Vista previa del material en texto
Espectrometría molecular por luminiscencia • fluorescencia • fosforescencia • quimioluminiscencia fotoluminiscencia fluorescencia la excitación molecular se consigue mediante la absorción de fotonesfosforescencia quimioluminiscencia La molécula excitada se forma en el curso de una reacción química. FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos gaseosos, líquidos y sólidos, tanto sencillos como complejos. 589.6 y 589.0 nm El tipo mas sencillo de fluorescencia es el que manifiestan los vapores atómicos diluidos Después de 10-8 s los electrones vuelven al estado fundamental EMITIENDO RADIACIÓN DE ESTAS DOS MISMAS LONGITUDES DE ONDA EN TODAS LAS DIRECCIONES. Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida se vuelve a emitir sin cambio de frecuencia, se conoce como RADIACIÓN DE RESONANCIA O FLUORESCENCIA DE RESONANCIA. Espín del electrón El principio de exclusión de Pauli establece que no puede haber dos electrones en un átomo cuyos cuatro números cuánticos sean iguales. Esta restricción requiere que no haya mas de dos electrones en un orbital y, además, el espín de cada uno debe ser opuesto al del otro. En estas condiciones, se dice que los espines están apareados o emparejados. Debido al apareamiento de los espines, la mayoría de las moléculas no presenta un campo magnético neto, por eso se dice que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos estáticos. Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, poseen un momento magnético y, por consiguiente, los atrae un campo magnético, se dice que los radicales libres son paramagnéticos. A y B: En el estado basal o fundamental y el estado excitado sencillo se pueden representar los dos electrones con flechas opuestas (espines opuestos). C: En el estado triplete excitado tiene menor energía que el estado sencillo correspondiente. Los dos electrones poseen el mismo espín A B C Singulete y triplete Estados excitados sencillo/triple Las propiedades de una molécula en el estado triple excitado y sencillo excitado difieren de manera significativa. Por ejemplo, una molécula es paramagnética en el estado triple y diamagnética en el sencillo. Lo mas importante es el hecho de que una transición sencillo a triple, o viceversa, que también supone un cambio en el estado electrónico, es un suceso significativamente menos probable que la correspondiente transición sencillo a sencillo. Por tanto, el tiempo de vida medio de un estado triple excitado dura a veces desde 10-4 hasta varios segundos, mientras que el tiempo de vida medio para un estado sencillo excitado es de 10-8 . Además, es muy baja la probabilidad de que tenga lugar la excitación de una molécula en el estado fundamental a un estado triple excitado. DIAGRAMA DE NIVELES DE ENERGÍA PARA UNA MOLÉCULA FOTOLUMINISCENTE DIAGRAMA DE JABLONSKI VELOCIDADES DE ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN • La velocidad a la cual se absorben un fotónes es enorme. Su valor es del orden de 10-14 a 10-15 s. • La emisión fluorescente tiene lugar a una velocidad significativamente mas baja. 10-5 a 10-10 s. • La velocidad promedio de la emisión fosforescente se requieren tiempos comprendidos entre 10-4 y 10 s o más. PROCESOS DE DESACTIVACIÓN Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación de etapas mecánicas: • radiante: mediante la emisión de un fotón de radiación (fluorescencia y fosforescencia) • no radiante El camino más propicio hacia el estado fundamental es aquel que reduce al mínimo el tiempo de vida del estado excitado. Si la desactivación por fluorescencia es más rápida que los procesos no radiantes, se observa emisión. En cambio, si una trayectoria no radiante tiene una constante de velocidad más favorable, no hay fluorescencia o es menos intensa. La fotoluminiscencia está limitada a sistemas con características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de relajación o desactivación no radiantes disminuya hasta el punto en el que el proceso de emisión pueda competir cinéticamente con ellos. Respecto a la cuestión cuantitativa, se entienden bien los procesos de emisión, pero apenas se empiezan a comprender los procesos de desactivación. (1) https://www.youtube.com/watch?v=CcssdJf0pKQ https://www.youtube.com/watch?v=LmxsmzaeIB4 https://www.youtube.com/watch?v=CcssdJf0pKQ https://www.youtube.com/watch?v=CcssdJf0pKQ https://www.youtube.com/watch?v=CcssdJf0pKQ https://www.youtube.com/watch?v=CcssdJf0pKQ https://www.youtube.com/watch?v=LmxsmzaeIB4 Procesos de desactivación • Relajación vibracional • Conversión interna • Conversión externa • Cruce entre sistemas • Fosforescencia Relajación vibracional Las colisiones entre moléculas de las especies excitadas y las del solvente ocasionan una transferencia de energía rápida y un incremento minúsculo de la temperatura del solvente. La relajación vibracional