Protocolos - Micro e Macrofungos pdf versão 1

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PROTOCOLOS DE COLETAS, ANÁLISES, 
IDENTIFICAÇÃO E ARMAZENAMENTO DE 
FUNGOS AMBIENTAIS 
 
 
 
 
Prof. Dr. Jorge Luiz Fortuna 
Docente Adjunto com Dedicação Exclusiva da área de Microbiologia do curso de 
Ciências Biológicas do Campus X da Universidade do Estado da Bahia (UNEB). 
Responsável pelos Laboratórios de Microbiologia e de Biologia dos Fungos. 
E-mail: jfortuna@uneb.br 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fungus Extremus 
Teixeira de Freitas-BA 
2020
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para citar esta apostila: 
 
FORTUNA, J. L. Protocolos de Coletas, Análises, Identificação e Armazenamento de Fungos 
Ambientais. Teixeira de Freitas: Projeto Fungus Extremus, UNEB, Campus X. 2020, 37 p. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fortuna, Jorge Luiz 
 
Protocolos de Coletas, Análises, Identificação e Armazenamento de Fungos 
Ambientais / Jorge Luiz Fortuna – Teixeira de Freitas-BA, 2020. 
37 p. : il. 
 
Organizador: Jorge Luiz Fortuna. 
Apostila (Ciências Biológicas) – Universidade do Estado da Bahia, 
Departamento de Educação – Campus X, 2020. 
 
1. Biologia. 2. Fungos. 3. Micologia. 4. Protocolos. 5. Apostila. I. Fortuna, Jorge 
Luiz. II. Título. 
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Projeto Fungus Extremus – UNEB – Campus X – Ciências Biológicas – Prof. Dr. Jorge Luiz Fortuna 
 
SUMÁRIO 
 
1. CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS, p. 4 
INTRODUÇÃO, p. 4 
NOMENCLATURA, p. 4 
CLASSIFICAÇÃO, p. 5 
2. COLETA DE ESPÉCIMES EM CAMPO, p. 7 
INTRODUÇÃO, p. 7 
EQUIPAMENTOS PARA A COLETA, p. 7 
3. MACROFUNGOS, p. 9 
APRESENTAÇÃO, p. 9 
4. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS, p. 10 
ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS, p. 10 
5. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MACROFUNGOS, p. 11 
PROCEDIMENTOS EM CAMPO, p. 11 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES 
LABORATORIAIS, p. 11 
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO, p. 12 
6. MICROFUNGOS, p. 14 
APRESENTAÇÃO, p. 14 
FUNGOS INGOLDIANOS, p. 14 
FUNGOS AERO-AQUÁTICOS, p. 15 
FUNGOS AQUÁTICO-TERRESTRES, p. 15 
FUNGOS AQUÁTICO-FACULTATIVOS, p. 15 
7. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MICROFUNGOS, p. 16 
APRESENTAÇÃO, p. 16 
TIPOS DE COLORAÇÃO MICROSCÓPICA, p. 16 
ESTRUTURAS DO MICÉLIO, p. 16 
TIPOS DE CONIDIÓFOROS, p. 17 
CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO CRESCIMENTO, p. 17 
CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO EIXO, p. 17 
CLASSIFICAÇÃO DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA, p. 17 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ONTOGENIA DOS CONÍDIOS, p. 18 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A PROLIFERAÇÃO DOS CONÍDIOS, p. 18 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ABERTURA DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA, p. 18 
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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A LIBERAÇÃO (SENESCÊNCIA) DOS CONÍDIOS, p. 19 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SEQUÊNCIA DE PRODUÇÃO DOS CONÍDIOS, p. 19 
8. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MICROFUNGOS, p. 20 
PROCEDIMENTOS EM CAMPO, p. 20 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES 
LABORATORIAIS, p. 20 
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO, p. 21 
9. FUNGOS ENDOFÍTICOS E EPIFÍTICOS, p. 23 
APRESENTAÇÃO, p. 23 
PROCEDIMENTOS EM CAMPO, p. 23 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES 
LABORATORIAIS, p. 23 
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO, p. 24 
10. MICROCULTIVO, p. 26 
MONTAGEM DA CÂMARA ÚMIDA, p. 26 
PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA, p. 26 
MICROCULTIVO E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS, p. 26 
11. ARMAZENAMENTO DE ESPÉCIMES, p. 27 
SECAGEM EM ESTUFA, p. 27 
CAIXA COM ESPÉCIME SECA, p. 27 
MÉTODO CASTELLANI, p. 27 
TUBO COM ÓLEO MINERAL ESTERILIZADO, p. 27 
12. MEIOS DE CULTURA, p. 28 
ÁGAR BATATA DEXTROSE (ABD), p. 28 
ÁGAR CENOURA MILHO (ACM), p. 28 
13. RESINAS, CORANTES E REAGENTES, p. 29 
RESINA PVLG (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + GLICERINA), p. 29 
RESINA PVL (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + FENOL), p. 29 
AZUL DE ALGODÃO, p. 30 
LACTOFENOL DE AMANN, p. 30 
AZUL DE METILENO, p. 31 
VERMELHO CONGO A 1%, p. 31 
KOH (HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO) A 5%, p. 31 
FLOXINA B 1%, p. 31 
REAGENTE DE MELZER, p. 32 
14. REFERÊNCIAS USADAS E CONSULTADAS, p. 33 
 
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1. CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS 
 
INTRODUÇÃO 
Provavelmente os fungos atuais se originaram a partir de seres unicelulares denominados de 
nucleariidas (nucleariids), que são organismos ameboides heterotróficos com pseudópodos 
filamentosos. Estes seres fazem parte do clado Opisthokonta (Opisthokonts), onde são agrupados 
os organismos eucariontes que formam um clado estritamente monofilético que inclui os fungos 
e os animais. 
A partir do clado Opisthokonta são originados dois outros clados irmãos: o Holomycota, onde se 
encontram os fungos; e o Holozoa, onde se encontram os animais. 
Existem três tipos básicos de agrupar e classificar os seres vivos: 
a) Monofilético: formado por grupos naturais que incluem o ancestral comum mais recente 
do grupo e todos os descendentes desse ancestral. 
b) Polifilético: formado por grupos que não incluem o ancestral comum de todos os 
indivíduos, agrupando táxons semelhantes que não foram herdados por um antepassado 
comum. 
c) Parafilético: formado por grupos que inclui o ancestral comum mais recente do grupo, 
mas não todos os descendentes desse ancestral. 
Nas últimas décadas do Séc. XX houve a divisão em subgrupos à medida que o conhecimento 
sobre a Biologia dos Fungos foi se aprofundando. Dividiu-se o reino em dois subgrupos não 
taxonômicos: Eumycetes (fungos sensu stricto), que apresentam uma organização tipicamente 
miceliana e uma parede celular contendo quitina; e Pseudomycetes (pseudofungos), que 
apresentam parede celular contendo celulose em vez de quitina. 
A partir do avanço da Biologia Molecular, a classificação atual dos fungos tende a ser 
monofilética, podendo ser dividida em três grupos principais: Zoospóricos, que são fungos que 
apresentam flagelos em alguma fase da vida; Zigospóricos, que são fungos que formam 
zigosporângios; e os Dicarióticos, que também são conhecidos como fungos superiores, cuja 
principal característica é possuir hifas dicarióticas que se apresentam com dois núcleos 
independentes. 
 
NOMENCLATURA 
As regras de nomenclatura para os fungos segue o Código Internacional de Nomenclatura. Com 
algumas exceções a nomenclatura dos táxons hierárquicos para os fungos segue o seguinte 
padrão: 
REINO Fungi 
SUB-REINO ...myceta 
FILO ...mycota 
SUB-FILO ...mycotina 
CLASSE ...mycetes 
ORDEM ...ales 
FAMÍLIA ...mycetidae 
 
