Biologia Molecular - Livro Completo

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Biologia Molecular 
Unidade 1 
1. Apresentação 
Seção 1 de 6 
A Biologia Molecular é uma área da ciência que estuda os aspectos genéticos 
das células dos seres vivos, abordando desde a estrutura básica do DNA com 
todos os seus componentes até o desenvolvimento de alterações e doenças 
associadas. 
O conhecimento acerca desse assunto vai facilitar a sua assimilação a respeito 
do modo como algumas doenças se desenvolvem, dos diagnósticos delas e do 
direcionamento de alguns tratamentos. 
Sabemos que diversos diagnósticos são realizados utilizando o material 
genético, portanto, o conteúdo desta disciplina poderá ser aplicado tanto no 
diagnóstico de doenças infecciosas e na terapia gênica, bem como na 
compreensão dos aspectos farmacogenéticos para o tratamento de doenças. 
2. Introdução 
Olá, estudante! Tudo bem? 
Você está no material “Bases da Biologia Molecular”. 
Aqui, nós estudaremos os princípios da genética molecular, enfatizando os componentes 
de estudo dessa ciência, o DNA e o gene. 
Além da estrutura, da função e dos mecanismos de ação desses componentes, vamos 
explorar as principais descobertas e marcos históricos que contribuíram para o 
desenvolvimento científico que podemos observar atualmente na área. 
Ainda, entenderemos os mecanismos das mutações genéticas e as principais técnicas 
utilizadas para a manipulação de ácidos nucleicos e separação de moléculas. 
Bons estudos! 
Objetivos da unidade 
Aqui nosso objetivo é auxiliar você no desenvolvimento das seguintes competências 
profissionais até o término desta etapa de estudos. 
• Compreender os aspectos gerais da genética molecular; 
• Estudar os processos envolvidos no dogma central da biologia; 
https://sereduc.blackboard.com/courses/1/7.3347.80709/content/_5201060_1/scormcontent/index.html#/
• Entender os tipos de mutações genéticas e os impactos na saúde; 
• Discutir sobre a técnica da eletroforese e suas aplicações. 
3. Genética Molecular 
O interesse humano em compreender tanto os mecanismos envolvidos com a ampla 
variabilidade fenotípica distribuída entre as espécies quanto a maneira como essas 
informações são passadas para as gerações posteriores é antigo, sabia? 
 
Pois é, foram nas pesquisas idealizadas por Gregor Mendel (1822 – 1884) que surgiram 
os primeiros esboços sobre os mecanismos relacionados à hereditariedade, os quais 
futuramente seriam considerados a base para o estudo da Genética. Entretanto, apenas 
no início da década de 70 houve uma série de novas descobertas, que permitiram um 
avanço rápido e significativo na área da Biologia Molecular, que trouxe como 
consequência o surgimento do estudo da Engenharia Genética, caracterizada pela 
manipulação do DNA a nível molecular. 
 
De forma geral, a Engenharia Genética pode ser resumida a um conjunto de métodos e 
técnicas que podem ser aplicados para diversas finalidades e que possuem como 
mecanismo de ação a fragmentação de uma molécula de DNA, que serve para a futura 
análise de um gene específico. 
 
Nesse sentido, as principais descobertas que favoreceram a evolução teórica/prática 
da Engenharia Genética foram: 
Enzimas de restrição: Também podem ser chamadas de endonucleases de restrição e 
possuem como mecanismo de ação o reconhecimento de uma sequência de nucleotídeos 
específica de uma molécula de DNA, promovendo a clivagem (hidrólise) dessa 
sequência. 
DNA ligase: Como o próprio nome sugere, essas enzimas possuem a função de ligar 
fragmentos da molécula de DNA que possuem terminações complementares. 
Plasmídeos: São fragmentos circulares de DNA extracromossomial, que podem ser 
utilizados como carreadores de material genético entre diferentes organismos. 
O uso dessas estruturas permitiu a criação de organismos geneticamente modificados 
(transgênicos), designados como organismos que foram submetidos a modificações 
genéticas, visando o favorecimento de uma característica específica de interesse e sendo 
amplamente utilizado na indústria alimentícia. A nível laboratorial, houve uma evolução 
significativa no desenvolvimento de kits voltados ao diagnóstico de doenças infecciosas. 
Para saber mais a respeito da Genética Molecular, convidamos você a assistir ao vídeo 
baixo, que aborda sobre esta área de estudo e seus impactos no futuro da saúde pública e 
na sociedade: 
Estrutura e composição dos ácidos nucleicos 
Com base no que tratamos aqui, é importante situar você sobre o foco dos estudos da área 
de genética molecular: os dois tipos de ácidos nucleicos que podem estar presentes nos 
organismos, o DNA e o RNA, que, de forma geral, são os responsáveis pelo transporte e 
pelo armazenamento das informações genéticas. 
 
Ambos apresentam similaridades em relação a sua estrutura química, já que são formados 
por um componente comum, os nucleotídeos. Estes, são formados basicamente por três 
componentes, uma pentose (açúcar que possui cinco carbonos), que assume uma posição 
central, para que um grupo fosfato e uma base nitrogenada possam se ligar a um dos 
carbonos de sua estrutura. 
 
As bases nitrogenadas, vale dizer, são formadas por uma estrutura anelar de carbono e 
nitrogênio e, como tendem a se ligar entre si em determinadas ocasiões, são consideradas 
as estruturas de maior variabilidade dos nucleotídeos. 
 
Ainda, as bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos: 
As purinas, que representam o grupo caracterizado por possuir dois anéis de 
carbono e nitrogênio, sendo composto pelas bases adenina (A) e guanina (G), 
As pirimidinas, que são menores, por possuir apenas um anel de carbono e 
nitrogênio, sendo composto pelas bases timina (T), citosina (C) e uracila (U). O 
DNA possui A, G, C e T, e o RNA contém U ao invés de T, apresentando A, G, 
C e U na sua composição. 
Para o estudo da composição do DNA e RNA, é essencial o entendimento de dois tipos 
de interações estruturais que ocorrem na molécula, as ligações fosfodiéster e as ligações 
de hidrogênio. 
 
As fosfodiéster são responsáveis pelas ligações entre os nucleotídeos, gerando 
polinucleotídeos e conferindo às cadeias de ácidos nucleicos linearidade e 
direcionalidade. Assim, as cadeias possuem uma extremidade diferente da outra, que 
representam o início e o fim da cadeia. 
 
Essa interação ocorre entre o grupamento fosfato, que está ligado ao carbono 5’ da 
pentose de um nucleotídeo, com o grupamento hidroxila, ligado ao carbono 3’ da pentose 
do nucleotídeo adjacente. Quando a ligação acontece, o primeiro e o último nucleotídeo 
da cadeia apresentam respectivamente um grupamento fosfato (5’) e um grupamento 
hidroxila (3’) livres e, por isso, é dito que a síntese dos ácidos nucleicos acontece no 
sentido 5’ – 3’. 
 
O DNA possui duas cadeias de nucleotídeos distintas que se ligam entre si e caracterizam 
uma conformação em dupla hélice. Para entender como ocorre essa ligação, 
primeiramente é importante compreender que as duas cadeias possuem direções opostas, 
ou seja, o início de uma cadeia (extremidade 5’) vai estar pareado com o final da outra 
cadeia (extremidade 3’), representando uma orientação antiparalela entre as duas. 
 
A ligação propriamente dita acontece pela interação entre as bases nitrogenadas das duas 
cadeias, por meio de ligações de hidrogênio. Por razões de tamanho, formato e 
composição química, a ligação não ocorre aleatoriamente entre os diferentes tipos de 
bases nitrogenadas, e o que se observa é a interação entre adenina (A) e timina (T), por 
duas ligações de hidrogênio, e entre citosina (C) e guanina (G), por três ligações de 
hidrogênio. 
 
Resumidamente, a estrutura do DNA é composta por uma parte externa, formada por 
polinucleotídeos e mantida por ligações fosfodiéster, e uma parte interna, formada por 
bases nitrogenadas mantidas por ligações de hidrogênio, contribuindo para a manutenção 
da estrutura de dupla hélice. 
 
O RNA é uma molécula que possui uma estabilidade química inferiorao DNA, 
normalmente é formada apenas por uma fita simples e, por isso, não forma ligações de 
hidrogênio com outra cadeia de nucleotídeos, exceto nos casos em que existe a 
possibilidade de um dobramento estrutural sobre si própria, para formar algumas regiões 
de dupla hélice. 
 
Propriedades do ácido 
desoxirribonucleico (DNA) 
Como você entende o DNA? 
 Podemos dizer que o ácido desoxirribonucleico (DNA) é a molécula responsável pelo 
armazenamento das informações genéticas, que conduzem a estrutura biológica de uma 
espécie específica e coordenam as funções celulares. 
 Como já foi visto, a estrutura do DNA é formada por nucleotídeos, que contém uma 
pentose denominada desoxirribose e possuem adenina, timina, citosina ou guanina como 
possibilidades de bases nitrogenadas ligadas a si. A estrutura final é caracterizada pela 
ligação entre duas cadeias distintas, que giram em torno do próprio eixo, contribuindo 
para a formação da dupla hélice. 
 Durante alguns estudos conduzidos sobre o funcionamento do DNA, foram estabelecidas 
algumas propriedades funcionais dessa molécula, que são essenciais para a evolução e a 
manutenção fisiológica de um organismo. Dentre elas, podemos citar: 
 Estrutura diversificada: apesar de possuir apenas quatro tipos de bases nitrogenadas, 
essas estruturas podem se organizar em diferentes sequências específicas e ordenadas, 
que passam a constituir um gene. Os genes, por sua vez, podem apresentar entre si tanto 
variação de tamanho quanto variação nas combinações de bases utilizadas para formação 
de uma sequência. Nesse contexto, os genes são codificados com o objetivo de produzir 
um produto funcional biológico, que na maioria das vezes trata-se de uma proteína, que 
são moléculas primárias que podem assumir diversas funções. A obtenção de proteínas 
por meio da codificação de um gene é feita a partir da realização de transcrição e tradução 
do DNA, funções que serão comentadas posteriormente. 
 Habilidade de replicação: a replicação é um processo que precede a divisão celular e 
tem como objetivo duplicar o conteúdo de DNA de uma célula para dividir o material 
entre as células-filhas, garantindo que ocorra a preservação da informação genética. 
 Mutabilidade: durante a replicação, podem ocorrer erros que levam a alterações 
estruturais e falhas na organização sequencial das bases nitrogenadas dos genes, 
caracterizando uma mutação. As mutações ocorrem frequentemente no DNA, mas a 
maioria delas não apresenta efeitos adversos significativos em relação à função das 
moléculas codificadas. E quando ocorre uma mutação, existe a possibilidade de se realizar 
uma replicação de uma cópia de DNA diferente da original, que passa a ser transmitida 
para as células descendentes. 
 Realizar transcrição e tradução: são etapas relacionadas com a expressão e codificação 
do gene para a produção de uma molécula específica. Para a realização de todas as etapas 
que envolvem essas duas fases, ocorre a participação de diversas moléculas assessórias 
que atuam diretamente no DNA. 
Propriedades do ácido ribonucleico 
(RNA) 
Já o ácido ribonucleico (RNA) é uma molécula que está diretamente relacionada com a 
regulação gênica e a produção de proteínas, sabia? 
 
Bem, assim como o DNA, o RNA possui uma estrutura formada por nucleotídeos, porém, 
a pentose do RNA é chamada de ribose, a diferença dessa para com a desoxirribose é 
apenas em relação ao grupamento que está ligado ao carbono 2’. Enquanto a ribose possui 
uma hidroxila, a desoxirribose possui um hidrogênio. 
 
Mais do que isso, sabe-se que as bases nitrogenadas disponíveis para o RNA são 
diferentes, apresentando adenina, guanina, citosina e uracila. Dessa maneira, a estrutura 
final é geralmente caracterizada como uma cadeia simples de polinucleotídeos com as 
bases nitrogenadas ligadas a si. 
 
Observe, na Figura 3, as diferenças estruturais entre o RNA e o DNA. 
 
Existem basicamente três tipos de moléculas de RNA, que desempenham funções 
distintas, são elas: 
RNA mensageiro (RNAm): É o produto obtido após a transcrição do DNA. Mantém a 
característica de fita simples e possui a função de carregar uma informação específica do 
código genético do DNA para os ribossomos, para que estes possam realizar a síntese das 
proteínas. 
 
RNA ribossômico (RNAr): É um componente dos ribossomos que atua no 
reconhecimento da sequência de informações do RNAm. Alguns RNAr possuem 
atividade enzimática, ou seja, podem catalisar as reações químicas envolvidas com a 
síntese de proteínas, recebendo o nome de ribozimas. 
 RNA transportador (RNAt): É responsável pelo transporte dos aminoácidos até os 
ribossomos para que sejam utilizados na formação das proteínas. É necessário que os 
aminoácidos transportados sejam aqueles especificados pela sequência do RNAm. 
O dogma central da Biologia 
Dogma central é um termo utilizado para referenciar a sequência de eventos a qual a 
informação genética é submetida, mostrando como o DNA é capaz de produzir proteínas. 
 
As etapas do dogma central se iniciam com a utilização do DNA para a produção de uma 
molécula de RNA mensageiro, num processo denominado transcrição. Após essa 
transcrição, o RNA obtido contém as informações necessárias para a codificação dos 
aminoácidos que são utilizados para formar as proteínas, caracterizando, assim, a etapa 
de tradução. 
 
Essa teoria do dogma central já sofreu algumas atualizações, após a descoberta de que 
algumas espécies virais possuem a capacidade de converter uma molécula de RNA em 
DNA, num processo conhecido como transcrição reversa. 
 
Observe a esquematização do dogma central na Figura 4 
 
 
 
 
 
Agora, tomando essa discussão por base, vamos às etapas do dogma central? 
Replicação de DNA 
A replicação do DNA é uma etapa essencial para a transmissão do material genético após 
a divisão celular, garantindo que as células-filhas possuam ao final do processo a mesma 
quantidade de material genético. Ela acontece seguindo um modelo semiconservativo, o 
que significa, em outras palavras, que cada fita da dupla hélice de uma molécula de DNA 
já existente (parentais) vai servir como modelo para a síntese de duas novas fitas duplas, 
formadas por uma fita recém-sintetizada e outra que foi preservada das fitas parentais. 
 
O início dessa etapa se dá pela separação das fitas parentais de DNA, que resulta na 
formação de uma região chamada forquilha de replicação, onde estão presentes as 
enzimas que participam do processo. A separação das fitas parentais, por sua vez, é feita 
por uma enzima chamada DNA helicase, que atua desfazendo as ligações de hidrogênios 
que formam os pares de base, permitindo que cada uma das fitas simples de DNA 
formadas tenham as bases nitrogenadas livres para ligações posteriores. 
 
Dessa maneira, atuando junto a helicase durante a abertura das fitas, a DNA 
topoisomerase diminui a tensão geral atribuída às torções excessivas da dupla hélice. 
Após a separação, uma enzima chamada primase (um tipo de RNA-polimerase) produz 
uma pequena fita complementar de RNA, chamada primer, nas duas fitas simples de 
DNA que foram formadas. A DNA polimerase, nesse caso, como enzima responsável 
pela adição de novos nucleotídeos nas fitas, tem o seu desempenho dependente da 
efetividade das enzimas citadas anteriormente. Assim, a helicase e a topoisomerase 
criam condições favoráveis, que facilitam a movimentação da polimerase ao longo da 
fita, e o primer, inserido pela primase, atua como uma fita iniciadora, suprindo a falta de 
capacidade da polimerase em produzir uma nova sequência do início, passando a 
expandir a cadeia a partir do primer. 
 
Como mencionado antes, as duas cadeias que compõe uma molécula de DNA estão 
dispostas em uma orientação antiparalela, e essa característica promove uma interferência 
durante o processo de separação da dupla hélice. Nessa disposição,a polimerase só 
consegue adicionar os nucleotídeos quando segue a direção 5’ – 3’, porém, durante a 
separação das fitas antiparalelas do DNA, ocorre a formação de duas fitas simples 
distintas, uma fita líder (leading strand) que possui sentido 5’ – 3’, que segue a mesma 
direção da forquilha de replicação, e uma fita descontínua (lagging strand) que possui 
sentido 3’ – 5’, direção oposta a forquilha. 
 
É importante dizer que a síntese da fita líder acontece continuamente a partir de um único 
primer na extremidade 5’, enquanto a síntese da fita descontínua exige um procedimento 
mais complexo, que envolve a participação de múltiplos primers, adicionados 
regularmente à medida que ocorre a separação da fita parental, que juntos formam uma 
sequência descontínua que segue na direção 5’ – 3’. Cada primer associado à sua fita-
molde é chamado de fragmento de Okazaki, e esse, posteriormente, tem a sequência de 
primer retiradas, e, ainda nesse processo, sabe-se que as cadeias de DNA remanescentes 
são ligadas por uma enzima chamada DNA ligase. 
Fonte: https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-
replication/a/molecular-mechanism-of-dna-replication 
https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-replication/a/molecular-mechanism-of-dna-replication
https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-replication/a/molecular-mechanism-of-dna-replication
DEFINIÇÃO 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• DNA polymerase = DNA polimerase. 
• RNA primer = RNA iniciador. 
• Single strand binding protein = Proteína de ligação de fita simples. 
• Sliding clamp = Grampo deslizante. 
• Okazaki fragments = Fragmentos de Okazaki. 
• Lagging strad = Fita atrasada. 
• Leading strad = Fita líder. 
Transcrição de DNA 
Já a transcrição do DNA é a etapa caracterizada pelo uso do DNA para a produção de 
RNA mensageiro (RNAm). 
 
A RNA polimerase é a enzima que, com outros fatores, atua em diversas funções no 
processo de transcrição, como o reconhecimento e a ligação a uma região específica do 
DNA (região que vai ser transcrita), que passa a ser chamada de promotor. Após a ligação, 
essa enzima promove ao redor do promotor a dissociação dos pares de base do DNA, 
formando uma estrutura chamada bolha de transcrição (Figura 7), que facilita o acesso à 
região molde do DNA necessária para o início da transcrição. 
 
Os nucleotídeos da fita de RNA são complementares a sequência do promotor e após o 
pareamento entre ambas, os outros nucleotídeos vão sendo adicionados pela RNA 
polimerase no sentido 5’ – 3’ num processo denominado alongamento da cadeia. O RNA 
mensageiro que foi transcrito apresenta as bases nitrogenadas complementares ao molde 
de DNA, exceto pela troca da timina por uracila. Assim, após o reconhecimento da 
sequência finalizadora, a RNA polimerase reconhece o término do transcrito e se dissocia 
tanto do RNA transcrito, como da sequência molde (DNA). 
 
Fonte: https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/AcNucleico5.php 
 
Após a finalização do processo de transcrição, a cadeia de RNA, que foi transcrita, é 
considerada um pré-RNAm, que deve ser submetida a alguns processos, para que venha 
a se tornar um RNAm maduro e funcional. 
 
Nesse sentido, o processamento do pré-RNAm também envolve algumas etapas, que se 
inicia pela adição de diferentes grupos químicos em cada extremidade da fita. Na 
https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/AcNucleico5.php
extremidade inicial 5’ de um pré-RNAm recém-formado, um grupo enzimático sintetiza 
e adiciona uma guanina modificada, que passa a se chamar cap 5’, ao passo que na 
extremidade terminal 3’ a enzima poli (A) polimerase adiciona uma sequência de bases 
adenina, que formam uma estrutura chamada cauda poli (A). As duas estruturas 
promovem a proteção do RNAm contra atividades enzimáticas e auxiliam no seu 
transporte até o citoplasma. 
 
Observe o processo de Splicing na figura abaixo. 
Fonte: https://opened.cuny.edu/courseware/lesson/679/student/?task=2 
 
DEFINIÇÃO 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• Primary RNA transcript = Transcrição de RNA primário. 
• RNA processing = Processamento do RNA. 
• Spliced RNA = RNA após maturação. 
• UNTRANSLATED REGION = Região não traduzida. 
Quando o pré-RNAm é formado, a sua estrutura é composta por dois tipos de regiões: 
• os éxons, que correspondem as regiões codificadoras de proteínas; 
• e os íntrons, que representam as regiões não codificadoras. 
Para o andamento da maturação, o pré-RNAm é submetido a um processo chamado 
splicing de RNA, que consiste na remoção das regiões não codificadoras (íntrons), para 
posterior união das regiões codificadoras (éxons) remanescentes. 
 
Os eventos do splicing são mediados por um complexo de proteínas de RNA, chamado 
de spliceossomos. Nele, as proteínas se ligam primeiramente a sequências 
potencializadoras de splicing, que estão localizadas nos éxons, para que ocorra o 
recrutamento de outras proteínas que se ligam a dois pontos distintos do íntron, uma 
região chamada Branch site e outra localizada próxima a região 3’. Após a ligação em 
https://opened.cuny.edu/courseware/lesson/679/student/?task=2
ambas as regiões, as proteínas se unem formando o complexo spliceossomos, que atua 
removendo as extremidades do íntron e fundindo os éxons, obtendo, ao final, um RNAm 
maduro. 
 
Observe o processo de splicing de RNA na figura abaixo 
 
FIQUE DE OLHO 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• pre-mRNA = pré-RNAm 
• Spliced mRNA = RNAm após splicing 
Além disso 1. o 2'OH de um nucleotídeo dentro do intron, sendo este definido durante a 
montagem do spliceossomo, executa um ataque nucleofílico no primeiro nucleotídeo do 
intron, consideramos como o local do splice, formando o laço 2. 3'OH do exon 5' promove 
um ataque eletrofílico no primeiro nucleotídeo juntando-se assim aos exons e liberando 
o laço do íntrons, promovendo a remoção dessas regiões. 
Tradução de RNA 
A tradução do RNA, por seu turno, é um processo que envolve a decodificação e o uso 
das informações genéticas presentes em um RNAm para a produção de proteínas. Esse 
processo envolve a participação cooperativa de três tipos diferentes de RNA: o RNA 
mensageiro (RNAm), o RNA transportador (RNAt) e o RNA ribossômico (RNAr). 
 
O início da tradução é caracterizado pela formação de um complexo formado a partir da 
interação entre três componentes, o RNAm que possui as instruções necessárias para a 
codificação de uma proteína específica, que é envolvido por um ribossomo que possui 
duas partes, uma grande e uma pequena, e o RNAt (Figura 10). 
 
A leitura do RNAm é feita por códon (sequência de três nucleotídeos), onde cada códon 
representa um aminoácido específico que vai compor a estrutura da proteína codificada, 
e se inicia quando o RNAt associado a subunidade pequena do ribossomo se liga ao início 
da extremidade do RNAm e migra ao longo da cadeia até encontrar o códon de iniciação, 
que na maioria dos casos corresponde a sequência específica da metionina (AUG). 
 
Após isso, a subunidade grande do ribossomo se associa, formando o complexo de 
iniciação. Uma vez formado o complexo, é preciso entender alguns pontos relacionados 
a sua estrutura: 
1. Primeiramente, o RNAt é formado por uma sequência de três nucleotídeos, que 
são complementares a sequência dos códons e, por isso, são chamados de 
anticódons; 
2. O outro ponto é a existência de três compartimentos no ribossomo (E, P e A), 
responsáveis por auxiliar a ligação do RNAt ao RNAm e conduzir a 
movimentação do RNAt ao longo do complexo. 
No início da tradução, o RNAt que transporta a metionina está localizado no 
compartimento P, e para dar continuidade ao processo, precisaque o códon que está 
exposto no compartimento A seja preenchido por outro RNAt correspondente. Com o 
complemento simultâneo dos dois compartimentos (P e A), o RNAr catalisa uma reação 
peptiltransferase, que resulta na ligação peptídica entre o aminoácido associado ao RNAt 
do compartimento P, que é transferido para o aminoácido ligado ao RNAt do 
compartimento A. 
 
Depois da ligação entre os aminoácidos, o RNAm é deslocado, de forma que o RNAt que 
não apresenta mais o aminoácido associado seja expulso através do compartimento E, 
enquanto o RNAt que agora possui dois aminoácidos associados seja transferido para o 
compartimento P, deixando um novo códon exposto no compartimento A, para que o 
processo seja repetido. A fase de alongamento é caracterizada pelo aumento do tamanho 
da proteína, a partir da junção de todos os aminoácidos instruídos pelo RNAm. (Figuras 
10). 
 
O fim da tradução ocorre pelo reconhecimento de códons de parada, que não apresentam 
uma sequência relacionada à especificação de um aminoácido, mas promove a sinalização 
necessária para a separação e a liberação da proteína sintetizada. 
 
