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Av. Hidalgo 935, Colonia Centro, C.P. 44100, Guadalajara, Jalisco, México bibliotecadigital@redudg.udg.mx - Tel. 31 34 22 77 ext. 11959 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA COORDINACIÓN GENERAL ACADÉMICA Coordinación de Bibliotecas Biblioteca Digital La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos que posteriormente quiera darle a la misma. UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA NUEVO HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA “DR. JUAN I. MENCHACA “ ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MÉDICA TESIS PARA OBTENER EL DIPLOMA DE ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MÉDICA DETECCIÓN DE PÉRDIDAS O GANANCIAS GENÓMICAS EN PACIENTES CON ANOMALÍAS CONGÉNITAS MÚLTIPLES Y/O DISCAPACIDAD INTELECTUAL EVALUADAS MEDIANTE EL USO COMBINADO DE KITS DE AMPLIFICACIÓN DE SONDAS DEPENDIENTES DE LIGANDOS MÚLTIPLEX (MLPA) M.C.P. Jehú Rivera Vargas Guadalajara, Jalisco, Enero de 2016 UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA NUEVO HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA “DR. JUAN I. MENCHACA “ ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MÉDICA TESIS PARA OBTENER EL DIPLOMA DE ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MÉDICA DETECCIÓN DE PÉRDIDAS O GANANCIAS GENÓMICAS EN PACIENTES CON ANOMALÍAS CONGÉNITAS MÚLTIPLES Y/O DISCAPACIDAD INTELECTUAL EVALUADAS MEDIANTE EL USO COMBINADO DE KITS AMPLIFICACIÓN DE SONDAS DEPENDIENTES DE LIGANDOS MÚLTIPLEX (MLPA) ALUMNO M.C.P. Jehú Rivera Vargas DIRECTOR DE TESIS Dr. en C. Jorge Roman Corona Rivera CO-DIRECTORA DE TESIS Dra. en C. Lucina Bobadilla Morales Guadalajara, Jalisco, Enero de 2016 SEDES Unidad de Citogenética, Servicio de Hematología y Oncología, División de Pediatría, Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”. Centro de Registro e Investigación sobre Anomalías Congénitas (CRIAC), Servicio de Genética, División de Pediatría, Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”. Servicio de Oncogenética, Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”. Laboratorio de Citogenética, Genotoxicidad y Biomonitoreo, Instituto de Genética Humana “Dr. Enrique Corona Rivera”, Departamento de Biología Molecular y Genómica, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Contenido temático 1. Titulo 1 2. Investigadores 1 2.1 Investigador Responsable 1 2.2 Investigador Principal 1 2.3 Investigadores Asociados 1 3. Sede 1 4. Abreviaturas 2 5. Marco teórico 3 5.1 Anomalías congénitas múltiples 3 5.2 Epidemiología 3 5.3 Clasificación 3 5.3.1 Clasificación en base a su severidad 4 5.3.2 Clasificación en base a su presentación 4 5.3.3 Clasificación en base a su patogenia 5 5.3.4 Clasificación en base a su etiología 6 6. Niños con anomalías congénitas múltiples 6 7. Discapacidad intelectual en niños 7 8. Ligamiento multiplex-dependiente de amplificación de sonda (MLPA) 9 8.1. Ventajas de MLPA para el estudio genético 10 8.2. Ensayo de MLPA 11 8.3. Variaciones de la MLPA 13 8.4. Limitaciones de la técnica de MLPA 14 8.5. Aplicaciones de la MLPA 14 8.6. MLPA y pérdidas o ganancias genómicas o cromosómicas 15 8.7. MLPA y anomalías congénitas múltiples 15 8.8. MLPA y discapacidad intelectual 15 8.9. Combinación de kits de MLPA de utilidad en el estudio de niños con ACM/DI 16 9. Definición y planteamiento del problema 19 10. Pregunta de investigación 19 11. Magnitud 19 12. Antecedentes 19 13. Justificación 23 13.1 Magnitud 23 13.2 Trascendencia 23 13.3 Vulnerabilidad 24 13.4 Factibilidad 24 14. Hipótesis 24 15. Objetivos 24 15.1 Objetivos general 24 15.2 Objetivos particulares 24 16. Materiales y métodos 25 16.1 Diseño 25 16.2 Universo de Estudio 25 16.3 Muestra de estudio 25 16.4 Tamaño de muestra y sistema de muestreo 25 16.5 Criterios de Selección 25 16.5.1 Criterios de Inclusión25 16.5.2 Criterios de Exclusión 26 11.5.3 Criterios de no Inclusión 26 16.6 Definición de variables 26 16.6.2 Operacionalización de variables 26 16.7 Descripción de Procedimientos 26 16.7.1 Métodos y técnicas 27 16.7.2 Muestra sanguínea 28 16.7.3 Extracción de leucocitos 28 16.7.4 Extracción de ADN por Qiagen 28 16.7.5 Reacción MLPA 29 16.7.5.1 Preparación 29 16.7.5.2 Desnaturalización 30 16.7.5.3 Hibridación 30 16.7.5.4 Ligación 30 16.7.5.5 Reacción PCR 31 16.7.6 Análisis de la información 31 16.8 Validación de datos 32 16. 8.1 Bases de datos y programas de cómputo 32 16.9. Consideraciones éticas 32 16.10 Cronograma de actividades 32 16.11 Recursos 33 16.11.1 Recursos Humanos 32 16.11.2 Recursos Materiales 33 16.11.3 Recursos Financieros 33 17. Resultados y discusión 34 17.1 Frecuencia de detección de síndromes de microdeleción y pérdidas o ganancias subteloméricas 34 17.2 Síndromes de microdeleción (Salsa MLPA PROBEMIX P245-B1) 34 17.2.1 Síndrome de deleción 22q11.21 35 17.2.2 Síndrome de deleción 7q11.23 39 17.2.3 Síndrome de deleción 4p16.3 41 17.2.4 Síndrome de deleción 15q11.2 42 17.2.5 Síndrome de deleción 17p13.3 44 17.3 Síndromes de microdeleciones o microduplicaciones subteloméricas 45 17.3.1Síndrome de microdeleciones o microduplicaciones subteloméricas con cariotipo anormal 47 17.3.1.1 Desbalances subteloméricos en pacientes con cariotipo inicial 46,XXadd(20)(p13): del 20p13 y dup 3p26.3 47 17.3.1.2 Desbalances subteloméricos en paciente 46,XY, del (13)(q34): del 13q34 51 17.3.1.3 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo 47,XY, +13: dup 13q12.11 y dup 13q34 52 17.3.1.4 Desbalances subtelomericos en pacientes con cariotipo 46,XY,r(18)(p11.3;q23): del 18p11.32 y del 18q23 55 17.3.1.5 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo 47,XX+21,add(15)(p11.2): dup 21q11.2 y dup 21q22.3 57 17.3.1.6 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo mos 47,XXY[190]/46,XY[10]: dup Xp22PAR y dup Xq28 59 17.3.2. Síndromes de microdeleciones o microduplicaciones subteloméricas con cariotipo normal 61 17.3.2.1 Síndrome de microdeleción subtelomérica 1p36.33 61 17.3.2.2 Síndrome de microduplicación subtelomérica 3q29 67 17.3.2.3 Síndrome de microduplicación subtelomérica duplicación 4p16.3 69 17.3.2.4 Síndrome de microdeleción subtelomérica 6p25.3 71 17.3.2.5 Síndrome de microduplicación subtelomérica 7p22.3 74 17.3.2.6 Síndrome de microdeleción 8p23.3 subtelomérica 79 17.3.2.7 Síndrome de microdeleción subtelomérica 10q26.3 81 17.3.2.8 Síndrome de microdeleción subtelomérica 12p13.33 83 17.3.2.9 Síndrome de microdeleción subtelomérica 13q12.11 85 17.3.2.10 Síndrome de microduplicación subtelomérica 15q26.3 87 17.3.2.11 Síndrome de microdeleción 18p11.32 y microduplicación subtelomérica 20p13 89 17.4. Comparación de nuestros hallazgos con los estudios previamente publicados 91 17.4.1 Hallazgos con salsa MLPA P245 microdeleciones 91 17.4.1 Hallazgos con salsa MLPA P036/ P070 subtelomérica 91 18. Conclusiones y perspectivas 19. Agradecemientos 93 94 19. Bibliografía 95 20. Anexos 103 Especialidad en Genética Médica 1 1. TITULO Detección de pérdidas o ganancias genómicas en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual evaluadas mediante el uso combinado de kits amplificación de sondas dependientes de ligandos múltiplex (MLPA) 2. INVESTIGADORES 2.1 Investigadores Responsables: Dr. en C. Jorge Román Corona Rivera Doctor en Genética Humana y Especialista en Pediatra Médica, Jefe del Servicio de Genética, Profesor Titular del Curso de Especialidad en Genética Médica (CEGM), Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca” (HCG JIM), Director de Tesis. Dra. en C. Lucina Bobadilla Morales Doctora en Genética Humana, Médico Genetista, Supervisora de la Unidad de Citogenética (UC), Servicio de Hemato-Oncología (SHO), División de Pediatría y Profesora Adjunta del CEGM, HCG JIM, Co-Directora de Tesis. 2.2 Investigador Principal: M.C.P. Jehú Rivera Vargas Residente de la Especialidad de Genética Médica, HCG JIM. 2.3 Investigadores asociados Dr. en C. Alfredo Corona Rivera Doctor en Genética Humana, Jefe de la UC y Profesor Adjunto del CEGM, HCG JIM. Dra. en C. Helia Judith Pimentel Gutiérrez UC, SHO, División de Pediatría, HCGJIM Dra. en C. Citlalli Ortega de la Torre UC, SHO, División de Pediatría, HCGJIM Dra. en C. Lisette Arnaud López Servicio de Genética, División de Pediatría, HCGJIM Q.F.B. Alejandro Vázquez Reyes UC, SHO, División de Pediatría, HCGJIM M.C.P. Eugenio Zapata Aldana Residente de la Especialidad de Genética Médica, HCG JIM. 3. SEDES Servicio de Genética y Unidad de Citogenética, División de Pediatría, HCG JIM, Laboratorio de Citogenética, Genotoxicidad y Biomonitoreo, Instituto de Genética Humana “Dr. Enrique Corona Rivera”, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Especialidad en Genética Médica 2 4. Abreviaciones utilizadas AC. Anomalías congénitas ACM: anomalías congénitas múltiples ADN: Acido desoxirribonucleico CGH Arrays: Hibridación genómica comparativa VNC: Variación del número de copias DI: Discapacidad intelectual DHPLC: Cromatografía liquida de alta eficacia desnaturalizante DSM: Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales FISH: Hibridación fluorescente in situ GWAS: Secuenciación del genoma completo MLPA: Ligamiento multiplex-dependiente de amplificación de sonda MS: Metilación NT: Nucleótidos PC: Perímetro cefálico PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PEATC:Potenciales evocados auditivos de tallo cerebral RPH: Relative peak height (altura relativa del pico) RT: Transcriptasa reversa SMA: Atrofia muscular espinal SNP: Polimorfismos de un solo nucleótido VACTERL: Acrónimo, defectos vertebrales, atresia anal, cardiacos, fistula traqueoesofágica, renal y defectos de extremidades Especialidad en Genética Médica 3 5. Marco teórico 5.1 Anomalías congénitas La dismorfologia es el término utilizado para describir el estudio de las anomalías congénitas. El nacimiento de un niño con anomalías congénitas únicas o múltiples es una fuente de estrés para la familia y el equipo sanitario, (Repetto, 2012). 