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CLASSIFICAÇÃO 
Até o início do séc. XXI o reino Fungi era dividido basicamente em nove filos (Chytridiomycota; 
Neocallimastigomycota; Cryptomycota; Entomophthoromycota Blastocladiomycota; 
Zygomycota; Glomeromycota; Ascomycota e Basidiomycota), além de um grupo artificial (não 
taxonômico) de fungos que só se conhece a forma da sua reprodução assexuada. Este grupo é 
denominado de anamórfico ou mitospórico ou imperfeito ou conidial, podendo também ser 
conhecido como deuteromiceto (Deuteromycota). Este grupo não possui valor taxonômico, 
sendo seus membros relacionados aos filos Ascomycota e Basidiomycota assim que se conhece 
como ocorre sua reprodução sexuada (HIBBETT et al, 2007; MORAES et al, 2009; 
BLACKWELL, 2011; JONES et al, 2011; HUMBER, 2012). 
Desses nove filos somente são macrofungos os Eumycetes ou Dicarióticos que pertence aos filos 
Ascomycota e Basidiomycota, que são capazes de produzir estruturas facilmente visíveis. 
Marques (2012) determinou que os Pseudomycetes também podem formar esporóforos 
macroscópicos, apesar de pequenos, porém, os mesmos pertencem ao filo Myxomycota, que são 
estudados na área de Micologia, mas na realidade são bactérias. 
Apesar de esta classificação, descrita anteriormente, ser atual, três trabalhos recentes 
(TEDERSOO et al, 2018; WIJAYAWARDENE et al, 2018; NARANJO-ORTIZ; 
GABALDÓN, 2019) reorganizaram os grupos taxonômicos do reino Fungi a partir de estudos 
utilizando ferramentas de Biologia Molecular, agrupando-osde forma monofilética. 
De acordo com Tedersoo et al (2018) o reino Fungi pode ser subdividido em nove sub-reinos e 
18 filos descritos abaixo: 
GRUPO SUB-REINOS FILOS 
Zoospórico 
Aphelidiomyceta Aphelidiomycota 
Rozellomyceta Rozellomycota 
Chytridiomyceta 
Monoblepharomycota 
Crytridiomycota 
Neocallimastigomycota 
Blastocladiomyceta Blastocladiomycota 
Olpidiomyceta Olpidiomycota 
GRUPO SUB-REINOS FILOS 
Zigospórico 
Basidiobolomyceta Basidiobolomycota 
Zoopagomyceta 
Entomophthoromycota 
Kickxellomycota 
Zoopagomycota 
Mucoromyceta 
Mortierellomycota 
Calcarisporiellomycota 
Glomeromycota 
Mucoromycota 
GRUPO SUB-REINO FILOS 
Dicariótico Dikarya 
Entorrhizomycota 
Ascomycota 
Basidiomycota 
Ainda segundo Tedersoo et al (2018), o filo Ascomycota subdivide-se em três sub-filos 
(Taphrinomycotina; Saccharomycotina e Pezizomycotina), mesmo número de sub-filos do filo 
Basidiomycota (Pucciniomycotina; Ustilaginomycotina e Agaricomycotina). 
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Apesar desta atual classificação, em um recente trabalho de Naranjo-Ortiz e Gabaldón (2019), 
estes descreveram uma nova forma de classificar o reino Fungi. 
O novo formato proposto por Naranjo-Ortiz e Gabaldón (2019) apresenta um super-filo 
(Opisthoporidia), que é formado por um clado composto por três principais linhagens: 
Aphelidea; Rozellidea e Microsporidia, que também é conhecido como clado-ARM. 
Além deste super-filo a recente classificação proposta conta com oito filos: Chytridiomycota; 
Neocallimastigomycota; Blastocladiomycota; Zoopagomycota; Glomeromycota; Mucoromycota; 
Ascomycota e Basidiomycota. 
GRUPO FILOS SUB-FILOS CLASSES 
Zoospórico 
Crytridiomycota Crytridiomycotina 
Crytridiomycetes 
Monoblepharidomycetes 
Hyaloraphidiomycetes 
Neocallimastigomycota Neocallimastigomycotina Neocallimastigomycetes 
Blastocladiomycota Blastocladiomycotina 
Blastocladiomycetes 
Physodermatomyces 
GRUPO FILOS SUB-FILOS CLASSES 
Zigospórico 
Zoopagomycota 
Entomophthoromycotina 
Entomophthoromycetes 
Basidiobolomycetes 
Neozygitomycetes 
Kickxellomycotina 
Kickxellomycetes 
Asellariomycetes 
Barbatosporomycetes 
Dimargaritomycetes 
Harpellomycetes 
Ramicandelaberomycetes 
Zoopagomycotina Zoopagomycetes 
Glomeromycota Glomeromycotina 
Glomeromycetes 
Archaeosporomycetes 
Paraglomeromycetes 
Mucoromycota Mucoromycotina 
Mucoromycetes 
Endogonomycetes 
Umbelopsidomycetes 
O sub-reino Dikarya passa a ter apenas dois filos: o Ascomycota, que continua apresentando três 
sub-filos (Taphrinomycotina; Saccharomycotina e Pezizomycotina); e o filo Basidiomycota, que 
também continua com três sub-filos (Pucciniomycotina; Ustilaginomycotina e Agaricomycotina). 
FILOS SUB-FILOS CLASSES 
Ascomycota 
Taphrinomycotina 
Archaeorhizomycetes; Neolectomycetes; Pneumocystidomycetes; Schizosaccharomycetes; 
Taphrinomycetes 
Saccharomycotina Saccharomycetes 
Pezizomycotina 
Arthoniomycetes; Candelariomycetes; Collemopsidiomycetes; Coniocybomycetes; 
Dothideomycetes; Eurotiomycetes; Geoglossomycetes; Laboulbeniomycetes; 
Lecanoromycetes; Leotiomycetes; Lichinomycetes; Orbiliomycetes; Pezizomycetes; 
Sordariomycetes; Xylobotryomycetes; Xylonomycetes 
Basidiomycota 
Pucciniomycotina 
Agaricostilbomycetes; Atractiellomycetes; Classiculomycetes; Cryptomycocolacomycetes; 
Cystobasidiomycetes; Microbotryomycetes; Mixiomycetes; Pucciniomycetes; 
Spiculogloeomycetes; Tritirachiomycetes 
Ustilaginomycotina Exobasidiomycetes; Malasseziomycetes; Monilielliomycetes; Ustilaginomycetes 
Agaricomycotina 
Agaricomycetes; Dacrymycetes; Geminibasidiomycetes; Tremellomycetes; 
Wallemiomycetes 
 
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2. COLETA DE ESPÉCIMES EM CAMPO 
 
INTRODUÇÃO 
Para a realização de coletas em campo é necessário seguir alguns procedimentos para chegar aos 
resultados esperados de um estudo e/ou pesquisa da área micológica. 
Inicialmente é preciso escolher um local, obter informações sobre a localização e características 
do ambiente, ou seja, ter conhecimento da área onde se pretende realizar algum tipo de estudo 
e/ou pesquisa. Após a definição do local é preciso delimitar a área escolhida para coletar os 
espécimes durante todo o período do trabalho e/ou pesquisa. As coletas podem ocorrer de 
forma aleatória, coletando os espécimes em qualquer local da área escolhida ou por meio de 
parcelas que foram previamente demarcadas. 
As coletas podem ser realizadas durante todas as estações do ano, porém em períodos de chuvas 
intensas devem ser evitadas, pois as estruturas dos fungos podem se encontrar danificados devido 
a exposição intensa à chuva. O período ideal para coletar fungos é durante a manhã, pois o 
restante do dia será para realizar os procedimentos laboratoriais que requerem um pouco mais de 
tempo e atenção. 
 
EQUIPAMENTOS PARA A COLETA 
Seguindo os procedimentos de coleta, precisa-se de alguns equipamentos importantes para 
utilização no campo durante as coletas. Os principais equipamentos que não podem faltar são: 
a) Equipamentos de Proteção Individual (EPI): calça de tecido grosso; camisa de manga 
comprida; chapéu ou boné; meia; botas de cano longo ou sapatos/tênis resistentes e fechados; 
perneiras (imprescindíveis contra picadas e/ou mordidas de animais peçonhentos e/ou 
venenosos); e protetor solar. 
b) Máquina fotográfica: para fazer registros dos fungos no seu ambiente natural, fotografar 
suas estruturas macroscópicas, pois após a coleta as características macroscópicas sofrem 
alterações, principalmente nos cogumelos que são friáveis. 
c) Faca, canivete ou uma pá pequena de jardinagem: para ajudar na remoção do fungo do 
seu substrato (terra, troncos de árvores, etc.). 
d) Saco de papel (de vários tamanhos) e/ou frasco: utilizado para acondicionar 
individualmente os espécimes, devem ser colocados com muito cuidado para não danificar a 
amostra e devem estar identificados com um número além dos dados da coleta 
(dia/mês/ano). 
e) Ficha de campo, lápis e borracha: cada espécime coletado deve ter todas suas informações 
referentes à sua estrutura e características anotadas em uma ficha de campo (FIGURA 1). 
f) GPS: para marcar a localização da área de estudo e do local da coleta de cada espécime. 
g) Sacola ou caixa térmica: para transportar os espécimes já no interior dos sacos de papel. 
h) Régua ou fita métrica: utilizada para fotografar ao lado do espécime para comparação das 
medições da estrutura dos espécimes. 
i) Termômetro ambiental: para medir a temperatura do ambiente da área de estudo e do local 
da coleta de cada espécime. A medição sempre deve ser realizada à sombra. 
j) Higrômetro: para medir a umidade relativa do ar da área de estudo e do local da coleta de 
cada espécime. A medição sempre deve ser realizada à sombra. 
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k) Facão: para facilitar a caminhada em áreas com vegetação mais fechada. 
 