 
Figura 10 — Tradução de RNA 
Fonte: https://pt.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/translation-
polypeptides/a/the-stages-of-translation 
DEFINIÇÃO 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• Amino acid = Aminoácido. 
• tRNA= RNAt. 
• Large ribossomal subunit = Grande subunidade ribossomal. 
• Small ribossomal subinit= Pequena subunidade ribossomal. 
• EUKARYOTIC.... = Iniciação da tradução. 
• Star códon = Códon iniciador. 
• tRNA= RNAt. 
• Initiation complex = Complexo iniciador. 
• Complex of small subunit ........ (1) = Complexo da pequena subunidade 
ribossomal e iniciador RNA se liga a região 5'. 
• Complex scan.... (2) = O complexo verifica para procurar o códon iniciador. 
• Initiator tRNA binds... (3) = O iniciador RNAt se liga ao códon iniciador. 
• Large ribossomal subunit joins... (4) = A grande subunidade ribossomal se une 
para formar o complexo iniciador. 
• First round of elongation = Primeira etapa de alongamento. 
• Anticodon= Anti-códon. 
• mRNA = RNAm. 
• Methionine = Metionina. 
https://pt.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/translation-polypeptides/a/the-stages-of-translation
https://pt.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/translation-polypeptides/a/the-stages-of-translation
• Ribosome = Ribossomo. 
• Next amino acid = Próximo aminoácido. 
• tRNA binds to matching codon = RNAt se liga ao códon correspondente. 
• New peptide bond = Nova ligação peptídica. 
• mRNA shifts forward by a codon = RNAm se desloca para frente. 
4. Mutação Genética 
E, nesse cenário, o que são as mutações gênicas? 
 Como o próprio nome sugere, são alterações em regiões gênicas, mais precisamente nas 
bases nitrogenadas de DNA, criando uma modificação no gene original, que interfere de 
maneira direta na síntese de proteínas. Além disso, elas são responsáveis pela 
variabilidade genética que colabora com a evolução das espécies. Porém, é necessário 
mencionar, a viabilidade do material genético dessas espécies depende do equilíbrio 
funcional entre dois processos antagônicos: o reparo de DNA, responsável por conservar 
a molécula, e as próprias mutações, que geram as mudanças. 
 Diante disso, as mutações podem ser classificadas como: 
Cromossômicas : Quando estão relacionadas a modificações quantitativas ou estruturais 
dos cromossomos; 
Gênicas: Quando causam alterações nos pares de bases ou em extensas regiões do DNA. 
Aqui, estudaremos as mutações gênicas que alteram números pequenos de pares de base. 
 
Os seres humanos são organismos complexos, que apresentam dois tipos básicos de 
células susceptíveis a desenvolver mutações, as células somáticas e as células 
germinativas. 
 
As células somáticas abrangem todas as células do organismo, com exceção das células 
gaméticas masculinas e femininas. A mutação que acontece nesse tipo celular 
normalmente apresenta o potencial de interferir na funcionalidade celular, e pode 
apresentar uma evolução branda ou mais significativa. Durante a reprodução, a mutação 
somática não apresenta a capacidade de ser transmitida para a prole do portador da 
mutação. 
 
Por outro lado, as células da linhagem germinativa podem ser acometidas por mutações, 
mas, diferentemente da mutação somática, essa pode ser herdada pela prole do portador. 
As mutações germinativas estão diretamente ligadas com a evolução das espécies, já que 
o fato de ser transmitida a prole favorece a variabilidade genética. 
Mutações espontâneas 
Durante o processo de replicação do DNA, diversos fatores endógenos podem provocar 
uma mutação espontânea por erros metabólicos, sabia? 
 
Esses fatores em geral promovem o estabelecimento de mutações espontâneas pontuais, 
ou seja, alteram um único par de base da cadeia de DNA, como é o caso das substituições 
de base ou alterações em um número maior de bases, como acontece na adição ou deleção 
de base. 
 
A DNA polimerase, por exemplo, está sujeita a incorporar erroneamente uma base 
nitrogenada na sequência de DNA durante o processo de replicação, podendo ser causado 
por um deslize de movimentação da enzima ao longo da fita, ou induzida por 
modificações tautoméricas das bases nitrogenadas. 
DEFINIÇÃO 
As modificações tautoméricas são caracterizadas como flutuações químicas ocasionadas 
pela mudança na posição dos átomos de hidrogênio que compõe a estrutura da base, 
comprometendo a estabilidade da molécula e favorecendo a falha de sua incorporação a 
cadeia. 
Algumas alterações químicas dos nucleotídeos também podem favorecer o surgimento de 
mutações espontâneas, como a perda de bases e a desaminação de bases. 
 
A perda de bases acontece pelo rompimento espontâneo das ligações N-glicosídicas dos 
nucleotídeos, responsáveis pela ligação da base nitrogenada a pentose. Dependendo do 
tipo de base que foi perdida, podemos dizer que a molécula de DNA sofreu um processo 
de despurinação (quando a base perdida é uma purina) ou dispirimidinação (quando a 
base perdida é uma pirimidina), que por efeito, cria na cadeia um sítio apurinico (ausência 
de uma purina) ou apirimídico (ausência de uma pirimidina). Diante da ausência de uma 
base nitrogenada no seu sítio de ligação específico, qualquer um dos outros quatro tipos 
de base podem ser incorporados para substituí-lo, caracterizando uma mutação. 
 
A água presente no meio intracelular pode favorecer reações espontâneas de hidrólise, 
que modificam algumas propriedades das bases nitrogenadas. A desaminação hidrolítica, 
nesse sentido, é a perda do grupo amina da base nitrogenada após uma reação de hidrólise, 
que resulta na criação de outro tipo de base, interferindo diretamente no pareamento que 
forma os pares de base. Um exemplo disso é a desaminação da adenina, que forma uma 
base chamada hipoxantina, caracterizada por se ligar a uma citosina ao invés de uma 
timina, que seria a ligação natural da adenina, originando uma mutação. 
Substituição de bases 
Por afetar apenas um par de base da cadeia, a substituição de bases é classificada como 
uma mutação pontual, que atua na troca de bases nitrogenadas da cadeia do DNA. 
 
Quanto aos tipos de substituição, encontramos dois: 
• 1. A transcrição, caracterizada pela troca de uma base por outra de mesma 
categoria química, ou seja, substituição de uma purina por outra purina (A e G) 
ou a substituição de uma pirimidina por outra pirimidina (C e T); 
• 2. e a transversão, que é caracterizada pela troca entre bases de diferentes 
categorias químicas, ou seja, uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. 
Quando as mutações por substituição de base ocorrem em sequências codificadoras de 
proteínas, podem provocar efeitos a nível molecular da proteína específica. Essesefeitos 
podem ser classificados como mutações com sentido trocado, mutações sem sentido e 
mutações silenciosas. 
MUTAÇÕES COM SENTIDO TROCADO: São caracterizadas pela modificação de um 
códon do RNAm, que passa a especificar e associar um aminoácido diferente a estrutura 
da proteína. 
MUTAÇÕES SEM SENTIDO: Aqui, um códon específico para um aminoácido é 
alterado, e passa a atuar como um códon de terminação, trazendo como consequência o 
término prematuro do processo de tradução, produzindo uma proteína incompleta, que 
normalmente apresenta alteração ou perda de função. 
MUTAÇÕES SILENCIOSAS: Elas provocam alterações em um códon específico, mas 
como o código genético é degenerado, o códon continua codificando o mesmo 
aminoácido. 
Observe o esquema de mutações por substituição de bases na figura abaixo. 
 
Adição ou deleção de bases 
Diferentemente das mutações por substituição de bases, as mutações por adição ou 
deleção de bases não se restringem apenas a modificações em um único par de base da 
cadeia de DNA, e sim por alterações mais extensas em relação a sequência de bases. 
 
Como o próprio nome sugere, as adições estão associadas à inclusão de bases extras na 
sequência de DNA, enquanto as deleções se associam à remoção de bases da sequência 
de DNA que foi formada. 
 
Uma vez que a leitura do RNAm durante o processo de tradução é feita em sequências de 
três em três bases (códons), mutações por adição ou deleção podem alterar a fase de 
leitura, caracterizando uma mutação frameshift, que possui o nível de gravidade 
diretamente relacionado com o número de bases que foi adicionada ou removida. 
 
Assim sendo, pelo fato da sequência dos códons do RNAm ser alterada, é gerado um 
impacto direto na proteína que será codificada, seja por interrupção de tradução, seja com 
uma sequência de aminoácidos diferentes do que se esperava. Quando ocorre a mutação 
frameshift em bases nitrogenadas múltiplas de três (adição ou remoção completa de uma 
sequência de três bases que compõe um códon), os efeitos são menos graves, pois esse 
tipo de alteração resulta na tradução de uma proteína com aminoácidos a mais ou faltando, 
mas a sequência do RNAm é preservada e a leitura em si, acontece normalmente. 
Mutações induzidas 
As mutações induzidas são aquelas provocadas pela ação exógena de um agente 
mutagênico, que são algumas substâncias químicas ou fatores de natureza física, que 
possuem a capacidade de alterar a estrutura da molécula de DNA. 
 
Esse tipo de mutação está diretamente relacionado com a evolução dos hábitos da 
população humana, como mudanças nos padrões alimentares, condições sociais, local de 
moradia, acesso a saúde, entre outros. Sabe-se que os efeitos causados por esses agentes 
exógenos aumentam a reatividade da molécula do DNA, induzindo o surgimento de 
mutações causadas por erros estruturais. 
 
Considerando a dimensão desses efeitos, ressaltamos que há alguns tipos de mutação 
induzida, o que será apresentado logo a seguir. 
Mutações induzidas por agentes físicos 
Os principais agentes mutagênicos de natureza química são a luz ultravioleta (UV) e um 
conjunto de raios e feixes, que compõe o grupo associado a radiação ionizante. 
 
As radiações ionizantes possuem alta energia e capacidade de penetração tecidual, que 
podem induzir a molécula de DNA a sofrer adição ou deleção de bases nitrogenadas ou 
até mesmo danos mais graves, como o rompimento da molécula. O mecanismo de ação 
desse tipo de radiação é promover a ionização dos compostos químicos das células, 
aumentando a sua reatividade e, por consequência, a possibilidade de atuação direta sobre 
a molécula de DNA, causando as mutações. Nesses casos, a probabilidade de 
desenvolvimento de mutações está diretamente relacionada com a concentração total de 
radiação a qual o organismo foi exposto. 
 
Ao contrário da radiação ionizante, a luz ultravioleta não possui uma quantidade de 
energia suficiente para penetrar nos tecidos e causar a ionização dos compostos, por isso, 
propicia danos ao DNA de duas formas diferentes. 
 
A primeira forma é um dano direto a molécula de DNA, causado pela alta capacidade de 
absorção de luz UV, por parte de bases pirimidínicas (principalmente a timina). O excesso 
de absorção dessas bases induz um processo chamado dimerização de bases pirimidínicas, 
tornando-as ineficazes no ato do pareamento de bases, e ocasionando diversas ligações 
indevidas. 
 
A segunda forma é um dano indireto induzido pela excitação da luz UV a outros 
compostos celulares, que passam a agir diretamente na molécula de DNA. 
 
Observe o processo de dimerização pirimidínica na figura abaixo. 
 
Mutações induzidas por agentes químicos 
Os principais agentes mutagênicos de natureza química são as substâncias conhecidas 
como bases análogas, intercalantes de DNA e agente de ação direta. As bases análogas 
são componentes que possuem uma estrutura molecular semelhante à das bases 
nitrogenadas do DNA, e por isso, caso estejam presentes no momento da replicação da 
molécula, podem ser incorporadas indevidamente. 
Podemos citar como exemplos desses compostos a 5-bromouracila, que apresenta 
similaridade estrutural com a timina e pode estar ligada a uma adenina; e a 2-aminopurina, 
que possui similaridade com a adenina e pode estar ligada a uma timina. A ligação dessas 
substâncias pode induzir a substituição de bases, causando mutações. 
O ácido nitroso (HNO2) é o principal represente dos agentes de ação direta, ele promove 
um processo que já comentamos anteriormente, a desaminação de bases. A perda do 
grupo amina produz outros tipos de bases nitrogenadas, que alteram o pareamento de 
bases. 
Outra classe de agentes químicos que podem causar mutações são os intercalantes de 
DNA, que possuem a capacidade de se posicionar entre duas bases pareadas, aumentando 
a distância entre elas e alterando a estrutura da molécula de DNA. Esse tipo de agente 
está relacionado com mutações do tipo adição ou deleção de bases, já que quando ele se 
intercala entre bases de uma cadeia formada, outra base pode ser adicionada no espaço 
que ele cria entre duas bases, enquanto existe a possibilidade de um agente se intercalar 
entre bases de uma cadeia em crescimento, impedindo que outra base seja adicionada no 
local que foi ocupado. 
Reparo do DNA 
Após estudar os mecanismos de formação e perpetuação das mutações, que causam lesões 
e incorporações equivocadas de bases nitrogenadas na cadeia de DNA, ocasionando erros 
de leitura que se refletem na produção de proteínas com função comprometida, vamos 
nos deter nos modos de reparo do DNA. 
Bem, é preciso saber, antes de tudo, que durante a síntese da cadeia do DNA, as células 
adotam alguns mecanismos de reparo, que garantem a manutenção da integridade do 
genoma. Dentro desse contexto, a DNA polimerase desempenha uma atividade revisora 
que constitui o primeiro mecanismo de prevenção à formação de mutações, a 
exonuclease, que é caracterizada pelo deslocamento no sentido 3’ – 5’ da enzima, com o 
objetivo de reconhecer possíveis erros de incorporação de base, que em seguida possam 
ser corrigidos pela própria polimerase. 
O surgimento das mutações no DNA é inevitável, e por isso, as defesas dos organismos 
estão em constante evolução. Caso ocorra falha funcional nos mecanismos de reparo, as 
mutações tendem a se acumular no DNA, e por efeito são repassadas para as células filhas, 
ocasionando doenças com gravidade significativa, como a formação de tumores e 
cânceres no portador. 
Assim, como já dito, a célula é capaz de adotar diferentes mecanismos e estratégias para 
corrigir as lesões causadas pelas mutações, dentre elas podemos citar o reparo direto, o 
reparo por excisão e o reparo por recombinação, que explicamos abaixo. 
Reparo direto 
O mecanismo de reparo direto é caracterizado pela ação simples de remoção ou reversão 
das lesõesna cadeia de DNA. 
 
As principais lesões passíveis de serem corrigidas pelo reparo direto são a dimerização 
de pirimidinas e a alquilação de bases nitrogenadas. Fotorreativação é o nome dado ao 
mecanismo desencadeado pela enzima DNA fotolíase, que possui o objetivo de reverter 
a dimerização de pirimidinas, que foi induzida pela exposição a luz ultravioleta. Como 
mecanismo de ação, a enzima se utiliza do reconhecimento das bases dimerizadas e passa 
a absorver a energia luminosa, o que facilita a catálise da reversão dos dímeros as suas 
formas originais. 
 
EXEMPLO 
Um dos mecanismos de ação da quimioterapia para impedir o crescimento das células 
Um dos mecanismos de ação da quimioterapia para impedir o crescimento das células 
neoplásicas é a indução da alquilação das bases nitrogenadas do DNA, entretanto, as 
células são dotadas de um mecanismo natural de reparo, que consegue reverter esse erro, 
e por isso, é considerado como um fator de resistência ao tratamento quimioterápico. 
 
O processo de alquilação é caracterizado pela transferência de um grupamento metil ou 
etil as bases nitrogenadas do DNA, induzindo uma mudança conformacional que leva a 
erros de pareamento entre as bases. 
 
A guanina é a base com maior probabilidade de sofrer alquilação, pela adição de um 
grupamento metil a sua estrutura. A indução da metilação da guanina, por um agente 
alquilante, leva à formação da base O6-metilguanina, que passa a se parear com a timina 
ao invés da citosina (base originalmente pareada com a guanina), criando uma mutação 
no momento da replicação. 
 
Frente a isso, o mecanismo de reparo natural desse erro é a ação de uma enzima chamada 
O6-metilguanina-metiltransferase (MGMT), que reconhece a base alterada e remove o 
seu grupamento metil. 
Reparo por excisão 
Os reparos por excisão se caracterizam pelo reconhecimento e pela remoção de uma 
região lesada da fita, para que posteriormente ocorra uma nova síntese da região da 
cadeia, que irá servir como substituta. 
 
Além disso, existem dois tipos de reparos feitos por excisão, um que se volta a pares de 
base e outro direcionado aos nucleotídeos: 
 
Reparo por excisão de base 
 
É mediado por um grupo de enzimas chamadas glicosilases. 
Como já comentamos, a desaminação de uma base pode convertê-la em um tipo 
diferente de base, provocando o erro no pareamento e uma consequente mutação. 
Sobre isso, sabe-se que existem diferentes tipos de glicosilases, que reconhecem 
especificamente cada tipo de base que possa estar desaminada (ou com outros 
erros) e rompem a sua ligação N-glicosídica. 
 
Essa ligação, por sua vez, é responsável por unir a base nitrogenada (nesse caso, 
uma base defeituosa) a pentose do nucleotídeo. Após a eliminação da base, 
enzimas de restrição identificam o compartimento vazio na cadeia e removem o 
restante do nucleotídeo, para que a DNA polimerase possa inserir o nucleotídeo 
correto ao pareamento. 
 
Reparo por excisão de nucleotídeos 
 
É um importante mecanismo de reconhecimento e remoção de bases defeituosas, 
ou de alterações em sequências específicas, que possam causar a distorção 
estrutural da molécula de DNA. E um dos principais danos que é reparado por 
esse tipo de mecanismo é a dimerização da timina, induzida pela exposição a luz 
ultravioleta. 
 O reparo se inicia com a enzima helicase formando uma bolha (semelhante à 
bolha de transcrição, mas com objetivos diferentes) para que um grupo de enzimas 
possa reconhecer a sequência de nucleotídeos que está causando o dano. É após o 
reconhecimento que enzimas de restrição rompem as ligações fosfodiéster 
(aquelas responsáveis pelas ligações entre nucleotídeos) e removem a sequência 
defeituosa. Dando continuidade ao processo, a DNA polimerase utiliza a 
extremidade 3’ da fita que teve a sequência removida como um primer (iniciador), 
para sintetizar uma nova sequência corretamente. 
 
Observe o passo a passo do reparo por excisão de nucleotídeos na figura abaixo. 
 
Fonte: https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-
replication/a/dna-proofreading-and-repair 
 
DEFINIÇÃO 
 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja 
• 1. A radiação UV produz dímeros de timina; 
• 2. Uma vez que os dímeros são detectados, o DNA circundante aos dímeros se 
abre formando " uma bolha"; 
• 3. Enzimas específicas cortam a região danificada para fora da bolha; 
• 4. DNA polimerase substitui o DNA e a ligase promove as ligações especificas, 
finalizando o reparado da molécula. 
Reparo por recombinação 
Já o reparo por recombinação é um mecanismo alternativo de correção para erros 
que não foram solucionados por outras estratégias de reparo. Isso, porque, como 
já mencionado, a maioria dos mecanismos de reparo, após a remoção de uma base 
ou sequência defeituosa, se utiliza de uma fita de DNA não danificada como 
molde para a síntese de uma nova sequência. Entretanto, em situações em que 
existem danos nas duas fitas do DNA, não havendo disponibilidade no uso de uma 
sequência molde, a célula adota as estratégias relacionadas ao reparo por 
recombinação. 
 
https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-replication/a/dna-proofreading-and-repair
https://pt.khanacademy.org/science/biology/dna-as-the-genetic-material/dna-replication/a/dna-proofreading-and-repair
Ou seja, quando a DNA polimerase está se locomovendo ao longo da fita durante 
a replicação e encontra uma região danificada, ela precisa ultrapassar essa região 
sem adicionar os nucleotídeos para dar continuidade ao processo, criando uma 
dupla hélice filha. Diante disso, os espaços gerados pela ausência de nucleotídeos 
são preenchidos pelo material da outra fita de DNA, o que se qualifica como a 
recombinação. 
5. Extração de Ácido Nucleico 
Com o conhecimento sobre o que é o DNA e o RNA e como eles atuam, agora 
discutiremos a respeito da extração deles, que se dá por meio de testes diagnósticos. O 
que você sabe sobre isso? 
 
Para começar, é preciso ter em mente que os testes diagnósticos que se baseiam na análise 
dos ácidos nucleicos se iniciam com uma etapa de extração, que se baseia na manipulação 
das amostras biológicas, a fim de se obter um material de ácidos nucleicos puro, isto é, 
um material que não apresente outros componentes celulares, como proteínas, lipídeos e 
eletrólitos, que podem interferir nos resultados dos testes. 
 
Além disso, existem diferentes metodologias de extração de ácidos nucleicos, algumas 
são mais modernas do que outras, mas nelas o protocolo de extração escolhido varia a 
depender do tipo de ácido nucleico de interesse (DNA ou RNA) e do tipo de material 
biológico que será analisado. 
 
O manuseio prático desse tipo de teste, por sua vez, deve obedecer a diversas etapas 
rigorosas de controle de qualidade, relacionados com a prevenção da degradação do 
material genético e com contaminação da amostra durante o procedimento. 
 
Diante disso, manteremos nossa atenção especialmente nas principais etapas do 
procedimento de extração de ácidos nucleicos de uma amostra biológica. 
 
 
 
 
 
Extração por coluna 
Atualmente, existem alguns kits comerciais de extração de ácidos nucleicos que fornecem 
todos os reagentes necessários para o teste, visando a redução da rotina de trabalho que 
as outras técnicas proporcionam, que estão relacionadas com a produção dos próprios 
reagentes, a quantidade de reagentes utilizados e o tempo de execução prática do teste. 
A maioria dos kits comercializados tem como metodologia o emprego de uma coluna de 
extração, composta por uma membrana de sílica, que possui afinidade cromatográfica 
pelos ácidos nucleicos, levando a sua retenção. A extração por coluna também se inicia 
com a lise celular, e esse lisado é adicionado a coluna junto a um reagente formado por 
sais caotrópicos. Essessais, por seu turno, cumprem a função de desnaturação das 
proteínas e preservação do ácido nucleico, ocasionando a ligação dos ácidos à membrana. 
É interessante dizer que, assim como nos outros procedimentos, na extração por coluna, 
os ácidos nucleicos precisam ser submetidos a uma etapa de lavagem a partir da adição 
do etanol, e uma etapa de eluição pela adição de uma solução tampão (pode se o tampão 
TE). 
Durante o procedimento, as colunas são acopladas em tubos (Figura 14), e, nas etapas de 
adição do lisado aos sais caotrópicos e de lavagem, o complexo coluna-tubo é 
centrifugado. Com isso, o ácido nucleico permanece associado à membrana, ao passo que 
os reagentes que já cumpriram suas funções atravessam a membrana e se precipitam no 
tubo, sendo descartados em seguida. Ao final do procedimento, é obtido o ácido nucleico 
eluido. 
Observe, na Figura 15, a diferença entre a extração por coluna os demais protocolos de 
extração. 
 
 
 
DEFINIÇÃO 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
 Cell harvest = Precipitado de células. 
 Cell Lysis = Lise celular. 
 Reagent system = Sistema de reagente. 
 Column system = Sistema de coluna. 
 Protein removal = Remoção das proteínas. 
 Dna preciptation = Preciptação do DNA. 
 DNA rehydration = Reidratação do DNA. 
 DNA binding = Ligação do DNA. 
 Wash = Lavagem. 
 DNA elution = Eluição do DNA 
6. Eletroforese 
A eletroforese é uma técnica de biologia molecular amplamente utilizada em pesquisas 
científicas, essa se baseia na separação de moléculas ionizadas a partir das diferenças de 
peso molecular, tamanho e carga elétrica que possuem. Diversas moléculas podem ser 
submetidas a testes em eletroforese, possuindo diferentes objetivos associados a 
diagnósticos, investigações criminais, testes de paternidade, entre outros. 
 
Essa técnica utiliza componentes essenciais para a metodologia que é aplicada, dentre 
esses existe um gel que atua como matriz de migração das moléculas, essa migração 
ocorre após a indução de um campo elétrico formado por uma fonte de energia. Além 
disso, é necessário o uso de uma solução tampão, tanto para a produção do gel, quanto 
para uso no momento da execução do teste, pois possui a função de manter o PH do meio. 
 
O procedimento se inicia com a produção do gel que será utilizado como matriz de 
migração para as moléculas, e ele é feito a partir da mistura entre um meio desidratado e 
o tampão que é utilizado no teste, devendo ser fundidos por homogeneização seguida de 
aquecimento. A cuba de eletroforese é uma peça adotada como meio de suporte para a 
realização do teste, e é nela que a solução do gel deve ser despejada após o aquecimento, 
para que se possa acrescentar um “pente” que servirá como molde para formação dos 
poços no gel, após a sua solidificação (Figura 16). 
 
A cuba de eletroforese possui em suas extremidades um eletrodo positivo e outro 
negativo, por isso, os poços do gel que foram utilizados para depositar as moléculas de 
interesse de separação devem ser posicionados na extremidade do eletrodo negativo, por 
tais moléculas serem atraídas para o eletrodo positivo durante a migração. Desse modo, 
antes da fonte de energia ser ligada, criando o campo elétrico, o gel presente na cuba deve 
ser imerso pela solução tampão. 
 
Nos próximos tópicos, você entenderá mais sobre os princípios individuais de cada 
componente da eletroforese. 
 
Figuras 16 — Preparação do gel de agarose 
Fonte: https://kasvi.com.br/como-preparado-gel-de-agarose-eletroforese/ 
Características dos géis utilizados 
Mas de que se tratam os géis utilizados na eletroforese e quais são? 
 
Sabe-se que são placas moldadas a partir de um componente gelatinoso, que vão servir 
como matriz de migração para a amostra de interesse. Atualmente, existem dois principais 
tipos de géis empregados nas práticas de eletroforese, o gel de agarose e o gel de 
poliacrilamida, ambos apresentam diferenças funcionais. A base de produção dos géis é 
normalmente comercializada, e a sua confecção pode ser feita no próprio laboratório, a 
partir de uma reação de polimerização dos seus componentes, que leva à solidificação 
que resulta no gel. 
O gel de poliacrilamida 
Comumente chamado de PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis), esse gel tem a sua 
matriz formada a partir da polimerização gerada pela mistura entre a acrilamida e a bis-
acrilamida, que resulta na formação de ligações cruzadas entre as moléculas de 
acrilamida. 
 