5.2 Epidemiología de las anomalías congénitas Las anomalías congénitas (AC) son defectos relativamente comunes, afectan al 3% a 5% de los recién nacidos vivos en Estados Unidos y en Europa 2.1%. (Fatema et al., 2011). Las AC representan el 8% a 15% de las muertes perinatales, y del 13% a 16% de las muertes neonatales en la india. Principal causa de mortalidad infantil en Estados Unidos, (Fatema et al., 2011). La morbilidad y discapacidad tienen un impacto mayor en salud pública. Representan un alto costo de servicios de salud para la familia y el estado, ya que por ejemplo están presentes en 30% de las hospitalizaciones en salas pediátricas y su porcentaje es mayor en unidades de cuidados intensivos neonatales Ocupan el primer lugar de mortalidad durante el primer año de vida y posteriormente el tercero, después de los accidentes y neoplasias. Los tipos más comunes de anomalías incluyen entre muchos otros, las cardiopatías congénitas, labio y paladar hendido y los defectos del tubo neural, (Repetto, 2012). Se estima que un diagnóstico definitivo se alcanza en solo aproximadamente el 20- 50% de los niños con ACM, (Repetto, 2012). El mayor impacto de las malformaciones congénitas ocurre en las perdidas gestacionales. Existe una relación inversamente proporcional de defectos congénitos con la edad gestacional (2.7% a término vs 5.9% en prematuros), en prematuros el riesgo se incrementa significativamente con menor edad gestacional (9.3%). 5.3 Clasificación de las anomalías congénitas Las AC se clasifican usualmente desde cuatro enfoques diferentes que se señalan en la Figura 1. 5.3.1 Clasificación en base a su severidad Anomalías mayores. Son aquellas que tienen un efecto adverso sobre la salud, desarrollo o capacidad funcional y están presentes al nacimiento (Fatema et al., 2011). Es decir son aquellas que requieren tratamiento quirúrgico o medico a causa de las consecuencias funcionales o cosméticas. El 2-3% de los recién nacidos tienen anomalías congénitas mayores (Repetto, 2012). Especialidad en Genética Médica 4 Figura 1. Diferentes clasificaciones de las anomalías congénitas según su abordaje. Fuente: Modificado de Corona-Rivera y Ramírez-Dueñas (2013). Anomalías menores. También llamadas errores leves de la morfogénesis. No son de importancia médica tienen un efecto cosmético para el paciente. La presencia de múltiples anomalías menores deben alertar al médico por la probable presencia de una malformación mayor (Merks et al., 2003). Estudios de población sobre anomalías menores mostraron que la presencia de tres o más anomalías menores en un recién nacido hace que el neonato sea más propensos a tener un malformación mayor. Se subclasifican en: a) Anomalías menores verdaderas b) Variantes comunes. 5.3.2 Clasificación en base a su presentación Anomalías Únicas. Son aisladas y no sindrómicas. Patrón de anomalías múltiples. Las anomalías congénitas múltiples, implican defectos menores o mayores con un patrón especifico de anomalías. Se subclasifican en secuencias, asociaciones, espectro, síndrome y anomalías congénitas múltiples no clasificadas. a) Secuencia: Grupo anomalías en cascada, resultante de un solo defecto inicial en la morfogénesis. Por ejemplo la secuencia Robín (micrognatia, glosoptosis y dificultad respiratoria con sin paladar hendido, (Repetto, 2012). b) Síndrome: Es un patrón reconocible de anomalías con un etiología subyacente común. Los síndromes pueden ser reconocidos en el periodo en Especialidad en Genética Médica 5 alrededor del 25% de los recién nacidos evaluados por anomalías congénitas (Repetto, 2012). c) Asociación: Grupo de anomalías congénitas que se producen con una mayor frecuencia de lo esperado por la causalidad, pero sin una etiología común conocida. Por ejemplo la asociación VACTERL que incluye defectos vertebrales, atresia anal, defectos cardiacos, fistula traqueo-esofágica, renal y defectos de extremidades, (Repetto, 2012). d) Espectro: Comprende entidades con múltiples anomalías que muestran gran variabilidad clínica, como el espectro oculoauriculovertebral que puede tener afección prácticamente en todas las áreas del organismo. e) Anomalías congénitas múltiples no clasificadas. Ver más adelante. 5.3.3 Clasificación en base a su patogenia Malformaciones: Resultado de un defecto intrínseco del desarrollo de un órgano, o de una región corporal, debido a una morfogénesis incompleta, redundante y aberrante. Las malformaciones son anormalidades intrínsecas de la blastogénesis u organogénesis, afectando morfogenéticamente la unidad reactiva del embrión, (Gilbert et al., 2014). Las malformaciones que se producen durante los primeros 28 días de desarrollo son defectos de blastogénesis, durante la gastrulación, cuando el embrión constituye un campo del desarrollo primario. Las anomalías de organogénesis se producen durante la 4 a 8 semanas del desarrollo. Los defectos de blastogénesis son más severos que los de organogénesis. Los defectos de blastogénesis son anomalías multisistémicas o defectos de campo politópico, frecuentemente letal; los defectos de organogénesis son más localizados, son defectos del campo monotópico, menos letal, como el paladar hendido, (Gilbert et al., 2014). Con base a mecanismos ontogénicos existen tres principales clases de malformaciones: a) por morfogénesis incompleta, b) por morfogénesis redundante y c) por morfogénesis aberrante. La morfogénesis incompleta es la clase más común de malformaciones e implica una detención total o parcial del desarrollo y por lo tanto produce agenesia o hipoplasia de diferentes órganos o tejidos Deformaciones: Se producen por fuerzas mecánicas que distorsionan las estructuras por lo demás normales, lo que resulta de factores maternos o fetales, que se producen en cualquier momento en la gestación (Merks et al., 2003). Causas maternas como malformaciones uterinas y oligodramnios. Fetales como el pie equinovaro y artrogriposis por distrofia miotonica y mielomeningocele. (Gilbert et al., 2014). Disrupciones: Son defectos estructurales causados por la interferencia del desarrollo genéticamente normal de los primordios, resultado de eventos de varios orígenes, por ejemplo enfermedades vasculares, teratógenos, infecciosas o de origen mecánico, (Merks et al., 2003). Especialidad en Genética Médica 6 Displasia: Resulta de una histogénesis anormal (Merks et al., 2003), defecto estructural que resulta de una organización celular anormal o función alterada. Genes mutados que afectan vías intracelulares o metabólicas intermedias. Las displasias pueden ser metabólicas y no metabólicas. Ejemplo de displasia no metabólica son el síndrome Beckwith-Wiedemann, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa, von Hippel-Lindau, Cowden, síndrome Proteus, MEN, síndrome Pallister- Hall y síndrome Marfan. Displasias metabólicas como síndrome Zellweger y síndrome Smith- Lemli-Opitz, (Gilbert et al., 2014). 5.3.4 Clasificación en base a su etiología Monogénica. Representan el 10 -15% Cromosómicas. Representanel 5 -10% de los casos de anomalías congénitas. Infecciones o teratógenos. Representan el 10% Poligénica / multifactorial. Representa el 30 - 40% Desconocida. Representa el 30 - 50% 6. Niños con anomalías congénitas múltiples El término de anomalías congénitas múltiples (ACM) se aplica usualmente a niños con dos o más anomalías mayores o tres o más anomalías menores. Las ACM se definen como dos o más anomalías mayores, con la exclusión de las secuencias y síndromes, (Garne et al., 2011) Si se encuentra una etiología o diagnóstico para dicho patrón de ACM, se sustituye éste término por el correspondiente diagnóstico, v. gr. síndrome Down, asociación VACTERL, otros. Por lo anterior, el término de ACM se reserva para aquellos casos en que no se encuentra un diagnóstico o una etiología que explique dicho patrón de anomalías, por lo que también son llamados polimarformados en sentido estricto o sin diagnóstico. Los defectos al nacimiento afectan de 3 a 5% de todos los recién nacidos en Estados Unidos; el 0.7-1% de todos los recién nacidos, tienen ACM o síndrome, (Repetto, 2012). De acuerdo a la base de datos de la EUROCAT en un estudio de 17,733 casos de anomalías congénitas mayores, se encontró que el 7% tienen ACM, 15% anomalías cromosómicas, 2% síndromes monogénicos y 76% como anomalías congénitas aisladas, (Garne et al., 2011). ACM son causadas por aberraciones cromosómicas, mutaciones genéticas y factores teratógenicos, (Czeizel et al., 2008). Aproximadamente el 40 – 60 % de las anomalías congénitas no tiene un origen conocido. El 20% son resultado de factores genéticos y ambientales. 