina (DH/PH)
DH é fator de troca de nucleotídeos guanina = vai ativar GTPases○
PH possui cerca de 100 aa e interage com fosfolipídeos ou outras proteínas, 
como PKC.
○
•
Uma proteína normal é fosforila mas desfosforila depois, é dinâmico; mas junto com 
BCR fez proteção que ela não desfosforila, ela fica continuamente fosforilada, e ela fica 
mandando sinal a vida toda, então o que eu tenho que fazer? Não deixar ele ficar 
continuamente fosforilado
Aí bcr abl faz estímulos para: inibir a morte = vai acumular células (leucemia é acúmulo 
de células no sangue); vai mandar a célula ter adesão diferente na membrana, vai 
estimular outras moléculas/proteínas que ativam fatores de transcrição que vão fazer a 
célula aumentar, ficar muito na fase S, a célula aumentando sem parar
Inibidores de tirosina quinase (mesilato de imatinibe) - resultados e perspectivas
Como matar as células cancerosas em vez de só acalmá-las + não matar as 
normais: pelo fenômeno de dependência oncogênica = assim como um depende 
químico precisa de doses cada vez maiores de droga, a célula mutante precisa 
passar cada vez mais por outras mutações = bloquear a atividade da proteína 
oncogênica pode levar à morte da célula cancerosa sem danificar as normais
•
Ele inibe a ligação do ATP ao domínio quinase de ABL, bloqueado a atividade 
enzimática de BCR-ABL (bloquear a fosforilação dos substratos dessa proteína)
•
essa droga induz remissão hematológica e citogenética na maioria dos pacientes 
com LMC na fase crônica
Leva a remissão completa = desaparecimento das células com mutação○
A translocação desaparece = remissão citogenética○
O mRNA híbrido desaparece = remissão molecular○
A inibição permite que as células entre em apoptose○
É uma alternativa ao transplante de medula - todo mundo usa esse remédio, 
ninguém mais faz transplante
○
Primeiro sucesso de terapia alvo dirigida para câncer○
•
No entanto, estudos clínicos com este inibidor de tirosina-quinase ABL, mostraram 
que pacientes na fase avançada da LMC (crise blástica) respondiam inicialmente ao 
tratamento, mas depois recaiam. 
Alguns pacientes podem desenvolver resistência ao medicamento○
Associaram esta resistência clínica ao inibidor a uma reativação do sinal de 
transdução de BCR-ABL, que em alguns casos resultava de uma mutação no 
domínio quinase de ABL e em outros estava ligada a uma amplificação 
progressiva do gene BCR-ABL
○
Um outro estudo mostrou que a resistência ao mesilato de imatinibe, entre as 
células que expressam BCR-ABL, pode se desenvolver através de múltiplos 
mecanismos, como
superexpressão de BCR-ABL (amplificação gênica ou por outros 
mecanismos pós-transcricionais)

redução na captura do composto devido a superexpressão de 
glicoproteína P (Pgp)

degradação excessiva
○
foi observado que 50-90% dos casos de resistência ao imatinibe estavam 
associados a presença de mutações pontuais no domínio tirosina-quinase de 
BCR-ABL
a proteína BCR-ABL, em especial o domínio quinase, sofre alterações em 
sua estrutura o que impede a adoção da configuração apropriada para a 
ligação do inibidor

O imatinibe se liga à conformação inativa da quinase. Portanto, espera-
se que mutações que interfiram no mecanismo de autoregulação e 
favoreçam a adoção do estado ativo conduzam a resistência ao 
tratamento com mesilato de imatinibe. 