Para auxiliar na polimerização, algumas substâncias químicas que atuam como 
catalisadoras da reação podem ser acrescentadas, como o persulfato de amônio, que é 
https://kasvi.com.br/como-preparado-gel-de-agarose-eletroforese/
utilizado como fonte de radicais livres e a tetrametiletilenodiamina (TEMED), que possui 
a função de decompor o persulfato de amônio. Após a decomposição, os radicais livres 
são liberados, e são eles que catalisam a polimerização do gel. 
 
A maior desvantagem do uso do gel de poliacrilamida é que os componentes utilizados 
para a sua produção (acrilamida e TEMED) são neurotóxicos, por isso exigem cautela 
durante o seu manuseio. 
O gel de agarose 
A agarose utilizada para a produção do gel de agarose é um polissacarídeo natural, 
derivado de algas marinhas e composto basicamente por repetições de unidades de 
agarobiose, que são dissacarídeos compostos por D-galactose e 3,6-anidro-L-galactose. 
 Opostos aos PAGEs, os géis de agarose não possuem componentes neurotóxicos e 
apresentam uma polimerização mais simples e rápida, além de existir a possibilidade de 
um gel de agarose ser reutilizado para a confecção de outra matriz. [TB1] 
 [TB1][DG] Inserir recurso interativo, sugestão “Accordion”. 
Explicando 
A diferença entre os dois géis é basicamente no tamanho dos poros que sformados na 
matriz após a polimerização, onde os poros do gel de agarose são maiores, permitindo a 
separação de moléculas com uma maior variedade de tamanho, mas apresentando uma 
baixa capacidade de resolução se comparado ao PAGE, enquanto os poros do PAGE são 
menores, o que limita a separação de moléculas menores, tendo, no entanto, maior 
capacidade de resolução. 
Devido a variedade de tamanho das moléculas de ácidos nucleicos, para a separação de 
seus fragmentos, os géis de agarose são habitualmente mais escolhidos do que os PAGEs. 
Por exemplo, os fragmentos de DNA que foram separados durante a eletroforese têm o 
seu tamanho definido pela quantidade de pares de base (pb) que possuem. Uma 
eletroforese com gel de poliacrilamida apresenta maior eficácia em separar fragmentos 
menores, de até 500 pb, entretanto, o gel de agarose possui a capacidade de separar 
fragmentos que possuem de 100 pb até 50 kpb (1 kpb = 1000 pb). 
Fatores que conduzem a migração das moléculas no gel 
Uma vez que o gel está pronto, uma amostra controle junto as demais amostras de 
interesse devem ser distribuídas nos poços do gel, para que ele possa ser cuidadosamente 
posicionado no interior da cuba de eletroforese, dando continuidade ao procedimento — 
as amostras podem ser transferidas antes ou depois de posicionar o gel na cuba de 
eletroforese. 
 
Caso o interesse seja separar fragmentos de ácidos nucleicos, partimos do princípio de 
que os nucleotídeos que compõe a estrutura da molécula são carregados negativamente 
devido ao grupamento fosfato e, por isso, a extremidade do gel que contém os poços deve 
ser posicionada na mesma direção polo negativo da cuba (cátodo), para que após a 
submersão do gel em solução tampão, e no momento em que a fonte de energia seja 
ligada, as moléculas sejam atraídas para o polo positivo (ânodo), que está posicionado na 
extremidade oposta. 
 
Observe os componentes da eletroforese e o direcionamento da migração das moléculas 
na figura abaixo. 
 
Figura 17 — Sistema para corrida em gel 
Fonte: https://biosystems.commercesuite.com.br/loja/noticia.php?loja=460180&id=61&fbclid=IwAR3oinoxGhDDKimeOApJZi0SYxM2xT2b0DdS1PxSsP62ID4tDkGIuazDGdI 
Definição 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• Electrode = Eletrodo. 
• Power supply = Fonte de energia. 
• Sample wells = Poço. 
• Direction of movement = Direção da migração. 
• Buffer solution = Tampão de corrida. 
• Electrophoresis tank = Cuba de eletroforese 
Alguns fatores interferem diretamente na velocidade com que as moléculas se deslocam 
ao longo do gel, dentre eles, destacam-se os que estão associados com os componentes 
elétricos e os que estão relacionados com a resistência friccional. 
 
Os componentes elétricos estão ligados a dois fatores, o primeiro é o potencial elétrico 
aplicado no teste, ou seja, a voltagem utilizada pela fonte de energia e o segundo é a 
carga líquida das moléculas que estão sendo testadas. A carga líquida se baseia na 
capacidade que as proteínas possuem de adquirir carga, positiva ou negativa, a partir do 
https://biosystems.commercesuite.com.br/loja/noticia.php?loja=460180&id=61&fbclid=IwAR3oinoxGhDDKimeOApJZi0SYxM2xT2b0DdS1PxSsP62ID4tDkGIuazDGdI
https://biosystems.commercesuite.com.br/loja/noticia.php?loja=460180&id=61&fbclid=IwAR3oinoxGhDDKimeOApJZi0SYxM2xT2b0DdS1PxSsP62ID4tDkGIuazDGdI
PH do meio em que elas estão e, por isso, é importante que a reação seja feita com o uso 
de uma solução tampão, que estabilize o PH. 
 
A resistência friccional envolve alguns fatores que atuam como forças impeditivas que 
dificultam a migração das moléculas no gel. Dentre eles, podemos citar: 
• o tamanho das moléculas, de maneira que as moléculas menores se difundem 
por distâncias maiores e mais rapidamente que as moléculas maiores; 
• a concentração do gel, que está associada a possíveis manipulações no tamanho 
dos poros do gel, a partir de modificações na concentração da solução utilizada 
para produzi-lo; 
• a viscosidade da solução tampão em que o gel é imergido; 
• a conformação da molécula, no caso do DNA, este pode se encontrar em 
conformação circular, com excesso de torção etc.. 
Você sabia? 
A mobilidade eletroforética determina a velocidade com que uma molécula se movimenta 
no gel, a partir da exposição a um potencial elétrico específico. Esse índice pode ser 
calculado a partir da divisão da velocidade, que é diretamente proporcional aos elementos 
elétricos presentes, e inversamente proporcional a resistência friccional. 
Existem algumas diferenças entre a eletroforese que é feita para separação de proteínas, 
da que é feita para a separação de ácidos nucleicos. 
 
A eletroforese de ácidos nucleicos se baseia essencialmente no tamanho e na conformação 
dos fragmentos para realizar a separação, enquanto a eletroforese de proteínas utiliza 
outras variáveis, como carga intrínseca da molécula. 
 
Como as proteínas são formadas a partir da ligação de diferentes tipos de aminoácidos, 
existe uma variedade química e estrutural superior à dos ácidos nucleicos, que tem a sua 
estrutura composta por um número mais limitado de elementos. Diante disso, algumas 
técnicas podem ser executadas para a separação das proteínas, como o uso de um 
detergente chamado dodecil-sulfato de sódio (SDS), que altera a carga intrínseca das 
proteínas, tornando-as obrigatoriamente moléculas de carga negativa, de forma que a 
separação segue a mesma lógica que a dos ácidos nucleicos (atração de moléculas 
negativas pelo polo positivo). 
 
Nesse cenário, uma técnica chamada focalização isoelétrica utiliza o princípio das cargas 
líquidas das proteínas para alcançar sua separação e, para isso, precisa preservar a carga 
intrínseca das proteínas. Mas, como foi discutido, as proteínas apresentam a característica 
de modificar a sua carga, dependendo do PH encontrado no meio, por isso, essa técnica 
utiliza um gel que possui variações de PH ao longo de sua estrutura. 
 
Isso faz com que as proteínas migrem normalmente até alcançar uma região do gel (ponto 
isoelétrico), que possui um gradiente de PH específico, que a induz a tornar-se neutra, 
interrompendo a migração. Esse tipo de técnica é empregado na eletroforese de 
hemoglobinas, utilizada para o diagnóstico de diversas hemoglobinopatias. 
Eletroforese em ácidos nucleicos 
A interpretação a respeito do tamanho das moléculas dos ácidos nucleicos é determinada 
pelo número de pares de base (pb) quando se trata de DNA (dupla fita) e pelo número de 
nucleotídeos quando se trata de RNA (fita única). 
 
Além do tamanho dos fragmentos, a conformação que eles possuem tem importância 
significativa para o deslocamento no gel. Moléculas distintas que possuem equivalência 
de massa podem se movimentar em velocidades diferentes a partir da conformação que 
apresentam. Em outras palavras, uma molécula que apresente um volume menor se 
desloca mais rápido que uma molécula maior, mesmo que ambas possuam a mesma 
quantidade de massa. 
 
Assim que o tempo predeterminado de indução de carga elétrica termina, os fragmentos 
de ácidos nucleicos formam bandas no gel. E a variedade de bandas formadas no gel é 
estabelecida pelo tamanho e conformação dos fragmentos da molécula, onde as bandas 
que se aproximaram mais do polo positivo representam os fragmentos menores, que 
possuem uma mobilidade eletroforética maior, ao passo que as bandas que permaneceram 
mais próximas ao polo negativo representam os fragmentos maiores, que 
consequentemente possuem menor mobilidade eletroforética. 
 
Para que a visualização das bandas seja possível, os ácidos nucleicos precisam ser 
marcados previamente por corantes ou por radioisótopos. Um dos principais corantes 
utilizado na eletroforese de ácidos nucleicos é o brometo de etídio, caracterizado por ser 
um agente intercalante de DNA (se intercala entre os pares de base) e fluorescente, que 
torna possível a visualização das bandas quando colocado em contato com uma luz 
ultravioleta, fornecida por um equipamento chamado transiluminador. 
 
Ainda, o brometo de etídio apresenta alto potencial carcinogênico ao entrar em contato 
com o corpo, tornando-se um risco em potencial tanto para os analistas que trabalham 
com a técnica, quanto para o ambiente, caso o descarte não seja apropriado. Frente a essa 
condição, o corante Safer se tornou uma alternativa para suprir essas desvantagens e, 
apesar de ser mais caro do que o brometo de etídio, tende a substitui-lo gradativamente, 
por ser um reagente não mutagênico e também por cumprir a função de permitir a 
visualização das bandas após entrar em contato com a luz ultravioleta. 
 
Observe a visualização das bandas na figura abaixo. 
 
Figura 18 — Leitura do gel de eletroforese 
Fonte: elaborada por Juliana Gonçalves, 2022. 
 
Após os resultados obtidos pela eletroforese, a técnica de Southern blot (Northern blot se 
for para RNA) pode ser aplicada, para confirmar se uma sequência de DNA específica de 
interesse está ou não presente na amostra que foi analisada. Ou seja, essa técnica serve 
para identificar a presença de um gene específico em uma amostra que possui todo o 
genoma do organismo. 
 
Além de tudo o que já discutimos, é fundamental dizer que há um procedimento feito 
após a eletroforese, e ele consiste em duas etapas que se realizam em sequência, a 
transcrição e a hibridização. 
• 1. A etapa de transcrição se baseia no uso de uma membrana de nitrocelulose, 
que é posicionada sobre o gel de eletroforese, para que possa ser pressionada a 
partir da adição de um peso sobre a mesma (pode ser várias folhas de papel 
toalha). 
Nesse sentido, tanto a pressão exercida sobre a membrana, quanto uma etapa de 
aquecimento feita em seguida garantem que o DNA que estava no gel seja passado para 
a membrana. 
• 2. A próxima etapa é a hibridização, que se caracteriza pelo uso de uma sonda, 
que é uma molécula de DNA que possui uma sequência já conhecida e que deve 
ser idêntica ou complementar à sequência que setem interesse de se pesquisar. 
A sonda de DNA é normalmente marcada quimicamente, e caso ocorra pareamento entre 
as bases da sonda e do DNA da amostra, significa que a sequência pesquisada estava 
presente. A reação pode ser vista com o auxílio de uma autorradiografia ou por alteração 
de cor, caso a marcação seja feita por uma substância cromogênica. 
 
Figura 19 — Técnica de Southern blot 
Fonte: https://www.genome.gov/genetics-glossary/Southern-Blot 
 
Definição 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• 1. Electrophoresis gel = Gel de eletroforese. 
• 2. Nitrocellulose filter = Membrana de nitrocelulose. 
• 3. Blotting paper = Papel absorvente (blotting). 
• 4. DNA transferred to filter = DNA transferido para a membrana. 
• 5. Hybridize with unique nucleic acid probe = Hibridização com a sonda 
específica. 
• 6. Probe hybridized... = Sonda hibridizada a sequência complementar de DNA. 
• 7. Leitura. 
Assista 
Agora, de posse desses conhecimentos, apresentamos algumas dicas que podem ser úteis 
para a sua atuação profissional na área de Biologia Molecular, inclusive no que diz 
respeito ao que o mercado de trabalho pode oferecer: 
 
Sintetizando 
Neste material, conversamos sobre os aspectos genéticos, abordando a estrutura dos 
ácidos nucleicos e a formação dos nucleotídeos para originar a molécula de DNA, bem 
como o processo primordial da síntese proteica com o dogma central da biologia que 
envolve a replicação, a transcrição e a tradução. 
 
Além disso, observamos que falhas no DNA podem acarretar mutações genéticas que 
estão relacionadas com determinadas alterações de uma região do DNA que pode 
interferir na síntese proteica e promover alterações conformacionais na proteína e, com 
isso, causar doenças específicas. Nesse sentido, percebemos que tais alterações 
apresentam classificações que se dão de acordo com o tipo de nucleotídeo e a sequência 
do DNA. 
 
Posteriormente, aprendemos sobre duas técnicas iniciais que permitiram seguir com 
nossos estudos: a extração de DNA, que é necessária para que os procedimentos 
moleculares sejam aplicados para um diagnóstico específico, e a eletroforese, que é 
adotada para revelar se a extração ocorreu corretamente e para verificar de forma visual 
a técnica denominada reação em cadeia da polimerase (PCR). 
 
Agora, vamos seguir com nossos estudos? Estou lhe esperando! 
 
Referências Bibliográficas 
ALBERTS, A. et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. 
BORGES-OSÓRIO, M. R.; ROBINSON, W. M. Genética humana. 3. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2013. 
https://www.genome.gov/genetics-glossary/Southern-Blot
BRUNO, A. N. (Org.). Biotecnologia II: aplicações e tecnologias. Porto Alegre: 
Artmed, 2016. (Série Tekne). 
KUNZLER, A. Citologia, histologia e genética. Porto Alegre: SAGAH, 2018. 
NAOUM, P. C. Eletroforese: Hemoglobinopatias, Proteínas Séricas, Lipoproteínas e 
DNA. São Paulo: Editora Santos, 2012. 
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica de Lehninger. 6. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2014. 
OLIVEIRA, E. de. Eletroforese: conceitos e aplicações. Enciclopédia Biosfera, Centro 
Científico Conhecer – Goiânia, v.11, n.22, 2015. Disponível 
em: https://www.conhecer.org.br/enciclop/2015c/agrarias/Eletroforese.pdf. Acesso em: 
1 mar. 2022. 
SPUDEIT D. A. et al. Conceitos básicos em Eletroforese Capilar. Scientia 
Chromatographica, [S.l], v.4, n.4, p. 287-329, 2012. Disponível 
em: https://www.iicweb.org/scientiachromatographica.com/files/v4n4a05.pdf. Acesso 
em: 1 mar. 2022. 
STOCKHAM, S.; SCOTT, M. Fundamentos de Análises Clínicas Veterinárias. Rio 
de Janeiro: Guanabara. p.303-411, 2011. 
WATSON, J. D. et al. Biologia molecular do gene. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. 
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org). Biologia molecular 
básica. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.conhecer.org.br/enciclop/2015c/agrarias/Eletroforese.pdf
https://www.iicweb.org/scientiachromatographica.com/files/v4n4a05.pdf
Unidade 2 
1. Introdução 
Olá, aluno(a). Tudo bem? 
Para começarmos, é importante destacar que as técnicas moleculares estão em constante 
evolução e aperfeiçoamento e que, além disso, os aspectos gerais sobre a genética 
molecular e suas alterações são de extrema importância para o seu aprendizado. Assim, 
destaco que neste material iremos abordar as diferentes técnicas moleculares, desde as 
mais simples e de menor custo, até as mais complexas que permitiram o sequenciamento 
do genoma humano. 
Mas, você já se perguntou como é possível detectar poucas partículas virais que se 
escondem para não serem detectadas? Ou como foi possível saber exatamente a sequência 
do genoma humano e de outras espécies? 
Vem comigo em busca dessas respostas! 
Objetivos da unidade 
Prezado(a) estudante, 
A partir de agora, juntos, buscaremos: 
• Compreender os aspectos associados à reação em cadeia da polimerase e suas 
variações; 
• Entender a atividade das endonucleases de restrição; 
• Estudar o método de sequenciamento e sua importânia para o descobrimento do 
genoma humana; 
• Discutir sobre os polimorfismos genéticos e suas classifações; 
• Conhecer a aplicabilidade das técnicas para o diagnóstico e a pesquisa. 
Vamos em frente! 
2. Reação em cadeia da Polimerase (PCR) 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular, muito 
requisitada na rotina diagnóstica de alguns laboratórios de análises clínicas de referência 
e no desenvolvimento de pesquisas científicas. É uma técnica que permite a amplificação 
de um material genético in vitro, a partir da criação de diversas cópias de uma sequência 
específica de interesse, baseando-se no processo natural de replicação de DNA que ocorre 
in vivo. 
O principal objetivo do método é fornecer ao analista uma quantidade satisfatória da 
sequência específica do DNA, para que esta possa ser analisada individualmente e 
aplicada a diferentes propósitos, como o diagnóstico de doenças infeciosas ou genéticas, 
onde a sequência específica, que deverá ser amplificada e identificada, representa, 
respectivamente, o material genético de um microrganismo específico e a sequência 
responsável pela mutação genética. A técnica de eletroforese em gel, que você já deve ter 
estudado, é normalmente utilizada como controle de qualidade da PCR que, ao permitir 
a separação das moléculas oriundas da PCR, comprova se o processo de amplificação 
ocorreu de forma satisfatória. 
Para se obter as cópias idênticas de uma sequência específica de DNA por meio da PCR, 
alguns materiais devem ser utilizados durante a execução da técnica, como a Taq DNA 
polimerase, os primers para PCR (oligonucleotídeos iniciadores), os 
desoxirribonucleotídeos, a solução tampão e o DNA amostral que possui a sequência 
alvo. O tubo em que esses componentes são misturados é levado a ciclos repetitivos de 
temperaturas, feitos por um equipamento chamado termociclador, que será comentado 
neste capítulo. 
Taq DNA polimerase 
Como a PCR é um método submetido a diferentes níveis de temperatura, uma das 
principais desvantagens, dos primeiros testes que foram realizados, era a necessidade de 
adicionar uma certa quantidade de DNA polimerase ao final de cada ciclo da reação, já 
que ela não consegue desempenhar suas funções quando está em contato com as altas 
temperaturas presentes nos ciclos do teste. 
Uma das principais descobertas que possibilitou a melhoria da técnica foi o isolamento 
da enzima DNA polimerase de uma bactéria chamada Thermus aquaticus. Essa enzima 
passou a ser chamada de Taq DNA polimerase e difere da enzima humana por apresentar 
a resistência ao calor como principal característica, o que a tornou a principal escolha para 
o uso na PCR. Como o princípio do teste é reproduzir os mecanismos de replicação de 
DNA in vivo, a Taq DNA polimerase desempenhaa função de síntese de uma nova fita 
de DNA, a partir da adição de nucleotídeos a uma fita molde, seguindo o sentido 5’—3’, 
mas com ausência da capacidade de autocorreção no sentido 3’—5’ (exonuclease). 
DNA amostral 
Representa o DNA que é extraído da amostra e que será utilizada no teste, com o objetivo 
de pesquisar a presença (mesmo que em baixas concentrações) ou ausência da sequência-
alvo específica, através do processo de amplificação. O DNA que é extraído precisa 
apresentar bom estado de conservação e deve ser submetido a um processo de purificação, 
para evitar a presença tanto dos resquícios dos próprios reagentes utilizados no processo 
de extração, quanto de outras moléculas presentes na própria amostra, que apresentam 
potencial para interferir no andamento teste. Durante todas as etapas de manipulação do 
DNA amostral, é necessário cumprir todas as medidas de biossegurança, pois a 
contaminação por outra fonte de DNA na amostra pode levar a amplificação de 
sequências diferentes das que se tem interesse. 
Primers para PCR 
Assim como na replicação natural do DNA, a Taq DNA polimerase da PCR necessita de 
sequências iniciadoras (primers), que permitem a sua fixação e movimentação ao longo 
da fita, para que possa desempenhar sua função e produzir uma cópia. A sequência 
específica que se deseja amplificar pode ser manipulada a partir da escolha de diferentes 
tipos de iniciadores, para isso, duas sequências de primers são sintetizadas quimicamente 
para cada reação de PCR. Cada um dos dois primers utilizados atua em uma das fitas do 
DNA amostral e ambos possuem uma estrutura de nucleotídeos previamente projetada 
para se complementar aos nucleotídeos que compõem as extremidades da sequência de 
interesse de amplificação. A Taq DNA polimerase reconhece o primer que está 
estrategicamente posicionado e, a partir dele, articula a extensão da cópia da fita, 
limitando a amplificação apenas à sequência de interesse, e não ao DNA como um todo. 
Observe a ação dos primers na Figura 1. 
 
Figura 1 — Anelamento do primer 
Fonte: https://cdn.kastatic.org/ka-perseus-images/b249fdba25fa68f9020891a58f0a3ebac8ae258d.png 
Desoxirribonucleotídeos (dNTPs) e Solução Tampão 
(Buffer) 
Os desoxirribonucleotídeos representam os quatro de tipos bases nitrogenadas (que 
compõem a estrutura do DNA), que são adicionadas na reação de PCR, em concentrações 
equimolares. Durante a fase de extensão dos primers, a Taq DNA polimerase incorpora 
os dNTPs complementares a fita do DNA amostral, através do pareamento de bases. O 
conjunto dos dNTPs é formado pela adenina (dATP), citosina (dCTP), timina (dTTP) e 
guanina (dGTP). 
O buffer utilizado na PCR é composto basicamente por íons que garantem a estabilidade 
do PH, assegurando a funcionalidade da Taq DNA polimerase, e por cloreto de magnésio 
(MgCl2), que atua como fonte de magnésio, que é um cofator enzimático fundamental 
para a atividade da Taq DNA polimerase. 
Durante o primeiro ciclo da PCR, as duas fitas do DNA amostral são utilizadas para 
produzir uma cópia que contém uma sequência complementar a sequência específica de 
interesse de amplificação, por isso, tanto a molécula de DNA original quanto a cópia que 
foi sintetizada podem ser utilizadas para produzir novas cópias. Diante disso, é possível 
declarar que a PCR é uma reação em cadeia já que, a partir de ciclos consecutivos, todas 
as cópias originadas de um processo de amplificação gradativo podem ser utilizadas para 
produzir outras novas cópias, de forma que, ao final de aproximadamente vinte ciclos da 
PCR, é possível obter um número de aproximadamente um milhão de cópias. Entretanto, 
o esgotamento da cinética enzimática interrompe o processo de amplificação do DNA de 
forma que, após uma certa quantidade de ciclos, o número de cópias é estabilizado. 
Observe a progressão dos ciclos na Figura 2. 
 
Figura 2 — Ciclos de amplificação da PCR 
Fonte: https://www.gbo.com/pt_BR/novidades-e-eventos/noticias/ultimas-noticias/news-
detail/news/detail/News/foco-na-ciencia-reacao-em-cadeia-de-polimerase-pcr.html 
Assista 
Olá aluno (a), dando continuidade ao seu aprendizado, convido você a assistir ao vídeo 
abaixo. Ele aborda a Importância da evolução e do aprimoramento da classe de enzimas, 
denominadas DNA polimerase para técnica de amplificação de DNA. Veja: 
3. Etapas dos ciclos da PCR 
Caro(a) aluno(a), é importante que você saiba que todos os componentes da PCR devem 
ser misturados em um tubo, para que este possa ser adicionado a um equipamento 
chamado termociclador, responsável por submeter a amostra a um ciclo de diferentes 
temperaturas. Cada ciclo da reação é composto por três etapas básicas e, em cada uma 
delas, uma determinada temperatura é imposta sobre a amostra. 
Em uma reação de PCR, normalmente, a amostra sofre entre 30 a 40 ciclos, num processo 
que pode durar entre 2 a 4 horas. Como já foi dito anteriormente, a cada ciclo, o DNA 
amostral utilizado como molde sofre um processo de amplificação que resulta na criação 
de cópias do DNA. O fato de que a reação é composta por várias cópias de primers, 
enzimas Taq DNA polimerase e desoxirribunucleotídeos permite que as cópias geradas, 
https://www.gbo.com/pt_BR/novidades-e-eventos/noticias/ultimas-noticias/news-detail/news/detail/News/foco-na-ciencia-reacao-em-cadeia-de-polimerase-pcr.html
https://www.gbo.com/pt_BR/novidades-e-eventos/noticias/ultimas-noticias/news-detail/news/detail/News/foco-na-ciencia-reacao-em-cadeia-de-polimerase-pcr.html
a partir do DNA amostral, possam ser utilizadas como moldes para geração de outras 
cópias. As etapas de cada ciclo da PCR são: 
Desnaturação 
A etapa de desnaturação é o momento em que o equipamento aquece fortemente a 
amostra, atingindo cerca de 96°C, proporcionando a separação da dupla-fita de DNA, 
através da desestruturação das ligações de hidrogênio presentes entre as bases 
nitrogenadas. A desnaturação da molécula de DNA garante a formação de duas fitas-
simples, e permite que os componentes adicionados na PCR (primers, Taq DNA 
polimerase, desoxirribonucleotídeos) tenham acesso a sequência alvo da molécula, 
tornando as duas fitas possíveis moldes para a geração de cópias. 
Anelamento 
Como a temperatura de 90°C promove o rompimento das ligações de hidrogênio, nessas 
condições os primers ficam impossibilitados de formar pareamento de base com a 
sequência de interesse. Por isso, o equipamento reduz a temperatura imposta, sobre a 
amostra, para uma faixa entre 45° e 65°C, permitindo que os primers reconheçam e se 
associem as extremidades das sequências de interesse de amplificação, que possuem 
nucleotídeos complementares a sua estrutura, o que caracteriza o processo de 
anelamento. 
A variação de temperatura, que é imposta nessa etapa do ciclo, depende da predominância 
de bases nitrogenadas presentes na estrutura dos primers, já que as ligações de hidrogênio 
entre a citosina e a guanina formam-se mais efetivamente em temperaturas superiores as 
da ligação entre adenina e timina. 
Extensão 
Para a etapa de extensão, o equipamento precisa fornecer a temperatura ótima para o 
desempenho da atividade da Taq DNA polimerase, que seria cerca de 72°C. Após o 
pareamento de bases entre os primers e as suas respectivas sequências complementares 
presentes na região de interesse, a Taq DNA polimerase se liga a sequência iniciadora e 
passa a incorporar os desoxirribonucleotídeos complementares a sequência, criando uma 
cópia da região específica do DNA. 
Como cada etapa do ciclo depende de um nível de temperatura específica, é possível 
controlar o tempo em que os eventos de cada etapa podem acontecer, permitindo a 
existência de etapas de incubação e garantindo que todas as fases do ciclo possam ocorrer 
isoladamente. Observe as etapas da PCR na Figura 3. 
 