 
 
FIGURA 1. Ficha de campo para descrever as principais características dos fungos coletados. 
 
 
 
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3. MACROFUNGOS 
 
APRESENTAÇÃO 
Os macrofungos são fungos que produzem estruturas reprodutoras macroscópicas, designadas 
por estroma; carpóforo; esporocarpo; cogumelo; orelha-de-pau; basidioma (basidiocarpo) ou 
ascoma (ascocarpo), sendo visíveis a olho nu, ou seja, com tamanho superior a 1,0 mm. 
Os macrofungos compreendem um componente extremamente abundante e heterogêneo de 
biodiversidade do ecossistema e executam funções vitais ao meio ambiente (LEONARD; 
FECHNER, 2010). 
Os principais representantes dos Macrofungos são os pertencentes aos filos Ascomycota e 
Basidiomycota. 
O filo Ascomycota compreende o maior grupo do reino Fungi, constituído de aproximadamente75% de todos os fungos descritos. Seus representantes são considerados cosmopolitas e são 
encontrados na natureza como saprófitos, parasitas (especialmente de plantas), ou em associação 
mutualística (com algas unicelulares) formando os liquens. A principal característica deste grupo é 
a presença de asco contendo ascosporos, geralmente oito, que representam a estrutura de 
propagação do grupo. São produzidos por reprodução sexuada, mas a reprodução assexuada 
também pode ser encontrada (MORAES et al, 2009). 
Os representantes do filo Basidiomycota são considerados cosmopolitas e sapróbios. São 
comumente denominados “cogumelos”. Têm como principal característica a presença de basídio 
contendo basidiósporos, geralmente quatro, produzidos por reprodução sexuada, sendo que a 
reprodução assexuada também pode ser encontrada (MORAES et al, 2009). 
O surgimento do “corpo de frutificação” (aparecimento do esporocarpo) dos macrofungos pode 
ocorrer diversas vezes no ano, dependendo de temperatura e umidade favoráveis, mas o 
momento exato é muitas vezes espécie-específico. As variadas espécies de macrofungos requerem 
diferentes condições ambientais para a formação do esporocarpo. A sobrevivência do 
esporocarpo pode durar de algumas horas a vários anos, dependendo do habitat, fisiologia, 
agentes destrutivos e ciclo de vida da espécie. Caracteristicamente, um "pico" máximo de 
atividade ocorre nas épocas de surgimento do esporocarpo com diversidade e quantidade da 
produção do esporocarpo evidente. Este clímax é precedido por alguns dias ou semanas de 
rápida acumulação e posterior declínio na produtividade de fungos (LEONARD; FECHNER, 
2010). 
 
 
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4. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS 
 
ESTRUTURAS DOS MACROFUNGOS 
a) Micélio Reprodutivo ou Aéreo ou Estroma: corpo de frutificação do fungo, formado por 
hifas aéreas ou reprodutivas que apresentam a função de formar e liberar os esporos. 
 Basidioma ou Basidiocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos Basidiomycota. 
 Ascoma ou Ascocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos Ascomycota. 
b) Píleo: também chamado de chapéu, é a porção acima do estipe e que carrega o himenóforo. 
c) Himênio ou Superfície Himenial: camada membranosa superficial do macrofungo onde 
são produzidos os esporos (basidiósporos ou ascósporos). Também podem ser encontrados 
estruturas estéreis como cistídios (basidiomicetos); paráfises (ascomicetos) e setas. 
 Esporos: 
 Basidiósporos: esporos sexuais formados externamente em células denominadas de 
basídios, sendo exclusivos dos fungos Basidiomycota. 
 Ascósporos: esporos sexuais que se formam dentro de células denominadas de asco, 
sendo exclusivos dos fungos Ascomycota. 
 Estruturas Estéreis: 
 Cistídios: estruturas microscópicas estéreis, não ramificadas, geralmente clavadas a 
cilíndricas, de paredes finas ou espessas, que geralmente são encontradas no himênio de 
Basidiomycota. 
 Paráfises (Paraphysis): estruturas estéreis formadas por células terminais das hifas 
estéreis e filamentosas que geralmente apresentam um ápice globoso ou capitado ou 
forma de baqueta que geralmente são encontradas em Ascomycota. 
 Setas (Setae): estruturas estéreis formadas por hifas diferenciadas que apresentam 
forma de cerda ou seta com parede espessa. 
d) Himenóforo: parte do macrofungo que suporta o himênio. Pode se apresentar na forma de 
lamelas; poros; tubos; acúleos; etc. 
e) Estipe: também denominado de haste, pé ou pedúnculo, é a parte que sustenta o estroma 
(micélio reprodutivo) do fungo. 
f) Anel: estrutura circular presente no estipe da maioria dos cogumelos. 
g) Volva: estrutura que envolve a base do estipe em alguns cogumelos. 
 
 
 
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5. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MACROFUNGOS 
 
PROCEDIMENTOS EM CAMPO 
1) Materiais importantes: canivete; facão; perneiras; GPS; termômetro; higrômetro; etc. 
2) Fotografando o macrofungo: ao encontrar um magrofungo deve-se fotografá-lo em seu 
habitat natural registrando as suas estruturas. O segundo registro deve ser realizado com o 
auxílio de uma régua ou trena milimétrica para captar as medições gerais do corpo frutífero do 
fungo ainda no seu ambiente natural. 
3) Anotações: na ficha de campo (FIGURA 1) devem ser anotadas todas as informações sobre a 
coleta e o fungo, tais como: data, local de coleta, coletores, clima, tipo de substrato que se 
encontra o fungo, coloração das estruturas e presença ou ausência de odor. 
4) Coleta do macrofungo: com uma faca ou canivete o macrofungo deve ser coletado junto 
com uma parte do seu substrato, sempre atento para não danificar as estruturas principais do 
fungo (píleo e haste). 
5) Coleta para identificação molecular: retirar um ou mais fragmentos do fungo ainda fresco e 
colocar em um ou mais microtubos de 2,0 mL (tipo eppendorf) e depois completar com sílica 
gel. 
6) Armazenamento: os macrofungos coletados devem ser armazenados em sacos de papel e/ou 
frascos. No exterior dos sacos/frascos devem ser descritas as informações de identificação 
conforme a ficha de campo. 
7) Transporte: todo material coletado deve ser encaminhado para o laboratório no mesmo dia 
para as etapas de triagem e análises para a identificação. O material deve ser transportado em 
caixa isotérmica. 
 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES 
LABORATORIAIS 
a) Autoclave: usado para esterilização de materiais e meios de cultura. 
b) Estufa de esterilização (Pasteur): para esterilização de vidrarias em geral. 
c) Microtubo: usar microtubo de 2,0 mL (tipo eppendorf) para colocar fragmentos do fungo 
fresco para identificação molecular. 
d) Sílica gel: para retirar umidade do fungo sem alterar o seu material genético. 
e) Béquer: para colocar água e utilizar na esporada. 
f) Placa de Petri: para meio de cultura e esporada. 
g) Lâmina e lamínula: para visualização de esporos que foram depositados durante a esporada. 
h) Resina PVLG (Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool 
Polivinílico + Ácido Lático + Fenol): para fixação das lamínulas na lâmina. 
i) Esmalte incolor: para vedação da lamínula. 
j) Microscópio óptico: para visualização de esporos e estruturas microscópicas dos fungos. 
k) Estereomicrócopio óptico (Lupa): para visualização de detalhes macroscópicos dos 
Macrofungos (lamelas. Poros; himênio; etc.). 
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l) Estufa de secagem com ventilação forçada: para secagem dos macrofungos para 
armazenamento na Micoteca. 
m) Lâmina de aço; pinça e agulha: usadas para manipulação e cortes de estruturas dos fungos. 
n) Folha de papel branca e preta: usada como apoio das lamelas para obtenção dos esporos. 
o) Água destilada: para hidratar as estruturas dos fungos durante as análises. 
p) KOH (hidróxido de potássio) a 5%: hidratante para análise e medição das estruturas 
microscópicas (coloração citoplasmática e separação das hifas). Quando os macrofungos 
escurecem na presença do KOH significa que sofreu uma reação Xantocroica. 
q) Reagente de Melzer: empregado nas análises das microestruturas do basidioma 
(basidiósporos, basídios) e também para determinar as reações de amiloidia (amiloide ou 
destrinoide ou inamiloide) de esporos, ascos, basídios e tecidos himeniais de ascomycota e 
basidiomycota. Nas análises de estruturas hifais seu uso é indispensável. 
 Reação Amiloide: caracterizada pela coloração azul. 
 Reação Dextrinoide: coloração marrom ou avermelhada (IKI +). 
 Reação Inamiloide: quando não houve nenhuma alteração na cor (IKI –). 
r) Floxina 1%: corante para estruturas hialinas microscópicas dos fungos. 
s) Azul de metileno: usado para corar estruturas hifais. Ao reagir coram-se de verde esmeralda 
(grupo xantocroicos) e violeta claroou azul arroxeado (grupo dos basidiocarpos corticosos). 
Observação: o uso desse corante é importante, pois dependendo do tipo de reação, sua leitura 
torna-se um item para identificação da espécie. 
t) Azul de algodão: usado para observar a reação das microestruturas, sendo a reação chamada 
de cianófila quando for positiva. 
 