7.5% son causados por mutaciones en un único gen, 6% son causados por anomalías cromosómicas y 5% son causados por enfermedad materna. El riesgo de recurrencia de ACM es de 5%. Especialidad en Genética Médica 7 7. Discapacidad intelectual en niños La discapacidad intelectual (DI) es un trastorno de inicio en el periodo de desarrollo que caracteriza por limitaciones en la inteligencia y las habilidades de adaptación, en los dominios conceptual, social y practico (DSM-V). El inicio de la discapacidad debe ocurrir antes de los 18 años. De acuerdo al manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales la discapacidad intelectual se define como un IQ de 70 o menos, en una prueba estandarizada de inteligencia y aplicada individualmente. El término sustituye y mejora el antiguo término de retraso mental. El termino retraso global del desarrollo se utiliza generalmente para describir a los niños menores de 5 años que no cumplan los hitos de desarrollo esperados y tienen déficit en múltiples áreas de funcionamiento. La prevalencia de la discapacidad intelectual se estima en 7.5 por cada 1000 individuos de la población general. Es dos veces más común en los hombres en comparación con las mujeres. El riesgo de recurrencia de la discapacidad intelectual en las familias con antecedente de un niño con discapacidad intelectual grave es de 3 al 9%. La mayoría de los individuos tienen intelectual leve la discapacidad y la causa general no se identifica. Un pequeño porcentaje de los individuos tienen déficits severos y necesitarán apoyos de toda la vida, (Patel et al. 2011) En Europa central, el gasto de la atención sanitaria en la DI según la clasificación internacional de enfermedades (CIE) representa representa el 8% del coste, superando los gastos que se relacionan con otras categorías de la CIE. Además el impacto en la persona y la sociedad, la discapacidad suele crear grandes desafíos para los miembros sanos de la familia, que a menudo tienen que proporcionar una amplia atención y a veces experimentan una importante restricción de la libertad personal, (Rauch et al. 2006). Aunque el conocimiento de la etiología de la DI por lo general no permite un tratamiento, es útil para el manejo de la enfermedad, así como para la aceptación de la discapacidad, la conexión con otros padres y grupos de apoyo. El diagnostico causal proporciona un alivio emocional significativo y duradero para los padres, (Rauch et al. 2006). Los siguientes 3 criterios deben cumplirse: a) Déficits de las funciones intelectuales, como razonamiento, resolución de problemas, planificación, pensamiento abstracto, juicio, aprendizaje académico y el aprendizaje de la experiencia. Confirmada por la evaluación clínica y la prueba estandarizada de inteligencia individualizada. b) Déficit en la función adaptativa, tales como la comunicación, participación social y la vida independiente, en diferentes medios como el hogar, la escuela, el trabajo y la comunidad. c) El inicio de las deficiencias intelectuales y de adaptación durante el periodo de desarrollo. Especialidad en Genética Médica 8 De acuerdo a la severidad la discapacidad intelectual se clasifica, (Escala de Inteligencia de Wechsler): 1. Leve: Coeficiente intelectual en rangos de 50-55 a 70, representa el 85% de los casos 2. Moderada: Coeficiente intelectual en rangos de 35-49 a 50-55, está presente en el 10% de casos 3. Severa: Coeficiente intelectual en rangos de 20-25 a 35-40, presente en el 4% de los casos 4. Profunda: Coeficiente intelectual menor que 20-25 Presente en el 1% de casos La DI también se clasifica en sindromatica y no sindromatica. La DI sindromica, los pacientes presentan una o múltiples características clínicas o comorbilidades además DI. La DI no sindromica definida por la presencia por la presencia de DI como la única característica clínica, (Kaufman et al. 2010). 7.1.1. Etiología de la discapacidad intelectual DI puede ser causada por factores ambientales y/o genéticos. Sin embargo, hasta el 60% de los casos, no hay causa identificable. La exposición ambiental a determinados teratógenos, los virus, la radiación pueden provocar DI, el traumatismo craneoencefálico o la falta de oxígeno al cerebro, explican algunos casos de DI no sindromica, (Kaufman et al. 2010). El cromosoma X ha sido un objetivo en muchos estudios en busca de las causas de DI no sindromatico debido a la mayor afectación de hombres que mujeres, hay aproximadamente 40 genes que se sabe causan DI no sindromatica y el 80% de ellos residen en el cromosoma X, algunos de estos genes causan DI sindromatica y DI no sindromatica, (Kaufman et al. 2010). 1. Causas genéticas. Las causas genéticas de la DI están presentes en el 25- 50% de los casos, aunque este porcentaje aumenta con la gravedad, (Kaufman et al. 2010). La DI es causado por alteraciones cromosómicas, microdeleciones (Un 10% de los pacientes con DI son portadores de microdeleciones o duplicaciones), variaciones en el número de copias, anormalidades en la codificación de un gen y DI asociada al cromosoma X. Algunos ejemplos de enfermedades genéticas son el síndrome Down, síndrome X frágil, y la fenilcetonuria. 2. Causas gestacionales. La DI puede resultar cuando el bebé no se desarrolla correctamente dentro de la madre. Por ejemplo, Una mujer que bebe alcohol o tiene una infección como rubéola durante el embarazo también puede tener un bebé con DI. 3. Causas perinatales. Por ejemplo la encefalopatía hipoxico isquémica. 4. Problemas de salud. Enfermedades como la tos ferina, el sarampión o meningitis pueden causar DI. También pueden ser causada por desnutrición extrema, o por la exposición a sustancias tóxicas como el plomo o el mercurio. Especialidad en Genética Médica 9 El rendimiento de las pruebas genéticas en la identificación de causas genéticas de DI varía del 2 a 7%. 8. Ligamiento multiplex-dependiente de amplificación de sonda (MLPA) La técnica de amplificación de sondas dependientes de ligandos múltiplex (MLPA, por sus siglas en Inglés) fue desarrollada Schouten et al., (2002) en un centro de investigación de Microbiología en Holanda. Es un método de PCR multiplex, que permite que en una misma reacción se pueda detectaranormalidades en el número de copias de hasta 50 secuencias genómicas diferentes de DNA o ARN, es capaz detectar secuencias que difieren en solo nucleótido. Es relativamente fácil de realizar ya que únicamente requiere un termociclador y un equipo de electroforesis. La técnica de MLPA se basa en una primera reacción de unión-ligación de sondas con la zona homologa de interés, solo las sondas que hayan hibridado podrán ser ligadas y posteriormente amplificadas por PCR. Mediante el análisis de fragmentos y aprovechando la diferencia de tamaño de cada una de las sondas, se podrán identificar aberraciones en el número de copias genómicas. Hasta 96 muestras se pueden procesar al mismo tiempo, con resultados en 24 horas. La técnica MLPA posee muchas aplicaciones, incluyendo la detección de mutaciones, el diagnóstico molecular de enfermedades genéticas caracterizadas por la presencia de metilación anormal del ADN, la cuantificación relativa de ARNm, la detección de variaciones en el número de copias del genoma, la detección de duplicaciones y deleciones de genes específicos, determinación de aneuploidias, MLPA posee un gran potencial para el diagnóstico prenatal. 8.1 Ventajas de MLPA para el estudio genético MLPA ofrece múltiples ventajas respecto a otras técnicas que existen en el mercado para la detección de alteraciones en el número de copias genómicas. Las técnicas inicialmente desarrolladas para la detección de mutaciones puntuales, como la secuenciación y la cromatografía liquida de alta eficacia desnaturalizante (DHPLC), generalmente no logran detectar cambios en el número de copias. El análisis Southern pone de manifiesto muchas aberraciones pero no siempre detecta pequeñas deleciones. La reacción en cadena de la polimerasa PCR detecta amplificaciones y deleciones bien caracterizadas (se utiliza cuando se conoce el sitio exacto de la mutación), pero el punto exacto de interrupción de la mayoría de las deleciones se desconoce. Al comparar MLPA con hibridación in situ fluorescente (FISH), la MLPA no solo representa una técnica multiplex sino que también permite identificar aberraciones que resultan demasiado pequeñas (50-70 nt) para ser detectadas por FISH. Finalmente al cotejarla con hibridación genómica comparada (CGH array), MLPA es una técnica de bajo costo y sencilla porque solo requiere de un termociclador y un equipo de electroforesis. MLPA no es útil para el cribado de todo genoma. Motivos por los cuales debe considerarse a la MLPA como la primera alternativa en estudio genético de enfermedades que van desde las clásicas 9 Especialidad en Genética Médica 10 (Duchene, síndrome DiGeorge, SMA), a las más raras (pancreatitis hereditaria, deficiencia de antitrombina) (Tabla 1). Al principio, la detección de deleciones/duplicaciones de genes se basaba principalmente en el uso de Southern Blot y técnicas de FISH. Sin embargo, ambos métodos consumen mucho tiempo y tienen un bajo rendimiento y no son capaces de detectar pequeños reordenamientos intragénicos. El estudio MLPA representa el estándar de oro para el análisis molecular de todas las patologías derivadas de la presencia de variaciones en el número de copias de varios genes, (Stuppia et al., 2012). MLPA, es una técnica semicualitativa, capaz de determinar ganancias o pérdidas en el número de copias de regiones genómicas específicas. Algunas de sus características son su fácil aplicación y bajo costo (Caceres et al., 2011). Debido a su bajo costo, confiabilidad y facilidad de aplicación se ha convertido en una técnica muy popular para la investigación, identificación de alteraciones cromosómicas y como herramienta de diagnóstico, (González et al., 2008). Tabla 1. Comparación entre MLPA y otros métodos para la detección de deleciones/duplicaciones. METODO VENTAJAS DESVENTAJAS MLPA • Detecta pequeños reordenamiento • Hasta 40 objetivos • Alto rendimiento • Bajo costo • No se puede detectar la pérdida neutral de copias de heterocigosidad. • Puede tener problemas con mosaicismo, la heterogeneidad en tumores, o contaminación con las células normales. FISH • Detecta reordenamientos equilibrados • Detecta mosaicismo • Detecta la heterogeneidad del tumor • Puede cuantificar varias copias • No se puede detectar la pérdida neutral de copias de heterocigosidad. • No se puede detectar reordenamientos pequeñas (por ejemplo, deleciones <100 kb o duplicaciones> 500 kb). • Número limitado de objetivos y rendimiento. PCR Cuantitativa • Detecta pequeños reordenamientos e incluso mutaciones puntuales • Pueden cuantificar varias copias • Optimización y eficiencia de prueba es una preocupación. • Número limitado de objetivos. • Puede tener problemas con mosaicismo, la heterogeneidad del tumor, o contaminación con las células Especialidad en Genética Médica 11 • Bajo costo normales. Southern blot • Detecta pequeños reordenamientos • Detecta mosaicismo • No se puede detectar la pérdida neutral de copias de heterocigosidad. • No cuantitativa. • Laborioso y lleva mucho tiempo • Número limitado de objetivos y rendimiento. CGH array • Puede detectar muy pequeñas reordenaciones • Puede investigar el genoma completo • Bajo costo por punto de datos • No se puede detectar la pérdida neutral de copias de heterocigosidad • Costosos equipos y reactivos • Bajo rendimiento SNP array • Puede detectar pérdida neutra copia o heterocigosidad • Puede investigar el genoma completo • Bajo costo por punto de datos • No se puede detectar reordenamientos pequeñas (por ejemplo, deleciones o duplicaciones <100 kb). • Costosos equipos y reactivos • Bajo rendimiento Fuente: Tomado de Stuppia et al. (2012). 