Estudar qual mutação está causando isso - existem mais 4 fármacos que 
estamos testando; câncer é assim, ele vai ficar resistente; 

Vai aparecendo clones mutados, se você não matar todas as células de 
uma vez no início vai sempre aparecer mais células resistentes

Com remédio: se a célula não morria, agora morre (tudo volta ao normal, 
a oncocélula para de ser vantajosa em relação às outras; no caso como a 
oncocélula estava proliferando tanto que as normais não estavam 
recebendo nutrientes etc a oncocélula vivia de forma vantajosa, agora 
que a oncocélula está sendo bloqueada, inibida, as normais voltam a se 
sobressair); então paciente pode ficar curado, porque todas as células 
anormais morreram. Remissão molecular: sem leucemia, sem proteína 
bcrabl, sem cromossomo ph; em 5 anos de droga metade fica curado, 
metade não porque tinha uma célula escondidinha
Não existe a denominação "oncocélula" eu que usei agora, acho 
que fala "célula cancerígena" mesmo
□

○
•
A) O imatinibe se liga ao sítio de ligação do ATP no 
domínio tirosina-cinase da Bcr-Abl e impede a Bcr-Abl 
de transferir um grupamento fosfato do ATP para o 
resíduo de tirosina em uma proteína-substrato. Isso 
bloqueia a transmissão do sinal para proliferação 
celular e sobrevivência
B) azul: imatinibe; fita verde: domínio tirosina quinase 
da proteína ABL
Pode existir mutação que faça a ligação da BCRABL com imatinibe ser fraca, é uma 
resistência a doença; mas vale lembrar que o problema da LMC não é liga a proteína 
com ATP, isso é normal, o problema é ligar permanentemente, ficar ligada, isso que é 
LMC. 
Existiam várias teorias de onde vinha essa resistência, mas hoje se sabe que é por conta 
dessas outras mutações que vão ocorrendo
Esquema no slide: fase crônica (da Marília), fase acelerada (já tá mais anormal, as células 
já adquirem mais mutações) e crise blástica (a pessoa vai falecer disso, dura 6 meses, 
tanta mutação que já virou outra doença)
Aí tem no slide: dos crônicos, 9 sumiram o cromossomo ph, e 2 remissão molecular; mas 
na crise blástica esse resultado não acontece assim. 
Aula 4: apoptose
Na leucemia há resistência à apoptose e, portanto, menor número de células 
apoptóticas, apontadas pelas setas.
Normal: (tiremos de pessoa normal e deixamos em cultura por alguns dias)
Perda de integridade celular•
Condensação e segregação da cromatina (que vai para margem contra o 
envelope nuclear)
•
Condensação do citoplasma•
Formam-se vacúolos•
A célula com a seta mais acima: está entrando em apoptose = apoptose começa 
pela digestão do núcleo
•
A seta a direita: núcleo está diminuindo, a cromatina ficando em volta e tudo 
sendo digerido
•
Excesso de células que se acumulem, que acumulam mutações = 3 a 5 anos fica crônico, 
não tem como tratar, nem transplante de medula funciona; e com outras mutações, 
obviamente, imatinib não funciona, porque ele foi desenhado especificamente para ficar 
naquele buraquinho certo para deslocar ATP e deixar a célula morrer (lembrando que 
tem casos que imatinib desloca o ATP de todas as células e a pessoa curar)
A arte do câncer é isso; desenhar medicamentos que ataquem certinho as proteínas 
específicas que causam os câncer
Leucemia:
Resistência a apoptose = menor número de células apoptóticas (setas)•
Só tem uma célula morrendo, todas as outras estão vivas, enquanto na amostra 
normal todas as células estão morrendo, porque o certo é elas morrerem mesmo
•
Via intrínseca de ativação das caspases
Ínicio: ação de diferentes sinais de estresse intracelular, tais como irradiação, 
agentes quimioterápicos, vírus, bactérias e ausência de fatores de crescimento 
celular, os quais convergem para a mitocôndria.
•
Ativação: liberação de certos fatores mitocondriais para o citosol, como por 
exemplo, o citocromo c (SMAC/DIABLO), que, juntamente com a molécula 
APAF-1, promovem a ativação da caspase-9, que por sua vez, ativa as 
caspases-3, -6 e –7 gerando o fenótipo apoptótico.
•
Como isso ocorre: na membrana externa da mitocôndria, há proteínas BAX, BAK e 
BCL-2. As proteínas BAX e BAK são pró-apoptóticas e, portanto, devem ser 
reguladas por alguém. Quem as regula é a BCL-2. Normalmente, a BCL-2 
atrapalha a ligação entre 2 BAX ou 2 BAK (imagina que você tá tentando chegar 
em alguém, mas tem outra pessoa que fica atrapalhando você e o/a @ toda hora. 
Prazer, BCL-2).