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO 
1) Fotografia: todos os fungos devem ser fotografados novamente no laboratório ao lado de 
uma régua ou escala sobre uma superfície clara para análise e registro de suas características 
para comparar com as registradas em campo. 
2) Descrição do macrofungo: com o auxílio de literaturas especializadas, cada estrutura 
macroscópica do fungo deve ser caracterizada desde o tamanho (medir as estruturas); a forma; 
a cor, descrevendo detalhadamente cada característica de cada parte do fungo (píleo; himênio; 
himenóforo; estipe; anel; volva; etc.). 
3) Anotação das características: todas as informações devem ser anotadas em uma ficha ou em 
caderno próprio do responsável da pesquisa. São informações importantes de caráter de 
identificação: medidas e formas de esporos; coloração; tipo de reação com reagentes; tipo de 
hifas; etc. 
4) Reações de amiloidia: gotas de reagente de Melzer devem ser adicionadas diretamente no 
himênio de fungos do tipo orelha-de-pau para observação de reação. 
5) Contagem dos poros: no caso de fungos com poros no himênio (himenóforo), estes devem 
ser contados e anotados. A contagem dos poros é feita utilizando-se uma régua milimetrada e 
estereomicroscópios (lupa). Contam-se quantos poros tem por milímetro. Devem ser 
escolhidas pelo menos dez (10) regiões do fungo para fazer a contagem. Anota-se o menor 
valor e o maior valor. 
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6) Técnica de esporada: deve ser feita a técnica de esporada para obter os esporos dos fungos, 
principalmente aqueles na forma de cogumelo, mas os fungos do tipo orelha-de-pau também 
podem ter esporada. 
a. Técnica de esporada de cogumelos: utiliza-se um pedaço de papel retangular (se 
possível uma metade branca e outra preta) com um pequeno corte em forma de círculo 
no meio para encaixe da haste (estipe). O cogumelo deve ficar encaixado com a 
superfície do himênio (himenóforo) sobre o papel e a estipe dentro da água em um 
béquer durante 24 horas em um local escuro para que os esporos possam cair das 
lamelas e marcar o papel. No outro dia poderá ser observada a cor da esporada, além 
disso, poderão ser coletados esporos para serem fixados em lâminas com a resina e 
lamínula para observação em microscópio óptico. 
b. Técnica de esporada para fungos tipo orelha-de-pau: a obtenção de esporos ocorre 
com o himênio (himenóforo) voltado para baixo sobre uma lâmina de vidro colocada 
em uma placa de Petri forrada com papel toalha que deverá ser umedecido com água 
deionizada ou destilada. A placa deverá ser tampada e armazenada durante 24 horas em 
ambiente escuro para obtenção dos esporos. No outro dia observa-se a lâmina para 
confirmar ou não a presença de esporos. Caso se encontrem os esporos coloca-se a 
resina e depois a lamínula para observação em microscópio óptico. 
7) Cortes: as análises do basidioma (basidiocarpo) e do himênio (himenóforo) iniciam-se com 
cortes destas estruturas utilizando-se lâminas de aço (tipo Gillette). Os cortes devem ser feitos 
em diferentes partes do basidioma e himênio para visualização das hifas (para caracterização) e 
outras microestruturas (cistídios, paráfises, setas, etc.). 
8) Montagem das lâminas em cogumelos: cortes finos da lamela devem ser colocados sobre 
uma lâmina e depois se colocam os reagentes e corantes. O uso dos corantes deve ser utilizado 
separadamente em lâminas diferentes. Com a lamínula cobre-se a amostra e leva ao 
microscópio para visualização em diferentes aumentos. 
9) Montagem das lâminas em fungos porosos (orelha-de-pau): cortes finos devem ser feitos 
em diferentes regiões do fungo sobre diferentes lâminas. Em uma lâmina adicionar uma gota 
de KOH 5% e em outra adicionar KOH 5% e corante azul de metileno. Cobrir com lamínula 
e observar em microscópio óptico para caracterizar as hifas. Quando as estruturas são hialinas 
(transparentes), de difícil observação, acrescentar o corante floxina 1%. 
10) Identificação: após todas as análises descritas acima e consequente registros das 
características dos fungos utilizam-se chaves de identificação; bancos de dados de herbários e 
literaturas especializadas para identificação do espécime. 
11) Conservação do macrofungo: o espécime é seco em estufa de ventilação forçada a 45°C 
por 12 h (fungos mais secos) e 24 h (fungos friáveis ou úmidos). Após a secagem cada fungo 
é acondicionado em caixas de papel com suas respectivas informações e inserido na micoteca 
para conservação e/ou futuros estudos. 
 
 
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6. MICROFUNGOS 
 
APRESENTAÇÃO 
Os fungos anamórficos formam um grupo de fungos onde a reprodução assexuada é 
predominante, com a formação de conídios como estrutura de propagação. A reprodução 
sexuada é ausente, desconhecida ou teve a capacidade perdida. Esse grupo está relacionado aos 
gêneros do filo Ascomycota e Basidiomycota por comparação de sequências gênicas. São 
considerados como cosmopolitas, sapróbios e parasitas de animais e plantas. Os conídios são 
formados por células conidiogênicas, presentes nos conidióforos, que são prolongamentos de 
hifas modificadas, com função reprodutiva. Os conídios podem ter diferentes formas, tamanhos 
e cores, podem possuir ou não a superfície texturizada, ornamento ou septo (MORAES et al, 
2009). 
Os microfungos são definidos como fungos com produção de estruturas microscópicas de 
esporos (MUELLER et al, 2004). Estão distribuídos praticamente em todos os grupos 
(Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota) e possuem 
estruturas reprodutivas microscópicas (MORAES et al, 2009). 
Os fungos conidiais, também incluídos entre os microfungos, representam a fase anamórfica de 
Ascomycota e Basidiomycota e tem aproximadamente 15.000 espécies descritas mundialmente 
(KIRK et al, 2001). A estrutura reprodutiva mais comum em fungos são os conídios (reprodução 
sexuada dominante), Moraes et al (2009) afirmam que os conídios são prolongamentos de hifas 
modificadas, com função reprodutiva, formados por células conidiogênicas, presente nos 
conidióforos. 
Os fungos conidiais formam um grupo artificial, anteriormente conhecido como fungos 
mitospóricos, fungos imperfeitos, fungos anamórficos ou Deuteromicetos e constituem a fase 
assexuada dos filos Ascomycota e Basidiomycota, não apresentando forma sexuada de 
reprodução. A maior parte destes fungos conidiais perdeu sua capacidade de reprodução sexuada 
ou de se reproduzirem dessa forma em condições extremas ou desconhecidas (KIRK et al, 2001). 
Os fungos conidiais podem estar presentes em quase todos os tipos de substratos possíveis de 
serem utilizados em sua nutrição e podem ser encontrados tanto em ambientes terrestres, 
associados às plantas, serrapilheira, solo e outros substratos, quanto em ambientes aquáticos 
(água doce, salobra ou salgada), associados a partes de vegetais submersas e organismos aquáticos 
(ALEXOPOULOS et al, 1996; MUELLER et al, 2004; SEIFERT et al, 2011). 
As estruturas reprodutivas básicas que compõem este grupo são os conídios, os conidióforos e as 
células conidiogênicas, sendo de grande importância para a taxonomia devido a grande 
diversidade morfológica propiciada pela plasticidade fenotípica/genotípica do grupo 
(ALEXOPOULOS et al, 1996). 
Os fungos conidiais podem ser divididos em fungos ingoldianos; fungos aero-aquáticos; fungos 
aquático-terrestres; e fungos aquático-facultativos (ALEXOPOULOS et al, 1996; GOH; HYDE, 
1996; INGOLD, 1975; SILVA et al, 2014). 
 
FUNGOS INGOLDIANOS 
São dependentes exclusivamentedo ambiente aquático para sua reprodução. Sua identificação é 
baseada na morfologia dos conídios que apresentam formas hidrodinâmicas (tetra-radiados, 
ramificados e sigmoides) que auxiliam na aderência ao substrato (DIX; WEBSTER, 1995; GOH, 
1997). Estão presentes na natureza habitando, principalmente, ambientes lóticos com água limpa 
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e clara. Porém, alguns já foram reportados em água poluída (SRIDHAR et al, 2000), lagos e no 
ambiente terrestre (BANDONI,1972, SCHOENLEIN-CRUSIUS; MALOSSO 2006). 
 