8.2. Ensayo de MLPA La sonda de MLPA consiste en dos sondas de oligonucleótidos. Cada locus amplificable por PCR consiste en dos hemisondas, cada una de las cuales contiene la mitad de la secuencia blanco, fragmento primer variable en tamaño y unos de los primer necesarios para la amplificación. Una diferencia entre la MLPA y la PCR multiplex estándar, la MLPA utiliza un único par de primer para amplificar todas las secuencias. El resultado de la amplificación de productos de KIT SALSA MLPA está en rangos de entre 130 – 480 nt (nucleótidos), en longitud y puede ser analizado por electroforesis capilar. La reacción de MLPA se puede dividir en cinco pasos: (1) desnaturalización del ADN y la hibridación de sondas de MLPA; (2) reacción de ligación; (3) amplificación por PCR; (4) la separación de los productos de amplificación por electroforesis; (5) el análisis de datos, (Figura 2). 12 Especialidad en Genética Médica 12 Figura 2. Pasos de la reacción de MLPA. Fuente: MRC Holland™. En el primer paso, el ADN se desnaturaliza y se incuba con una mezcla de sondas de MLPA. Cada sonda de MLPA consiste de dos oligonucleótidos separados, las dos sondas de los oligonucleótidos hibridan inmediatamente junto a las secuencias blanco, solo cuando las dos sondas hibridan en las zonas blanco pueden ser ligadas durante la reacción de ligación. Solo las sondas ligadas pueden ser amplificadas por PCR, una de las sondas del par de primer está marcada con fluorescencia. Los productos de amplificación son separados usando electroforesis capilar. Las sondas de oligonucleótidos que no se ligan no pueden ser amplificadas por lo que no generan una señal. La eliminación de sondas que no ligan es innecesaria lo que hace de la MLPA una técnica sencilla. El análisis se realiza mediante la medición de los picos o áreas de fluorescencia comparándolo con muestras de ADN control. Por lo tanto, el MLPA solo utiliza un par de primers para la amplificación, mientras que la PCR múltiplex típica requiere el uso de primers de PCR específicos para cada secuencia diana. 13Especialidad en Genética Médica 13 Las dos etapas principales de un análisis MLPA son la normalización y la inferencia de alteraciones en el número de copias. Normalización para controlar la variación de la eficiencia de la PCR se hace a través del uso de sondas control. El método más simple de normalización, determina la señal normalizada de cada sonda en una muestra dada dividiendo la intensidad máxima por la suma de todas intensidades de pico de la muestra. Este método fue inicialmente propuesto y recomendado por MRC-Holand. Porcentajes inferiores a 0,7 se consideran pérdidas y relaciones de más de 1.33 son ganancias en el número de copias. MLPA se basa en comparación de intensidades de los picos de las diferentes sondas entre la muestra estudiada y las muestras de control, (González et al. 2008). Pocos métodos se han desarrollado para detectar CNV (variaciones en el número de copias) a partir de datos de MLPA, algunos de los que se ofrecen como Coffalyser que es el software más utilizado, un programa basado en Excel capaz de realizar todos los pasos de normalización de datos y correcciones para la señal pendiente. Se recomienda el Coffalyser por su facilidad de uso, el software requiere una licencia Microsoft de Office para operar y, no incorpora los últimos adelantos en el análisis de los datos de MLPA (Caceres et al., 2011). Más recientemente, Van Eijk et al. desarrolló MLPAinter, una herramienta para la visualización y el control de calidad de los datos MLPA. Una herramienta especialmente útil para manejar una gran cantidad de muestras. MLPAstats es una herramienta para evaluar la significancia de la diferencia de los picos entre casos y controles. Considerando una ganancia relativa (1), la pérdida de (-1) o sin cambio (0). 8.3 Variaciones de la MLPA Pocas variaciones de MLPA se han desarrollado, como la RT-MLPA (Transcriptasa reversa MLPA), se utiliza para el perfil de ARNm, para la detección de ARNm de diversos genes de la apoptosis y la inflamación. La RT-MLPA ofrece varias ventajas en comparación con otras técnicas de perfiles de expresión (Transferencia Northerm, PCR en tiempo real y microarrays). En primer lugar permite el rápido procesamiento de numerosas muestras en una PCR estándar de formato de 96 pocillos. En segundo lugar el análisis de RT-MLPA es sencilla y aporta información cuantitativa sobre el tamaño medio del gen. Aunque la cantidad preferida de muestra de ARN es de 20 a 200 ng, RT-MLPA se ha utilizado con éxito en poca muestra, 5-10 ng. La MS-MLPA (MLPA de metilación) es otra variación de la MLPA que se utiliza para la cuantificación del número de copias y perfiles de metilación. Es un método semicuantitativo para perfiles de metilación, en la que la detección del número de copias se combina con el uso de una enzima de restricción sensible a la metilación, es ampliamente utilizado en la detección de alteraciones epigenéticas. Útil para la detección de enfermedades de impronta como síndrome Angelman, Prader Willi y Beckwith Wiedemann. En el análisis de errores de metilación en muestras de tumores, para examinar la inactivación transcripcional de genes supresores de tumores que pueden dar lugar a la progresión del tumor o la resistencia a los Especialidad en Genética Médica 14 agentes quimioterapicos. La detección de patrones de metilación aberrantes, se puede utilizar para examinar el tipo de tumor más de cerca. 8.4. Limitaciones de la técnica de MLPA Se requieren entre 100 a 200ng de muestra de ADN para obtener resultados confiables y reproducibles. Las reacciones de MLPA son más sensibles a contaminantes y a la degradación del ADN que la PCR convencional. La detección de deleciones que implican un solo exón deben ser analizadas por otro método. Puede ser capaz de discriminar mutaciones puntuales conocidas. En comparación con FISH el MLPA no puede ser utilizado para estudiar células individuales. No detecta mosaicos. MLPA es también incapaz de detectar reordenamientos equilibrados, ya que esta técnica se basa en la comparación de cantidades de ADN de un paciente frente a un control. Actualmente existen en el mercado más 300 sondas dedicadas al estudio de distintas enfermedades. 8.5 Aplicaciones de la MLPA Trastornos Neuromusculares. Varios tipos de trastornos neuromuscular heredados son debidos a deleciones o duplicaciones de genes específicos. Entre estos, Distrofinopatias (distrofia muscular de Duchenne y Distrofia Muscular Becker), atrofia muscular espinal (SMA) y la neuropatía hereditaria de Charcot Marie Tooth representan una gran parte de las enfermedades neuromusculares. Análisis del gen SHOX. El gen SHOX, asignado en la Región pseudoautosómica de los cromosomas X e Y, está implicado en la regulación del crecimiento y se relaciona con diferentes enfermedades como el síndrome de Turner (TS), estatura corta idiopática (ISS), discondrosteosis de Leri Weill (LWD) y la enfermedad de Langer (LS). La mayoría de las mutaciones que causan deficiencia de SHOX están representadas por deleciones dentro de la región codificante de este gen. Los principales enfoques utilizados originalmente para la detección de deleciones eran FISH o el análisis de microsatélites, que son estudios no útiles para su aplicación en un programa de cribado, y también teniendo en cuenta que la baja estatura es una condición muy común que afecta a aproximadamente 3 % de la población. El estándar de oro para la detección de deleciones en SHOX es el MLPA. El MLPA es capaz de detectar diferentes reordenamientos del gen SHOX (incluyendo pequeñas deleciones intragénicas no detectables por el análisis FISH) Diagnóstico prenatal. MLPA es una prueba rápida, flexible, sensible y robusta para la detección prenatal de aneuploidías. Van Opstal et al. Informo de un estudio prospectivo sobre 4.000 muestras utilizando MLPA para detectar aneuploidías de 13, 18, 21, X e Y cromosomas, obteniendo 3932 concluyentes (98,3%) y 68 (1,7%), los resultados no concluyentes. El estudio MLPA parece ser un buen candidato para reemplazar el análisis FISH de interface para la detección de aneuploidías cromosómicas más comunes, aunque el cariotipo sigue siendo el estándar de oro para el diagnóstico prenatal completo. Especialidad en Genética Médica 15 Cáncer. Varios estudios han investigado la utilidad del análisis MLPA en el estudio molecular de diferentes formas de cáncer. Las tres principales aplicaciones del estudio MLPA en este campo son: análisis de deleciones / duplicaciones en la línea germinal en los genes relacionados con cánceres hereditarios; el análisis de deleciones / duplicaciones somáticas en los genes implicados en la progresión de la enfermedad y a la respuesta a la terapia; análisis de la metilación del ADN como un mecanismo de inactivación de los genes supresores de tumores. 