Figura 3 — Ciclos da PCR e suas temperaturas 
Fonte: https://datasciencehomeblog.files.wordpress.com/2019/03/captura-de-tela-2019-03-12-c3a0s-17.18.00.png 
4. Tipos de PCR 
Hoje em dia, a técnica da PCR é uma das principais metodologias aplicadas na área da 
biologia molecular e, por existir a possibilidade de utilizá-la para alcançar diferentes 
objetivos, ao longo dos anos, a técnica original foi submetida a diversas adaptações e 
melhorias, o que gerou a criação de outras variantes da técnica. A PCR pode ser utilizada 
para fins de pesquisa científica, diagnósticos laboratoriais, testes aplicados na área da 
genética, entre outros. Os principais tipos de PCR, que são utilizadas hoje em dia, são a 
PCR convencional, a PCR com transcriptase reversa e a PCR em tempo real. 
PCR convencional 
Diferente das variantes mais utilizadas atualmente em laboratórios de análises clínicas, a 
PCR convencional não apresenta a principal característica: a visualização dos resultados 
enquanto o procedimento do teste está em andamento. Nesse tipo de técnica, os resultados 
da amplificação só podem ser visualizados ao final de todos os ciclos, a partir do uso da 
eletroforese. 
O produto da PCR convencional, ou seja, uma solução enriquecida com a sequência alvo 
de interesse, deve ser submetida a um teste de eletroforese, para que ocorra a migração 
das moléculas de DNA ao longo do gel, formando diferentes tipos de bandas a partir de 
suas variações de peso molecular. As bandas formadas no gel, como resultado da 
eletroforese, são comparadas com as bandas de uma amostra padrão (de que se tem 
conhecimento dos resultados), tornando possível a avaliação quanto ao tamanho, 
quantidade e intensidade delas. 
As principais aplicabilidades desse método estão associadas com a obtenção de uma 
solução concentrada de DNA que pode ser utilizada em outras metodologias, como o 
sequenciamento genético ou a genotipagem, que pode ser utilizada como método de 
diagnóstico e tratamento. A PCR convencional também é utilizada como um teste 
qualitativo, ou seja, apresenta boa funcionalidade para a determinação da presença ou 
ausência de uma sequência de DNA específica na amostra. 
PCR com transcriptase reversa (RT-PCR) 
A maioria das variantes da PCR possui o objetivo de amplificar moléculas de DNA, mas, 
em determinadas ocasiões, existe o interesse em amplificar moléculas de RNA, para isso, 
a variante RT-PCR pode ser utilizada, sendo caracterizada pela adição da enzima 
transcriptase reversa aos componentes do teste. Diagnósticos de doenças virais causadas 
por espécies que possuem o material genético formado por RNA ou a avaliação da 
expressão genética a partir de transcritos (RNAm), são alguns exemplos da aplicabilidade 
da RT-PCR. 
Diferente das técnicas que amplificam diretamente a molécula de DNA, a RT-PCR é 
composta por duas fases, uma na qual ocorre a conversão do RNA em DNA, a partir da 
transcrição reversa, e outra em que acontece a amplificação da sequência propriamente 
dita. A primeira etapa consiste na síntese de uma fita de DNA, com sequência 
complementar (DNAc), a partir da utilização de um molde de RNA, em uma reação 
catalisada pela enzima transcriptase reversa, que é a mesma enzima que algumas espécies 
virais utilizam para produzir, a partir de seu RNA, uma molécula de DNA capaz de se 
incorporar ao genoma do hospedeiro. A obtenção do DNAc é feita em apenas um ciclo, 
e todos os ciclos seguintes são destinados à amplificação da sequência propriamente dita, 
utilizando o próprio DNAc como molde, o que caracteriza a segunda fase da RT-PCR. 
Nesta fase, a reação pode ser vinculada a uma PCR em tempo real (RT-qPCR), para se 
obter uma solução enriquecida com as sequências específicas do DNAc. 
PCR em tempo real (qPCR) 
A variante mais utilizada em rotina laboratorial é a PCR em tempo real, também 
conhecida como PCR quantitativa (qPCR). O princípio da qPCR é a capacidade de 
monitoramento dos ciclos da reação, enquanto estes ainda estão acontecendo, o que 
caracteriza o “tempo real”. Dessa forma, a qPCR permite que os resultados sejam 
coletados durante o procedimento, diferindo-a das outras variantes, que fornecem os 
resultados apenas no final da reação. 
Para a obtenção dos resultados, a qPCR se utiliza de um sistema de marcadores 
fluorescentes chamado sistema TaqMan. Esse sistema é constituído por uma sonda 
(oligonucleotídeos = um fragmento curto formado por poucos pares de bases), que 
apresenta na sua estrutura um fluoróforo na extremidade 5’ e uma substância silenciadora 
(quencher) na extremidade 3’, que atua como antagonista da emissão de fluorescência por 
parte do fluoróforo, a partir da absorção de luz. Durante o procedimento, caso a sequência 
alvo esteja presente na amostra, a sonda do sistema TaqMan passa por um processo de 
anelamento logo após o primer, para que posteriormente seja clivada pela atividade da 
Taq DNA polimerase. 
Após a clivagem da sonda, dois eventos passam a acontecer simultaneamente, o primeiro 
é a continuidade da etapa de extensão feita pela Taq DNA polimerase, e o segundo é a 
dissociação dos componentes da sonda, permitindo que o fluoróforo aumente a 
intensidade de sua fluorescência, já que foi separado do quencher. A medição da 
fluorescência, emitida pelo fluoróforo, é o que permite a análise dos resultados em tempo 
real. Observe o mecanismo de ação da sonda TaqMan na Figura 4. 
 
Figura 4 — Sistema Taqman 
Fonte: https://www.researchgate.net/profile/Chris-Bass-
3/publication/221845071/figure/fig1/AS:202926065754114@1425392752235/TaqMan-SNP-genotyping-The-
TaqMan-assay-is-a-PCR-method-employing-oligonucleotide-probes.png 
Definição 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
- Quencher sem TaqMan probe = sonda Taqman. 
- Forward primer e Reverse primer usamos em inglês, sem tradução. 
- Fluorophore = Fluoróforo. 
- SNP = sítio do SNP. 
- Extension during PCR = extensão durante a PCR. 
- Specific binding of probe = local específico de ligação da sonda. 
- Probe displacement and cleavage = deslocamento e clivagem da sonda. 
- Fluorescence = fluorescência. 
- PCR product = produto do PCR. 
- Cleavage products = produto da clivagem. 
 
Nested PCR e Multiplex PCR 
A metodologia da Nested PCR consiste em amplificar, primeiramente, um fragmento de 
forma abrangente, copiando até sequencias localizadas fora dela, para utilizar 
posteriormente esse produto para a realização da amplificação em si. Essas duas etapas 
podem ser realizadas simultaneamente ou em duas reações separadas, melhorando a 
eficiência e especificidade da reação. 
Na multiplex PCR, mais de um fragmento de DNA pode ser amplificado numa única 
reação, cada um com o seu par de primers específico. Esse procedimento apresenta 
vantagens para algumas aplicações como testes de paternidades, que devem analisar 
vários marcadores genômicos ao mesmo tempo e para introduzir um controle de reação 
esse método. Nesses casos, esse tipo de PCR tem a vantagem de simplificar 
significativamente o processo. 
Principais aplicações da PCR 
Caro(a) aluno(a), a identificação de polimorfismos ou mutações pontuais é uma aplicação 
muito utilizada da qPCR, principalmente nas áreas clínicas e de pesquisa. É ideal para 
analisar mutações, até mesmo de um único nucleotídeo modificado, e para a sua detecção 
no fragmento de DNA alvo, é necessária a avaliação do produto amplificado em curva de 
dissociação, realizada automaticamente após a termociclagem. 
Na área da farmacogenética, a qPCR vem sendo cada vez mais utilizada, no intuito de 
analisar a expressão de um determinado gene em resposta a um tratamento com fármacos 
específicos. Para detecção de microrganismos em doenças infectocontagiosas, a qPCR 
também possui alta aplicabilidade, pois permite a distinção de uma sequência especifica 
de DNA dentro de uma mistura complexa. 
Nesse campo, a qPCR permite a determinação específica da presença e quantidade do 
material genético de um vírus, bactéria ou fungo, com base na relação existente entrea 
carga viral e a gravidade da doença. Através dessa técnica, é possível mensurar a 
progressão da doença nos pacientes e a eficácia das terapias antivirais. A análise de 
bactérias, com esse mesmo processo, pode viabilizar um rápido acesso as características 
de sensibilidade do organismo, permitindo que se prescreva o antibiótico adequado. 
Assista 
Para complementar seu aprendizado, convido você a assistir ao vídeo abaixo que trata do 
uso da técnica de reação em cadeia da polimerase, PCR, e suas especificidades. Vamos 
lá! 
Enzimas de restrição 
Enzimas de restrição, também conhecidas como endonucleases de restrição, são enzimas 
que possuem a capacidade de reconhecer sequências específicas das moléculas de DNA 
e de realizar o corte dessa sequência, produzindo terminações de fitas simples. Esse tipo 
de enzima está presente em diversos organismos procariotos (principalmente bactérias), 
onde acredita-se que possuam uma função biológica de defesa, como quando cortam 
segmentos do material genético de vírus que infectam bactérias, inviabilizando suas 
funções. 
Para proteger o DNA endógeno da ação das enzimas de restrição, as sequências 
específicas, que são reconhecidas por essas enzimas, têm a sua sequência alterada pela 
adição de um grupo metílico, e é a partir das características de realização de cortes e 
capacidade de metilação que as enzimas de restrição podem ser classificadas em três tipos 
diferentes. Enzimas do tipo I possuem a capacidade de corte e de metilação, entretanto, 
apesar de reconhecer sequências específicas, os cortes são feitos aleatoriamente. Já as 
enzimas do tipo III também apresentam as capacidades de corte e de metilação, mas 
diferentemente das enzimas de tipo I, além do reconhecimento específico das sequências, 
o corte não é feito de maneira aleatória, ou seja, também possui especificidade de ação. 
Ambos os tipos, I e III, possuem como característica a necessidade do uso de energia 
metabólica (adenosina trifosfato – ATP) para se locomover ao longo da molécula de 
DNA, o que as difere das enzimas do tipo II, que apesar de apresentar apenas a capacidade 
de corte, não necessita de ATP para realizar as suas funções. Existem centenas de tipos 
de enzimas de restrição do tipo II, e por suas características são o tipo de enzimas que 
mais são utilizadas em testes de biologia molecular. 
Procedimento de clivagem de DNA 
Como já vimos, as enzimas de restrição reconhecem especificamente pequenas 
sequências de quatro a oito pares de base, que passam a se chamar sítios de restrição. As 
sequências dos sítios de restrição do DNA caracterizam-se como palindrômicas (figura 
5), ou seja, se a sequência de ambas as fitas que compõem a molécula do DNA for lida 
na direção 5’—3’, os dois sítios de restrição, presentes em cada fita, vão apresentar a 
mesma sequência de pares de base. 
Pensando nisso, convido você a observar, na Figura 5, como existem diferentes tipos de 
enzimas de restrição. Veja que cada uma delas reconhece um sítio de restrição específico, 
assim, é possível isolar diferentes regiões de uma mesma molécula de DNA. Uma das 
principais aplicações das enzimas de restrição são em técnicas de genotipagem, já que é 
possível submeter diferentes moléculas de DNA a ação de um conjunto de enzimas de 
restrição, que consequentemente gera um padrão de fragmentos característicos, como 
também, em técnicas de recombinação, sendo utilizadas em pesquisas e na engenharia 
genética. 
 
Figura 5 — Sequência palindrômica 
Fonte: https://docplayer.com.br/52980895-Tecnologia-do-dna-recombinante.html 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer o termo presente na imagem acima. 
Veja: 
Palindrome = Sequência palindrômica 
Além da especificidade de reconhecimento de determinadas sequências da molécula de 
DNA, as enzimas de restrição também podem ser classificadas a partir do padrão de corte 
que fazem na molécula. Alguns tipos de enzimas realizam cortes assimétricos nas fitas 
do DNA, originando fragmentos que possuem uma extremidade que apresenta apenas 
uma cadeia. 
Todos os fragmentos que possuem esse tipo de extremidade são complementares aos 
outros fragmentos originados pela mesma enzima de restrição (em alguns casos, de 
enzimas de restrição diferentes), por isso, esses fragmentos são conhecidos por apresentar 
extremidades coesivas, dispondo como principal característica a capacidade de 
pareamento transitórios entre si, quando submetidos a uma temperatura adequada. 
Outros tipos de enzimas promovem cortes simétricos entre nucleotídeos vizinhos, 
caracterizando os fragmentos como de extremidades cegas. Esse tipo de fragmento, 
diferente das extremidades coesivas, não apresentam a capacidade de pareamento 
transitório. Observe a diferença entre os padrões de cortes que originam os fragmentos 
cegos e coesivos na Figura 6. 
 
Figura 6 — Diferentes tipos de cortes das enzimas de restrição 
Fonte: https://users.med.up.pt/~med05009/bcm/digestao_frame_files/image006.jpg 
 
https://users.med.up.pt/~med05009/bcm/digestao_frame_files/image006.jpg
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer o termo presente na imagem acima. 
Veja: 
CUT = CORTE 
Dessa maneira, durante o processo de replicação de uma molécula de DNA, a enzima 
DNA-ligase cumpri o seu papel fisiológico ao ligar as extremidades dos fragmentos de 
Okazaki. A DNA-ligase pode ser utilizada em conjunto com as enzimas de restrição, por 
apresentar a capacidade de reestruturar as ligações fosfodiéster que foram rompidas. 
Quando aplicadas em conjunto, as enzimas de restrição e a DNA-ligase tornam-se 
ferramentas indispensáveis para as técnicas de engenharia genética, pois permitem a 
manipulação e recombinação genética, a partir da retirada de uma sequência específica e 
sua substituição por outra de interesse. 
Diversidade de enzimas de restrição 
Diversas enzimas de restrição podem ser aplicadas em testes de biologia molecular, que 
dependem da atividade de clivagem de uma sequência específica do DNA. Atualmente, 
foram catalogadas milhares de enzimas diferentes, apesar de que pouco mais de uma 
centena possui aplicabilidade em metodologias de biologia molecular. A nomenclatura 
das enzimas é normalmente criada a partir da espécie bacteriana em que foi descoberta e, 
por vezes, seguida de um algarismo romano, nos casos em que na mesma bactéria foram 
identificadas mais de um tipo de enzima de restrição. Observe, na Figura 7, alguns 
exemplos de enzimas de restrição, junto a bactéria onde foi caracterizada e a sequência 
de restrição que possui afinidade para clivar. Considere “Sticky” para um corte que cria 
extremidades coesivas, e “Blunt” para cortes que criam extremidades cegas. 
 
Figura 7 — Exemplos de diferentes enzimas de restrição 
Fonte: https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4113623/mod_resource/content/1/Aula%204%20-
%20Tecnologia%20DNA%20recombinante_enzimas%20de%20restri%C3%A7%C3%A3o.pdf 
Sequenciamento de DNA 
Podendo ser feito por diferentes metodologias, o sequenciamento genético se caracteriza 
como um procedimento que possui o objetivo de determinar a sequência de nucleotídeos 
presentes em uma determinada região do DNA. Trata-se de um processo complexo, visto 
que genomas completos apresentam uma sequência excepcionalmente longa, e que o 
princípio do teste se baseia na clivagem do DNA em fragmentos menores, para posterior 
construção da sequência. 
No início das pesquisas voltadas para o sequenciamento de DNA, duas técnicas se 
destacaram no cumprimento dessa função: o método de Sanger, também conhecido como 
método de terminação de cadeia de dideoxinucleosídeos trifosfato (ddNTPs), apresentava 
resultados satisfatórios para a rotina de sequenciamento de regiões longas de uma 
molécula de DNA, enquanto o método de degradação química de DNA, desenvolvida por 
Maxam e Gilbert, se mostrou eficaz no sequenciamento de regiões mais curtas 
(oligonucleotídeos). 
Ao longo dosanos, algumas modificações foram feitas no método de Sanger, que 
contribuíram para a criação de novas metodologias mais eficazes e que passaram a ser 
conhecidas como métodos de nova geração. Apesar de, atualmente, os métodos de nova 
geração serem amplamente utilizados por permitirem acesso ao sequenciamento de 
genomas completos, de forma mais barata e rápida, o método de Sanger ainda pode ser 
aplicado em determinadas situações, como o sequenciamento de fragmentos individuais 
gerados por uma reação de PCR. 
No decurso deste material, você será introduzido aos princípios funcionais do método de 
Sanger e dos métodos de nova geração e as discussões das estratégias elaboradas para a 
aplicação dessas técnicas no sequenciamento genético. 
Método de Sanger 
Para o seu funcionamento, o método de Sanger se baseia na capacidade que a DNA 
polimerase possui de criar uma cópia de uma molécula de DNA, a partir da adição de 
nucleotídeos em uma fita molde que possua previamente uma sequência iniciadora. Já 
que o objetivo do método é a produção de cópias de uma região específica da sequência 
do DNA, os componentes utilizados no teste se assemelham aqueles que são utilizados 
na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que por sua vez, simula os componentes 
presentes no processo natural de replicação do DNA. 
Assim como na PCR, o método de sequenciamento de Sanger necessita dos seguintes 
componentes: 
• DNA polimerase: que possui a função de incorporar os nucleotídeos na cópia da 
sequência que será formada. 
• DNA alvo: uma molécula de DNA que possui a sequência de interesse e que irá 
servir como molde para a formação das cópias complementares. Deve estar na 
forma de fita simples, ou ser submetido a um processo de desnaturação, permitindo 
que os outros componentes tenham acesso a sua estrutura. 
• Sequência iniciadoras (primers): é um fragmento de DNA que possui uma 
sequência curta, que, ao se ligar a sequência de interesse do DNA alvo, atua como 
iniciador, por permitir o início da atividade da DNA polimerase. 
• Desoxirribonucleotídeos: são os nucleotídeos que serão incorporados a estrutura 
das fitas de DNA, pela ação da DNA polimerase, são eles: dATP (adenina), dTTP 
(timina), dTCP (citosina) e dTGC (guanina). 
Além dos componentes clássicos de uma PCR, no sequenciamento de Sanger também são 
adicionados dideoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com corantes. Existem quatro tipos 
de ddNTPs, que representam as versões dideoxi dos quatro nucleotídeos, sendo elas 
ddATP (adenina), ddTTP (timina), ddCTP (citosina) e ddGTP (guanina). 
As principais diferenças estruturais entre os ddNTPs e os outros nucleotídeos são a 
ausência de um grupamento hidroxila na posição 3’ da pentose e a marcação de sua base 
nitrogenada, feita pela adição de um corante específico. Como a ligação fosfodiéster 
depende da presença de um grupamento hidroxila, quando um ddNTPs é incorporado na 
sequência, os próximos nucleotídeos ficam impossibilitados de serem adicionados, em 
outras palavras, a presença de um ddNTPs na cadeia atua como inibidor da atividade da 
DNA polimerase. Por esse motivo, os ddNTPs são conhecidos como terminadores de 
cadeia, e como a sua incorporação é feita de maneira aleatória, o resultado é a obtenção 
de sequências de DNA de tamanhos variados, que apresentam, em suas terminações, um 
dos quatro tipos de bases nitrogenadas ligadas a um corante específico. 
O procedimento do teste é iniciado com o preparo da amostra, que consiste na mistura de 
todos os componentes em um tubo, incluindo a DNA polimerase, o DNA alvo, os primers, 
os dNTPs e os ddNTPs. Os últimos são adicionados em concentrações inferiores as dos 
dNTPs, para evitar que a extensão das cadeias seja interrompida precocemente. A 
próxima etapa é submeter a amostra a ciclos constantes de variação de temperaturas, 
visando alcanças os mesmos objetivos que uma PCR. 
O ciclo se inicia com o aquecimento da amostra, visando a desnaturação e consequente 
abertura da dupla fita de DNA, seguida de uma etapa de redução da temperatura para 
possibilitar a ligação dos primers a sequência alvo e posterior alcance da temperatura 
ideal para o funcionamento da DNA polimerase. Durante a etapa de extensão da cadeia, 
os dNTPs são constantemente incorporados a nova cadeia, até que eventualmente a DNA 
polimerase incorpore um ddNTPs a sequência, impossibilitando a adição de outros 
dNTPs. 
Como já foi visto, devido a adição aleatória dos ddNTPs, ao final da reação, é obtido um 
concentrado de fragmentos de DNA, que possuem tamanhos diferentes e a possibilidade 
de conter ao final de sua sequência uma base nitrogenada marcada. A próxima etapa é 
realizar a separação dos fragmentos contidos no concentrado, através de um tipo de 
técnica de eletroforese, conhecida como eletroforese capilar, que efetua a separação a 
partir das diferenças entre a massa e carga dos fragmentos. 
Como o próprio nome sugere, o gel desse tipo de eletroforese é solidificado no interior 
de um capilar, permitindo que os fragmentos ultrapassem os poros do gel e sejam 
direcionados para uma rota onde há a interceptação por um laser. Os fragmentos menores 
conseguem se locomover com maior velocidade em relação aos fragmentos maiores, mas 
como todos eles possuem um ddNTPs anexado a um corante no final da cadeia, ambos 
são avaliados e contabilizados no momento do contado com o laser. Cada um dos quatro 
tipos de ddNTPs possui um tipo diferente de corante anexado a si, de forma que é possível 
observar os resultados a partir de um gráfico fornecido pelos detectores de fluorescência, 
que mostra tanto o padrão de coloração, que representa um tipo específico de ddNTPs, 
quanto a intensidade de fluorescência que foi gerada, registrando, a partir disso, a 
sequência de DNA complementar. 
Atualmente o método de Sanger tende a ser gradativamente substituído por métodos mais 
modernos, que se propõe a realizar o sequenciamento de genomas completos, de forma 
mais barata, rápida e eficaz. Ao conjunto de técnicas e aprimoramentos voltados ao 
sequenciamento de DNA, dá-se o nome de métodos de sequenciamento de nova geração 
ou métodos de alto desempenho. Observe as etapas do método de sequenciamento de 
Sanger automatizado na Figura 8. 
 