FUNGOS AERO-AQUÁTICOS 
Não conseguem completar seu ciclo de vida em ambiente aquático, sobrevivem vegetativamente 
à substratos submersos. Porém, só esporulam quando expostos ao ar. Geralmente colonizam 
matéria em decomposição e habita ambientes lênticos. Sua dispersão ocorre na superfície da água 
(GOH; HYDE, 1996; SHEARER et al, 2007).Vivem em ambientes lênticos como lagos e 
riachos, colonizam matéria orgânica em decomposição, possui conídios com estruturas 
multicelulares de formas distintas em sua maioria helicoidal ou clatróide, estas formas possui ar 
que possibilita os conídios a flutuarem sendo dispersos na superfície da água (BARBOSA, 2011; 
SILVA, 2013). 
 
FUNGOS AQUÁTICO-TERRESTRES 
Geralmente são encontrados em gotas de chuva ou orvalho, em plantas intactas, como a 
superfície foliar ou mesmo no tronco, formando um filme d’água que funciona como um micro-
habitat aquático (ANDO, 1992). 
 
FUNGOS AQUÁTICO-FACULTATIVOS 
São fungos que podem ser encontrados tanto em ambiente terrestre quanto aquático (lóticos e 
lênticos). São caracterizados como sapróbios, com conidióforos e conídios de parede 
relativamente espessa, podendo se desenvolver sobre substratos vegetais submersos ou terrestres 
(SILVA, 2013). Podem esporular e dispersar seus conídios nos ambientes terrestre e aquático Os 
conídios neste grupo são ovoides, cilíndricos, obclavados, piriformes ou fusiformes, o que não 
caracteriza adaptações distintas para o ambiente aquático (GOH; HYDE, 1996). 
 
 
 
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7. PRINCIPAIS ESTRUTURAS DOS MICROFUNGOS 
 
APRESENTAÇÃO 
Fungos Hyphomycetes (Hifomicetos) ou Deuteromycetes (Deuteromicetos) ou Conidiais ou 
Anamorfos (Anamórficos) ou Imperfeitos (Fungi imperfecti) são fungos que só é conhecida a 
reprodução assexuada. Apresentam estruturas características, tais como: conidióforos, células 
conidiogênicas e conídios (conidiósporos). 
Os conídios têm como função a dispersão e a perpetuação das espécies sendo de grande 
importância ecológica e taxonômica. 
Quando se conhece a fase sexual destes fungos, na maioria das vezes, estes passam a se classificar 
no filo Ascomycota ou no filo Basidiomycota. 
 
TIPOS DE COLORAÇÃO MICROSCÓPICA 
a) Fungos Demáceos ou Dematiáceos: fungos escuros ou negros. 
b) Fungos Hialinos: fungos claros. 
 
ESTRUTURAS DO MICÉLIO 
h) Micélio Vegetativo ou de Absorção ou Assimilativo: formado por um conjunto de hifas 
que estão submersas no substrato ou crescendo na superfície, sendo formado por hifas 
septadas, que são filamentos celulares cilíndricos geralmente multinucleados, com parede 
celular. As hifas geralmente apresentam ramificações entre o ápice e a base do micélio. 
i) Micélio Reprodutivo ou Aéreo ou Estroma: corpo de frutificação do fungo, formado por 
hifas aéreas ou reprodutivas que apresentam a função de formar e liberar os conídios 
(esporos). 
 Basidioma ou Basidiocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos 
Basidiomycota. 
 Ascoma ou Ascocarpo: estrutura reprodutora complexa dos fungos Ascomycota 
j) Esclerócito ou Escleroto: formado por hifas agregadas escuras com parede espessa e 
firmemente entrelaçadas com função de resistência. 
k) Rizomorfo ou Rizoide: aglomerado de hifas formando denso filamento semelhante a raízes. 
l) Hifopódio (Hyphopodia): formado por hifas diferenciadas com função de se fixar ao 
substrato. Também denominado de Apressório. 
m) Estomatopódio (Stomatopodia): formado por hifas diferenciadas de fungos parasitas que 
penetram no tecido do hospedeiro. Também conhecidas como Haustório. 
n) Seta (Setae): estrutura formada por hifas diferenciadas que apresentam forma de cerda ou 
seta com parede espessa. 
o) Paráfise (Paraphysis): estrutura formada por células terminais das hifas estéreis e 
filamentosas que geralmente apresentam um ápice globoso ou capitado ou forma de baqueta. 
p) Conidióforo: é uma hifa diferenciada que dará origem aos conídios. Pode não estar presente. 
q) Célula Conidiogênica: célula produtora de conídios. Sempre está presente. 
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r) Métula: célula de um conidióforo que transporta (carrega / sustenta) as fiálides. 
s) Fiálide: célula conidiogênica que produz conídios blásticos de maneira basípeta. 
 
TIPOS DE CONIDIÓFOROS 
a) Conidióforo Micronematoso: conidióforo com mesma espessura/tamanho que a hifa 
principal. 
b) Conidióforo Macronematoso: conidióforo com espessura/tamanho maior que a hifa 
principal. 
c) Conidióforo Isolado: formado apenas por uma hifa diferenciada. 
d) Conidióforo Agrupado: formado por agrupamento de diversas hifas. Pode ser classificado 
em Protegido e Desprotegido. 
 Conidióforo Agrupado Protegido: 
 Acérvulo: corpo de frutificação (estroma) em forma de almofada, fechado tendo 
apenas uma abertura, composto por hifas impactadas que originam os 
conidióforos. 
 Picnídio: corpo de frutificação assexual, geralmente em forma piriforme, 
revestido por conidióforos. 
 Conidióforo Agrupado Desprotegido: 
 Sinema: corpo de frutificação formado por diversos conidióforos em paralelo. 
 Esporodóquio: corpo de frutificação em forma de almofada ou prato recoberto 
por conidióforos. 
 
CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO CRESCIMENTO 
a) Basáuxico: o crescimento do conidióforo ocorre na base. 
b) Acroáuxico: o crescimento do conidióforo ocorre no ápice. 
 
CLASSIFICAÇÃO DO CONIDIÓFORO QUANTO AO EIXO 
a. Simpódico ou Simpodial: quando o eixo principal para de crescer e o crescimento continua 
na ramificação lateral, repetindo o mesmo processo. 
b. Monopódico ou Monopodial: quando o eixo principal sempre cresce mais que os ramos 
(ramificações) laterais. 
c. Acropetálica: quando uma cadeia de hifas é formada ocorrendo ramificação (bifurcação) e 
formação dos conídios ocorre no topo das bifurcações. 
 
CLASSIFICAÇÃO DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA 
a. Integrada: quando a célula conidiogênica está incorporada no eixo principal ou em ramos do 
conidióforo onde os conídios são terminais ou intercalares. Os conídios são produzidos no 
conidióforo. 
b. Discreta ou Distinta: quando a célula conidiogênica apresenta um formato distinto 
(ampuliforme, esférica, etc.). Os conídios são produzidos numa estrutura fora do conidióforo. 
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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ONTOGENIA DOS CONÍDIOS 
a) TÁLICO: conídio origina-se da subdivisão de células ou hifas pré-existentes sem a produção 
de uma nova parede celular. Divide-se em Holotálico e Enterotálico. 
 Holotálico: quando os conídios não se encontram em cadeia e são formados a partir do 
surgimento de septos. Divide-se em Tálico-ártrico e Tálico-solitário. 
 Tálico-ártrico ou Artrotálica: quando a hifa pré-existente sofre apenas septação. 
 Tálico-solitário: quando o ápice da hifa recebe um acúmulo de citoplasma originando 
o conídio. 
 Enterotálico ou Enteroártrico: quando os conídios se apresentam em cadeia e 
separados por compartimentos (células) que sofrem lise. 
b) BLÁSTICO: conídio origina-se a partir do crescimento da parede celular de uma célula pré-
existente. Divide-se em Holoblástico e Enteroblástico. 
 Holoblástico: quando a parede externa da célula conidiogênicaé contínua com a parede 
do novo conídio. Divide-se em Monoblástico e Poliblástico. 
 Monoblástico: ambas as paredes (internas e externas) da célula conidiogênica 
contribuem para a formação dos conídios. 
 Poliblástico: conídio emerge da parede interna da célula conidiogênica, sendo exposto 
pelo rompimento da parede externa. 
 Enteroblástico: quando a parede externa da célula conidiogênica é descontínua com a do 
conídio. A parede do conídio é derivada da superfície interior da célula. Divide-se em 
Trético e Fialídico. 
 Trético: células conidiogênicas estão integradas no conidióforo e apresentam poros. 
Divide-se em Monotrético e Politrético. 
 Fialídico: apresenta células conidiogênicas evidentes, diferenciadas do conidióforo, 
podendo apresentar colarete ou não. Divide-se em Monofialídico e Polifialídico. 
 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A PROLIFERAÇÃO DOS CONÍDIOS 
a) Determinado: ocorre apenas um evento de conidiogênese saindo apenas um conídio. 
b) Percorrente ou Anélide: ocorre uma proliferação de mais de um conídio, geralmente em fila. 
Como consequência o resíduo de secessão forma anéis no conidióforo. 
c) Simpodial: ocorre uma proliferação mudando de direção no crescimento fazendo com que o 
conidióforo mude o eixo (geniculação). 
d) Fialídico: ocorre rápida sucessão de conídios a partir de células conidiogênicas denominadas 
fiálides. 
 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A ABERTURA DA CÉLULA CONIDIOGÊNICA 
a) Ausência: quando não há abertura visível na célula conidiogênica. 
b) Presença: quando apresenta abertura visível na célula conidiogênica. Pode ser Denticulado ou 
Cicatrizado. 
 Denticulado: dentado de maneira pouco profunda. 
 Cicatrizado: célula conidiogênica apresenta uma cicatriz deixada pelo conídio. 
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CLASSIFICAÇÃO QUANTO A LIBERAÇÃO (SENESCÊNCIA) DOS CONÍDIOS 
a) Esquizolítico ou Esquizólisis: o conídio é liberado a partir da ruptura da hifa. Geralmente 
são formadas cicatrizes circulares. 
b) Rexolítico ou Rexólisis: o conídio é liberado a partir da lise ou fratura da célula basal. 
 