8.6. MLPA en pérdidas o ganancias genómicas o cromosómicas En niños con ACM y/o DI la técnica de MLPA ha resultado de utilidad para identificar péridas o ganancias genómicas a nivel subtelomérico o bien para la identifación de microdeleciones en síndromes tanto comunes (v. gr. síndrome Prader-Willi, Williams, otros) como de díficil reconomiento clínico (microdeleción 2p16, microdeleción 17q21, otros). 8.7. MLPA y anomalías congénitas múltiples Las anomalías congénitas múltiples afectan aproximadamente al 3% de los recién nacidos. La capacidad del cariotipo convencional para detectar anomalías cromosómicas en los recién nacidos varía considerablemente del 3 a 15%. Usando FISH, GWAS y MLPA casi duplica la tasa de detección de anomalías cromosómicas en ACM/DI. El GWAS solo detecta solo detecta el 99% de todas las alteraciones cromosómicas, por tanto se considera que el GWAS debe sustituir al cariotipo convencional, pero su alto costo hace difícil su implementación. Por tanto la MLPA por su bajo costo, rapidez hace que sea una alternativaviable en estos pacientes con ACM/DI. 8.8. MLPA y discapacidad intelectual DI es un problema común que afecta aproximadamente al 1-3% de la población, pero varia en diferentes estudios de 1 a 10%. La causa de la discapacidad intelectual sigue siendo desconocida hasta en el 80% de los pacientes, (Rauch et al. 2006). Se estima que la mitad de los casos se deben a factores genéticos, las aberraciones cromosómicas la causa más común. Varios métodos basados en FISH, PCR, array y estudios del genoma completo ha sido desarrolladas en los últimos años para aumentar la tasa de detección de aneusomias inicialmente de las regiones subtelomericas, (Rauch et al. 2006). La MLPA es una técnica rápida, fácil de interpretar y rentable, sigue siendo el método de elección para el cribado de grandes cohortes de pacientes con DI en países en desarrollo. Los reordenamientos subtelomericos submicroscopicos han sido durante mucho tiempo implicados en la etiología de la DI no sindromatica. Estos reordenamientos incluyen deleciones, translocaciones equilibradas y otras aberraciones que no pueden ser vistas bajo el microscopio. Las regiones subtelomericas son un foco análisis para los reordenamientos subtelomericos, como la densidad de genes en esta región es mayor que en el resto del genoma, (Kaufman et al. 2010). Especialidad en Genética Médica 16 Aproximadamente la mitad de las aneusomias segmentarias implican regiones subtelomericas y terminales de los cromosomas. Los reordenamientos subtelomericos han demostrado ser causa significativa de DI en muchos estudios cromosómicos y se cree que son responsables de 3-6% de los casos, y aproximadamente el 50% de ellos son hereditarios, (Kaufman et al. 2010). El numero genes cuyo defecto puede dar lugar a discapacidad intelectual es grande. En algunos casos las características fenotípicas sugieren la implicación de un gen o región cromosómica. Sondas de MLPA se encuentran disponibles para encontrar la causa del retraso mental sindromatico, tales como síndrome Rett, Sotos, Prader- Willi/Angelman. Para los pacientes con discapacidad intelectual no sindromatico la causa genética se encuentra en una minoría. Por lo general la detección primaria se realiza mediante cariotipo, cuando no se detecta anomalía se sugiere el uso de las siguientes sondas: • SALSA Probemix MLPA P245 para síndromes de microdelecion (21 síndromes de microdelecion distintos). • SALSA Probemix MLPA P036 para telomeros. 8.9. Combinación de kits de MLPA de utilidad en el estudio de niños con ACM/DI Salsa MLPA P036 human telomere-3 probemix Aproximadamente el 3-8% de todos los casos de discapacidad intelectual es causado por variaciones en número de copias de regiones subtelomericas. Esta salsa MLPA P036 contiene una sonda MLPA para cada región subtelomerica y está diseñada para detectar deleciones y duplicaciones de regiones subtelomericas. Los cromosomas acrocentricos 13, 14, 15, 21 y 22, tienen más de 10 Mb de secuencias de repetidos. También incluye dos sondas no telomericas para secuencias especificas del cromosoma Y. Debido a un aumento en la frecuencia de variaciones en el número de copias (CNV) cerca de los telomeros en los individuos sanos, se recomienda investigar más a fondo cualquier anomalía detectada. Las deleciones y duplicaciones detectados por MLPA siempre deben ser confirmados por otros métodos. Salsa MLPA P070 human telomere-5 probemix Esta salsa contiene una sonda para cada región subtelomerica y está diseñada para detectar deleciones y duplicaciones subtelomericas. La mayoría de las sondas están diseñadas para un gen bien caracterizado cerca del telómero. Para la confirmación de resultados sonda MLPA P036 puede ser usada. No todas las deleciones y duplicaciones detectadas serán patogénicas, especialmente en el caso de subtelomericas. Salsa MLPA P245 síndromes de microdeleción Especialidad en Genética Médica 17 Desarrollada para el estudio de pacientes que presentan retraso en el desarrollo o DI inexplicable. Los resultados que sugieren una deleción o duplicación de origen cromosómico deben ser confirmados por otras técnicas o por sondas MLPA específicas. Está limitada a un número de sondas para cada región cromosómica específica y no detecta todas las posibles causas de los síndromes incluidos. Varios de estos síndromes de microdeleciones son de diagnóstico clínico difícil, por lo que este kit de MLPA constituye una importante herramienta para el diagnóstico. Tabla 2. Síndromes microdeleción detectados con la sonda P245 de MLPA. REGION AFECTADA TRASTORNO HALLAZGOS CLINICOS 1p36 Síndrome deleción 1p36 Discapacidad intelectual, hipotonía, disgénesia cerebrales, anomalías congénitas del corazón, anomalías visuales y fontanela anterior amplia. 2p16 Síndrome deleción 2p16 Discapacidad intelectual, rasgos autistas, microcefalia progresiva, ptosis palpebral e hipoplasia nervio óptico 2q23/MBD5 Síndrome microdelecion 2q23 Discapacidad intelectual grave, hiperactividad, risa inapropiada, microcefalia, talla baja y convulsiones 2q33/SATB2 Síndrome Glass Discapacidad intelectual, microcefalia, fisuras palpebrales hacia abajo, dientes apiñados, paladar hendido y convulsiones 3q29 Síndrome microdelecion 3q29 Discapacidad intelectual de leve a moderada, autismo, marcha atáxica, microcefalia, labio y paladar hendido 9q22.3 Síndrome Gorlin Craneosinostosis sutura metopica, hidrocefalia obstructiva, convulsiones, calcificación de la hoz del cerebro, carcinoma de células basales de la piel y hoyuelos en piel de palmas y plantas. 15q24 Síndrome microdelecion 15q24 Discapacidad intelectual, fisuras palpebrales oblicuas hacia abajo, hipotonía, hernia diafragmática y ano imperforado. 17q21 Síndrome Koolen De Vries Discapacidad intelectual de moderada a severa, hipotonía, cara alargada, anomalías cardiacas y genitourinarias. 22q13 Síndrome Phelan-‐ McDermid Hipotonía neonatal, retraso global del desarrollo, crecimiento normal o acelerado, dolicocefalia y orejas grandes. 5p15 Síndrome Cri du Chat Llanto característico, fisuras palpebrales oblicuas hacia arriba, discapacidad intelectual, microcefalia y micrognatia 18 Especialidad en Genética Médica 18 22q11 Síndrome Di George Leve a moderada deficiencia inmune, anomalía cardiaca, hipoparatiroidismo, anomalías oculares y renales y paladar hendido. Región distal 22q11 Síndrome deleción distal 22q11 Deficiencia de células T, arco aórtico interrumpido, estenosis de coanas, retrognatia, orejas pequeñas. 10p15 Síndrome Di George 2 Defectos septum interventricular, aneurismas septum ventricular y defectos del tabique auricular. 8q Síndrome Langer-‐ Giodion Discapacidad intelectual, exostosis múltiple cartilaginosa, nariz bulbosa, cabello escaso y micrognatia. 17p Síndrome Miller-‐Dieker Lisencefalia, hipoplasia de cuerpo calloso, retraso psicomotor, micrognatia, microcefalia, convulsiones. 17q11.2 Síndrome microdelecion NF1 Retraso psicomotor, neurofibromasde inicio temprano, manchas café con leche, microcefalia, nódulos de Lisch 15q11-‐q13 Síndrome Prader-‐Willi/Angelamn Hipotonía, dificultad para succión, discapacidad intelectual, obesidad/ escasa coordinación motriz, problemas de equilibrio, ataxia, estado aparente de alegría. Duplicación MECP2/Xq28 Síndrome Rett Sexo femenino, discapacidad intelectual de leve a severa, movimientos estereotipados de las manos 16p13.3 Síndrome Rubinstein-‐Taybi Pulgares anchos, discapacidad intelectual moderada a grave, fisuras palpebrales oblicuas hacia abajo 17p11.2 Síndrome Smith-‐Magenis Retraso psicomotor, alteraciones de comportamiento, hipotonía, hiporreflexia, letargo generalizado, hiperactividad e impulsividad. 5q35.2-‐q35.3 Síndrome Sotos 5q35.3 Sobrecrecimiento, acromegalia, discapacidad intelectual, paladar alto, prognatismo y edad osea avanzada 7q11 Síndrome Williams Hipercalcemia, estenosis de la aorta supravalvular, hipertensión e iris stellata 4p16.3 Síndrome Wolf-‐Hirschhorn Microcefalia, puente nasal ancho en casco griego, micrognatia, asimetría facial, orejas grandes y protuberantes Fuente: Modificado de Wilson y Cooley (2000). Especialidad en Genética Médica 19 9. Definición y planteamiento del problema Existe una gran cantidad de pacientes con ACM/DI en nuestro medio en los que no se ha llegado al diagnóstico, los cuales representan aproximadamente el 50% de casos. Un 3% a 8% de los casos de retraso mental son causados por variaciones en el número de copias de regiones telomericas. 