Figura 8 — Etapa do Sequenciamento de Sanger – automatizado 
Fonte: https://cdn.kastatic.org/ka-perseus-images/ebba6687f584843d0f47bacf938c4c7b0ced1428.png 
 
Caro(a) aluno(a), vamos conhecer os termos da imagem acima? Veja: 
- Template = molde. 
- Primer extension and chain termination = extensão do primer e terminação da cadeia. 
- Capillary gel electropforesis = eletroforese em capilar (gel). 
 - Chromatogram = cromatograma. 
https://cdn.kastatic.org/ka-perseus-images/ebba6687f584843d0f47bacf938c4c7b0ced1428.png
- Sequence = sequência. 
Métodos da nova geração 
Os métodos de nova geração são caracterizados como um grupo de novas técnicas 
automatizadas, que apresentam algumas vantagens em relação ao método de 
sequenciamento proposto por Sanger. Dentre elas, destacasse a capacidade de promover 
várias reações de sequenciamento simultaneamente, de forma que é possível ter acesso a 
informações sobre milhões de pares bases de uma única vez, além de realizar o 
sequenciamento de um DNA presente em baixas concentrações, apresentar um baixo 
custo e a obtenção de resultados mais rápidos. 
Diferente do método de Sanger, que utiliza etapas prévias de clonagem para a realização 
do sequenciamento, os métodos de nova geração utilizam uma etapa prévia de PCR em 
fase sólida, para obter a amplificação do DNA molde, antes da realização do 
sequenciamento em si. Essa característica aumenta a sensibilidade do teste, por permitir 
que as milhões de moléculas de DNA, geradas a partir da etapa de amplificação, possam 
ser analisadas simultaneamente em uma única reação, minimizando o trabalho manual de 
preparo de placas de sequenciamento e a necessidade de separaçãodos fragmentos pela 
eletroforese em gel. 
Apesar de possuírem a etapa de amplificação por PCR em fase sólida como um fator 
comum, as plataformas de sequenciamento de nova geração diferem entre si na forma 
como a amostra é preparada e amplificada, e nas estratégias utilizadas para analisar a 
sequência de interesse. O sistema da plataforma 454 utiliza como metodologia o 
pirosequenciamento, que se baseia na análise de produtos oriundos de reações 
enzimáticas feitas durante o teste. Durante a adição de desoxinucleotídeos, a cadeia que 
está sendo formada, ocorre a liberação de pirofosfato, que é convertido em ATP. Essa 
fonte de energia metabólica gerada pelo pirofosfato pode ser utilizada para oxidar um 
componente chamado luciferina, que passa a emitir um sinal de luz, que pode ser captado 
por um detector acoplado ao sistema do teste, e a partir disso, fornecer os resultados do 
sequenciamento. 
Além dos métodos que utilizam o pirosequenciamento, é possível destacar outros dois 
tipos de metodologias empregadas: a de semicondutores de íons utilizada pela plataforma 
Ion Torrent, que possui semelhanças com o pirosequenciamento, pois ambas se propõem 
a detectar um produto liberado durante a incorporação de um desoxiribonucleotídeo a 
cadeia, por intermédio da DNA polimerase. No caso dos semicondutores de íons, o 
produto detectado são íons de hidrogênio, feito a partir do uso de PHmetro sensíveis. 
O sistema da plataforma Illumina utiliza a metodologia das terminações reversíveis 
cíclicas, que se baseia na adição de quatro tipos de dideoxinucleotídeos terminadores 
reversíveis marcados com fluoróforos, junto a enzima DNA polimerase, que fará a 
incorporação desses terminadores nos fragmentos que foram previamente formados. Nos 
ciclos em que existe a incorporação dos dideoxinucleotídeos, os fluoróforos emitem luz, 
que é detectada para fornecer as informações do sequenciamento. 
Estratégias de sequenciamento de DNA 
Um dos principais empecilhos para o sequenciamento de um genoma completo está na 
sua longa extensão de nucleotídeos, tornando necessária a implementação de estratégias 
para se obter o resultado esperado. Uma das principais estratégias para o sequenciamento 
desses genomas é a criação de bibliotecas de genes, estas são caracterizadas como o 
conjunto de fragmentos de DNA, que representa todos os genes de uma espécie 
específica, permitindo o sequenciamento completo de um genoma e a possibilidade de 
isolamento de um gene específico, que possua interesse em se analisar. 
A criação de uma biblioteca de genes obedece a algumas etapas, que se inicia com o uso 
de uma técnica denominada Shotgun. Essa técnica se baseia em submeter o genoma a 
ação de uma ampla variedade de enzimas de restrição, que clivam diferentes sequências 
do DNA, promovendo a sua fragmentação. Após a etapa de Shotgun, cada fragmento de 
DNA passa a ser chamado de inserto, e todos os insertos devem ser inseridos em vetores 
apropriados, que possuam a característica de autorreplicação, como os plasmídeos 
bacterianos ou os vírus bacteriófagos. Assim que a etapa de inserção acaba, os vetores 
são adicionados a bactérias hospedeiras, que, a partir de sua reprodução, gera clones que 
também possuem o inserto de interesse, caracterizando uma biblioteca de DNA como um 
grupo de vetores idênticos, que possuem na sua composição os diferentes fragmentos de 
DNA de interesse. Observe as etapas do Shotgun na Figura 9 
O Shotgun hierárquico é uma técnica derivada do Shotgun convencional, voltada para o 
sequenciamento de uma região/sequência específica do DNA, ao invés do genoma 
completo do organismo. Assim como no Shotgun convencional, o hierárquico também 
possui etapas de fragmentação do DNA, entretanto, os insertos obtidos possuem 
sequências maiores, que precisam ser inseridos e clonados em vetores que possuam a 
capacidade de suportar suas dimensões. 
Existem duas possibilidades de vetores, os cromossomos artificiais bacterianos (BACs) e 
os cromossomos artificiais de leveduras (YACs), que promovem a clonagem da sequência 
de interesse, para que estas possam ser submetidas a outra etapa de clivagem, para 
posterior inserção em plasmídeos ou bacteriófagos. Após a inserção nos segundos 
vetores, a técnica segue da mesma forma que o Shotgun convencional. 
Caso o objetivo do pesquisador seja a avaliação de genes, é possível elaborar uma 
biblioteca de DNA complementar (DNAc), que consiste na clonagem de DNAc derivados 
de uma reação enzimática catalisada pela transcriptase reversa, que utiliza RNA 
mensageiro para produzir o DNAc. Esse tipo de estudo permite avaliar as variações de 
expressão gênica de um organismo, por exemplo, é possível comparar a concentração de 
transcritos de DNAc em uma biblioteca criada a partir de um tecido normal e um tecido 
neoplásico, facilitando o estabelecimento de um marcador tumoral, que pode ser utilizado 
futuramente como critério diagnóstico. 
 
Figura 9 — Técnica Shotgun 
Fonte: https://members.tripod.com/never_clone_alone/at1/library.gif 
 
Caro(a) aluno(a), vamos conhecer os termos da imagem acima? Veja: 
-Human dna = dna humano. 
- Cleave with.... = clivagem com nuclease de restrição. 
- Millions of.... = milhões de fragmentos genômicos de DNA. 
- Dna fragments... = fragmento de DNA inserido em plasmídeos. 
- Recombinant DNA.... = moléculas recombinantes de DNA. 
- Introduction of plasmids... = introdução dos plasmídeos em bactérias. 
- Genomic library = Biblioteca genômica. 
 
Análise de genomas 
A bioinformática é uma ciência originada da fusão da biologia com a informática, que foi 
criada para lidar com a necessidade de compreender certas funções biológicas, a partir da 
avaliação de uma grande quantidade de dados gerados. Diante da implementação de 
https://members.tripod.com/never_clone_alone/at1/library.gif
metodologias de sequenciamento genético automatizado, ao longo dos anos, os cientistas 
conseguiram sequenciar o genoma completo de diversos organismos, promovendo 
avanços significativos na ciência biomédica. A análise completa do genoma de um 
organismo específico gera uma quantidade massiva de dados, que passaram a ser 
coletados e analisados por programas de bioinformática, que se utilizam de algumas 
etapas de análise computacional durante o processo, como a montagem, a predição, a 
anotação e a criação de mapas de genomas. 
Montagem de genomas 
A montagem de genomas é a etapa responsável por ordenar corretamente as sequências 
de todos os fragmentos obtidos após uma etapa de sequenciamento. Seguindo essa linha 
de raciocínio, espera-se que quanto maior o tamanho dos fragmentos, mais fácil é a etapa 
da montagem dos genomas, entretanto, o mecanismo de ação de todas as técnicas de 
sequenciamento, que foram abordadas, possuem a característica comum de produzir 
fragmentos de comprimentos pequenos, dificultando o processo da montagem. Esse 
procedimento é realizado por programas computacionais de montagem, que promovem o 
alinhamento das sequências (reads), baseando-se em regiões complementares entre elas, 
gerando uma sequência única e contínua (contig). 
Durante essa etapa, alguns problemas podem acontecer, dentre eles, destacam-se a 
possibilidade da montagem de regiões com sequências repetitivas e a inserção errônea de 
nucleotídeos na sequência, por parte da DNA polimerase. As sequências repetitivas são 
erros gerados pela dificuldade de ordenar corretamente os fragmentos, e podem ser 
resolvidas a partir do uso de fragmentos do mesmo trecho, porém, com variação de 
tamanho, ao passo que a incorporação equivocada de nucleotídeos na sequência é 
solucionada a partir da realização de mais de um sequenciamento da mesma região, de 
forma que é possível comparar as sequências que foram formadas e identificar os 
nucleotídeos. 
Anotação de genomas 
Caro(a) estudante, fique atento(a), pois essa etapa se caracteriza por descobrir e atribuir 
certasfunções biológicas a determinadas sequências de nucleotídeos presentes nos 
contigs, com o objetivo de compreender os processos fisiológicos que ocorrem naquele 
organismo específico, por exemplo: identificar quais são os trechos responsáveis pela 
codificação de proteínas, quais são as proteínas que eles codificam e os responsáveis pela 
transcrição do RNA regulatório. 
Apesar de poder ser feita manualmente, a anotação do genoma é atualmente feita por 
programas de bioinformática, que se baseiam na comparação das sequências obtidas com 
outras, presentes em um amplo banco de dados já existente e conhecido, de forma que é 
possível identificar nas novas sequências obtidas, quais estão relacionadas com regiões 
promotoras, regiões não codificantes, regiões responsáveis pela codificação de um tipo 
de proteína específica, entre outras informações. 
Mapas de genomas 
Após a etapa de anotação, todas as informações possíveis contidas no genoma são 
representadas no formato de um mapa genômico, logo, esses mapas são compartilhados 
com toda a comunidade científica por um banco de dados utilizado mundialmente. Os 
mapas pré-existentes são fundamentais para as etapas de montagem e anotação de novos 
genomas, pois permitem a comparação entre as sequências genéticas de organismos 
similares, direcionando os pesquisadores as principais possibilidades relacionadas às 
funções de um sequenciamento que nunca havia sido feito antes. 
 
Dando continuidade ao nosso material, convido você a entender um pouco mais a 
respeito da importância que a técnica de sequenciamento de DNA trouxe para a 
sociedade. Para isso, sugiro que assista ao vídeo abaixo e, assim, amplie seus 
conhecimentos. 
 
 
O GenBank é um dos principais bancos de dados de compartilhamento de mapa 
genômicos, que permite o acesso de equipes de pesquisa distribuídas em diversos países, 
facilitando uma análise comparativa. 
Polimorfismo genético 
Neste material, você será introduzido a natureza da variabilidade genética, como esta 
pode ser influenciada por mutações e os polimorfismos genéticos. Como você já deve 
estar familiarizado com a teoria das mutações, o próximo tema que trataremos será focado 
no entendimento teórico dos polimorfismos genéticos, conceituando os tipos de 
polimorfismos, as suas respectivas características e possíveis aplicações científicas. 
Algumas regiões de uma molécula de DNA são significativamente semelhantes quando 
comparadas entre os cromossomos de diferentes seres humanos, que habitam diferentes 
localidades, entretanto, as sequências de uma região específica de DNA apresentam, em 
média, pelo menos um par de base que as difere entre si. Atualmente, já se foi catalogado 
milhões de diferenças e variações de sequências de uma mesma região do DNA, entre o 
maior número possível de diferentes populações humanas, apesar disso, a amostragem 
utilizada até o momento é considerada baixa, supondo-se, dessa forma, que a 
variabilidade genética da espécie possua uma extensão muito maior. 
A caracterização dos polimorfismos é semelhante à das mutações, ambas são variações 
genéticas que podem acontecer tanto em sequências codificadoras quanto em não 
codificadoras, entretanto, para ser considerada um polimorfismo, essa variação precisa 
apresentar uma frequência populacional superior a 2%. A maior parte dos polimorfismos 
está localizada em regiões não codificadoras, por isso, não apresentam relevância 
fisiológica para o organismo, mas aquelas que estão presentes em regiões codificadoras 
podem ser responsáveis pela criação de proteínas variantes ou pelo desenvolvimento de 
algumas patologias. 
Variação genética 
Quando avaliamos e comparamos o genoma de dois indivíduos da espécie humana, que 
não apresentam graus de parentesco entre si, a sequência de seus materiais genéticos é 
idêntica em cerca de 99,5% de sua extensão. As pequenas diferenças entre as duas 
sequências completas são o que torna cada indivíduo exclusivo, caracterizando a presença 
de uma variação genética, que é chamada de polimorfismo genético. E, como já foi dito, 
a maioria das diferenças entre as sequências de organismos de mesma espécie apresenta 
baixa (ou até mesmo ausência) influência nas características fenotípicas e fisiológicas de 
um organismo, ao passo que outros tipos de variações podem tornar o portador susceptível 
ao desenvolvimento de doenças como o câncer, transtornos alimentares, resistência a 
medicamentos, entre outros. 
Para entender o conceito de variação genética e polimorfismo, é preciso relembrar alguns 
conceitos aplicados na área de genética, como locus e alelos. Uma posição específica no 
cromossomo, onde está localizada uma determinada sequência do DNA, é denominada 
locus, cada locus de um cromossomo homólogo pode ser ocupado por dois tipos de genes, 
um que apresenta uma sequência comum a maioria dos indivíduos de uma mesma espécie, 
outro que representa uma forma alternativa desse mesmo gene, que passa a ser conhecido 
como alelo. Aos alelos que possuem predominância em uma determinada espécie, dá-se 
o nome de alelo selvagem, enquanto as formas alternativas, que possuem uma alteração 
na sequência de nucleotídeos, recebem o nome de alelos variantes. Caso um tipo 
específico de alelo variante esteja distribuído entre diferentes populações de uma mesma 
espécie, com uma frequência superior a 2%, diz-se existir um polimorfismo genético. 
A variação genética garante que cada indivíduo possua um perfil único de sequências de 
DNA, e cada perfil passa a ser chamado de DNA fingerprinting, que podem apresentar 
diferentes aplicabilidades no ramo da genética medicinal. Na genética forense a 
identificação de certos tipos de polimorfismos pode ser utilizada para a realização de 
testes de paternidade ou para análises criminalísticas que utilizam vestígios biológicos, 
como sangue, saliva e sêmen, para identificar e provar quem são os indivíduos envolvidos 
no crime. As aplicações se estendem para o diagnóstico de diversas patologias, a partir 
da identificação de um polimorfismo que foi previamente associado a uma doença 
específica, como vários tipos de câncer, autismo, doenças cardíacas, diabetes, entre 
outras. 
Tipos de polimorfismo 
A maioria dos polimorfismos presentes no genoma humano são causados por variações 
simples que afetam apenas um nucleotídeo, por isso, são conhecidos como polimorfismos 
de nucleotídeos únicos (SNPs). A presença de SNPs no genoma é comum, já que se estima 
que é possível observar um SNP a cada 1.000 pares de base de uma sequência. Esse tipo 
de polimorfismo é distribuído de uma forma em que a grande maioria está presente em 
regiões não codificadoras e, por isso, não apresentam nenhum efeito adverso para os seus 
portadores, entretanto, existem diversos SNPs conhecidos, que estão localizados em 
regiões codificadoras de proteínas, comprometendo diretamente na função do gene 
(Figura 10) 
Os SNPs podem ser classificados de acordo com a sua capacidade de influenciar a 
funcionalidade do gene em que ele está presente. Como você já deve saber, na fase de 
tradução do dogma central, todos os aminoácidos que serão utilizados para compor a 
estrutura de uma proteína são codificados por sequências de três nucleotídeos, que é 
chamada de códon. Apesar de existirem diversas combinações possíveis para a formação 
de um códon, em alguns casos, um mesmo tipo de aminoácido pode ser codificado por 
diferentes sequências de códons. O entendimento desses conceitos é importante para a 
compreensão da classificação dos polimorfismos. 
Milhares de SNPs já foram reportados em regiões codificadoras de proteínas, entretanto, 
nem todos promovem uma alteração significativa na estrutura dos códons. Cerca de 
metade desses polimorfismos, apesar de possuírem a capacidade de alterar a estrutura dos 
códons, com a nova sequência formada a partir da troca de nucleotídeos, permanecem 
com a função de codificaro mesmo tipo de aminoácido que a sequência original, não 
alterando a ordem dos aminoácidos prevista para a formação da proteína, caracterizando 
um SNP sinônimo. Os polimorfismos que provocam mudanças estruturais capazes de 
modificar a composição das proteínas formadas são chamados de SNP não sinônimos, e 
são esses os mais comumente associados a doenças, por interferirem diretamente na 
função do gene em que está localizado, podendo também ser chamado desta forma, de 
polimorfismo funcional. 
 
Figura 10 — Polimorfismo de um único nucleotídeo 
Fonte: https://www.revistasaudenews.com.br/fotos/p_20160713_193804_27.jpg 
Outro tipo de polimorfismo é o que está relacionado com a formação de um DNA 
repetitivo em tandem e pode ser de dois tipos principais, as repetições tandem de número 
variável (VNTR, do inglês variable number tandem repeats) e as pequenas repetições 
(STR, do inglês short tandem repeats). Os VNTRs também são chamados de 
minissatélites e consistem em trechos de DNA que são constituídos por repetições de um 
mesmo tipo de sequência, que pode ter de 15 a 100 nucleotídeos e estar localizado em 
várias posições do cromossomo. Caso um DNA que possua VNTR seja submetido a ação 
de enzimas de restrição capazes de reconhecer as regiões flanqueadoras do VNTR, é 
possível obter fragmentos de diferentes tamanhos, que podem ser separados por 
eletroforese e aplicados em diferentes ocasiões, como testes de paternidade. Assim como 
os VNTRs, os STRs também são caracterizados pela presença de padrões de repetições 
de nucleotídeos, porém, são mais curtas, podendo ter até 14 nucleotídeos, por isso são 
chamadas de microssatélites e podem ser utilizadas em testes de paternidade. 
Observe um exemplo de STR na Figura 11. 
 
Figura 11 — Polimorfismo do tipo STR 
Fonte: https://ars.els-cdn.com/content/image/3-s2.0-B978012804124600001X-f01-17-9780128041246.jpg 
Caro(a) aluno(a), vamos conhecer os termos da imagem acima? Veja: 
- Short tandem repeats = sequências curtas repetidas em tandem. 
- Repeats = repetições 
- Participant = participante. 
Caro(a) aluno(a), 
Chegamos ao final da nossa etapa de estudos. Acredito que, ao longo do nosso 
material, você compreendeu que a PCR é uma técnica que apresenta diversas 
variações, sendo as quatro principais: a PCR convencional, RT-PCR, qPCR e 
PCR-RFLP. 
Além disso, compreendeu que essa variação permite o diagnóstico de diferentes 
materiais genéticos (DNA e RNA) e ajuda a estudar alterações na sequência de 
nucleotídeos. Conversamos também sobre a evolução do sequenciamento 
genético, sua aplicação e a importância para o estudo do genoma humano. 
Por fim, estudamos sobre os polimorfismos genéticos, suas diferentes 
classificações e sua importância para a variabilidade genética de cada indivíduo. 
Vale ressaltar que o entendimento das variações genéticas e da evolução das 
técnicas moleculares permitiu um avanço no diagnóstico precoce e no 
desenvolvimento de novas técnicas para o tratamento de doenças. 
Desejo a você sucesso! 
Referências Bibliográficas 
AZAMBUJA. O. J. et al. Sequenciamento de DNA mitocondrial para avaliação de 
diferenças genéticas em ovinos. Journal of the Selva Andina Animal Science, vol.1, 
n.1, 2014. 
BICKLE, T. A. et al. Biology of DNA restriction. Microbiol Rev, 57(2), 434-450, 
1993. 
BRUNO, A. N. Biotecnologia II: aplicações e tecnologias. Artmed editora, 2017. 
ELLEGREN H; GALTIER, N. Determinants of genetic diversity. Nat Rev Genet, 
17(7):422-33, 2016. 
FERREIRA, M. E. A importância da pesquisa genômica e o sequenciamento do 
DNA. Comunicado técnico 91. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnológicos. 
Brasília, 2003. 
FIETTO. J. L. R. Sequenciando genomas. Ciências genômicas fundamentos e 
aplicações. Sociedade Brasileira de Genética, 2015. 
HERRERA, R. J.; GARCIA-BERTRAND, R. Chapter 1 - The Nature of Evolution. 
Ancestral DNA, Human Origins, and Migrations. Academic Press.1, 1-31, 2018. 
STROHER, P. R. Sequenciamento de nova geração e entomologia: Novas perspectivas 
para antigos questionamentos. Revista da biologia, 18 (1): 6-16, 2018. 
PRAY, L. et al. Restriction enzymes. Nature Education 1(1):38, 2008 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Unidade 3 
1. Introdução 
Olá, aluno(a). Tudo bem? 
Inicialmente, você precisa entender que a genética forense é um ramo atual da ciência, que 
utiliza as técnicas moleculares para auxiliar na elucidação de crimes e outros aspectos que 
envolvem a Lei, como os testes de paternidade. 
Dessa maneira, iremos conversar sobre os aspectos da genética forense e as técnicas 
atualmente aplicadas para esse fim, bem como, iremos discutir sobre os aspectos da expressão 
e regulação gênica, importantes para o diagnóstico de diversas doenças e para o entendimento 
do porquê algumas pessoas ficam doentes e os aspectos envolvidos na gravidade dessas 
doenças. Além da genética forense e da expressão gênica, iremos debater sobre a clonagem 
de DNA e sobre como podemos aplicar essa técnica em prol da saúde humana. 
Tenho certeza de que algumas perguntas sugiram, por exemplo: como será que descobrimos 
a paternidade de alguém? Como uma pessoa tem um câncer mais agressivo que outras? Ou 
como clonaram a ovelha Dolly? 
Ficou curioso(a) para entender as respostas dessas perguntas? Vem comigo que no final deste 
material você mesmo(a) irá conseguir responder cada uma dessas indagações. 
Ah, não se esqueça de que você é o maior protagonista do seu aprendizado. Dito isso, vamos 
juntos construir novos conhecimentos? 
Objetivos da Unidade 
Caro(a) estudante, 
A partir de agora, juntos, buscaremos: 
• Compreender as aplicações das técnicas moleculares na genética forense; 
• Estudar as técnicas envolvendo a clonagem de DNA; 
• Entender os processos envolvidos na expressão e regulação gênica; 
• Discutir a aplicabilidade das técnicas no diagnóstico laboratorial e na pesquisa. 
2. Genética Forense 
O termo genética pode ser descrito como uma ciência que busca estudar os mecanismos 
relacionados a transmissão de informações genéticas entre as gerações familiares, mas, 
quando os conceitos e técnicas da genética passam a ser utilizados para solucionar questões 
relativas ao Direito, o termo utilizado passa a ser genética forense. Atualmente, existem 
basicamente três tipos de perícias que englobam a genética forense e todas elas estão 
relacionadas a identificação genética de um material biológico, são elas: investigação de 
parentesco, criminalística e identificação individual. 
Podemos chamar uma investigação aplicada à genética forense de perícia, e todas as 
conclusões obtidas durante a investigação são descritas em um relatório pericial. Após a 
conclusão de um relatório, estes devem ser enviados aos seus respectivos solicitantes para que 
possam compor um conjunto de provas, que podem ser utilizadas durante um julgamento em 
tribunal. 
A criminalística biológica é um tipo de perícia caracterizada como o estudo dos indícios de 
materiais biológicos deixados no local do crime, que torna possível estabelecer a identidade 
do criminoso a partir da análise de compatibilidade genética. Essas amostras são coletadas na 
cena do crime e precisam ser, obrigatoriamente, de natureza biológica, já que o objetivo é 
identificar o DNA do suspeito, como todas as células nucleadas do corpo humano abrigam o 
mesmo tipo material genético, a possibilidade de amostras biológicas coletadas para análise 
aumenta (podendo ser sangue, sêmen, pelos em geral, saliva, restos de pele, entre outros). 
Após a coleta da amostra (que pode ser encontrada em objetos da cena do crime, no corpo da 
vítima ou do suspeito, objetos pessoais pertencentes à vítima ou suspeito, na arma do crime, 
entre outros), o material é enviado ao laboratório, que passa a traçar o perfil genético do DNA 
encontrado na amostra, para investigar se esse apresenta compatibilidade com o perfil genético 
do suspeito. 
Já a perícia por investigaçãoindividual está relacionada principalmente a investigação de 
restos cadavéricos. Quando um corpo é encontrado em situação de decomposição ou 
carbonização, por exemplo, a sua identificação a partir das características físicas da vítima 
torna-se difícil, de forma que a avaliação de seu perfil genético é utilizada para a sua 
identificação. 
Mas, fique atento(a), pois a perícia por identificação individual não se restringe apenas a 
investigações criminais. Em casos de desastres aéreos, incêndios ou qualquer tipo de 
acontecimento de caráter acidental, que também prejudique a integridade física das vítimas, 
seus perfis genéticos também podem ser traçados com o objetivo de identificá-los. 
 