CLASSIFICAÇÃO QUANTO A SEQUÊNCIA DE PRODUÇÃO DOS CONÍDIOS 
a) Basípeta ou Basi-axial: conídio mais novo está no início (base) da cadeia. 
b) Acrópeta: conídio mais novo está no ápice da cadeia. 
 
 
 
 
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8. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DE MICROFUNGOS 
 
PROCEDIMENTOS EM CAMPO 
1) Materiais importantes: canivete, facão, perneiras, GPS, termômetro, higrômetro; etc. 
2) Coleta de material em campo: seguir o protocolo específico de cada coleta. 
3) Armazenamento das amostras: em sacos de papel e/ou frascos; 
4) Transporte para o laboratório: em caixas isotérmicas. 
 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES 
LABORATORIAIS 
a) Autoclave: usado para esterilização de materiais e meios de cultura. 
b) Estufa: utilizado para crescimento dos microfungos. 
c) Estufa de esterilização (Pasteur): para esterilização de vidrarias em geral. 
d) Vasilha de plástico: para lavagem dos substratos em água corrente. 
e) Placa de Petri: 
 Para fazer um micro ecossistema (mini estufa) onde serão colocados os substratos para 
crescimento dos microfungos; 
 Para repique dos microfungos em Ágar Batata e/ou Ágar Cenoura Milho; 
 Para fazer o microcultivo. 
f) Caixa isotérmica: para colocar as placas de Petri contendo os substratos. A caixa isotérmica 
deve ser forrada com papel toalha úmido e fechada. 
g) Folha de papel toalha: usada para a secagem dos substratos e também para forrar as placas 
de Petri (micro ecossistema) e a caixa isotérmica. 
h) Estereomicrócopio óptico (Lupa): para visualização dos microfungos crescendo nos 
substratos. 
i) Microscópio óptico: para visualização das estruturas microscópicas dos microfungos. 
j) Seringa com agulha de insulina: para manipulação dos microfungos no substrato e 
transferência para as lâminas de vidro para visualização das estruturas dos microfungos no 
microscópio óptico. 
k) Lâmina e lamínula: para visualização do microfungo retirado do substrato e para fazer 
microcultivo. 
l) Resina PVLG (Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool 
Polivinílico + Ácido Lático + Fenol): para fixação das lamínulas na lâmina. 
m) Esmalte incolor: para vedação da lamínula. 
n) Estufa de secagem com ventilação forçada: para secagem dos substratos para 
armazenamento na Micoteca. 
o) Lâmina de aço ou bisturi: usados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura Milho para 
fazer o microcultivo. Também serão utilizados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura 
Milho, com o microfungo, para ser armazenado no método Castelanni (1939). 
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p) KOH (hidróxido de potássio) a 5%: pode ser utilizado no caso de microfungos escuros 
(demáceos). Usados para clarear microfungos demáceos. 
q) Floxina B 1%: corante para estruturas hialinas (claras) microscópicas dos fungos. 
r) Corantes: usados na microscopia óptica. O ideal é fazer uma lâmina SEM CORANTE e 
outra COM CORANTE. Os principais corantes utilizados são: 
 Azul de metileno. 
 Azul de algodão. 
 Lactofenol de Amann. 
 Vermelho Congo. 
 
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO 
1) Higienização das amostras coletadas: lavagem do material em água corrente intermitente 
durante 30 min. 
2) Secagem do material: sobre papel toalha durante 15 min em temperatura ambiente. 
3) Cultivo em micro ecossistema: colocar as amostras dos substratos coletados (para ser 
cultivado) em placas de Petri contendo papel toalha (esterilizados) e depois umedecer o 
papel com água também esterilizada. 
4) Armazenamento: colocar as placas com os substratos em temperatura ambiente, dentro de 
caixa isotérmica, contendo papel toalha umedecido no fundo da caixa e tampar a caixa. 
5) Visualização: após uma semana, começar a visualização dos substratos nas placas de Petri 
utilizando lupa (estereomicroscópio) para observação de crescimento de microfungos. 
6) Registrar: assim que um microfungo for encontrado deve-se fotografá-lo ainda nos 
substratos, diretamente da ocular da lupa. 
7) Preparação da lâmina direta: com o auxílio de agulhas de insulina deve-se retirar o 
microfungo do substrato e transferi-lo para uma lâmina de vidro contendo resina PVLG 
(Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool Polivinílico + Ácido 
Lático + Fenol). 
8) Desmembramento do microfungo: ainda na lâmina, e com o auxílio das agulhas, o 
microfungo deve ser desmembrado para facilitar a visualização de suas estruturas tais como 
os esporos e células conidiogêncas. 
9) Visualização e registro: tendo uma boa visualização das estruturas fúngicas pode-se 
colocar a lamínula sobre a lâmina e fotografar as estruturas do microfungo diretamente da 
ocular do microscópio. 
10) Selar as lâminas: após a confecção das lâminas estas devem ser seladas passando esmalte 
incolor nas bordas das lamínulas e deixando secar por 24 h antes de usá-las novamente. 
11) Cultivo em meio de cultura: deve ser realizado cultivo em meio Ágar Cenoura Milho 
(ACM) e Ágar Batata Dextrose (ABD) com 0,5% de cloranfenicol (ver protocolo de 
produção) dos microfungos encontrados nos substratos, utilizando as técnicas de uma estria 
e/ou três picadas. Após os repiques as placas devem permanecer incubadas de 3 a 7 dias 
(dependendo da taxa de crescimento de cada espécime). 
12) Registro das placas: as placas com crescimento dos microfungos devem ser fotografadas, 
tanto a face superior (micélio aéreo) quanto a face inferior (micélio vegetativo). Suas 
características devem ser anotadas. 
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13) Microcultivo: após o crescimento dos microfungos nos meios de cultura, realizar o 
microcultivo (ver protocolode microcultivo). 
14) Visualização do microcultivo: as lâminas produzidas no microcultivo devem ser 
visualizadas em microscópio óptico para caracterizar e medir (com auxílio da escala 
micrométrica da ocular) as estruturas dos microfungos que serão importantes para a 
identificação destes. Anote tudo em seu caderno de pesquisa. 
15) Registrar: as estruturas visualizadas nas lâminas devem ser fotografadas e o aumento da 
imagem deve ser anotado. 
16) Armazenamento em tubos de ensaio: a partir das placas de Petri com ACM e ABD com 
crescimento dos microfungos deve-se fazer repiques para tubos de ensaio contendo o meio 
de cultura ACM inclinado e após o crescimento dos microfungos, no meio de cultura, 
adicionar óleo mineral esterilizado até cobrir a amostra. 
17) Armazenamento em água: a partir das placas de Petri, com ACM e ABD com crescimento 
dos microfungos, deve-se fazer cortes cúbicos do ágar, com o auxílio de um bisturi, 
formando fragmentos do ágar contendo o microfungo. Estes fragmentos devem ser 
colocados em frascos de vidro contendo água deionizada ou destilada, ambos esterilizados 
(ver protocolo do método de Castellani). 
18) Armazenamento do substrato e das lâminas: os substratos, dos quais foram retirados os 
microfungos, devem ser secos em estufa com ventilação forçada a 45°C/24 h e depois 
armazenados em caixas junto com suas respectivas lâminas. Tudo deve ser identificado e 
registrado na Micoteca. 
 