10. Pregunta de investigación ¿Cuál es la frecuencia de detección de pérdidas o ganancias cromosómicas en pacientes con anomalías congénitas múltiples y discapacidad intelectual evaluadas mediante el uso combinado de kits de MLPA? 11. Magnitud Los pacientes agrupados como con ACM/DI comprenden un grupo amplio y heterogéneo de enfermedades que afectan a aproximadamente el 3% de los recién nacidos. Un porcentaje estimado en más del 40-60% de pacientes con ACM/DI quedan sin un diagnóstico definitivo, con sus consecuentes implicaciones para estas familias durante el asesoramiento genético y la capacidad de cariotipo convencional para detectar anomalías cromosómicas en estos pacientes varía considerablemente, desde 3% hasta un 15%, dependiendo de la selección de los pacientes y la inclusión del síndrome de Down en las cohorte. Un 3% a 8% de los casos de ACM/DI son causados por variaciones en el número de copias de regiones subteloméricas y un número similar se explica por microdeleciones en otras regiones de los cromosomas. 12. Antecedentes Cariotipo convencional detecta anomalías en 3 a 15% de los pacientes con anomalías congénitas múltiples. La MLPA proporciona una mayor detección que el cariotipo convencional, un menor coste que el estudio de asociación del genoma completo, GWAS. El GWAS detecta el 99% de todas alteraciones cromosómicas seguido del FISH, pero por su alto costo se hace difícil su aplicación, (Jehee et al., 2011). La mayoría de las enfermedades hereditarias humanas se deben a alteraciones en la secuencia de ADN (mutaciones puntuales), deleciones o duplicaciones de genes representan una parte relevante (aproximadamente 5%) de todas las mutaciones causantes de enfermedades, y en algunos casos son los más causa frecuente de una enfermedad genética, (Stuppia et al., 2012). Estudio de Jehee et al. (2011), incluyó 261 individuos a los que se les realizo análisis de cariotipo y MLPA, revelaron desequilibrios cromosómicos en 87 (33,3%) pacientes. Cariotipo convencional detectó 17 de la anomalías (6,5%), mientras que MLPA identificó 83 (31,8%). En los pacientes con cariotipo normal, desequilibrios subtelomericos microscópicos se encontraron en 19 pacientes (7,3%), 11 de ellos Especialidad en Genética Médica 20 eran terminales o deleciones crípticas, y el resto eran translocaciones balanceadas 57 (21.8%). Estudio de Pohovski et al. (2013) incluyo 150 pacientes con DI inexplicable con o sin rasgos dismorficos o anomalías congénitas. Utilizo dos kits de MLPA, P036, PO70 para deleciones subtelomericas y el kit MLPA P245 para síndromes de microdelecion. El análisis subtelomerico con ambas sondas se realizó en todos los pacientes. En 21 (14%) se encontró que tenían desequilibrios cromosómicos, 11 (7.3%) reordenamientos subtelomericos, 10 microdeleciones y 9 pacientes desequilibrios subtelomericos. En tres pacientes los desequilibrios fueron detectados por SALSA MLPA P036. De las 10 microdeleciones 5 correspondieron a síndrome DiGeorge, dos síndromes microdelecion 17q21.31, un síndrome microdelecion 15q24, un síndrome Prader-Willi/Angelman y un síndrome Langer-Giedion. Todos los desequilibrios fueron verificados por kits MLPA de seguimiento, y es el primer estudio que utiliza kits MLPA para la confirmación y para establecer el tamaño aproximado de los desequilibrios. Pruebas confirmatorias con kits de MLPA en combinación con cariotipo de alta resolución y/o revisión de los hallazgos clínicos es en la mayoría de los casos suficiente para establecer el diagnostico. Varios estudios han demostrado la viabilidad de CGH array o MLPA como pruebas de primera línea en la detección desequilibrios cromosómicos constitucionales crípticos. La MLPA comparada con la CGH array es una técnica rápida, de bajo costo y una opción razonable para los pacientes con DI. En pacientes con DI y cariotipo normal la MLPA para cribado subtelomerico ha identificado desequilibrios patogénicos en 2.9 a 5.3% de los pacientes. La incidencia de síndromes de microdelecion y microduplicación fue 6.6%, el síndrome Di George fue la alteración más frecuente, que se encuentra en el 3.3% de los pacientes y representa una cuarta parte de todas las aberraciones detectadas y va de acuerdo a otros estudios. En este estudio todos los pacientes fueron evaluados por genetista clínico y tenían un cariotipo de rutina normal. Estudio Mundhofir et al. (2013), incluye 436 pacientes con DI inexplicable, en los cuales utilizaron la SALSA MLPA P070 y P036 para desbalances subtelomericos. Los resultados anormales fueron confirmados con otros kits MLPA, FISH y SNP. Como resultado encontraron alteración subtelomerica en el 3.7% de los pacientes. Con la SALSA P070 se encontró deleción o duplicación subtelomerica en 23 de los 436 pacientes. En 20 de estos pacientes la alteración fue confirmada por la SALSA P036, en tres casos no pudo confirmarse. La prueba a los padres fue posible en 8 de los 20 pacientes, puso de manifiesto una ocurrencia de novo en 5 casos. Concluyendo que los reordenamientos subtelomericos son una causa importante de DI. Estudio Wu et al. (2010), incluyo 451 niños chinos con moderado a severo retraso del desarrollo y DI inexplicable. Fueron evaluados con SALSA MLPA subtelomericas P070 y P036 y SNP array para determinar variaciones en el número de copias. Alteraciones subtelomericas fueron identificados en 23 pacientes, con una tasa de detección de 5.1%, 16 pacientes con deleción simple, 2 con duplicación y 5 con deleción y duplicación. La deleción más común fue la 4p16.3. Se realizó MLPA a los Especialidad en Genética Médica 21 padres de pacientes con alguna alteración subtelomerica, no encontrándose reordenamientos. Ahn et al. (2007), estudio 208 pacientes para la detección desequilibrios subtelomericos y validación de la técnica MLPA. 124 pacientes con diagnóstico previo de anomalías cromosómicas se utilizaron en el estudiode validación. Los casos de anomalías incluían trisomía 13, 18 y 21, delaciones, duplicaciones, anomalías en cromosomas sexuales y alteraciones submicroscopicas identificadas por FISH. Otros 84 pacientes para el estudio de detección desequilibrios fueron incluidos. Utilizo cuatro sondas de MLPA subtelomericas (MRC-Holland), P019, P020, P036 AY B y P069. Todas las muestras de los pacientes fueron probadas con una combinación de P019 + P020, P036 A/B y P069. Todas las anomalías subtelomericas identificadas por MLPA se probaron posteriormente utilizando sondas subtelomericas específicas del cromosoma de Abbott-Vysis o MP Biomedicals. Análisis FISH multisubtelomerico se llevó a cabo. Como resultado todas las regiones subtelomericas anormales conocidas fueron correctamente identificadas. En tres casos con anomalías conocidas, la anomalía solo se detectó por una de las dos sondas de MLPA. Un paciente quien había sido previamente diagnosticado con monosomia 2q37 mediante cariotipo con bandeo G mostro un numero normal de copias de esta región por MLPA. En un paciente se encontró una deleción por la técnica de MLPA, mientras que el estudio FISH resulto normal. Los resultados de validación mostraron que la técnica MLPA es altamente eficiente para la detección de desequilibrios subtelomericos, con intervalos de confianza del 95%. Además en este estudio fueron evaluados 455 pacientes, MLPA subtelomericos detecto anormalidades en el número de copias en 27 (5,9%). En uno de ellos se encontró una duplicación (22q; 1 sonda) y deleción (9q; 2 sondas) que no habían sido detectados por el análisis cromosómico de bandas G. Tres resultados fueron confirmados posteriormente por otras técnicas, ya sea FISH o mediante pruebas de otros miembros de la familia. En 13 casos se encontró una deleción, tres de las cuales fueron intersticiales y duplicaciones en 15 casos, seis de las cuales fueron intersticiales. En seis casos se trató de una anomalía de novo. Siete casos se demostraron ser hereditarios. Por tanto en este estudio como en publicaciones anteriores en el uso de la MLPA para detectar desequilibrios subtelomericos recomienda el uso de dos sondas diferentes para identificar regiones subtelomericas anormales, ambas sondas necesarias para demostrar concordancia de un resultado anormal. Aunque algunos resultados tienen que ser confirmados por otras técnicas y algunos son heredados de los padres de apariencia normal y por lo tanto pueden ser hallazgos incidentales. Todos los resultados anormales se les realizo un seguimiento con FISH. En los casos en los que solo una sonda MLPA da resultado anormal, la confirmación por otra técnica se considera necesario antes de llegar a un diagnostico concluyente. La FISH es la primera prueba de seguimiento. La prevalencia de desequilibrios subtelomericos ha sido previamente reportado como entre 0 y el 10.7% por FISH y MLPA. Especialidad en Genética Médica 22 En conclusión la MLPA es una técnica extremadamente eficiente, y por motivos de rendimiento y costo tiene ventajas considerables sobre FISH. La CGH-array aumentara claramente la detección de anormalidades en pacientes con retraso del desarrollo, dismorfia y DI. Sin embargo por su mayor costo y en su sistema de salud financiado por estado es que poco probable su introducción, hasta entonces la MLPA representa el mejor método disponible para desequilibrios submicroscopicos. Erjavec et al. (2006), estudio 100 pacientes con DI y/o rasgos dismorficos, con el objetivo de identificar reordenamientos subtelomericos crípticos como causa de DI mediante la técnica FISH y su confirmación con MLPA y CGH array. Se estudiaron 54 niñas y 46 niños de entre 0 a 19 años (media 3 años), los criterios de selección fueron DI de leve a moderada (CI <70) o retraso del desarrollo con rasgos dismorficos; cariotipo normal con un nivel de resolución > 450 bandas, excepto en un caso en el que se encontró material translocado utilizando FISH y una deleción subtelomerica; exclusión de otras posibles etiologías mediante una evaluación genética completa y las pruebas pertinentes, por ejemplo síndrome X frágil. Se analizaron un mínimo de 5 metafases para cada cromosoma, más de 10 metafases e interfaces se analizaron cuando se detectaron reordenamientos cromosómicos. La técnica MLPA se llevó a cabo utilizando el kit SALSA P036 (MRC Holland). La hibridación genómica comparativa se realizó también. En