Fonte: https://minio.scielo.br/documentstore/1806-
9649/cdqMpjgTTNvKtqXJQ5KGJdg/f3a0cee182ead4596a2fd42ed4df53edca1fb7e1.jpg 
A documentação de qualidade é essencial durante os procedimentos da perícia, visto que se 
trata de uma análise meticulosa e determinante para a resolução dos casos. A cadeia de 
https://minio.scielo.br/documentstore/1806-9649/cdqMpjgTTNvKtqXJQ5KGJdg/f3a0cee182ead4596a2fd42ed4df53edca1fb7e1.jpg
https://minio.scielo.br/documentstore/1806-9649/cdqMpjgTTNvKtqXJQ5KGJdg/f3a0cee182ead4596a2fd42ed4df53edca1fb7e1.jpg
custódia é um documento em que se registra toda a trajetória da amostra, o local e a forma de 
coleta, o coletador, a forma e o período de armazenamento e outras informações que garantam 
a credibilidade do laudo pericial final. 
As principais técnicas de genética forense utilizadas atualmente usam polimorfismos DNA, 
que você já deve ter estudado anteriormente. Além disso, analisam as regiões VNTRs 
(variable number tandem repeat), também conhecidas como minissatélites, e as regiões STRs 
(short tandem repeats), também chamadas de microssatélites. Esses marcadores genéticos são 
encontrados em todas as células nucleadas do corpo e em todas essas células existem dois 
tipos de DNA, o nuclear e o mitocondrial. 
As diferenças entre as duas moléculas de DNA não se restringem apenas ao tamanho e a 
estrutura, mas, também, na forma de herança, já que o DNA mitocondrial é herdado 
exclusivamente das mães e o DNA nuclear é herdado dos dois progenitores e, por isso, é 
preferencialmente utilizado nas conclusões das análises periciais. 
Uma pequena parcela do genoma humano é composta por repetições tandem, ou seja, 
sequências de DNA que não são codificadas e que se repetem sucessivamente (VNTR e STR). 
Essas repetições podem ser utilizadas para diferenciar dois organismos da mesma espécie a 
partir da diferença do número de sequências repetidas, presentes em um par de cromossomos 
homólogos. Como as regiões VNTRs são maiores quando comparadas aos STRs, a sua análise 
torna-se mais difícil de ser interpretada, de forma que as regiões STRs (microssatélites), são 
as mais utilizadas para a identificação do perfil genético dos organismos de interesse. 
Como a maioria das regiões codificantes do DNA humano são praticamente idênticas em 
todos os indivíduos, essas regiões não podem ser utilizadas para uma avaliação pericial de 
compatibilidade genética, por isso, os STRs são as regiões de escolha para a análise, já que 
não são traduzidos em proteínas, então, a sua expressão não será influenciada por nenhuma 
patologia e a quantidade de repetições varia de indivíduo para indivíduo. 
As regiões STRs podem apresentar de dois a sete pares de base, sendo aqueles que possuem 
quatro pares de base os mais utilizados nos testes de identificação genética. Os STRs possuem 
alelos com tamanhos próximos e isso permite, dentre outras vantagens, a amplificação e 
análise de diferentes regiões do DNA, ou seja, a metodologia utilizada é a qPCR multiplex. 
Imaginando um cenário de análise de genética forense, os produtos obtidos após a qPCR 
multiplex representam sequências de tamanhos pequenos, o que também é uma vantagem, 
imaginando um cenário no qual o DNA, que está sendo amplificado, pertence a uma amostra 
degradada, como acontece em corpos carbonizados, por exemplo. 
VOCÊ SABIA? 
É possível resumir o fluxograma de uma perícia, a partir da seguinte sequência de atividades: 
a coleta da amostra no local do crime, a identificação do tipo de amostra que foi coletada, a 
extração e quantificação do DNA da amostra, que é feito por qPCR, à amplificação do DNA 
que foi extraído, a partir do uso de STRs e qPCR multiplex, a comparação dos resultados 
obtidos da amostra coletada com a das amostras dos suspeitos, a elaboração do laudo pericial 
e o envio para os seus determinados solicitantes. 
Existem outras possibilidades de técnicas, além daquelas que utilizam os STRs, como a análise 
do cromossomo Y, que é herdado de pai para filho e, por isso, é uma análise feita 
exclusivamente em indivíduos do sexo masculino. Esse tipo de análise é muito utilizado em 
casos de abuso sexual, em que a amostra que é coletada, na maioria dos casos, contém a 
mistura do DNA da vítima e do agressor. Outra possível técnica utilizada é a fenotipagem 
forense, que tem o objetivo de pressupor algumas características físicas do suspeito, a partir 
da identificação de certos tipos de genes. Esses genes são responsáveis por expressar algumas 
características fisionômicas, que permitem descartar alguns suspeitos que estão sendo 
investigados. 
Testes de paternidade 
Como já foi dito anteriormente, a técnica mais utilizada para o teste de paternidade é a que 
utiliza a amplificação do DNA a partir do uso de STRs. Como em muitos procedimentos da 
biologia molecular, o início da análise de paternidade começa com a extração do DNA de uma 
amostra biológica, nesse caso, as amostras da criança, da mãe e dos supostos pais. Dessa 
forma, a extração do DNA segue alguns procedimentos básicos, utilizados com o intuito de 
isolar e purificar o DNA presente na amostra. 
O primeiro passo é degradar as células da amostra para que o DNA, que anteriormente estava 
recluso ao meio intracelular, seja exposto. Esse processo é normalmente feito em um tubo 
específico, que possui uma membrana de retenção, que concentra o DNA após a lise das 
células, entretanto, esse material ainda possui contaminantes oriundos das outras estruturas 
celulares, como as proteínas que compõem a estrutura da membrana. O uso de detergentes, 
seguidos de uma etapa de centrifugação, removem esses resíduos, permitindo que, ao final da 
eluição do DNA, reste apenas a molécula purificada e pronta para ser utilizada. 
Após a etapa de extração do DNA, o produto obtido deve ser preparado para ser submetido a 
uma reação de PCR. Como a técnica utiliza STRs, a metodologia aplicada será a qPCR 
multiplex, que se baseia na amplificação de diferentes regiões do DNA, de forma simultânea, 
por utilizar vários pares de primers, específicos para cada região de interesse. Após o término 
da qPCR multiplex, os resultados da mãe e do filho devem ser comparados, com a finalidade 
de identificar qual o alelo da criança foi herdado da mãe, de forma que o alelo remanescente 
passe a ser chamado de alelo paterno obrigatório. Tanto a identificação do alelo materno, 
quanto do alelo do possível pai são identificados a partir da comparação entre o número de 
repetições STRs presentes no DNA, veja o exemplo abaixo (figura 2). 
 
Fonte: https://www.testepaternidade.pt/teste/wp-content/uploads/2020/08/Marcador-resultado-teste-
paternidade.jpg 
https://www.testepaternidade.pt/teste/wp-content/uploads/2020/08/Marcador-resultado-teste-paternidade.jpg
https://www.testepaternidade.pt/teste/wp-content/uploads/2020/08/Marcador-resultado-teste-paternidade.jpg
Após traçar o perfil genético da criança e dos supostos pais, é necessário fazer uma análise 
estatística para interpretar os resultados. Essa análise é baseada no cálculo do índice de 
paternidade (IP), que representa a probabilidade do suposto pai que foi analisado, seja o pai 
biológico da criança, em relação a probabilidade de que outro homem, pertencentea mesma 
raça, seja o pai biológico da criança. O cálculo se baseia na divisão da probabilidade da 
transmissão do alelo materno / probabilidade da transmissão do alelo paterno (referente ao 
suposto pai que está sendo analisado) e a probabilidade da transmissão do alelo materno / 
análise da frequência com que esse alelo paterno se repete em populações da mesma raça do 
suposto pai analisado, ou seja, a probabilidade de que outro homem seja o pai biológico da 
criança. 
É por essa razão que: os resultados dos testes de paternidades nunca podem ser expressos com 
100% de compatibilidade, já que, para concretizar essa afirmação, todos os outros homens 
pertencentes a mesma raça deveriam ser testados também. 
CURIOSIDADE 
Vale ressaltar que o teste de paternidade é o nome com o qual a técnica ficou popular, 
entretanto, a denominação correta é análise de vínculos genéticos. 
3. Clonagem de DNA 
No inconsciente popular, o uso do termo clonagem está diretamente relacionado à criação de 
um organismo geneticamente idêntico a outro, como o famoso caso de clonagem da ovelha 
Dolly. As repercussões causadas pela criação de um organismo sem necessariamente a 
presença de um pai e uma mãe trouxe muita inquietação para a sociedade e incitou o 
imaginário para diversas possibilidades de aplicações igualmente impressionantes, que 
poderiam ser realizados com essa técnica (SBPC, 2001). 
Atualmente, pouco se conhece sobre os outros tipos de clonagem, como a terapêutica e a do 
DNA, que já são amplamente aplicadas em diversas áreas da biologia molecular. A 
metodologia que permitiu a clonagem foi proposta inicialmente pelo cientista alemão Hans 
Spermann em 1938, que demonstrou que o processo basicamente consistia na transferência de 
um núcleo integro de uma célula para um óvulo, tornando possível o seu desenvolvimento em 
outro organismo (SBPC, 2001). 
Em 1984, uma ovelha foi produzida artificialmente a partir de células embrionárias por 
pesquisadores da Universidade de Cambridge. Na mesma década, cientistas conseguiram 
clonar uma vaca retirando células embrionárias jovens da mesma e na década seguinte, em 
1995, pesquisadores do centro de reprodução na Escócia clonaram duas ovelhas com base em 
células embrionárias de 9 dias (SBPC, 2001). 
Em 1997, a mesma equipe conseguiu realizar a clonagem da ovelha Dolly a partir de células 
congeladas. O advento da clonagem feita a partir de células somáticas, e não mais 
embrionárias, tornou a clonagem da ovelha Dolly um marco no estudo dessa área da biologia 
molecular. 
As áreas relacionadas à biologia molecular apresentaram um crescimento rápido e 
significativo nos últimos anos. No Brasil, o único clone de que se tem registro foi em 2001: 
uma bezerra produzida pela Embrapa. Por outro lado, a técnica de clonagem do DNA vem 
sendo amplamente utilizada na agropecuária (SBPC, 2001). 
A possibilidade de clonagem de organismos trouxe consigo diversos questionamentos éticos 
que discutem as limitações do uso da técnica. Essas técnicas de biologia molecular permitiram 
a idealização de tecnologias de reprodução em série e um panorama em que as empresas de 
biotecnologia podem manipular as linhagens de animais, plantas e quem sabe humanos 
geneticamente modificados. 
Nesse cenário, é inevitável que a ciência e a sociedade pensem e se questionem sobre quais 
são os limites dos avanços tecnológicos, em especial dessas técnicas, se tratando de uma 
discussão que vai além dos âmbitos acadêmicos e científicos. Ao Direito, por exemplo, cabe 
estabelecer as leis e os regulamentos que imponham limites ao uso das técnicas de engenharia 
genética, e também estipulem possíveis punições para quem ultrapassar esses limites (SBPC, 
2001). 
As áreas de genética e biologia molecular estão frequentemente no foco das discussões éticas, 
por suas técnicas conflitarem constantemente com as percepções sobre os conceitos de vida 
apresentados pela sociedade, criando discursões a respeito da criação de organismos 
geneticamente modificados ou outros avanços envolvendo manipulação do DNA. 
Particularmente, a clonagem envolve questões bem mais profundas, pois, apesar de ser uma 
ferramenta que nos ajuda a compreender a essência da nossa existência e proporciona 
tratamento para diversos tipos de doenças, podem trazer também potenciais consequências 
danosas para a sociedade. 
As discussões e as preocupações sobre esse tema levaram à elaboração de um protocolo para 
a proibição de clonagem humana, denominado de “Protocolo in Prohibition of Cloning 
Human Beings”, como parte da Convenção Europeia sobre direitos humanos e biomedicina, 
assinado por 19 países membros do COE (Couincil of Europe) que se comprometeram a 
proibir, por lei, qualquer procedimento que envolva a clonagem de seres humanos. 
Por outro lado, outras técnicas de clonagem já são utilizadas com grande eficácia em outros 
campos, como a clonagem terapêutica, por exemplo, que visa formar células saudáveis para 
que elas possam substituir possíveis tecidos danificados, sendo uma das grandes expectativas 
desse processo a substituição de tecido medular lesado em casos de paralisia, seja paraplegia 
ou tetraplegia. Essa técnica da medicina, contudo, esbarra novamente em questões morais e 
éticas na medida em que sua eficácia está intimamente ligada ao uso de células tronco 
embrionárias retiradas de embriões descartados por clínicas de fertilização. 
As discussões em torno desse tema ainda não chegaram a uma conclusão, mas o uso de células 
tronco retiradas de embriões é proibido no mundo inteiro. Pesquisadores utilizam outros tipos 
de células tronco contidas em tecido adultos, mas que não demonstram a mesma eficácia. 
EXEMPLO 
Um exemplo já bem difundido é o uso de células tronco da medula para o tratamento de 
leucemias, na qual são retiradas células da medula de um doador e aplicadas em um receptor 
compatível, promovendo a diferenciação em novas células medulares. (SILVA, 2020). 
Outra forma de clonagem é a de DNA. Esse tipo de clonagem não tem relação com a 
reprodutiva ou a terapêutica e já é bem utilizada e estabelecida em alguns ramos da indústria 
ou medicina, porém, ainda fomenta muitas dúvidas em relação as possíveis consequências 
futuras. 
Em um contexto de frequente avanço da genômica, ou seja, da manipulação dos genes, 
especialmente para a criação de organismos geneticamente modificados (OGM) ou 
transgênicos, as discussões buscam conscientizar a sociedade sobre a ética em se produzir 
OGM’s em larga escala e sobre a segurança na transferência ou manipulação de genes em 
organismos vivos. 
EXEMPLO 
De acordo com Rubio (2012), os questionamentos éticos sobre o uso massivo de OGM’s 
existem e estão relacionados a alguns tópicos, como por exemplo: 
- Os OGM’s causam perda massiva da biodiversidade, até que ponto isso levaria a extinção 
de algumas diversidades vegetais no futuro; 
- Como remediar os impactos socioeconômicos, culturais e sociais, gerados pela introdução 
dos OGM’s em larga escala, nas comunidades camponesas, ribeirinhas e indígenas; 
- Como evitar que a contaminação de sementes contribua para a formação de monopólios por 
empresas que produzam sementes transgênicas patenteadas. 
 
Fonte: https://i0.wp.com/www.digit.fyi/wp-content/uploads/2019/07/dolly-the-sheep-
pic.jpg?resize=640%2C360&ssl=1 
O processo de clonagem e recombinação gênica 
Existem basicamente duas formas de se caracterizar o termo “clonagem de DNA”, uma delas 
é a produção de cópias idênticas de um segmento específico de uma molécula de DNA, a outra 
está associada ao isolamento de um gene específico de interesse. 
É possível realizar a clonagem de uma molécula de DNA a partir de duas técnicas distintas, a 
reação em cadeia da polimerase (PCR) combinada a eletroforese é um procedimento utilizado 
quando o interesse da clonagem é apenas para a conferência da presença ou ausência de um 
https://i0.wp.com/www.digit.fyi/wp-content/uploads/2019/07/dolly-the-sheep-pic.jpg?resize=640%2C360&ssl=1https://i0.wp.com/www.digit.fyi/wp-content/uploads/2019/07/dolly-the-sheep-pic.jpg?resize=640%2C360&ssl=1
gene específico na amostra, enquanto o uso de vetores plasmidiais é uma técnica de clonagem 
que se propõe a avaliar a produção de proteínas. 
Para entender o conceito e as diferenças entre os processos de clonagem de DNA e de DNA 
complementar, é preciso relembrar alguns conceitos estruturais da molécula. As moléculas de 
DNA são formadas por éxons, caracterizadas como regiões codificantes, ou seja, participam 
do processo de transcrição e tradução do DNA, e os íntrons, que são as regiões não 
codificantes, que também participam do processo de transcrição da molécula, mas não são 
traduzidas em proteínas. Para diferenciar as duas metodologias, também é importante lembrar 
que o produto da transcrição de uma molécula de DNA são moléculas de RNA mensageiro 
(RNAm), que apresentam as informações genéticas contidas no DNA e são responsáveis por 
conduzir as etapas da síntese de proteínas específicas. 
As principais diferenças entre a clonagem de DNA e a clonagem de DNA complementar é 
que na primeira toda a molécula de DNA é clonada, não existindo distinção entre as regiões 
que compõe a molécula, ou seja, tanto os éxons quanto os íntrons são clonados nesse método, 
de forma que as proteínas que serão produzidas a partir da tradução desse gene podem 
apresentar proporções diferentes. Em contrapartida, a clonagem de DNA complementar utiliza 
uma molécula de RNAm para realizar a clonagem. Assim, o RNAm sofre a ação da 
transcriptase reversa e da DNA polimerase, permitindo a produção de cópias de DNA que se 
restringem as regiões codificantes, ou seja, apenas os éxons são clonados nesse método. Além 
disso, a concentração de proteínas traduzidas é diretamente proporcional a quantidade de 
RNAm que foi utilizada no procedimento. 
Dessa forma, existem basicamente duas metodologias utilizadas no processo de clonagem do 
DNA e a escolha de qual delas utilizar depende do objetivo a ser alcançado com a clonagem. 
Quando a finalidade da clonagem se resume em observar a presença ou a ausência de um gene 
específico de interesse, a metodologia de escolha é a combinação de duas técnicas já 
estudadas, que seria primeiramente, a produção de cópias de DNA através da técnica de PCR 
(reação em cadeia da polimerase), para posterior revelação através da eletroforese em gel de 
agarose, interpretada a partir do padrão de bandas de migração formadas no gel. 
Vamos recapitular alguns conceitos já estudados sobre PCR e eletroforese, para entender a 
sua aplicabilidade nos processos de clonagem. Os reagentes e o equipamento utilizados na 
PCR buscam mimetizar a síntese de DNA que ocorre naturalmente no interior das células. O 
termociclador é o equipamento utilizado nas reações de PCR, por proporcionar um ciclo de 
variação de temperaturas, que controlam as etapas do procedimento, dividindo-as em três 
fases principais, a desnaturação (96°C), que permite a separação da dupla fita de DNA em 
duas fitas moldes simples, o anelamento (55 – 65°C), que permite a ligação dos primers a fita 
molde, e, por fim, a etapa de extensão (72°C), que é caracterizada por um leve aumento de 
temperatura em relação a etapa anterior, permitindo o início da ação da Taq polimerase, que 
estende os primers, produzindo as novas fitas de DNA. 
Os reagentes utilizados no processo da PCR atuam a partir da continuidade da variação de 
temperatura de cada ciclo, dentre eles podemos citar resumidamente os primers, representados 
como uma pequena sequência de nucleotídeos complementares as sequências presentes nas 
extremidades de cada fita molde simples, atuando como um iniciador da reação. Também são 
adicionados a reação os nucleotídeos (A, T, C e G), que serão inseridos na fita molde pela Taq 
polimerase, caracterizando a fase de extensão. Após o término da PCR, o produto obtido é 
normalmente avaliado através da eletroforese em gel de agarose, que utiliza uma corrente 
elétrica e uma matriz em gel para separar os fragmentos de DNA a partir do seu tamanho. 
Os fragmentos que possuem o mesmo tamanho são agrupados no gel, formando uma banda 
de migração, que pode ser visualizada a olho nu, mas esse processo é facilitado pela adição 
de pigmentos com afinidade ao DNA. A formação das bandas de migração no gel é o padrão 
que deve ser observado para validar os resultados da PCR. 
A outra metodologia de clonagem envolve a utilização de moléculas de DNA extra 
cromossomal, normalmente encontradas em bactérias, que são chamados de plasmídeos. Os 
plasmídeos se caracterizam como moléculas de DNA de dupla fita, mas que apresentam uma 
conformação circular e que podem ser transferidos entre bactérias. Por também apresentar a 
capacidade de autorreplicação, é a principal metodologia utilizada para fins de estudo 
biotecnológicos de produção e função das proteínas de interesse. 
A primeira etapa da clonagem de DNA por vetores plasmidiais é a inserção do gene de 
interesse na molécula do plasmídeo, que deve ser feito mediante a atividade de enzimas de 
restrição. Como já vimos anteriormente, enzimas de restrição são naturalmente produzidas 
por bactérias, com o intuito de protegê-las contra a infecção de vírus bacteriófagos, mas que 
possuem aplicabilidade biotecnológica, devido a sua capacidade de reconhecer e clivar uma 
determinada sequência de DNA. 
Após a clivagem, o fragmento de DNA cortado pode apresentar dois tipos de conformação 
diferenciados a partir das características de suas extremidades. Os fragmentos de extremidades 
cegas, apesar de apresentarem a capacidade de se ligar a outras extremidades cegas, não são 
capazes de gerar pontes de hidrogênio entre si, já que não existe complementariedade de bases. 
Em contrapartida, as extremidades coesivas são capazes de gerar pontes de hidrogênio, já que 
a sua ligação é estabelecida por complementariedade de bases, por isso, são mais específicas 
e utilizadas do que as extremidades cegas, pois permitem um maior controle de ligação do 
gene ao plasmídeo. 
A DNA ligase é a enzima que conduz a próxima etapa da clonagem, ao desempenhar a mesma 
função que naturalmente exerce no interior das células, promover a ligação entre fragmentos 
de DNA, através da formação de ligações fosfodiéster, que promovem a união dos 
nucleotídeos. Quando aplicadas nos ensaios de clonagem, a DNA ligase é responsável por 
unir as extremidades do gene, que foi clivado pelas enzimas de restrição, a estrutura molecular 
dos plasmídeos, gerando uma molécula de DNA recombinante (plasmídeo + gene de 
interesse). Observe o esquema abaixo que relata esse processo (Figura 4) 
 
Fonte: http://s2.glbimg.com/krpI-
Jq2xdNeZEMsed_bQkRs0A0=/0x0:1556x2000/620x797/s.glbimg.com/po/ek/f/original/2013/09/11/celul
as-tronco_clonagem_e_tecnologia_do_dna_recombinante_5_1.jpg 
A próxima etapa, após a formação da molécula de DNA recombinante, é a sua inserção em 
células bacterianas, num processo chamado de transformação. Existem basicamente duas 
formas para alcançar a transformação, mas ambas promovem a desestabilização da membrana 
das bactérias, tornando-as mais susceptíveis a entrada do DNA recombinante. A primeira 
forma é o uso de eletroporação, que consiste na indução de pulsos de carga elétrica, criando 
poros na membrana das células. E a segunda forma utiliza o choque térmico, ao submeter as 
bactérias a altas temperaturas, seguido de um processo de resfriamento. 
Apesar do uso das técnicas de transformação, nem todas as bactérias passam a ser portadoras 
dos novos plasmídeos, seja por falha na ligação ou falha no próprio processo de 
transformação, assim, para garantir que apenas as bactérias portadoras passem para a próxima 
etapa, é necessário iniciar a fase de seleção bacteriana. Normalmente, os plasmídeos que são 
inseridos, além de conter o gene de interesse, também possuem um gene de resistência a um 
antibiótico específico, deforma que a cultura dessas cepas bacterianas deva ser feita em um 
meio de cultura que possua esse antibiótico em sua composição. Caso a bactéria não seja 
portadora do plasmídeo, ela não irá conseguir se desenvolver no meio de cultura, diferente das 
bactérias portadoras, que crescem e formam colônias. 
Algumas colônias bacterianas podem sobreviver ao crescimento por apresentarem o 
plasmídeo de resistência, mas não necessariamente possuir o gene de interesse, já que existe 
a possibilidade de falha na inserção plasmidial. Para confirmar se as bactérias sobreviventes 
possuem o gene de interesse, além do gene de resistência, deve-se coletar o DNA das bactérias 
http://s2.glbimg.com/krpI-Jq2xdNeZEMsed_bQkRs0A0=/0x0:1556x2000/620x797/s.glbimg.com/po/ek/f/original/2013/09/11/celulas-tronco_clonagem_e_tecnologia_do_dna_recombinante_5_1.jpg
http://s2.glbimg.com/krpI-Jq2xdNeZEMsed_bQkRs0A0=/0x0:1556x2000/620x797/s.glbimg.com/po/ek/f/original/2013/09/11/celulas-tronco_clonagem_e_tecnologia_do_dna_recombinante_5_1.jpg
http://s2.glbimg.com/krpI-Jq2xdNeZEMsed_bQkRs0A0=/0x0:1556x2000/620x797/s.glbimg.com/po/ek/f/original/2013/09/11/celulas-tronco_clonagem_e_tecnologia_do_dna_recombinante_5_1.jpg
das colônias que foram geradas, submetê-los a um processo de PCR, seguido pela revelação 
em eletroforese em gel de agarose. 
As bactérias selecionadas são nutridas em grandes meios de cultura, induzidas a proliferação, 
seguida de uma indução, através de sinais químicos, a codificação e produção da proteína de 
interesse, que é posteriormente purificada (figura 5). Essa técnica é amplamente utilizada 
atualmente para a produção de biofármacos, como a insulina utilizada no tratamento de 
diabéticos insulinodependentes. 
 