•
Por que a BCL-2 impede o encontro de 2 BAX ou de 2 BAK? Porque, se elas se 
encontram, elas formam um canal na membrana da mitocôndria. E daí? Qual o 
problema? O problema é que, se vocêcoloca um buraco onde não deveria ter, 
você pode ter vazamento de coisa que não era pra vazar. Tá, mas o que você não 
quer que vaze? Citocromo c. O citocromo c tem que ficar na mitocôndria e não 
fora dela (em situações normais). (É isso que a próxima imagem quer dizer)
•
Homodímero: 2 coisas iguais se juntando (2 BAX ou 2 BAK)
Heterodímero: 2 coisas diferentes se juntando (BAX com BCL ou BAK com BCL)
Resumo: 
Formação de poros por BAX/BAK -> saída de citocromo C -> cascata de 
caspases ->: apoptose
•
BCL-2 bloqueia BAX/BAK -> BCL-2 bloqueia apoptose, é antiapoptótico•
BAD bloqueia BCL -2 -> BAD bloqueia a ‘’antiapoptose’’, BAD é apoptótico•
As BAD regulam negativamente (ou 
seja, “inibem”) a BCL-2. A BAD, mais 
especificamente, “sequestra” a 
BCL-2. Ela tira o inconveniente que 
estava te atrapalhando com o/a @ 
da jogada. Se o inconveniente cai 
fora, você, uma proteína BAX/BAK, 
pode se juntar com seu parzinho 
BAX/BAK respectivo <3
BAX juntou com BAX e BAK juntou com BAK. E agora?•
Vazou citocromo c. Por que vazar citocromo c é ruim? Citocromo c deve ficar 
associado na membrana interna da mitocôndria (cadeia respiratória e a 
importância dela para a gente gerar ATP). Quando ele sai da mitocôndria, ele, 
como qualquer outra substância na nossa célula, vai interagir com alguém (lembre-
se: a célula é um sistema altamente dinâmico! Ninguém fica sozinho, solto pelo 
citoplasma). Com quem o citocromo interage? 
•
Com proteínas APAF (mais especificamente, APAF1). No caso, o citocromo c vai 
induzir uma mudança de conformação na APAF1 (com gasto de ATP) e, como 
ocorreu com o citocromo c, a APAF1 não vai ficar simplesmente à deriva na célula. 
Ela vai se juntar com outras APAF1 (com outras 6 APAF1, formando um heptâmero) 
e
•
recrutar pró-caspases 9 (quem são as caspases? São proteínas que clivarão outras 
proteínas citosólicas, como a actina, promovendo a morte celular. As pró-caspases 
são as formas inativadas delas). Assim, temos um conjunto de APAF1 + pró-
caspases 9. Esse conjunto é chamado de apoptossomo.
•
O que faz um apoptossomo? Cliva pró-caspases 3 (que é clivada formando caspase 
3 - ou seja, ativando-a). 
•
A partir daí, a apoptose é encaminhada e se torna um processo irreversível, ou seja, 
depois que ativou caspase, já era.
•
Algumas moléculas que atuam na mitocôndria são centrais no controle da 
apoptose pela via intrínseca, como as proteínas da família Bcl-2. Essa família 
apresenta:
membros que inibem a apoptose (Bcl-xL, Mcl-1, A1, Bcl-2, Bcl-w, CED-9 e 
Bfl-1), regulando a translocação dos fatores apoptogênicos
○
membros que promovem ou sensibilizam a célula à morte celular (Bad, Bax, 
Bak, Bid, etc) (BORNER, 2003).
○
•
Via extrínseca de ativação das caspases
Ativação: interação de receptores localizados na superfície celular, denominados 
“Receptores de Morte” (“DR, Death Receptors”), aos seus específicos ligantes. É a 
morte por ligante.
•
Esses receptores incluem o Fas (CD95), TNFR1, DR3, DR4, DR5 e DR6.•
Início: trimerização dos receptores de morte, que, por exemplo, no caso de 
interação do Fas-FasL, permite o recrutamento de duas proteínas sinalizadoras, 
FADD e pró-caspase-8, formando o complexo DISC (“Death-inducing signaling 
complex”, ou seja, domínios de morte).
•
A pró-caspase-8 é transformada em caspase-8 ativa e então é liberada para o 
citoplasma, onde poderá agir na fase executora do processo ao ativar diretamente 
a caspase-3, ou então promover o desencadeamento da via intrínseca por meio da 
clivagem da molécula Bid, a qual se dirige à mitocôndria, induzindo liberação de 
citocromo c e SMAC (AMARANTE-MENDES e GREEN, 1999).