es tan eficaz que el tiempo de vida medio de una molécula excitada en forma vibracional es 10-12 s o menos. Una consecuencia de la eficacia de la relajación vibracional es que la banda de fluorescencia se desplaza hacia menores frecuencias o longitudes de onda más largas respecto a la banda de absorción (desplazamiento Stokes). El traslape sólo tiene lugar en el pico de resonancia relacionado con transiciones entre el nivel vibracional más bajo del estado fundamental y el nivel correspondiente de un estado excitado. Conversión interna •La conversión interna es un cruce entre dos estados de la misma multiplicidad (sencillo-sencillo o triple-triple). Corresponde al traslape de los niveles de energía vibracional. •Estos procesos son muy eficaces. •La molécula pasa a un estado electrónico de menor energía sin emitir radiación. •Por lo regular, es más probable la conversión interna a través de niveles vibracionales traslapados que la pérdida de energía por fluorescencia. excitación S0 S3 250 nm S0 S2 325 nm S0 S1 350 nm emisión S1 S0 450 nm La quinina proporciona un ejemplo de conversión interna. Esta sustancia, presente en la naturaleza, posee dos bandas de excitación analíticamente útiles, a 250 nm y 350 nm. Sin importar qué longitud de onda se utilice para excitar la molécula, la longitud de onda del máximo de emisión es 450 nm. Esta situación prevalece en los compuestos alifáticos, por ejemplo, y explica el hecho de que estas especies rara vez emitan fluorescencia. En esta clase de compuestos, la desactivación por transferencia de energía a través de los niveles vibracionales superpuestos tiene lugar tan rápido que no hay tiempo para que ocurra la fluorescencia. La conversión interna puede ocasionar el fenómeno de PREDISOCIACIÓN. Cuando el electrón se mueve desde un estado electrónico superior a un nivel vibracional superior de un estado electrónico mas bajo, en el que la energía vibracional es lo suficientemente grande como para provocar la rotura de un enlace. La rotura de los enlaces puede ser consecuencia de la absorción por un cromóforo, seguida de conversión interna de energía electrónica en energía vibracional asociada con el enlace débil. Los procesos de disociación también compiten con el proceso de fluorescencia. Conversión externa: desactivación de un estado electrónico excitado puede comprender la interacción y la transferencia de energía entre la molécula excitada y el solvente u otros solutos. Es de relevancia el efecto que ejerce el solvente en la intensidad de la fluorescencia de la mayor parte de las especies. Además, aquellas condiciones que tienden a reducir la cantidad de colisiones entre partículas (baja temperatura y elevada viscosidad) tienden por lo general a aumentar la fluorescencia. Los detalles de los procesos de conversión externa se desconocen aun. Cruce entre sistemasEl cruce entre sistemas es un proceso en el cual hay un cruce entre estados electrónicos de multiplicidad distinta. El proceso más común es del estado sencillo al estado triple. Como con la conversión interna, la probabilidad del cruce entre sistemas aumenta si los niveles vibracionales de los dos estados se superponen. El cruce entre sistemas es más común en moléculas que contienen átomos pesados, como el yodo o el bromo (efecto del átomo pesado); o la presencia de especies paramagnéticas, como el oxígeno molecular, en la solución. Fosforescencia La desactivación de estados electrónicos excitados también puede ser causada por la fosforescencia. Después del cruce entre sistemas para lograr un estado triple excitado, la desactivación posterior puede tener lugar por: conversión interna o externa o por fosforescencia. El tiempo de vida promedio de un estado triple excitado respecto a la emisión es grande y varía desde 10-4 a 10 s o más. La emisión causada por una transición de este tipo podría persistir durante algún tiempo después de que la irradiación se haya interrumpido. Rendimiento cuántico rendimiento cuántico o eficacia cuántica (F ) de la fluorescencia o la fosforescencia es la relación entre la cantidad de moléculas que manifiestan luminiscencia y el número total de moléculas excitadas. constantes de velocidad relativas para los procesos de desactivación : • fluorescencia (kf) • cruce entre sistemas (ki) • conversión externa (kec) • conversión interna (kic) • predisociación (kpd) • disociación (kd) ecdpdicecif f kkkkkkk k Tipos de transiciones en fluorescencia Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorción de radiación ultravioleta de longitud de onda menor a 250 nm, porque tal radiación es suficientemente energética como para producir predisociación o disociación. Rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones: . La emisión está relacionada con procesos menos energéticos: * * n* Fluorescencia y estructura Emiten Fluorescencia: • compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos • compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados • hidrocarburos aromáticos no sustituidos no emiten fluorescencia emiten fluorescencia Efecto de la rigidez estructural Fluorescencia se ve favorecida por la rigidez de las moléculas. La intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinolina es mucho menor que la de su complejo con cinc: eficacias cuánticas en condiciones de medición similares: para fluoreno: 1,0 y bifenilo: 0,2 Cadmio+selenio https://www.youtube.com/watch?v=bNuoYm7Su4o&t=8s https://www.youtube.com/watch?v=bNuoYm7Su4o&t=8s https://www.youtube.com/watch?v=bNuoYm7Su4o&t=8s https://www.youtube.com/watch?v=bNuoYm7Su4o&t=8s https://www.youtube.com/watch?v=bNuoYm7Su4o&t=8s https://www.youtube.com/watch?v=bNuoYm7Su4o&t=8s Efectos de la temperatura y del solvente La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en las moléculas al subir la temperatura. Al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura es elevada aumenta la probabilidad de desactivación por conversión externa. Una disminución en la viscosidad del solvente aumenta también la probabilidad de conversión externa y ocasiona el mismo resultado. Efecto del pH en la fluorescencia Por lo general, la fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende del pH. Es probable que tanto la longitud de onda como la intensidad de emisión sean diferentes en las distintas formas del compuesto. Supresión dinámica Por lo general, el término supresión o amortiguamiento (quenching) se refiere a la transferencia de energía no radiante desde una especie excitada hacia otras moléculas. La supresión o amortiguamiento dinámico, también llamado supresión por colisiones, requiere el contacto entre la especie excitada y el agente supresor (Q). Este fenómeno se presenta con tal rapidez que los participantes en el choque pueden difundirse. La velocidad depende de la temperatura y la viscosidad. Oxigeno disuelto (quenching) Con frecuencia, la presencia de oxígeno disuelto reduce la intensidad de la fluorescencia de una solución. Este efecto podría ser el resultado de una oxidación, inducida fotoquímicamente, de las especies fluorescentes. Pero lo más común es que la supresión (quenching) se presente como una consecuencia de las propiedades paramagnéticas del oxígeno molecular, lo cual impulsa el cruce entre sistemas y la conversión de moléculas excitadas en el estado triple. Otras especies paramagnéticas tienden también a atenuar la fluorescencia. Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación absorbido por el sistema. Es decir: Donde: P0 es la potencia del haz que incide sobre la solución P es su potencia después de atravesar una longitud b del medio f es la eficacia cuántica del proceso de fluorescencia K es una constante que depende de las características geométricas y otros factores. Con el objeto de relacionar F con la concentración c de la especie fluorescente, se escribe la ley de Beer en la forma: εbC10 0 P P Donde: e es la absortividad molar de las moléculas fluorescentes y ebc es la absorbancia A )εbC10(1 0 PK´F P)- 0 (PK´FεbC10 0 P P y El término exponencial de la ecuación se puede desarrollar como una serie de Maclaurin fluorescencia vs concentración: debería ser lineal a bajas concentraciones. las desviaciones negativas a elevadas concentraciones se da por autoabsorción o absorción secundaria. ... ! )bC.,( ! )bC.,( bC.,P´KF 3 3032 2 3032 3032 32 0 ee e Siempre que: 2.303ebc = A 0.05 todos los términos posteriores entre corchetes son pequeños respecto al primer termino. En estas condiciones, el error relativo máximo cometido es de 0.13%. KCF )bC.,(P´KF e30320 Espectros de emisión y de excitación En la figura se muestran los tres tipos de espectros fotoluminiscentes del fenantreno. INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA Los componentes de los instrumentos para medir la fotoluminiscencia son similares a los de los fotómetros o espectrofotómetros UV/visible. Fuentes la magnitud de la señal es directamente proporcional a la potencia de la fuente radiante P0. Por esta razón, se usan fuentes más intensas que las lámparas de tungsteno o deuterio utilizadas en las mediciones de absorción. • La lámpara más común para los fluorómetros es la lámpara de vapor de mercurio. • Cuando se requiere una fuente de radiación continua, se utiliza normalmente una lámpara de arco de xenón. • también se usan los diodos y Rayos láser. Filtros y monocromadores • FLUOROMETROS: filtros de interferencia y de absorción • ESPECTROFLUORÓMETROS: monocromadores de red. Transductores Las señales de emisión de luminiscencia son de baja intensidad. Los tubos fotomultiplicadores son los transductores que más se utilizan. Tambien se utilizan arreglos de diodos. Celdas y compartimientos para las celdas Para mediciones de fluorescencia se