Fonte: https://cdn.kastatic.org/ka-perseus-images/3d99ed829e755272b76bc49863614c76e8f55e97.png 
 
4. Expressão Gênica 
Sabe-se que o DNA é o código utilizado para codificar e produzir qualquer molécula, de RNA 
ou proteína, que a célula irá precisar para desempenhar funções básicas fundamentais. Por 
essa razão, entender de que maneira esse código é decifrado para construir essas proteínas 
complexas é fundamental para compreender o funcionamento da célula e, consequentemente, 
do organismo como um todo. 
O campo de estudos que busca entender e explicar de que forma isso acontece é o da expressão 
gênica, que analisa as formas como alguns genes podem ser ativados ou inativados, 
seletivamente, para produzir proteínas que serão destinadas à cumprir funções fisiológicas 
específicas. Um dos fatores utilizado para estudar esse mecanismo de expressão dos genes é 
a diferenciação das células (ALBERTS, 2011). 
Hoje se sabe que as células, independentemente do tipo, contêm os mesmos genes, 
demonstrando que o processo de diferenciação, que acontece no período embrionário, é 
resultado das mudanças na expressão gênica das células. Por isso, conhecer os mecanismos 
que controlam esse processo tornaria possível a reconstrução de um organismo, a 
diferenciação de células e outras inúmeras aplicações possíveis. 
Atualmente, existem mais de duzentos tipos celulares descritos, espalhados pelo organismo, 
cada um com a sua função especializada. 
EXEMPLO: 
https://cdn.kastatic.org/ka-perseus-images/3d99ed829e755272b76bc49863614c76e8f55e97.png
Como exemplos, possuímos células específicas para a produção de hormônios, como as 
células β do pâncreas que produzem insulina, os linfócitos B especializados na produção de 
anticorpos, as hemácias que compõe a maior parte da constituição celular do sangue, capazes 
de produzir proteínas que podem transportar o oxigênio, a hemoglobina, entre outras. A 
diferença fundamental entre elas é somente quais genes dessas células estão ativados e quais 
estão inativados, dentre o genoma total contido em todas elas (ALBERTS, 2011). 
Especialmente para os organismos multicelulares, é muito importante saber quais genes estão 
expressos ou não, já que muitos tipos celulares serão formados, gerando, consequentemente, 
diferentes tipos de tecidos e órgãos. É fundamental que essa diferenciação ocorra de forma 
eficaz e, por isso, faz-se necessário que a célula produza diferentes sequências de RNA, que 
serão utilizadas no processo de tradução de proteínas, regulado por um conjunto de genes 
específicos, que encontram-se expressos naquele momento (ALBERTS, 2011). 
É importante ressaltar que as diferentes expressões dos genes não estão relacionadas a 
mudanças na sequência de nucleotídeos no DNA. De fato, todas as células, seja qual for a sua 
morfologia ou função, vão apresentar o mesmo genoma. Essa evidência já foi demonstrada 
através de experimentos em que retirou-se o núcleo de uma célula de pele de uma rã adulta e 
transplantaram para um ovo de rã sem o núcleo. Dessa forma, foi observado que o ovo se 
desenvolveu normalmente mostrando que nenhuma sequência fundamental do DNA havia 
sido perdida, caso contrário, o organismo não conseguiria se desenvolver completamente. 
Esses experimentos só demonstraram que a diferenciação celular não está ligada a diferença 
nos genes, ou seja, nas sequências do DNA, mas sim na expressão diferente desses genes em 
cada grupo de células (ALBERTS, 2011). 
Uma das práticas para se evidenciar como cada tipo celular produz conjuntos distintos de 
proteínas é a técnica de separação de moléculas denominada de eletroforese. Através dessa 
técnica, é possível comparar a composição proteica de diferentes células como neurônios, 
hepatócitos ou outras. O objetivo desse tipo de estudo está no rastreio de diferentes tipos de 
expressões gênicas, mostrando que existem muitas proteínas comuns a todas as células que 
são fundamentais para os processos básicos do metabolismo da célula. 
Proteínas como RNA-polimerase, enzimas relacionadas à glicólise, proteínas que formam o 
citoesqueleto, proteínas dos ribossomos ou de reparo celular estão presentes em todos os tipos 
celulares. 
Contudo, existem proteínas altamente especializadas que estão relacionadas as diferentes 
características de cada célula. Muitas são raras e só podem ser identificadas através de técnicas 
sensíveis e específicas, como a espectrometria de massas ou através do monitoramento das 
sequências de RNAm que codificam essas proteínas. 
A avalição de diferentes sequências de RNAm mostrou que um célula diferenciada apresenta 
uma média de 5.000 a 15.000 genes expressos, apesar de apresentar um total de 25.000 genes. 
Esses dados comprovam que a expressão de um conjunto de genes diferentes em cada tipo de 
célula é o que causa as grandes variações observadas em cada uma delas, principalmente 
quanto a funcionalidade e morfologia. 
DEFINIÇÃO 
Em suma, a expressão gênica é um processo pelo qual a informação contida nos genes, ou 
seja, na sequência de nucleotídeos, é revertida ou traduzida em moléculas que determinam as 
propriedades distintas das células. A expressão de um gene envolve um conjunto de etapas 
que vão desde a transcrição, ou seja, síntese da molécula de RNA, até a tradução, que é a 
conversão desse RNA em uma proteína de fato, todo esse processo foi denominado de “dogma 
central” (BIOREDE, 2020). 
5. Regulação Gênica 
A regulação gênica pode ser definida como um conjunto de mecanismos utilizados pelas 
células, para controlar quais serão os genes, dentre os diversos presentes no seu material 
genético, que serão expressos conforme as suas necessidades. Um grupo de células podem se 
diferenciar após receber o mesmo tipo de estímulo, mas após a fase de diferenciação, 
dependendo de condições internas ou externas, essas células podem apresentar variações na 
sua expressão gênica, ou seja, podem produzir proteínas de proporções e funcionalidades 
diferentes, conforme a sua necessidade. As diferenças entre os padrões de expressão gênica 
são o que cria diferentes grupos celulares, que são especializadas em desempenhar um papel 
diferente no organismo (figura 6). 
 
Fonte: https://knoow.net/wp-content/uploads/2017/12/Express%C3%A3o-G%C3%A9nica-400x291.pngPensando assim, todas as células possuem o mesmo material genético, sua diferença funcional 
depende de quais genes estão ativos ou inativos. 
DEFINIÇÃO 
Por exemplo, as células beta pancreáticas possuem como função principal a produção do 
hormônio insulina, envolvido no controle glicêmico, enquanto as células hepáticas removem 
as possíveis toxinas presentes na corrente sanguínea. Apesar de apresentar funções diferentes, 
ambas as células comportam o mesmo material genético em seus núcleos, entretanto, os genes 
que favorecem a tradução de insulina estão ativos nas células pancreáticas e inativos nas 
células hepáticas, caracterizando a expressão gênica como um modulador de diferenciação e 
função celular. 
As células comportam mecanismos de controle e autorregulação, que atuam em diferentes 
pontos do processo de transcrição e tradução, alterando quantitativamente e qualitativamente 
as proteínas produzidas, conforme as necessidades do organismo. 
https://knoow.net/wp-content/uploads/2017/12/Express%C3%A3o-G%C3%A9nica-400x291.png
6. Fatores de Transcrição 
A transcrição dos genes é o processo em que uma determinada sequência de DNA é convertida 
em uma molécula de RNA, que futuramente será traduzida em uma proteína específica. Por 
isso, a etapa de transcrição é um dos principais pontos de controle da expressão gênica, já que 
caso um gene não seja transcrito, ele também não poderá ser traduzido e as proteínas não serão 
produzidas. 
Existem diversos mecanismos de controle nessa etapa do dogma central, mas, no geral, um 
gene possui duas regiões de controle de transcrição, a região promotora e o sítio de iniciação, 
que são respectivamente o local onde a RNA polimerase e a síntese do RNA propriamente 
dita se iniciam. 
Além dessas regiões, as células possuem um conjunto de proteínas, chamadas de fatores de 
transcrição, que atuam regulando a expressão gênica. Um fator de transcrição pode se unir a 
sequência alvo do DNA e atuar como ativador ou repressor da transcrição, ao facilitar ou 
dificultar a ligação da RNA polimerase ao gene. 
Um dos principais facilitadores da transcrição é chamado de enhancer, que é caracterizado 
como uma sequência de DNA que atua aumentando a afinidade das proteínas, que participam 
da transcrição, por uma sequência promotora. O mecanismo de ação de um enhancer é 
promover uma curvatura na estrutura molecular do DNA, facilitando o acesso das proteínas 
de transcrição a uma região promotora específica (figura 7). 
 
Fonte: https://genestogenomes.org/wp-content/uploads/2017/01/rsz_transcription_factors.png 
 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. 
Veja: 
- Enhancers = acentuadores. 
- Activator proteins = proteínas ativadoras. 
- Other transcriptions factors proteins = outros fatores transcricionais proteicos. 
https://genestogenomes.org/wp-content/uploads/2017/01/rsz_transcription_factors.png
- Promoter = promotora. 
- RNA polymerase = RNA polimerase. 
- Methyl groups = grupo metil. 
- CTCF (CCCTC - fatores de ligação). 
- Insulator = mantém em inglês. 
O TATA box é uma das principais sequências promotoras do DNA e é utilizada como a 
sequência de reconhecimento de um fator de transcrição chamado TFIID (Transcription 
Factor IID). Um dos principais componentes desse fator de transcrição é a sua subunidade 
TBP (TATA Binding Protein), que, como o próprio nome sugere, é responsável por promover 
a ligação do TFIID ao TATA box. Completada a fase de ligação, o TFIID passa a recrutar 
outros fatores de transcrição, que juntos formam um complexo de transcrição, responsável por 
facilitar e garantir a ligação da RNA polimerase a sequência de DNA. 
 
Fonte: http://labs.icb.ufmg.br/lbcd/prodabi3/grupos/grupo1/images/fatoresdetranscricao.gif 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
- Start transcription = início da sinalização para a transcrição. 
- RNA polymerase II = RNA polimerase II. 
- Protein kinase (TFIIH) activity = atividade da proteína quinase (TFIIH). 
http://labs.icb.ufmg.br/lbcd/prodabi3/grupos/grupo1/images/fatoresdetranscricao.gif
- Transcription begins = início da transcrição. 
Controle da expressão pós-transcricional 
Após a conclusão do processo de transcrição da molécula de DNA, o transcrito primário ainda 
não pode ser considerado uma molécula de RNA mensageiro completa, por isso, é chamada 
inicialmente de pré-RNA. Para concluir o processo de maturação em RNAm, a molécula passa 
por algumas etapas, como a adição da cap 5’ e cauda poli-A, e o processo de splicing. 
Como já foi visto, esses processos tornam a molécula de RNAm apta para sair do núcleo e ser 
traduzida em uma proteína específica. Para relembrarmos, o cap 5’ é uma guanina modificada, 
que é adicionada ao nucleotídeo inicial da estrutura do RNA, enquanto a cauda poli-A é 
caracterizada como uma sequência de adeninas, que são adicionadas ao último nucleotídeo do 
RNA, ambas as estruturas apresentam funções auxiliares ao transporte citoplasmático e 
proteção da molécula de RNA. 
Um terceiro processo é necessário para a conclusão do processo maturativo, o splicing de 
RNA. Essa etapa é mediada pela ação de proteínas chamadas spliceossomos, que possuem a 
função de retirar os íntrons da sequência de RNA, ou seja, apenas as sequências codificantes 
(éxons) permanecem na estrutura da molécula. Todas as etapas citadas são procedimentos que 
ocorrem após a transcrição do DNA e são susceptíveis a mecanismos de regulação, com o 
intuito de controlar a expressão gênica. 
Outra forma de regulação da expressão pós-transcricional é o uso de microRNAs (miRNAs), 
que são sequências de RNA reguladoras que também são transcritas no núcleo, através da 
atividade da RNA polimerase II, e sofrem um processo de maturação no citoplasma. Os 
transcritos primários dos miRNAs, chamados de pri-miRNAs, são formados basicamente por 
duas regiões, a “stem”, em que os dois segmentos de RNA possuem pareamento de bases e 
por isso formam uma estrutura linear, e a região “loop”, que por não apresentar pareamento 
forma alças circulares em sua estrutura. 
Durante o processo de maturação, a região circular é removida e a estrutura restante do RNA 
é incorporada a um complexo proteico, chamado de complexo silenciador induzido por RNA 
(RISC). Esse complexo atua na regulação da expressão gênica, o seu mecanismo de ação 
depende diretamente da compatibilidade entre as bases desse complexo com a molécula alvo 
(RNAm), podendo exercer dois tipos de atividades diferentes. 
Caso a complementariedade entre as moléculas seja perfeita, o complexo irá promover a 
degradação da molécula de RNAm, já nos casos em que a complementariedade é parcial, o 
complexo se liga a molécula de RNAm, mesmo que de forma incompleta, e impede que ela 
seja traduzida. Observe a figura 9, a qual esquematiza o processo de controle transcricional. 
 
Fonte: https://www.frontiersin.org/files/Articles/129023/fnmol-08-00004-HTML/image_m/fnmol-08-
00004-g001.jpg 
 
 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. 
Veja: 
- Transcription = transcrição. 
- RNA polymerase II = RNA polimerase II. 
- Cleavage = clivagem. 
- Export & cleavage = Exportação e clivagem. 
- mRNA degradation = degradação do mRNA. 
- Near-perfect complementation = não tem tradução, pode deixar em inglês e em itálico. 
- RISC complex = Complexo RISC. 
SINTETIZANDO 
Após a leitura do nosso material, você pôde perceber que a genética forense utiliza 
diversas técnicas para a elucidação dos crimes, podendo utilizar metodologias de 
identificação de cromossomos Y. Entretanto, a mais utilizada é a análise do STR, que 
se refere a regiões de repetição do DNA que podem ser transmitidas através da herança 
genética, ou seja, herdamos dos nossos pais de acordo com o alelo do gene transmitido. 
É importante lembrar que um alelo terá herança maternae o outro uma herança paterna 
e, por esse motivo, a análise genética tem um nível de confiança muito alto ao afirmar 
a paternidade ou maternidade de um indivíduo. 
Outro ponto que abordamos e discutimos foi sobre os aspectos transcricionais e 
regulatórios de um gene, sendo esse um processo importante e que qualquer alteração 
https://www.frontiersin.org/files/Articles/129023/fnmol-08-00004-HTML/image_m/fnmol-08-00004-g001.jpg
https://www.frontiersin.org/files/Articles/129023/fnmol-08-00004-HTML/image_m/fnmol-08-00004-g001.jpg
pode gerar proteínas anômalas que poderão desencadear um desequilíbrio na célula ou 
até mesmo uma patologia. 
Você pôde entender que, através do estudo desses aspectos genéticos, é possível 
verificar o nível de expressão de um gene e associar a gravidade de uma doença, seja 
ela adquirida ou uma doença genética sem cura. 
Para finalizarmos nossa discussão, peço que nunca se esqueça de que a genética e a 
biologia molecular são ciências que apresentam um desenvolvimento tecnológico 
muito rápido, por isso, é sempre importante ficar atento(a) às novas publicações 
científicas, pois elas representam o futuro dessa área. Lembre-se de nunca parar de 
buscar novos conhecimentos. 
Referências Bibliográficas 
ALBERTS, A. et al. Biologia molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. 
CARLTON, V. E. et al. Functional single nucleotide polymorphism-base association. Human 
Genomics, v. 2, n. 6, p. 391-402, jun. 2006. 
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HANNAH, A. Tandem repeats mediating genetic plasticity in health and disease. Nature Reviews 
Genetics, v. 19, n. 5, p. 286-298, maio 2018. doi:10.1038/nrg.2017.115 
JOBLING, M. A.; GILL, P. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Review Genetics, 
n. 5, p. 739-751, 2004. 
NATIONAL OF INSTITUTES OF HEALTH. What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)?. 
2018. Disponível em: <https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp>. 
NEW ENGLAND BIOLABS. Types of restriction endonucleases. 2018. Disponível em: 
<https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases/types-of-
restriction-endonucleases>. 
ROCHA, A. P. et al. Polimorfismos genéticos: Implicações na patogênese do carcinoma medular de 
tireoide. Arq. Bras. Endocrinal Metab, 51/5, 2007. 
SILVER, H. Probability of inclusion in paternity testing: a technical workshop. Washington, DC: 
AABB, 1982. THOMPSON, W. C. Genética médica. 6º Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 
2002 
STUMVOLL, V. P. (Org.). Criminalística. 6. ed. Campinas, SP: Millenium, 2014. 
THOMPSON, W. C et al. Chapter 11: DNA in the courtroom. Psychological and scientific evidence 
in criminal trials. West Group, 2003. Disponível em: http://bioforensics.com/articles/Chapter11.pdf. 
VERDIN, E.; OTT, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to 
epigenetics,metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 16, p. 258-264, 
2015. Disponível em: <https://www.nature.com/articles/nrm3931#f4> 
http://bioforensics.com/articles/Chapter11.pdf
Unidade 4 
1. Introdução 
Olá, estudante! Tudo bem? 
Aqui, discutiremos os aspectos associados a técnicas moleculares de última geração, bem 
como sua aplicação no diagnóstico, no acompanhamento e no tratamento de doenças. 
Ao final, conversaremos sobre os aspectos da edição gênica, discutindo sobre como se 
desenvolve essa técnica e como é possível realizá-la. Vale ressaltar que todo o conteúdo 
desenvolvido aqui se apoiará no aprendizado anterior. 
Está curioso(a) para aprender qual a ferramenta mais eficaz para o diagnóstico molecular de 
câncer? 
Como podemos verificar os aspectos genéticos no metabolismo de fármacos? Ou como 
fazemos edição gênica? 
Juntos, vamos construir novos conhecimentos!!! 
OBJETIVOS DA UNIDADE 
• Compreender os aspectos técnicos dos microarranjos; 
• Discutir a aplicabilidade dos microarranjos; 
• Discutir sobre a aplicabilidade das técnicas moleculares no diagnóstico das doenças 
infecciosas; 
• Estudar sobre o CRISPR/Cas9, bem como, sua aplicação na edição dos genomas. 
Vamos em frente! 
2. Microarranjo 
Projeto Genoma Humano 
Diante do que foi estudado até aqui, você já deve saber que o genoma é o conjunto de 
moléculas de DNA pertencentes a uma determinada espécie e que o DNA tem sua estrutura 
formada por moléculas ligadas sequencialmente, chamadas de nucleotídeos. 
Os nucleotídeos, por sua vez, são moléculas constituídas basicamente por três componentes, 
um açúcar com cinco carbonos, que, por isso, é chamado de pentose, um grupo fosfato e uma 
base nitrogenada, esta pode ser de quatro tipos diferentes: adenina (A), timina (T), citosina 
(C) e guanina (G). Assim, como a pentose e o grupo fosfato são os mesmos em todos os 
nucleotídeos, o que diferencia uma região do DNA de outra é a ordem sequencial das bases 
nitrogenadas. 
Mas o que você conhece do Projeto Genoma Humano (PGH)? 
Este projeto se tratou de uma ação integrada entre vários grupos de pesquisas de diferentes 
países que durou 13 anos e possuiu o objetivo de sequenciar todas as 3,1 bilhões de bases 
nitrogenadas presentes no genoma humano. Ao final da pesquisa, o resultado obtido foi um 
conjunto de dados e informações, formados a partir do sequenciamento de um genoma geral, 
composto pelo genoma de doadores anônimos, pertencentes a diferentes grupos étnicos 
(Figura 1). Atualmente, qualquer pesquisador, em qualquer laboratório do mundo, pode 
acessar esses bancos de dados e utilizá-los como base para o desenvolvimento de diferentes 
estudos genéticos. 
Antes da conclusão do Projeto Genoma Humano, uma das principais técnicas utilizada era a 
criação de mapas genômicos, que buscavam representar graficamente a distância entre os 
genes e quais as respectivas posições deles em um cromossomo específico. Vale dizer que, 
quando utilizamos o termo “mapa genômico”, estamos nos referindo à análise de um genoma 
como um todo, ao invés de restringir a nossa análise a um gene específico, como é feito nas 
técnicas estudadas anteriormente. 
 
Fonte: https://br.freepik.com/vetores-premium/visualizacao-de-analise-genomica-sequenciacao-de-
genomas-de-dna-mapa-genetico-do-acido-desoxirribonucleico-e-analise-da-sequencia-do-
genoma_6286723.htm 
Um dos principais avanços proporcionados pelos produtos obtidos do Projeto Genoma 
Humano foi a possibilidade de melhorias dos estudos da genômica funcional, uma área 
destinada a estudar as interações entre o genoma e os possíveis fenótipos formados, a fim de 
avaliar a influência do genoma nas características e funções biológicas do organismo. É 
importante relembrar, ainda, que o termo fenótipo é adotado para se referir às características 
que podem ser observadas em um indivíduo, geradas a partir de interações genéticas. 
Microarranjos de DNA 
Dentre as principais técnicas voltadas à análise funcional de diferentes padrões genéticos, 
destaca-se o método do microarranjo (em inglês, microarray). 
Os microarranjos são considerados um conjunto de técnicas aplicadas na área de biologia 
molecular que proporcionam a análise de polimorfismos e expressão de transcritos de um 
genoma específico, por meio da construção de um chip de DNA. 
https://br.freepik.com/vetores-premium/visualizacao-de-analise-genomica-sequenciacao-de-genomas-de-dna-mapa-genetico-do-acido-desoxirribonucleico-e-analise-da-sequencia-do-genoma_6286723.htm
https://br.freepik.com/vetores-premium/visualizacao-de-analise-genomica-sequenciacao-de-genomas-de-dna-mapa-genetico-do-acido-desoxirribonucleico-e-analise-da-sequencia-do-genoma_6286723.htm
https://br.freepik.com/vetores-premium/visualizacao-de-analise-genomica-sequenciacao-de-genomas-de-dna-mapa-genetico-do-acido-desoxirribonucleico-e-analise-da-sequencia-do-genoma_6286723.htm
Um chip de DNA consiste em um arranjo de moléculas de DNA que são impressos em umalâmina de vidro (empregadas para a leitura microscópica), de forma que comportem uma certa 
densidade de moléculas por centímetro quadrado. Essa visualização é feita a partir de uma 
análise integrada da microscopia com sistemas computadorizados, capazes de converter as 
imagens em algoritmos de computação gráfica (Figura 2). 
 
Fonte: https://www.istockphoto.com/br/fotos/gene-chip 
O primeiro passo para a criação de uma lâmina de microarranjo se trata de selecionar quais 
são as células de interesse analítico que serão utilizadas na técnica. Essa escolha depende de 
qual patologia será estudada e sempre acompanha a lógica de eleger o mesmo tipo de célula. 
Em estados patológicos diferentes, por exemplo, caso o interesse seja avaliar o perfil genético 
de uma célula tumoral hepática, além dela, uma célula hepática normal também deve ser 
utilizada como amostra de referência, com o intuito de comparação. Assim, as diferenças 
apresentadas entre as células alteradas e as células normais permitem elucidar os mecanismos 
de desenvolvimento e evolução da doença. 
Após a escolha das células que serão adotadas, elas são submetidas a uma etapa de cultura 
celular, para posterior obtenção de seu RNAm e, consequentemente, de uma molécula de 
DNA, a partir de um processo de transcriptase reversa. As moléculas de DNA formadas, nesse 
cenário, precisam ser identificadas isoladamente, e essa identificação é feita com a 
incorporação de substâncias capazes de emitir fluorescência, chamadas, por isso, de 
fluoróforos. 
Os dois fluoróforos mais manipulados nas técnicas de microarranjo são as cianinas 5 e 3, que 
emitem fluorescências nas cores vermelho e verde, respectivamente. Nesse caso, um tipo de 
fluoróforo é incorporado no DNA obtido das células normais, enquanto o outro é incorporado 
no DNA das células alteradas, sendo possível diferenciá-las ao final da reação. 
Além disso, cada ponto da lâmina de microarranjo possui múltiplas cópias de um DNA, que 
passam a ser chamadas de sondas e que devem apresentar complementariedade estrutural ao 
DNA de interesse analítico. Em geral, as sondas mais utilizadas nas lâminas de microarranjos 
são as de oligonucleotídeos, que são pequenas sequências sintetizadas de modo químico. 
https://www.istockphoto.com/br/fotos/gene-chip
Quando o processo de incorporação dos fluoróforos é concluído, os dois DNAs são misturados 
e inseridos nos microarranjos de DNA, que podem apresentar em sua estrutura os 
oligonucleotídeos complementares ou cDNA. 
É interessante saber, nesse processo, que o princípio de ação da técnica se baseia na avaliação 
da similaridade que os dois tipos de DNAs vão apresentar em relação à capacidade de ligação 
ao cDNA presentes previamente nas lâminas de microarranjos, caracterizando o processo de 
hibridização das amostras. 
Em suma, cada ponto da lâmina em que houve uma ligação entre a sonda e o DNA de interesse 
emite um sinal de fluorescência, que é diretamente proporcional ao número de moléculas 
hibridizadas. 
Ou seja, após a digitalização da lâmina, é possível observar a proporção da expressão gênica 
que foi identificada em ambas as amostras (normal e alterada), por meio da relação de 
hibridação apresentadas entre elas, o que permite observar a diferença entre as expressões 
gênicas das células alteradas e das normais. (Figura 3). 
OBSERVAÇÃO: 
Uma das principais desvantagens do método é a baixa precisão e a baixa especificidade do 
teste, devido ao uso de sondas curtas, fazendo com que uma análise de expressão gênica, feita 
da melhor forma possível, utilize diferentes lâminas de microarranjos, com diferentes padrões 
de sonda, o que aumenta o custo-benefício do teste. 
 
Fonte: https://www.fetalmed.net/o-uso-do-microarranjo-de-dna-em-medicina-fetal/ 
A partir da comparação dos perfis genéticos das células alteradas e normais, é possível aplicar 
a técnica ao estudo de doenças cancerígenas, ao avaliar quais são os padrões genéticos 
associados à progressão do tumor, quais são as características que influenciam o 
estabelecimento de um quadro metastático, bem como ao avaliar se existe influência genética 
relacionada à resistência de um paciente a um certo tipo de tratamento medicamentoso etc. 
O estudo da resposta de pacientes ao tratamento medicamentoso de certas doenças, baseando-
se na variabilidade genética em diferentes indivíduos, é conhecido como farmacogenômica. 
https://www.fetalmed.net/o-uso-do-microarranjo-de-dna-em-medicina-fetal/
Assim, foi o uso de microarranjos nesse ramo da medicina que permitiu traçar a melhor 
conduta terapêutica para determinados pacientes, ao examinar se eles podem apresentar 
alterações genéticas que interfiram no metabolismo ou no transporte de um fármaco 
específico. 
Nesse estudo, também se consegue acompanhar possíveis efeitos adversos causados por uma 
ação medicamentosa, de forma que a conduta terapêutica possa ser modificada ou 
personalizada, conforme a necessidade do paciente. Um grupo de pacientes diferentes pode 
apresentar a mesma patologia, mas também ter diferentes respostas frente a um mesmo 
tratamento. Por isso, o objetivo da farmacogenômica é identificar os fatores genéticos 
responsáveis pela variedade de possíveis reações entre os pacientes do grupo e modificar o 
tratamento a fim de beneficiar todos os integrantes da mesma forma. 
Normalmente, o que se pretende avaliar em relação a uma conduta terapêutica é tanto a 
presença de resistência a um tratamento quanto a susceptibilidade a eventos de toxicidade 
relacionados a um fármaco, como também ambas as situações associadas ou não a um 
prognóstico responsivo ao tratamento. Dessa maneira, pode-se examinar se os benefícios de 
um determinado tratamento compensam possíveis efeitos adversos que ele pode causar. 
 