•
Este recrutamento e ativação da pró-caspase-8 são alvos de proteínas 
antiapoptóticas, como a proteína c-Flip (FADD-like ICE inhibitory proteins), que 
possui estrutura similar à caspase-8, porém sem domínio catalítico. Esta molécula 
pode se ligar ao complexo Fas-FADD, inibindo o recrutamento, consequente 
clivagem e ativação da pró-caspase-8, impedindo o desencadeamento do processo 
de apoptose (IRMLER et al., 1997).
•
Na imagem, observa-se que o grupo I (Bax em dímeros) e o grupo III (Bad não 
homodimerizado/sozinho) formam grupos proapoptóticos. Por outro lado, Bcl-2 (em 
dímeros) formará um grupo II, antiapoptótico.
Em células saudáveis, as proteínas antiapoptóticas se ligam às apoptóticas, 
bloqueando as ações destas.
Quando a célula é lesada ou para de receber sinais para continuar viva, as proteínas 
BCL-2 são bloqueadas. Esse bloqueio poderá ocorrer através do grupo III da figura 
(apoptótico), que fará regulação negativa do grupo II (antiapoptótico). Como 
consequência desse bloqueio, as proteínas Bax, agora ‘’livres’’ poderão se dimerizar, 
formando o grupo I, apoptótico, que possui ação matadora intrínseca. 
Como descobriu BCL-2?
Tem um linfoma que tem translocação comum, frequente; e da mesma 
forma que descobriram BCR-ABL você descobriu essa translocação e 
viram o que estava naquela região: 2 oncogenes importante:
BCL-2•
MYC (estimula proliferação celular, se ele alterado vc tem câncer 
agressivo, não tem tratamento para ele)
•
Depois descobriu todo o papel do BCL-2 (toda a linha história que 
vimos no ED de morte celular)
Se descobriu que haviam proteínas parecidas com BCL-2 que inibem a 
despolarização da mitocôndrias e existem proteínas que fazem o 
contrário:
Alguns sinais podem induzir ou inibir a morte celular, por isso que 
umas das formas de matar o tumor é irradiar câncer
•
Lembrando que na via extrínseca você trata o microambiente 
para atacar as célula neoplásicas; 
Lembrando que via extrínseca o linfócito que vai atuar 
atacando a célula errada
Este recrutamento e ativação da pró-caspase-8 são alvos de proteínas 
antiapoptóticas, como a proteína c-Flip (FADD-like ICE inhibitory proteins), que 
possui estrutura similar à caspase-8, porém sem domínio catalítico. Esta molécula 
pode se ligar ao complexo Fas-FADD, inibindo o recrutamento, consequente 
clivagem e ativação da pró-caspase-8, impedindo o desencadeamento do processo 
de apoptose (IRMLER et al., 1997).
•
Caspase 8 pode ativar BID -> facilita a formação de poros por Bax e Bak -> saída 
do citocromo C
•
proteína FLIP → inibidoras que controlam a via extrínseca → dimerizam-se com a 
caspase 8, formando um heterodímero → inibe a apoptose
•
IAP → inibidores de apoptose → proteínas que se ligam a caspases ativadas e as 
inibem → também podem marcar caspases para destruição nos proteossomos
•
A proteína BCL-2
Antiapoptótica (assim como BCLxl e Flip)•
Domínios das proteínas da família BCL-2 e suas estruturas primárias:•
Pesquisa 1: a expressão de BCR-ABL na linhagem hematopoética murina Ba/F3 
induzia a expressão da molécula anti-apoptótica BCL-2,
•
Pesquisa 2: ao introduzir o BCR-ABL na linhagem humana pró mielocítica HL-60, o 
aumento de BCL-xL, outro membro anti-apoptótico da família BCL-2, mas não de 
BCL-2, cuja expressão, estava inclusive diminuída em relação à linhagem infectada 
com o vetor vazio
•
Dois anos depois, foi descrito que a atividade tirosina-quinase de BCR-ABL era 
responsável pela ativação de STAT5 que interage com o promotor de BCL-xL 
elevando os níveis deste gene
•
BCR-ABL parece atuar ao nível mitocondrial:
BCR-ABL ativa STAT5 (via de sinalização intracelular)1.
Aumenta BCR-xL (proteína antiapoptótica que impede a formação de canais na 
membrana externa da mitocôndria, por onde o citocromo c sairia)
2.