cuanto a los resultados se detectaron 11 aberraciones subtelomericas, la FISH revelo 10 reordenamientos subtelomericos, 4 pacientes con reordenación criptica desequilibrada, 2 con una deleción, 4 pacientes una deleción de 2qter una aparente variante normal. Se realizaron estudios de los padres en dos casos con deleción. La MLPA confirmo todos los reordenamientos subtelomericos excepto no detecto el polimorfismo 2qter, porque esta región se encuentra fuera de la región subtelomerica 2q polimórfica. Con la CGH se confirmaron anomalías subtelomericas superiores a 8MB, aunque algunas de las desventajas de esta técnica es su incapacidad detectar reordenamientos equilibrados y regiones altamente repetitivas. Rauch et al. (2006), incluyo 600 muestras de pacientes enviadas al laboratorio por médicos pediatras y médicos familiares en el periodo 2000-2002 con indicación de ACM en menores de 6 meses o retraso del desarrollo/DI con o sin ACM en niños mayores, para evitar sesgos no incluyeron pacientes con diagnostico previamente establecido y pacientes con aberraciones cromosómicas previamente detectados por cariotipo. La mayoría de los pacientes tenían menos 6 años al momento de la referencia y por lo general no tenían pruebas estandarizadas de coeficiente intelectual. Se encontraron los siguientes resultados, aberraciones numéricas en 68 (11.3%), 74 pacientes de los 600 se enviaron por sospecha de síndrome Down, se confirmó en 55 casos, por lo tanto la trisomía 21 represento el 9.2% del total con ACM/DI, siendo la causa conocida más común de discapacidad intelectual. Dos muestras fueron enviadas por trisomía 13 las cuales se confirmaron, trisomía 18 en un paciente, 6 muestras mostraron trisomía gonosomica, una muestra con trisomía 8 mosaico. Aneusomias segmentarias 19 (3.2%), supresiones en 8 muestras, duplicaciones 4, deleción y duplicación mosaico 1 muestra, translocaciones reciprocas balanceadas 5 muestras, inserción no balanceada 1 muestra. Aberraciones estructurales equilibradas de novo en 3 (0.5%), polimorfismos en 11 Especialidad en Genética Médica 23 muestras (1.8%), síndromes microdelecion (FISH) en 8 (1.3%), 2 síndromes Prader –Willi, 2 síndromes Williams y 4 deleción 22q11.2. Cariotipo normal en 491 muestras. Un total de 500 pacientes se analizaron con FISH para aberraciones subtelomericas, en 10 de las muestras (2%) se detectó una aberración criptica patógena. En dos pacientes deleción de polimorfismos heredados de padre sano se detectaron (del(9)(pter),del(Y)(qter)). En 65 pacientes la sonda GS-1101 o 17 para 2qter se utilizó, 5 pacientes mostraron una del (2) (qter). 435 muestras se analizaron con la sonda RP11-115B2 para 2qter. De ellos 24 pacientes mostraron una disminución de la señal de la sonda 2q en un homologo, 18 mostraron una disminución de la señal de la sonda 4q en un homologo, un paciente mostro señales disminuidas 2q y 4q en un homologo. Concluyendo que la aberración cromosómica más frecuente asociada ACM/DI es el síndrome Down, como segunda causa de ACM/DI los síndromes microdeleción. La tasa de detección de anomalías subtelomericas mediante cribado subtelomerico en pacientes con discapacidad intelectual inexplicable es del 2% después de la evaluación clínica y citogenética completa. Bruno et al. (2006), en un estudio prospectivo analizaron muestras de abortos espontáneos en el laboratorio de citogenética del Victorian Servicios Clínicos de Genética para análisis de cariotipo.En el estudio piloto se realizó análisis de MLPA en una serie consecutiva de muestras de abortos espontáneos, 34 de vellosidades coriónicas y 44 de tejido fetal referidos para cariotipo, la edad gestacional media fue 19 semanas. En el estudio de seguimiento se utilizaron muestras, 16 de vellosidades coriónicas y 84 de tejido fetal, no se realizó estudio de cariotipo. 13. Justificación 13.1 Magnitud Los pacientes agrupados como con ACM/DI comprenden un grupo amplio y heterogéneo de enfermedades que afectan a aproximadamente el 3% de los recién nacidos. Un porcentaje estimado en más del 40-60% de pacientes con ACM/DI quedan sin un diagnóstico definitivo, con sus consecuentes implicaciones para estas familias durante el asesoramiento genético y la capacidad de cariotipo convencional para detectar anomalías cromosómicas en estos pacientes varía considerablemente, desde 3 hasta un 15%, dependiendo de la selección de los pacientes y la inclusión del síndrome de Down en las cohorte. Un 3% a 8% de los casos de ACM/DI son causados por variaciones en el número de copias de regiones subteloméricas y un número similar se explica por microdeleciones en otras regiones de los cromosomas. 13.2 Trascendencia Adicional al cariotipo convencional, la implementación y aplicación de técnicas biología molecular como la hibridación in situ fluorescente (FISH), MLPA y el cribado de arreglos del genoma completo (WGAS, por sus siglas en Inglés) casi duplica la tasa de detección de pérdidas o ganancias genómicas en ACM/DI. Debido a que mediante WGAS se puede detectar hasta el 99% de todas las pérdidas o ganancias cromosómicas, se ha sugerido que el WGAS debería reemplazar cariotipo Especialidad en Genética Médica 24 convencional como el primera prueba diagnóstica utilizada para detectar pérdidas o ganancias cromosómicas en pacientes con ACM/DI. Sin embargo, el costo alto de los ensayos de WGAS (estimado en alrededor de €800-900 por ensayo) representa un problema para su disponibilidad en nuestro medio, por lo que la técnica de MLPA puede constituir una alternativa atractiva. 13.3 Vulnerabilidad Con la búsqueda de deleciones o duplicaciones genómicas mediante el uso combinado de dos kits de MLPA esperamos incrementar el porcentaje de individuos con ACM/DI con un diagnóstico definitivo y brindar un adecuado y certero asesoramiento genético a estas familias. 13.4 Factibilidad En nuestro Servicio de Genética atendido por Genetistas y Citogenetistas certificados por el Consejo Mexicano de Genética, A.C., estimamos que en alrededor del 40-60% de los pacientes con ACM/DI y que cuentan con un estudio citogenético de 550 bandas de resolución, no se ha podido realizar un diagnóstico definitivo. Previo consentimiento informado y firmado por alguno de los padres, iniciamos desde el año 2011 la recolección de muestras de ADN de pacientes con ACM/DI y cariotipo normal, por lo que es factible contar con una adecuada muestra de estudio. La Unidad de Citogenética de nuestro hospital cuenta con la capacidad humana y técnica para la realización de los ensayos de MLPA y contamos con los apoyos financieros correspondientes para la obtención de los kits de SALSA® P245 para microdeleciones y SALSAS® P036 y P070 para deleciones/duplicaciones subtelomericas (MCR-Holland, Amsterdam, The Netherlands). 14. Hipótesis No se incluye por ser un estudio descriptivo. 15. Objetivos 15.1 Objetivo general Determinar la frecuencia de detección de pérdidas o ganancias cromosómicas en pacientes con anomalías congénitas múltiples y discapacidad intelectual evaluadas mediante el uso combinado de dos kits de MLPA. 15.2 Objetivos particulares 1. Identificar a todos los pacientes con ACM con o sin DI atendidos en el Servicio de Genética del HCG JIM que no cuenten con un diagnóstico definitivo. 2. Realizar la caracterización clínica, antropométrica, de evaluaciones especializadas y de los estudios de gabinete y laboratoriales de los pacientes seleccionados con ACM con y sin DI que cuenten con evaluación citogenética y con muestra de ADN evaluados en el Servicio de Genética del HCG JIM durante el periodo de 2011-2015. Especialidad en Genética Médica 25 3. Identificar pérdidas o ganancias genómicas en los pacientes seleccionados mediante la aplicación de dos kits de MLPA en aquellos pacientes con ACM con o sin DI que cuenten con estudio citogenético y que éste no incluya el hallazgo de cromosomopatías numéricas. 16. Materiales y métodos 16.1 Diseño Estudio transversal analítico. 16.2 Universo de estudio Todos los pacientes atendidos por el Servicio de Genética clasificados como con ACM/DI que no tenían un diagnóstico definitivo pero que contaron con estudio citogenético de 450 bandas de resolución y con muestra de ADN, atendidos durante el periodo enero 2011 a diciembre 2015. 16.3 Muestra de estudio Todos los pacientes clasificados como con ACM/DI que no tenían un diagnóstico definitivo pero que contaron con estudio citogenético de 450 bandas de resolución y con muestra de ADN. 16.4 Tamaño de la muestra y sistema de muestreo Se tomó una muestra por conveniencia debido al diseño descriptivo del estudio donde se incluyeron todos los pacientes con ACM/DI sin diagnóstico definitivo, que contaron con cariotipo normal y con muestra de ADN, durante el periodo enero 2011 a diciembre 2015. Aplicamos los tres kits de MLPA para deleciones subteloméricas y síndromes de microdeleciones a 186 pacientes con ACM/DI. El sistema de muestreo fue por lo tanto no probabilístico consecutivo por conveniencia. 16.5 Criterios de selección 16.5.1 Criterios de inclusión Pacientes de uno u otro sexo clasificados como con ACM en base a la presencia de dos o más anomalías mayores y/o tres o más menores con o sin DI definida como retraso global del desarrollo en menores de cinco años o evaluados neuropsicologicamente como con DI en base a la afectación a las esferas intelectual, adaptativa, participativa y contextual, en quienes no se encuentro un diagnóstico definitivo posterior a la valoración de un genetista certificado y que contaron con un cariotipo con bandas G con un nivel de resolución de 450 bandas y tenían disponible una muestra de ADN en la genoteca de la Unidad de Citogenética del Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”, atendidos durante el periodo de enero de 2011 a diciembre 2015. Especialidad en Genética Médica 26 16.5.2 Criterios de exclusión Los pacientes con ACM/DI en los que el cariotipo demostró una alteración numérica (trisomía 21, 18, 13, 8, u otras) fueron excluidos del presente estudio. Los cariotipos que demostraron una alteración estructural (deleciones, microdeleciones, material adicional, otras), no se excluyeron y se buscó su correlación con los hallazgos en la aplicación de los dos kits de MLPA. En los pacientes en los calidad del ADN impidió la realización del ensayo de MLPA y no fue posible obtener una nueva muestra también fueron excluidos. 