Fonte: https://conectgene.com/como-funciona/farmacogenetica/ 
3. GeneXpert 
Você já ouviu falar em GeneXpert? 
Aqui, vamos dar atenção a esse tipo de teste de diagnóstico, mas, antes, queremos situar você 
em outra discussão… 
Conhecida popularmente como “peste branca”, a tuberculose é uma doença infectocontagiosa, 
causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, e é considerada pela Organização Mundial 
da Saúde (OMS) uma doença de emergência mundial, desde a década de 90. 
Atualmente, a grande preocupação com a criação de programas de controle e prevenção a essa 
doença está relacionada principalmente com sua associação direta com pacientes portadores 
do vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), que, por manifestarem um quadro de redução 
da atividade imunológica, apresentam maior susceptibilidade ao desenvolvimento das formas 
graves de tuberculose, em especial a forma pulmonar. 
https://conectgene.com/como-funciona/farmacogenetica/
Dentro desse contexto, a maioria dos laboratórios adota um fluxo de diagnóstico para a 
tuberculose que envolve basicamente duas metodologias: a baciloscopia e a cultura 
bacteriana. 
1. A baciloscopia se baseia na confecção de uma lâmina de escarro, que é corada a partir 
do método de Ziehl-Neelsen, específico para a identificação de bacilos álcool-ácidos 
resistentes, para posterior leitura e contabilização das formas bacilares. 
2. A cultura bacteriana, como o próprio nome sugere, se baseia no semeio da amostra 
do paciente em um meio de cultura específico, que favorece o crescimento das 
bactérias. 
Ambos os métodos apresentam desvantagens relacionadas ao diagnóstico da tuberculose, a 
baciloscopia, por exemplo, apresenta baixa sensibilidade, que é agravada por se tratar de uma 
técnica manual, já que os resultados podem apresentar-se divergentes dependendo de quem 
execute e interprete os resultados obtidos. 
Apesar de hoje em dia ser considerada o padrão ouro para o diagnóstico da tuberculose, a 
cultura de células bacterianas apresenta como principal desvantagem a demora na obtenção 
dos resultados, por depender do crescimento efetivo das bactérias e pelo fato de issoacontecer 
de maneira lenta com as bactérias Mycobacterium tuberculosis. 
Outro problema crescente, ligado à transmissão da tuberculose, é a presença de bacilos 
resistentes ao tratamento, que podem ser classificados em: 
1. Monorresistentes, quando apresentam resistência a apenas um dos fármacos utilizados no 
esquema terapêutico da tuberculose. 
2. Polirresistentes, quando apresentam resistência a dois ou mais fármacos, mas não 
apresentam resistência à associação rifampicina e isoniazida. 
3. Multirresistentes, quando apresentam resistência à associação rifampicina e isoniazida, 
sendo os fármacos correspondentes ao principal esquema terapêutico utilizado atualmente. 
4. Os que possuem resistência extensiva, quando possuem resistência à associação 
rifampicina e isoniazida e a outros fármacos que poderiam ser utilizados como tratamentos 
relacionados. 
A existência de bactérias multirresistentes é considerada um problema de saúde pública 
devido à baixa quantidade de fármacos disponíveis para o tratamento, de forma que a 
resistência ao seu uso pode levar ao desenvolvimento de uma infecção potencialmente não 
tratável. 
Após uma rápida introdução ao cenário atual do diagnóstico e do tratamento da tuberculose, 
utilizados no Brasil, vamos entender quais são as metodologias da biologia molecular que 
foram inseridas no fluxograma ao longo dos anos e qual é a importância diagnóstica e 
prognóstica dela para os pacientes contaminados. 
DEFINIÇÃO 
O GeneXpert MTB/RIF é um teste rápido molecular implementado no fluxo diagnóstico da 
tuberculose e apresenta como metodologia a PCR multiplex, nested e em tempo real. 
Esse teste foi projetado com o intuito de reduzir ao máximo a exposição do operador do 
equipamento a riscos biológicos e o fácil manuseio do equipamento, que garante que os 
operadores não precisem possuir especializações e experiência na área de biologia molecular 
(Figura 5). 
O método se baseia no uso de cartuchos descartáveis para a realização dos testes, e é 
justamente nos cartuchos que a única etapa manual do procedimento é realizada. Ela consiste 
na mistura da amostra de escarro em um tampão de tratamento, para que posteriormente essa 
mistura seja adicionada ao cartucho. A partir da inserção do cartucho no equipamento, todas 
as etapas subsequentes são realizadas de forma automatizada. 
 
Fonte: https://www.jsi.com/effective-use-of-genexpert-machine-at-apac-hospital-in-uganda-improves-
identification-of-tb-cases/ 
Os cartuchos são compostos por câmaras que armazenam os reagentes (incluindo os reagentes 
liofilizados da PCR) e a amostra, câmaras essas que são válvulas rotativas que controlam a 
movimentação dos líquidos no interior do cartucho, conforme a necessidade do equipamento, 
e as áreas onde acontecem a captação da amostra, as etapas de lavagem e lise celular. 
Nesse procedimento, em primeiro lugar, o equipamento promove a captura dos possíveis 
bacilos da amostra, a partir do uso de uma membrana de filtro, que deve ser imediatamente 
lavada com tampão, para eliminar outros componentes capturados pela membrana, restando 
apenas as bactérias. 
Após essa captura, o equipamento submete a membrana à ação de uma energia ultrassônica, 
que promove a lise das bactérias e a liberação do material genético contido em seu interior. 
Desse modo, o DNA obtido é eluido e misturado com os reagentes da Reação em Cadeia da 
Polimerase (PCR). 
O método GeneXpert MTB/RIF é caracterizado como uma PCR multiplex, por identificar a 
presença dos bacilos da tuberculose, a partir da utilização de primers específicos para a 
amplificação da sequência do gene rpoB, presente na região 81pb, ao mesmo tempo que utiliza 
outro tipo de primer, que identifica a presença de mutações relacionadas à resistência ao 
fármaco rifampicina nos bacilos da amostra. 
Esse método, em resumo, garante o diagnóstico de tuberculose, ao mesmo tempo que indica 
se o microrganismo é ou não caracterizado como multirresistente aos tratamentos disponíveis. 
Ou seja, além da metodologia multiplex, o GeneXpert também realiza a nested PCR, que, 
como já vimos, trata-se de um procedimento que realiza uma PCR em um produto de uma 
PCR primária, que, no caso do GeneXpert, é feita para aumentar a sensibilidade do ensaio. 
https://www.jsi.com/effective-use-of-genexpert-machine-at-apac-hospital-in-uganda-improves-identification-of-tb-cases/
https://www.jsi.com/effective-use-of-genexpert-machine-at-apac-hospital-in-uganda-improves-identification-of-tb-cases/
Você sabia que a Organização Mundial da Saúde (OMS) adotou o uso do GeneXpert em países 
de alta carga de tuberculose? Pois é, e isso inclui o Brasil! 
Essa metodologia é considerada como um potencial para a melhoria no diagnóstico e no 
auxílio ao tratamento da tuberculose, e a sua implantação já apresentou melhoras relacionadas 
à diminuição da incidência de casos de tuberculose no país. Isso, porque: a detecção precoce 
dos casos permite que o tratamento seja iniciado mais rapidamente, o que, por efeito, reduz a 
transmissibilidade da doença. 
4. Aplicação da Biologia Molecular no 
Diagnóstico das Doenças Infecciosas 
Sabe-se que com o desenvolvimento das tecnologias do DNA, a partir da década de 1950, 
fomos capazes de sequenciar praticamente todos os organismos patogênicos. O 
reconhecimento do genoma desses microrganismos se mostrou muito importante para uma 
série de aplicações, mas uma das mais bem descritas e adotadas hoje em dia é a identificação 
ou o diagnóstico desses agentes em amostras biológicas. 
Afinal, ao se conhecer a sequência de DNA característica de um determinado patógeno, é 
possível identificá-lo por meio de sondas específicas que podem revelar o seu genoma em 
qualquer amostra biológica. 
Um dos fatores fundamentais para o desenvolvimento desse método de diagnóstico molecular 
foi, por sua vez, o desenvolvimento das técnicas moleculares, em especial a PCR. 
PCR 
A PCR, desenvolvida na década de 1980, tornou os métodos tradicionais de diagnóstico, de 
certa forma, obsoletos, devido ao seu alto grau de especificidade e sensibilidade, até em 
amostras onde não se encontra microrganismos viáveis. 
Atualmente, ela é a técnica padrão ouro para a identificação de agentes infecciosos, muito 
disso se dá por ela deter propriedades de sintetizar regiões especificas de DNA em reações em 
cadeia, com ciclos de diferentes temperaturas. 
Como em cada ciclo o número de fragmentos é dobrado, são gerados ao final de alguns ciclos, 
milhares de fragmentos de DNA idênticos ao original. Assim sendo, a possibilidade de 
amplificar uma sequência específica de DNA de forma rápida e com o custo relativamente 
menor, aliada ao conhecimento sobre os genomas de uma variedade de agente infecciosos, faz 
com que essa tecnologia seja cada vez mais aplicável na área diagnóstica. 
A identificação de agente infeccioso ou seu diagnóstico molecular envolve fundamentalmente 
a quantificação de sua presença e a tipificação ou genotipagem de variantes presentes. Por 
isso, é por meio dessas bases que conseguimos identificar qualquer tipo de microrganismo, 
vírus, bactérias, protozoários ou fungos em uma diversidade de amostras como plantas, 
animais e humanos. 
Mas, um dos critérios para empreender tal ação é que se conheça total ou parcialmente a 
sequência de nucleotídeos do agente que se procura identificar, com a finalidade de desenhar 
os primers que funcionam como sondas que complementam uma sequência de DNA 
específica daquele patógeno. Desse modo, é feita a coleta do material biológico do indivíduo, 
da planta ou do animal e é realizado o processo de extração do DNA, entendeu? 
HIS e FISH 
Até aqui, observa-se que PCR é a principal metodologia de diagnóstico molecular empregada 
para a identificação de microrganismos infecciosos, entretanto, outras metodologias podem 
apresentar sensibilidade e especificidade suficientes para ter aplicabilidade diagnóstica, comoé o caso da hibridização in situ (HIS) e sua principal variação, a hibridização fluorescente 
in situ (FISH). 
Como as provas sorológicas não são capazes de diferenciar os anticorpos que são produzidos 
em resposta a infecções daqueles que foram produzidos por indução vacinal, e a PCR não 
consegue fornecer informações suficientes acerca da distribuição tecidual do microrganismo, 
nem da sua correlação direta com a lesão, a técnica FISH pode ser utilizada para elucidar essas 
questões (Figura 6). 
DEFINIÇÃO 
O FISH se trata de um método histoquímico, que permite a visualização direta dos 
microrganismos em cortes teciduais, garantindo simultaneamente a sua identificação e 
localização. O princípio básico da técnica é a interação de complementariedade entre uma 
sonda sintetizada e marcada com substâncias fluorescentes e a sequência molecular do alvo. 
 
Fonte : https://www.scielo.br/j/aib/a/rQfs49x8J3zb8NK5M67sbFb/?format=pdf&lang=pt 
https://www.scielo.br/j/aib/a/rQfs49x8J3zb8NK5M67sbFb/?format=pdf&lang=pt
Etapa 1 – Preparação da amostra 
Envolve a sua fixação em uma lâmina de miscroscopia, essa etapa é necessária para proteger 
o material genético da amostra, da ação de enzimas endógenas que possam estar presentes. 
Etapa 2 – Hibridização 
Após a fixação da amostra é iniciada a etapa de hibridização, que é caracterizada pela 
formação de um híbrido entre a sequência molecular alvo e uma sonda que pode ser de DNA 
ou RNA complementar. 
Etapa 3 – Lavagem 
Todas as sondas utilizadas na técnica estão associadas a substâncias fluorescentes, por isso, a 
etapa de lavagem é crucial para remover o excesso de sondas não ligadas, pois, caso elas 
permaneçam na reação, causará interferência no momento da leitura. 
Etapa 4 – Leitura de fluorescência 
Após o término da confecção da lâmina de FISH, a mesma deverá ser lida em um microscópio 
específico para leitura de fluorescência, onde será possível observar o comportamento do 
microrganismo responsável pela infecção. 
Outras técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico de doenças infecciosas, porém, com 
menor frequência, como as técnicas de Southern blot, Northern blot e Western blot. 
Southern blot 
A técnica de Southern blot utiliza uma eletroforese em gel de agarose, para identificar se uma 
determinada sequência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA. Após a 
realização da eletroforese, o gel em que ela foi feita deve ser tratado com uma solução salina, 
para promover a desnaturação do DNA que foi separado. 
Essa desnaturação é necessária para a próxima etapa, que consiste na transferência do material 
genético para uma membrana de nitrocelulose, que é colocada sobre o gel de agarose e 
aplicada uma leve pressão, garantindo que todo o material genético seja transferido para sua 
estrutura. 
É importante dizer também que, assim como na técnica FISH, a membrana também é tratada 
com sondas associadas a substâncias relevadoras, que também podem ser fluorescentes ou 
cromógenas, essas sondas são complementares ao material genético do microrganismo 
infeccioso que se tem interesse diagnóstico. 
E a etapa de lavagem, nesse caso, garante que as sondas não ligadas interfiram na interpretação 
dos resultados, que podem ser visualizados por alteração de cor, quando a associação da sonda 
é feita com uma substância cromógena ou por autoradiografia, na ocasião em que se trata de 
substâncias fluorescentes. 
Northen blot 
O método de Northern blot é tecnicamente muito semelhante ao Sourthern blot, entretando, o 
seu objetivo é identificar se um determinado gene é ou não transcrito por uma molécula de 
RNA, para posteriormente quantificá-la, e, por isso, a sonda utilizada no teste é de RNA. 
Western blot 
Por um lado, diferentemente das duas primeiras técnicas mostradas, que se baseiam na 
identificação de materiais genéticos, o Western blot possui o objetivo de identificar proteínas, 
por isso é bastante aplicado no diagnóstico de infeccções virais. 
A técnica se inicia com a extração das proteínas da amostra, para que elas possam ser 
submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, onde são separadas essencialmente 
pelo seu peso molecular. Por outro lado, assim como as outras técnicas, o produto final da 
eletroforese da Western blot também é transferido para uma membrana de nitrocelulose, que 
possui alta afinidade por proteínas (Figura 7). 
A revelação dos resultados é feita a partir da aplicação de dois anticorpos, no qual o primeiro 
anticorpo adicionado é específico para o antígeno proteico de interesse. Após a ligação do 
primeiro anticorpo, um segundo tipo de anticorpo é adicionado, que apresenta especificidade 
ao primeiro anticorpo e está conjugado a uma substância cromógena ou fluorescente, 
responsável pela visualização dos resultados, caso a proteína do microrganismo esteja 
presente na amostra. 
 
Fonte: http://edusanjalbiochemist.blogspot.com/2013/06/blotting-techniques.html 
 
Caro(a) aluno(a), convido você a conhecer os termos presentes na imagem acima. Veja: 
• Protein = proteína. 
• Gel electrophoresis = eletroforese em gel. 
• Transfer to paper = transferência para o papel. 
 • Antibody = anticorpo. 
 • Add probe = adição da sonda. 
 • Autoradiograph = autorradiografia. 
http://edusanjalbiochemist.blogspot.com/2013/06/blotting-techniques.html
5. CRISPR/Cas9 
Com o avanço da tecnologia, principalmente a associada à engenharia genética, diversos 
cientistas buscam correções diretas no gene, para, então, promover a cura ou um tratamento 
eficaz para as doenças genéticas. Uma das técnicas mais estudas da atualidade é o CRISP/Cas-
9. 
Vamos entender como funciona? 
O Conjunto de Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Espaçadas (CRISPR) é uma 
das principais técnicas de edição gênica utilizada atualmente e possui como aplicabilidade 
central o melhoramento genético de espécies de plantas, com o objetivo de melhorar a sua 
sobrevivência frente às adversidades e garantir o máximo aproveitamento de atividades 
agrícolas. 
Como o próprio nome sugere, a estrutura do CRISPR no genoma bacteriano é formada por 
repetições palindrômicas curtas, agrupadas e espaçadas de maneira regular, que quando são 
transcritas, formam um RNA guia, que atua no direcionamento de uma enzima nuclease 
chamada Cas9 a uma sequência-alvo, que normalmente é o material genético de um vírus 
invasor. 
Durante as pesquisas envolvendo o sistema CRISPR/Cas9, descobriu-se que ele atua como 
um sistema de defesa, que naturalmente “memoriza” o padrão genético do organismo invasor, 
em uma primeira infecção, na qual o bacteriófago consegue invadir a célula, mas não a 
destrói. 
Assim, durante a primeira infecção, parte do material genético do bacteriófago é inserido no 
genoma bacteriano, sendo intercalado entre as sequências de repetições, de forma que, durante 
uma nova infecção causada por um invasor que possua sequências iguais às que foram 
intercaladas inicialmente, o RNA guia será produzido por conduzir diretamente a enzima 
Cas9, promovendo a clivagem (Figura 8). 
 
Fonte: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2020/02/edicao-de-genoma-usando-crispr-cas9.html 
Diante de uma nova infecção as bactérias produzem diversas enzimas, e dentre elas, a mais 
conhecida e estudada é a Cas9. Essa enzima possui dois domínios de nuclease, que são 
responsáveis por clivar a sequência de DNA que foi reconhecida pelo sistema CRISPR. Antes 
de discutir as aplicabilidades da técnica, é preciso entender os seus mecanismos de ação 
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2020/02/edicao-de-genoma-usando-crispr-cas9.html
naturais, ou seja, como o sistema CRISPR/Cas9 das bactérias atua diante de uma infecção por 
bacteriófagos.[TB1] 
Já durante a transcrição do DNA bacteriano, a região CRISPR (que já tem fragmentos do 
material genético viral introduzidos em sua estrutura) produz um RNAm complementar à 
sequência-alvo presente nogenoma do vírus. Esse RNAm sofre a ação de moléculas chamadas 
tracRNA ou trans ativador RNA, responsáveis por clivar a molécula de RNAm, gerando um 
fragmento chamado crRNA ou CRISPR RNA (Figura 9). Esse complexo tracRNA/crRNA é 
responsável por se associar as enzimas Cas9 e direcioná-las à sequência-alvo do genoma viral, 
atuando como um RNA guia (sgRNA). 
 
Fonte: https://www.scielo.br/j/abc/a/S7rhCRLnYjVmCDfTrdSYTDs/?lang=pt# 
A sequência do sgRNA apresenta duas características estruturais principais, onde a sequência 
de nucleotídeos que compõe a extremidade 5’ da sequência corresponde à sequência de 
pareamento com a sequência do DNA alvo. Ou seja, apresentam compatibilidade de pares de 
base, enquanto a extremidade 3’ possui a estrutura necessária para se ligar a enzima Cas9. 
Além da estrutura relativamente simples, o reconhecimento de uma sequência de DNA 
também depende de que a sua localização seja adjacente a um PAM. 
Nesse contexto, Protospacer recognition motifs (PAM) são caracterizados como sequências 
“assinaturas” curtas (2 a 5 pares de base), que variam de acordo com o sistema e organismo 
baseado em CRISPR, e precisam ser reconhecidos pelo sgRNA. Mesmo que a sequência de 
sgRNA seja totalmente complementar à sequência do DNA alvo, caso ela não seja adjacente 
a um PAM, a sequência não é reconhecida pela enzima Cas9. Atualmente, existem três tipos 
de sistemas baseados em CRISPR (I, II e III), os dois primeiros atuam na clivagem de 
moléculas de DNA e o terceiro pode atuar tanto em moléculas de DNA quanto de RNA, mas 
as sequências PAM, vale ressaltar, desempenham papel essencial na adaptação de ligação e 
controle de interferentes em todos os três sistemas. 
Após o estudo do mecanismo de ação do sistema CRISPR/Cas9, utilizado pelas bactérias, foi 
pressuposto que esse sistema apresentava alto potencial de funcionabilidade, quando 
utilizados para manipulação genética. Como as células eucarióticas não apresentam todos os 
componentes necessários para a atuação do sistema CRISPR/Cas9, os pesquisadores precisam 
desenvolver um RNA guia (gRNA), voltado à sequência de DNA alvo de interesse, e inseri-
lo nas células juntamente com as enzimas Cas9, possibilitando a clivagem. 
Como as células apresentam mecanismos naturais de reparação de sequências clivadas, 
quando uma molécula de DNA é danificada pela ação das enzimas Cas9, uma série de eventos 
https://www.scielo.br/j/abc/a/S7rhCRLnYjVmCDfTrdSYTDs/?lang=pt
são iniciados com o objetivo de reparar os danos causados. Esses reparos podem acontecer de 
duas formas e são eles que definem a finalidade da edição genética promovida pelo sistema 
CRISPR/Cas9. 
Nos casos de reparações homólogas, a célula se utiliza de um molde de DNA para ligar as 
duas extremidades do DNA que foi clivado. Esse molde pode ser naturalmente originado na 
própria célula ou pode ser de origem exógena (doado), isto é, é possível induzir artificialmente 
qual molde de DNA será introduzido na estrutura molecular do DNA alvo e, dessa forma, 
introduzir uma nova mutação ao organismo, para que ele passe a desempenhar uma nova 
função específica. 
A outra forma de reparação é a não homóloga que, ao invés de utilizar um DNA molde doado, 
envolve apenas o princípio de ação do sistema CRISPR/Cas9, que cliva uma sequência 
específica do DNA alvo, e as extremidades remanescentes apresentam complementariedade 
entre si. Esse tipo de mecanismo é utilizado para realizar o knockout gênico (inativação), que 
permite a remoção de uma mutação indesejada (Figura 10). 
Como a técnica permite tanto a inserção, quanto a remoção de sequências de DNA, a sua 
aplicabilidade laboratorial está cada vez mais avançada. 
O uso do sistema CRISPR/Cas9 permite corrigir algumas mutações responsáveis por causar 
doenças genéticas, produzir antibióticos mais específicos ou melhorar o desempenho de 
alguns organismos, por meio da inserção de uma nova mutação, aumentando a resistências 
das plantas a alterações climáticas ou a susceptibilidade a pragas, por exemplo 
 
Fonte: https://profissaobiotec.com.br/sistema-crispr-cas-da-bacteria-a-terapia-genica/ 
SINTETIZANDO 
Aqui, abordamos, inicialmente, a técnica de microarranjos, que está associada com a detecção 
da expressão de um transcrito de RNA para verificar a atividade de determinadas células. 
https://profissaobiotec.com.br/sistema-crispr-cas-da-bacteria-a-terapia-genica/
Essa técnica possibilita a verificação de expressões aberrantes de proteínas e outros transcritos 
que permite associar a células tumorais, por exemplo. Com isso, é possível indicar, em 
diversos casos, a gravidade daquele tumor. 
Vale ressaltar, sobretudo, que essa técnica propicia justamente identificar diversos tipos de 
transcritos ao mesmo tempo e detectar níveis baixos, viabilizando um diagnóstico preciso e 
precoce. Outro aspecto importante da técnica é a aplicação para direcionamento terapêutico, 
principalmente para determinadas doenças, o que permite um tratamento mais direcionado e 
com menos toxicidade. 
Ao longo deste material, discutimos outros aspectos, como o diagnóstico das doenças 
infecciosas, diversas técnicas já foram abordadas, mas destacamos a importância do 
Genexpert, que, na realidade, engloba diversas outras técnicas, proporcionando um 
diagnóstico sensível, específico e um teste de resistência medicamentosa. 
Além disso, uma nova metodologia, muitos estudada na última década e que possibilita a 
edição do genoma humano, foi um dos focos da nossa discussão, estamos falando do CRISP-
cas9. Esta técnica permite a edição de uma parte do DNA, utilizando enzimas específicas e 
um RNA guia, promovendo a retirada de uma parte do DNA mutado e a inserção de uma nova 
sequência sem aquela mutação. 
Sobre o estudo dessa técnica, vale lembrar que rendeu o Nobel de Química para a francesa 
Emmanuelle Charpentier e para a norte-americana Jennifer Doudna, ambas dedicaram suas 
vidas para estudar os aspectos que permitiram o desenvolvimento dessa técnica. 
Finalizamos aqui a nossa discussão! 
Espero que esse conteúdo auxilie você na sua formação profissional e não perca de vista que 
a biologia molecular é uma área em constante mudança e precisa de estudos e atualizações 
frequentes. 
Espero encontrá-los(as) em breve!! 
Referências Bibliográficas 
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de edição genômica para a cardiologia. Arq. Bras. Cardiol, v. 108, n.1, p. 81-83, 2017. Disponível 
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