Sem citocromo c no citosol, sem cascata de caspases ativadas pela via extrínseca3.
Além disso:
Foi relatada a fosforilação de BAD em células hematopoéticas que expressavam 
BCR-ABL
E BAD fosforilada por quinase AKT e RAF fica inativa○
•
A expressão de BCR-ABL protegeu as células de expressões mais altas de BAD•
MEU RESUMO NO PAPEL ESTÁ MAIS FÁCIL DE ENTENDER!
Quando analisa homologia de uma proteína pode encontra homologia com outras proteínas e 
outras espécies, e essa distribuição dos Aas que são responsáveis pelo papel da proteína! (DNA só 
tá lá, mas quem faz tudo é aproteína pronta!)
As proteínas da família BCL-2 compartilham 4 domínios BH (domínios homólogos característicos de 
BCL-2 e que tem em várias espécies). Esse domínio medeia interações diretas entre membros das 
famílias pró-apoptótica (BAX, BAK, BID, BAD…) e antiapoptótica (BCL-2, BCL-XL…). Além disso, a 
maioria delas apresenta domínio transmembrana.
Saber o que cada domínio faz!!
→ os 𝞪 correspondem às 𝞪-hélices que compõem a proteína (lembrando que corresponde à 
estrutura secundária)
𝞪1, 𝞪2, 𝞪3, 𝞪4 e 𝞪7 são anfipáticas•
𝞪5 e 𝞪6 são predominantemente hidrofóbicas•
BH4 →Ê𝞪1 → domínio de ancoragem de algumas proteínas que influenciam na apoptose
Raf-1 → proteína com função antiapoptótica•
Bag-1 → proteína com função antiapoptótica•
Ced-4 → proteína com função pró-apoptótica•
Loop → região entre 𝞪1 e 𝞪2 que pode sofrer fosforilação (região de alça)
Domínio de ligação → BH3 → permite interações diretas entre membros da família Bcl-2 → é o 
único presente em todas as proteínas da família
Domínio de receptor → de 𝞪2 a 𝞪6, corresponde à fenda hidrofóbica da proteína → a fenda 
hidrofóbica apresenta relevância no que diz respeito ao desenvolvimento de potenciais 
medicamentos contra o câncer → esses agentes químicos se ligam à fenda hidrofóbica e inativam 
proteínas antiapoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL,...) → isso estimula a via intrínseca da apoptose
Formação do poro →Ê𝞪5 e 𝞪6 correspondem a hélices predominantemente hidrofóbicas → elas 
são importantes para a formação de poros (canais iônicos) por algumas proteínas da família da 
Bcl-2
→ um exemplo é o poro por onde passa o citocromo C, formado por Bax
Ancoragem de membrana → TM →Êdomínio de inserção da membrana (domínio transmembrana 
tem em várias proteínas, tá perto da extremidade C entre os Aas 219 e 237!!)
→ possibilita que as proteínas sejam ancoradas à membrana externa da mitocôndria
Bad será fosforilado pela via de sinalização intracelular 
PI3K/AKT (conforme dito acima. Na célula da Marília, essa 
via é ativada mesmo sem fator trópico), inibindo sua 
função de bloquear as proteínas antiapoptóticas ‘’BCL’’ 
(ocorre gasto de ATP). Sendo assim, as proteínas ‘’BCL-2’’, 
“BCL-xL” (antiapoptóticas) estarão ativas bloqueando a 
ação das apoptóticas ‘’Bax’’ (apoptóticas). Desse modo, o 
canal da proteína ‘’Bax’’ (apoptótica) estará fechado, 
impedindo a entrada de íons por ele. Essa entrada de íons 
BCR ABL libera P para várias proteínas, entre elas, as proteínas da via da p53 e a via de 
BCL-2 (BCL-xL); lembrando que BCL-2 estão na membrana mitocondrial e dependendo 
como as proteínas estão ocorre despolarização da membrana e liberação do citocromo 
C; 
Isso é uma família de proteínas!! Funções semelhantes a depender de cada domínio que 
se mantém; olha como são proteínas semelhantes, você precisa saber isso para quando 
criar um medicamento específico!