 
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9. FUNGOS ENDOFÍTICOS E EPIFÍTICOS 
 
APRESENTAÇÃO 
Fungos endofíticos são microfungos que habitam o interior de tecidos e órgãos vegetais sem 
causar prejuízos ao seu hospedeiro. 
Fungos epifíticos são microfungos que habitam as superfícies de partes estruturais dos vegetais. 
 
PROCEDIMENTOS EM CAMPO 
1) Materiais importantes: canivete, facão, perneiras, GPS, termômetro, higrômetro; etc. 
2) Coleta de material em campo: retirar a estrutura da planta com tesoura, canivete ou estilete. 
3) Armazenamento das amostras: em sacos de papel e/ou frascos; 
4) Transporte para o laboratório: em caixas isotérmicas. 
 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS PARA ANÁLISES 
LABORATORIAIS 
a) Vasilhas de plástico: para lavagem e higienização das estruturas das plantas. 
b) Álcool Etílico a 70%: para a higienização das estruturas das plantas. 
c) Hipoclorito de sódio: para a higienização das estruturas das plantas. 
d) Água deionizada ou destilada esterilizada: para a higienização das estruturas das plantas. 
e) Capela de exaustão ou fluxo laminar: local para higienização das estruturas dos das plantas. 
f) Autoclave: usado para esterilização de materiais e meios de cultura. 
g) Estufa: utilizado para crescimento dos microfungos. 
h) Estufa de esterilização (Pasteur): para esterilização de vidrarias em geral. 
i) Placa de Petri: 
 Para repique dos microfungos em Ágar Batata e/ou Ágar Cenoura Milho; 
 Para fazer o microcultivo. 
j) Folha de papel toalha: para forrar as placas de Petri (microcultivo). 
k) Estereomicrócopio óptico (Lupa): para visualização dos microfungos crescendo nos 
substratos. 
l) Microscópio óptico: para visualização das estruturas microscópicas dos microfungos. 
m) Seringa com agulha de insulina: para manipulação dos microfungos no substrato e 
transferência para as lâminas de vidro para visualização das estruturas dos microfungos no 
microscópio óptico. 
n) Lâmina e lamínula: para visualização do microfungo e para fazer microcultivo. 
o) Resina PVLG (Álcool Polivinílico + Ácido Lático + Glicerina) ou resina PVL (Álcool 
Polivinílico + Ácido Lático + Fenol): para fixação das lamínulas na lâmina. 
p) Esmalte incolor: para vedação da lamínula. 
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q) Lâmina de aço ou bisturi: usados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura Milho para 
fazer o microcultivo. Também serão utilizados para cortar o Ágar Batata ou Ágar Cenoura 
Milho, com o microfungo, para ser armazenado no método Castelanni (1939). 
r) KOH (hidróxido de potássio) a 5%: pode ser utilizado no caso de microfungos escuros 
(demáceos). Usados para clarear microfungos demáceos. 
s) Floxina B 1%: corante para estruturas hialinas (claras) microscópicas dos fungos. 
t) Corantes: usados na microscopia óptica. O ideal é fazer uma lâmina SEM CORANTE e 
outra COM CORANTE. Os principais corantes utilizados são: 
 Azul de metileno. 
 Azul de algodão. 
 Lactofenol de Amann. 
 Vermelho Congo. 
 
PROCEDIMENTOS NO LABORATÓRIO 
1) Higienização dos substratos: higienizar as estruturas das plantas coletadas (no interior de 
uma capela de exaustão ou fluxo laminar), utilizando recipientes previamente higienizados 
com solução de hipoclorito (3%), de acordo com o tipo de microfungo (epifítico ou 
endofítico) que se pretende isolar. 
 
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2) Colocando fragmentos nas placas: após a higienização deve-se cortar (utilizando lâmina 
de aço ou bisturi ou tesoura previamente esterilizada ou flambada) pequenos discos ou 
fragmentos (6-7 mm) das estruturas das plantas e colocar (usando uma pinça esterilizada ou 
flambada) na placa de Petri contendo Ágar Batata Dextrose (ABD). Para cada placa de Petri 
é possível colocar de três a cinco fragmentos. 
3) Incubação das placas: incubar em estufa úmida e manter em temperatura ambiente, 
analisar o crescimento que pode variar de três a seis dias, dependendo da estação. 
4) Repique dos fungos: repicar os variados fungos que cresceram a partir dos fragmentos das 
plantas para outra placa de Petri contendo ABD, sendo um fungo para cada nova placa de 
Petri. 
5) Microcultivo: realizar o método de microcultivo em lâminas dos fungos que cresceram nos 
fragmentos (ver protocolo de microcultivo); 
6) Visualização das lâminas do microcultivo: com o microscópio óptico fazer varredura na 
lâmina e medir as estruturas dos microfungos conforme o protocolo de identificação. Anotar 
as medidas realizadas. 
7) Registro: fotografar as estruturas e anotar o aumento da objetiva. 
8) Cultivo: cultivar os microfungos em placas de Petri e em tubos de ensaio inclinados com 
Ágar Cenoura Milho (ACM) com 0,5% de cloranfenicol. A incubação deve ser realizada a 
temperatura ambiente de 3 a 7 dias. 
9) Registro das placas: as placas com crescimento dos microfungos devem ser fotografadas, 
tanto a face superior (micélio aéreo) quanto da face inferior (micélio vegetativo). Suas 
características devem ser anotadas. 
10) Armazenamento em água: após o crescimento dos microfungos nas placas de Petri, retirar 
pequenos discos ou quadrados (utilizando bisturi esterilizado ou flambado) e colocá-los em 
frascos de vidro contendo água deionizada ou destilada esterilizada (ver protocolo para 
armazenamento a partir do método Castellani). 
11) Armazenamento em tubos de ensaio: após o crescimento dos microfungos nos tubos de 
ensaio, esterilizar óleo mineral e colocar dentro dos tubos até a total cobertura dos 
microfungos. 
 
 
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10. MICROCULTIVO 
 
MONTAGEM DA CÂMARA ÚMIDA 
Montar uma placa de Petri com o fundo coberto com papel de filtro e colocar sobre este um 
bastão em forma de “U” ou “V”, uma lâmina e três lamínulas. 
Caso não tenha um bastão para a lâmina ficar em cima use outra lâmina como base, colocando a 
lâmina de cima perpendicular à lâmina de baixo. 
Esterilizar todas as placas de Petri montadas em estufa de esterilização (Pasteur) a 180°C/3 horas. 
 
PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA 
Vazar, em placa de Petri esterilizada, uma camada fina do meio de cultura Ágar Batata Dextrose 
(ABD) ou Ágar Cenoura Milho (ACM), esterilizados. 
Após a solidificação do meio, com o auxílio de um bisturi (esterilizado ou flambado) ou canudo 
de plástico oumetal (previamente esterilizado), cortar pequenos fragmentos do Ágar. 
 
MICROCULTIVO E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 
Transferir, com o auxílio de um bisturi, um ou dois fragmentos do Ágar para a lâmina que está na 
placa de Petri do microcultivo (todo o procedimento deverá ser realizado próximo à chama do 
bico de Bunsen). 
Com uma agulha ou alça em “L” (previamente esterilizadas ou flambadas) transferir partes do 
micélio do fungo para o fragmento de Ágar que foi colocado sobre a lâmina. 
Colocar as lamínulas sobre os fragmentos do Ágar. 
Molhar o papel de filtro com água deionizada ou destilada esterilizada formando uma câmara 
úmida. 
Tampar a placa de Petri e deixar em temperatura ambiente, por aproximadamente uma semana 
ou mais dependendo do fungo estudado. 
Após esse período, inativar a esporulação, adicionando 1,0 mL de formol ao papel e vedando a 
placa com fita adesiva durante 24 h-48 h. O vapor de formol, além de inativar o fungo, irá auxiliar 
na fixação das estruturas microscópicas. 
Depois da inativação do fungo montar lâminas e lamínulas com corantes e/ou resinas. 
Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente, uma vez que nela deverão estar 
aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante e/ou resina e montar sobre uma 
lâmina. 
Desprezar o cubo de Ágar que ficou na lâmina e em seu lugar pingar uma gota de corante e/ou 
resina e recobrir com lamínula, para visualizar esporos e hifas também aderidos à lâmina. 
Observar em microscópio óptico. 
As lâminas podem ser vedadas utilizando esmalte incolor e esperando secar por 24 horas. 
 
 
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11. ARMAZENAMENTO DE ESPÉCIMES 
 
SECAGEM EM ESTUFA 
Tanto os substratos, dos quais foram retirados os microfungos, quanto também os macrofungos, 
devem ser secos em estufa com ventilação forçada e depois armazenados em caixas junto com 
suas respectivas lâminas de suas estruturas (para os microfungos) e lâminas dos esporos (para os 
macrofungos). Tudo deve ser identificado e registrado na Micoteca. 
A secagem dos substratos dos microfungos deve ser realizada a 45°C/24 h. 
A secagem dos macrofungos deve ser realizada a 45°C por 12 h (fungos mais secos) e 24 h 
(fungos friáveis ou úmidos). 
 