utilizan celdas o cubetas tanto cilíndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice Espectrofluorómetros provistos con detectores en serie Sensores de fluorescencia de fibra óptica Las sondas de fibra óptica se utilizan para demostrar que se pueden llevar a cabo distintos análisis por fluorescencia en lugares muy alejados de la fuente y del detector. En este caso, la radiación que procede de una fuente de rayos láser viaja a través de una fibra óptica y genera fluorescencia en las soluciones de la muestra. La emisión fluorescente regresa por la misma fibra óptica hasta un detector para la medición. La aplicabilidad de este tipo de dispositivo se ha extendido a analitosno fluorescentes mediante la inmovilización de un material indicador fluorescente en el extremo de la fibra óptica. https://www.youtube.com/watch?v=RLuE-khzwig https://www.youtube.com/watch?v=RLuE-khzwig https://www.youtube.com/watch?v=RLuE-khzwig https://www.youtube.com/watch?v=RLuE-khzwig https://www.youtube.com/watch?v=RLuE-khzwig Microscopía: https://www.youtube.com/watch?v=W9p6Y8IW89A https://www.youtube.com/watch?v=Wzk7SNLRJ5Y Métodos de imágenes por fluorescencia En los años recientes ya fue posible combinar la espectroscopia de fluorescencia con la microscopia óptica para generar imágenes de fluoróforos presentes en matrices de complejos tales como células. En algunos casos, la fluorescencia intrínseca o nativa de biomoléculas se puede usar junto con microscopia para supervisar la dinámica en las células. En ausencia de un fluoróforo nativo, los indicadores fluorescentes se pueden aprovechar para demostrar hechos biológicos. https://www.youtube.com/watch?v=W9p6Y8IW89A https://www.youtube.com/watch?v=W9p6Y8IW89A https://www.youtube.com/watch?v=Wzk7SNLRJ5Y QUIMIOLUMINISCENCIA La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada que emite luz cuando vuelve al estado fundamental. Las reacciones quimioluminiscentes se producen en varios sistemas biológicos, en los que el proceso se suele denominar bioluminiscencia. Entre los ejemplos de especies que presentan bioluminiscencia están las luciérnagas, un coral suave del genero Renilla y ciertas medusas, bacterias, protozoos y crustáceos. En química analítica su aplicación es reciente. Las reacciones químicas que producen quimioluminiscencia son pocas, lo que limita el procedimiento a un numero relativamente pequeño de especies. No obstante, algunas de las sustancias que reaccionan manifestando quimioluminiscencia son componentes importantes del ambiente. La alta selectividad, la sencillez y la extrema sensibilidad del método son la causa de su creciente utilización. El fenómeno de la quimioluminiscencia Hace más de un siglo se descubrió que ciertos compuestos orgánicos relativamente sencillos también eran capaces de manifestar quimioluminiscencia. El tipo de reacción más sencilla de dichos compuestos para producir quimioluminiscencia se puede formular como: En quimioluminiscencia la intensidad de radiación ICL (fotones emitidos por segundo) depende de la velocidad de la reacción química: y de la eficacia cuántica de quimioluminiscencia CL (fotones emitidos por molécula que ha reaccionado). El último término es igual al producto de la eficacia cuántica de excitación EX (estados excitados por moléculas que han reaccionado) y la eficacia cuántica de emisión EM (fotones por estado excitado). Estas relaciones se describen mediante la ecuación: dt Cd dt Cd dt Cd I EMEXCLCL Por lo regular, los sistemas quimioluminiscentes útiles en análisis presentan valores de CL comprendidos entre 0,01 y 0,2. Medición de la quimioluminiscencia El equipo para medir la quimioluminiscencia es muy sencillo, y puede consistir tan sólo de un recipiente de reacción adecuado y un tubo fotomultiplicador. En general, no es necesario ningún dispositivo para seleccionar la longitud de onda porque la única fuente de radiación es la reacción química entre el analito y el reactivo. https://www.youtube.com/watch?v=msdLfFc3Hr4 https://www.youtube.com/watch?v=CcN8NnGGPhs&t=93s https://www.youtube.com/watch?v=msdLfFc3Hr4 https://www.youtube.com/watch?v=msdLfFc3Hr4 https://www.youtube.com/watch?v=msdLfFc3Hr4 https://www.youtube.com/watch?v=CcN8NnGGPhs&t=93s https://www.youtube.com/watch?v=CcN8NnGGPhs&t=93s La señal característica de un experimento quimioluminiscente depende del tiempo y surge con rapidez hasta un máximo cuando la mezcla del reactivo y el analito se completa. Luego sigue una disminución de la señal más o menos exponencial. Por lo regular, en lo que se refiere al análisis cuantitativo, la señal se integra para un tiempo fijo y se compara con patrones tratados de forma idéntica. Otra opción es usar las alturas de los picos para efectuar los cálculos. A menudo se observa una relación lineal entre SEÑAL y CON., para intervalos de concentración de varios órdenes de magnitud.