Por exemplo, a gente ataca o BH3 bastante, porque ele está menos presente em 
proapoptoticas, mas está muito expressa nas proteínas antiapoptoticas na verdade eles 
testaram todos os domínios e viram que o melhor era BH3
O ambiente manda um estímulo para a célula e esse estímulo ativa a via ou nesse caso, 
inativa = no caso, no caso Marília essa inibição acontece sem o fator trófico
função de bloquear as proteínas antiapoptóticas ‘’BCL’’ 
(ocorre gasto de ATP). Sendo assim, as proteínas ‘’BCL-2’’, 
“BCL-xL” (antiapoptóticas) estarão ativas bloqueando a 
ação das apoptóticas ‘’Bax’’ (apoptóticas). Desse modo, o 
canal da proteína ‘’Bax’’ (apoptótica) estará fechado, 
impedindo a entrada de íons por ele. Essa entrada de íons 
é fundamental para a passagem do citocromo C pela 
membrana.
a proteína BCR-ABL desencadeia 
essa cascata que fosforila o BAD. 
Com isso, o BCL-XL e o BAD se 
separam,saindo da conformação de 
equilíbrio.Então, o BAD fica inativo e 
o BCL-XL passa a inibir a apoptose.
Artigo Imatinib: 
Results
Thirteen patients with CML (12 in CP and 1 in AP prior to starting imatinib 
treatment) who achieved CCR on imatinib treatment were studied.
Six patients received prior treatment with interferon- . BM cells were studied 
from 11 patients
○
CD34 cells were selected for study in all patients save one, in whom BM 
MNCs were studied. All patients were treated with standard doses (400 mg/d) 
of imatinib
○
•
point mutations resulting in amino acid changes in the BCR-ABL kinase domain 
were identified in 5 of the 13 patients studied. Seven different mutations were 
detected
•
The mutant BCR-ABL kinases generally showed intermediate levels of imatinib 
resis tance, with the L248V mutant demonstrating the greatest degree of 
resistance.
•
No evidence of cytogenetic or hematologic relapse was ob served in the 8 
patients in whom kinase mutations were not detected
•
. Detection of a kinase domain mutation was associated with a trend toward 
increased risk of relapse (P .058). Of 5 patients in whom kinase domain mutations 
were detected, 2 subsequently relapsed (recaída clínica nesse caso, na questão de 
voltar a ter sintomas *porque existe recaída hematológica, recaída molecular, 
recaída bioquímica) (Table 1). One patient who relapsed (no. 4) was detected to 
have the L248V mutation
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The L248V mutation was observed at high frequency in blood samples collected 
following relapse. The second patient who relapsed (no. 3) was detected to have 2 
mutant clones
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This patient relapsed in BC 2 months after this sample was obtained. A new 
mutation (D276G) was seen at the time of relapse, but the 2 mutations originally 
seen were no longer detected.
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For patients without BCR ABL mutations, Q-PCR analysis revealed increased BCR-
ABL levels in follow-up samples from 5 patients, confirmed in 2 or more follow-up 
samples in 3 patients, and unchanged or reduced levels in 3 patients. Patients with 
rising levels of BCR/ABL on Q-PCR were analyzed for kinase mutations. Mutations 
were detected in follow-up samples from 4 of the 5 patients with rising BCR/ABL 
levels 
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ArtigoÊcaso
MaríliaÊ-…
Câncer é policlonal; tem várias células cancerígenas; aí uma das células aparece com 
uma mutação, que faz com que essa célula não responda ao imatinib; então as outras 
células vão morrendo (porque o imanitib é efeciente a elas); aí a que não respondeu, 
que é resistente, começa a crescer e se multiplicar = nesse momento a pessoa tem a 
recaída clínica; 
Olha que a mais baixa está respondendo ao imatinib melhor
No caso, fizemos WB para todas as mutações
Isso para a gente ver se sexo, idade, meses antes de imatinib tem a ver com a 
resistência, porque a gente ainda não sabia que era por conta de mutação
Wild type é o controle; olha que no WB já tá ficando 
transparente = ou seja, vai ficando negativa
Mas olha a mutação L248V = continua super positiva = 
super resistente
Ok, mas agora vamos ver em que domínio da kinase 
cada mutação fica para construir as várias outras drogas 
que atacam especificamente a região onde aconteceu 
tal mutação
CD34+ é da medula mas dá uma circulada no sangue e as 
MNC são derivadas da CD34+ que estão no sangue mesmo