CAIXA COM ESPÉCIME SECA 
As caixas com espécimes dos microfungos devem conter identificação completa; substrato seco e 
lâminas com as estruturas do microfungo. 
As caixas com espécimes dos macrofungos devem conter identificação completa; espécime seca e 
lâminas com os respectivos esporos do macrofungo. 
 
MÉTODO CASTELLANI 
Realizar todo o procedimento próximo ao bico de Bunsen. 
A partir das placas de Petri contendo ACM e ABD, com crescimento dos microfungos, devem-se 
fazer cortes cúbicos do ágar, com o auxílio de um bisturi (esterilizado ou flambado), formando 
pequenos fragmentos do ágar contendo o microfungo. 
Os fragmentos devem ser transferidos para frascos de vidro contendo água deionizada ou 
destilada, ambos esterilizados, e depois tampados. 
Armazenar os frascos em temperatura ambiente ou refrigerador. 
 
TUBO COM ÓLEO MINERAL ESTERILIZADO 
Realizar todo o procedimento próximo ao bico de Bunsen. 
A partir das placas de Petri contendo ACM e ABD, com crescimento dos microfungos, devem-se 
fazer repiques para tubos de ensaio contendo o meio de cultura ACM inclinado e incubar de 3 a 7 
dias em temperatura ambiente. 
Após o crescimento dos microfungos, no meio de cultura dos tubos de ensaio, deve-se adicionar 
óleo mineral esterilizado até cobrir os microfungos. 
Armazenar os tubos de ensaio em temperatura ambiente ou refrigerador. 
 
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12. MEIOS DE CULTURA 
 
ÁGAR BATATA DEXTROSE (ABD) 
FÓRMULA: 
Infusão de Batata por 200 g 4,0 g/L* 
Dextrose 20,0 g/L 
Ágar 15,0 g/L 
*4,0 g de extrato de batata são equivalentes a 200 g de infusão de batata. 
pH final: 5,6 ± 0,2 a 25°C 
 
PREPARO: 
Suspender de 39,0 a 42,0 g (depende da marca) do pó em um litro (1.000 mL) de água destilada 
ou deionizada (verificar e seguir as instruções no rótulo do frasco do meio de cultura). 
Aquecer até dissolver completamente, sem ferver. 
Esterilizar em autoclave a 121°C por 15-20 minutos. 
Resfriar em temperatura ambiente. 
 
ÁGAR CENOURA MILHO (ACM) 
FÓRMULA: 
Cenoura madura ralada 30,0 g/500 mL 
Fubá de milho (tipo flocão) 30,0 g/500 mL 
Ágar bacteriológico 16 g/L 
 
PREPARO: 
Ralar a cenoura madura e pesar 30,0 g e colocar em um erlenmeyer com 500 mL de água 
deionizada ou destilada (Solução 1). 
Pesar 30,0 g de fubá de milho (tipo flocão) e colocar em um erlenmeyer com 500 mL de água 
deionizada ou destilada (Solução 2). 
Cozinhar por 15 minutos no fogão (não deixar ferver) as duas soluções em recipientes separados. 
Após cozidas as soluções 1 e 2 devem ser coadas separadamente (use coador de pano) e 
utilizando uma proveta coloque a mesma quantidade da Solução 1 e da Solução 2 em um único 
recipiente com tampa (geralmente a Solução 2 fica com menor volume). 
Após juntar as duas soluções acrescente o Ágar Bacteriológico, lembrando que a quantidade pode 
variar dependendo do volume final das duas soluções, para cada 1 L (1.000 mL) da solução final 
de cenoura e milho são acrescentados 16,0 g de Ágar (para outras quantidades use regra de três). 
Esterilizar em autoclave a 121°C por 20 minutos. 
Resfriar em temperatura ambiente. 
 
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13. RESINAS, CORANTES E REAGENTES 
 
RESINA PVLG (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + GLICERINA) 
FÓRMULA: 
PVA (Álcool Polivinílico Branco Granulado) 16,6 g 
Água deionizada ou destilada 100,0 mL 
Ácido lático 100,0 mL 
Glicerina 10,0 mL 
 
PREPARO: 
Em um erlenmeyer coloque 16,6 g de PVA em 100,0 mL de água deionizada ou destilada. 
Tampe com rolha de algodão hidrófobo e por cima da rolha coloque papel alumínio (faça 
pequenos furos no papel alumínio). 
Homogeneizar e autoclavar a 121°C/20 min. 
Depois de frio misturar com 100,0 mL de ácido lático e 10,0 mL de glicerina. 
Guardar em frasco âmbar ou coberto com papel alumínio ao abrigo da luz. 
Usar somente depois de 48 horas. 
Parte da resina pode ficar estocada no frasco maior (em refrigerador). 
A resina que vai ser usada pode ser colocada em frascos menores (âmbar ou coberto com papel 
alumínio), com conta-gotas. 
Identifique todos os frascos. 
 
RESINA PVL (ÁLCOOL POLIVINÍLICO + ÁCIDO LÁTICO + FENOL) 
FÓRMULA: 
PVA (Álcool Polivinílico Branco Granulado) 15,0 g 
Água deionizada ou destilada 100,0 mL 
Ácido lático 22,0 mL 
Fenol líquido 22,0 mL 
 
PREPARO: 
Modo de fazer a solução estoque: 
Em um erlenmeyer coloque 15,0 g de PVA em 100,0 mL de água deionizada ou destilada. 
Tampe com rolha de algodão hidrófobo e por cima da rolha coloque papel alumínio (faça 
pequenos furos no papel alumínio). 
Homogeneizar e autoclavar a 121°C/20 min. 
A solução estoque deve ser acondicionada em refrigerador depois de pronta e ao abrigo da luz 
(frasco âmbar ou coberto com papel alumínio). 
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Modo de fazer a solução de uso: 
Misturar 56,0 mL da solução estoque com 22,0 mL de ácido lático e 22,0 mL de fenol líquido. 
Guardar em frasco âmbar ou coberto com papel alumínio ao abrigo da luz. 
Usar somente depois de 48 horas. 
Parte da resina pode ficar estocada em refrigerador. 
A resina que vai ser usada pode ser colocada em frascos menores (âmbar ou coberto com papel 
alumínio), com conta-gotas. 
Identifique todos os frascos. 
 
AZUL DE ALGODÃO 
FÓRMULA: 
Ácido lático 20,0 g 100,0 g 
Cristais de fenol 20,0 g 100,0 g 
Glicerina 20,0 g 100,0 g 
Azul algodão 0,05 g 0,25 g 
Água destilada ou deionizada 20,0 mL100,0 mL 
 
PREPARO: 
Fundir os cristais de fenol em banho-maria e depois misturar com os outros ingredientes. 
Esperar 24 horas e filtrar. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
 
LACTOFENOL DE AMANN 
FÓRMULA: 
Ácido fênico 20,0 g 100,0 g 
Ácido lático 20,0 g 100,0 g 
Glicerina 40,0 g 200,0 g 
Água destilada ou deionizada 20,0 mL 100,0 mL 
Azul de Poirrierblau 0,05 g 0,25 g 
 
PREPARO: 
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. 
Depois adicionar 0,05g de azul de Poirrierblau. 
Esperar 24 horas e filtrar. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
 
 
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AZUL DE METILENO 
FÓRMULA: 
Azul de metileno 1,0 g 
Água destilada ou deionizada 100,0 mL 
 
PREPARO: 
Dissolver os dois ingredientes até a total dissolução dos componentes. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
 
VERMELHO CONGO A 1% 
FÓRMULA: 
Vermelho congo 1,0 g 
Água destilada ou deionizada 100,0 mL 
 
PREPARO: 
Dissolver os dois ingredientes até a total dissolução dos componentes. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
 
KOH (HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO) A 5% 
FÓRMULA: 
Hidróxido de potássio 5,0 g 
Água destilada ou deionizada 100,0 mL 
 
PREPARO: 
Dissolver os dois ingredientes até a total dissolução dos componentes. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
 
FLOXINA B 1% 
FÓRMULA: 
Floxina B 10,0 g 
Glicerina 75,0 mL 
Água destilada ou deionizada 175,0 mL 
 
PREPARO: 
Misturar todos os componentes e dissolver pelo calor. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
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REAGENTE DE MELZER 
FÓRMULA: 
Iodo 0,5 g 2,5 g 
Potássio iodado 1,5 g 7,5 g 
Hidrato de cloro 20,0 g 100,0 g 
Água destilada ou deionizada 20,0 mL 100,0 mL 
 
PREPARO: 
Dissolver os ingredientes e agitar. 
Armazenar em pote de vidro âmbar ou coberto por papel alumínio. 
 
 
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14. REFERÊNCIAS USADAS E CONSULTADAS 
 
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