16.5.3 Criterios de no inclusión No se incluyeron pacientes en los que la evaluación diagnóstica realizada por el genetista certificado concluyo como causa única una enfermedad o síndrome monogénico, multifactorial o teratógenicos. 16.6 Variables 16.6.1 Definición de variables Variable independiente: Deleciones o duplicaciones cromosómicas Variable dependiente: Anomalías congénitas múltiples con o sin discapacidad intelectual. 16.6.2 Operacionalización de las variables Variable Escala de medición Relación causal Unidad de medición Análisis estadístico Anomalías congénitas múltiples Cualitativa Nominal Dependiente Presente/ausente Frecuencia Proporción Discapacidad intelectual Cualitativa Nominal Dependiente Presente/ausente Frecuencia Proporción Deleciones o duplicaciones cromosómicas Cualitativa Nominal IndependientePresente/ausente Frecuencia Proporción Cariotipo bandas G resolución de 450 bandas Cualitativa nominal Independiente Normal/anormal Frecuencia Proporción Genero Cualitativa Nominal Descriptiva a) Masculino b) Femenino c) Indeterminado Frecuencia Proporción 16.7 Descripción de procedimientos A partir del año 2011 iniciamos la recolección de muestras sanguíneas para obtener ADN de todos los pacientes del Servicio de Genética, previo Especialidad en Genética Médica 27 consentimiento informado y firmado por alguno de los padres. Se contó con una base de datos que permitió identificar a los pacientes clasificados como con ACM/DI y también se contó con la información referente a los estudios de cromosomas por parte de la Unidad de Citogenética de nuestro hospital, así como la del Laboratorio de Citogenética Genotoxicidad y Biomonitoreo del Instituto de Genética Humana “Dr. Enrique Corona Rivera” del Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Médicos genetistas certificados valoraron a todos los pacientes antes de considerarlos como con ACM/DI, es decir, sin un diagnóstico definitivo. Para la selección de los pacientes y realización de los ensayos de MLPA se procedió de acuerdo al siguiente flujograma de estudio, utilizando un formato desarrollado ex-profeso (Anexo 1): ACM= anomalías congénitas múltiples, DI= discapacidad intelectual, MLPA= ligamiento multiplex-dependiente de amplificación de sonda. 16.7.1 Métodos y técnicas Se realizaron los siguientes pasos para el ensayo de MLPA. 1. Toma de muestra sanguínea y transporte 2. Extracción de leucocitos 3. Extracción de ADN 4. Reacción MLPA Especialidad en Genética Médica 28 5. Electroforesis capilar 6. Interpretación 16.7.2 Muestra sanguínea Las muestras sanguíneas se tomaron en el momento de la clasificación de un paciente como con ACM/DI. Se tomó la sangre con jeringa estéril de plástico de tres ml con aguja, una cantidad de dos mililitros (ml), la cual se colocó en un tubo con anticoagulante (EDTA) tapón lila de capacidad de 3 ml, previamente etiquetados con el nombre del paciente, registro de expediente y fecha de toma. Las muestras sanguíneas se trasportaron inmediatamente después de la toma al Unidad de Citogenética del Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I. Menchaca”. 16.7.3 Extracción de leucocitos • En un tubo de 50 ml se vertió la sangre (2-3ml). Los tubos donde estaba la sangre se lavan con solución salina que también se vertió en un tubo de 50 ml. Se aforo el tubo con solución de lísis (KCl al 1%) hasta 20 ml. • Se colocaron los tubos con la solución de lísis y la sangre en mezcladora durante un lapso de 10 minutos • Posteriormente se centrifugo a 4°C durante 10 minutos 2000rpm • Se decantó el tubo para eliminar el sobrenadante. La capa celular se conservó y se añadió nuevamente solución de lísis hasta 20ml para centrifugar nuevamente a 4°C durante 10 minutos a 2000rpm. • Nuevamente se decantó el tubo y se le añadió tampón fosfato salino (PBS) 2 ml, el cual se mezcló con el sedimento (linfocitos) con una pipeta Pasteur. • Se colocó la nueva mezcla en un tubo de microcentrifugación de 2ml y se centrifugo en minispin durante 30 segundos. • Se retiró el sobrenadante con pipeta Pasteur para obtener el sedimento lo más limpio posible y se aforo con PBS a 0.25ml. 16.7.4 Extracción de ADN. Protocolo de purificación de ADN a partir de Sangre o Fluidos Corporales (Protocolo de centrifugación) de QIAamp ® con el DNA Blood Mini Kit (50) • Se añadió con micropipeta 20 µL de proteínasa K (QIAGEN Proteasa) en el fondo del tubo de microcentrifugación • Se añadió 200 µL de Buffer AL a la muestra, se mezcló con vortex de pulso por 15 segundos • Se incubo a 56° por 10 minutos • Posteriormente se añadió 200 µL de etanol (96-100%) a la muestra, y de nuevo se mezcló mediante vortex de pulso por 15 segundos. Se centrifugo a 8000 rpm por un minuto. • Se colocó en un tubo limpio que contiene un filtro y se le añadió 500 µL de Buffer AW1, el cual se centrifugo nuevamente a 8000 rpm por 1 minuto. • Nuevamente se colocó en nuevo tubo de colección con filtro y se añadió 500 µL de Buffer AW2 para centrifugarlo a 14000rpm por 3 minutos. Especialidad en Genética Médica 29 • Se colocó en nuevo tubo de colección para microcentrifugación y se añadio 100 µL de agua destilada libre de nucleasas y se centrifugo a 8000 rpm por 1 minuto. • Se cuantifico la concentración de ADN extraído mediante el software y hardware Nanodrop® • Se almacenaron los tubos para microcentrifugación que contienen el ADN extraído a temperatura de -80°C para la conservación del ADN y posterior evaluación. 16.7.5 Reacción MLPA Componentes por SALSA en el kit MLPA Componente Ingredientes 1. SALSA MLPA Buffer 2. SALSA Ligasa- 65 KCl, Tris-HCl, EDTA, PEG-6000, Oligonucleotidos, pH 8.5 Glicerol, BRIJ (0.05%), EDTA, Beta-Mercaptoetanol (0.1%), KCl, Tris-HCl. pH 7.5, enzima ligasa 65 (origen bacteriano) 3. Ligasa Buffer A NAD (origen bacteriano), pH 3.5 4. Ligasa Buffer B Tris-HCl, detergentes no ionicos, MgCl2. pH 8.5 5. SALSA PCR primer mix Oligonucleotidos sintéticos con colorante fluorescente (FAM, Cy5, IRD800, ROX), dNTPs, Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ. pH 8 6. SALSA Polimerasa Glicerol, detergentes no iónicos, EDTA, DTT (0.1%), KCl, Tris-HCl, enzima polimerasa (origen bacteriano). pH 7.5 7. SALSA probemix P245 microdeletion-1 8. SALSA probemix P036 telomere-3 9. SALSA probemix P070 telomere-5 Oligonucleotidos sintéticos, oligonucleótidos purificados a partir de bacterias, Tris-HCl, EDTA. pH 8.0 Pasos: 1. Preparación 2. Desnaturalización del ADN 3. Hibridación de sondas 4. Ligación de sondas 5. Amplificación por PCR 6. Análisis de resultados 16.7.5.1 Preparación 1. Una cantidad de ADN de 50- 250 ng en 5µl 2. Se disolvió y diluyo la muestra de ADN en TE (10 Mm Tris-HCl Ph 8.2 + 0.1 mM de EDTH). El pH de la muestra debe ser entre 8.0 – 8.5 3. La muestra de ADN no tuvieron altas concentraciones de contaminantes, como sales. Especialidad en Genética Médica 30 4. La concentración de EDTA no fue más que 2.5 mM 5. No se usaron muestra sanguínea heparinizada para extracción de ADN 6. Por cada reacción MLPA se usaron cinco muestras control. Cuando se utilizaron más de 21 muestras, agregamos una muestra control por cada 7 muestras extras, las muestras control se distribuyeron al azar por toda la placa. Las muestras de referencia fueron muestras de ADN de individuos sanos. 7. Por reacción de MLPA se incluyó una muestra control sin ADN, la cual contiene Dh20 o TE. Para controlar posible contaminación. 8. Se dio vortex a todos los buffer y probemix antes de uso 9. Se centrifugaron todos los tubos de reactivos MLPA antes de su uso. Después de su uso se almacenaron los reactivos entre -15°C Y -25°C. 10. Las soluciones enzimáticas nunca se les dio vortex, se mezclaron pipeteando. 16.7.5.2 Desnaturalización (DIA1) 1. Se Marcaron los tubos de 0.2 ml 2. Se agregaron 5 µl de la muestra de ADN (50-250ng) a cada tubo (o TE para el tubo control no ADN) 3. Se colocaron los tubos en el termociclador e iniciamos el programa del termociclador MLPA. Desnaturalizamos el ADN de la muestra por 5 minutos a 98°C y enfriamos la muestra a menos 25°C. Retiramos los tubos del termociclador. 16.7.5.3 Reacción de hibridación (DIA 1) 1. Se dio vortex al buffer MLPA y probemix MLPA antes de su uso. 2. Se preparó la master mix que contiene para cada reacción: 1.5 µl buffer MLPA (tapa amarilla) + 1.5 µl probemix (tapa negra). Mezclo bien la master mix con pipeta o vortex. 3. Después de la desnaturalización del ADN, se agregó 3 µl de la master mix a cada tubo con la muestra y mezclo bien pipeteando 4. Continuamos con el programa del termociclador:incubamos por 1 minuto a 95°C, después por 16-20 horas a 60°C. 16.7.5.4 Reacción de ligación (DIA 2) 1. Se dio vortex a los dos tubos de buffer ligase antes de usar 2. Se preparó la master mix Ligase-65. Mezcla para cada reacción: 25 µl dH20 + 3 µl ligase buffer A (tapa transparente) + 3µl ligase buffer B (tapa blanca). Se mezclaron bien usando la pipeta. Nunca se dio vortex 3. Continuamos con el termociclador pausado a 54°C 4. Cuando las muestran estaban a 54°C, se agregó 32 µl de master mix ligase a cada tubo y mezclo con pipeta gentilmente. 5. Continuamos con el programa del termociclador: incubamos por 15 minutos a 54°C (para ligación), siguientes 5 minutos a 98°C para la inactivación térmica de la ligase-65 y después pauso a los 20°C. Se removieron los tubos del termociclador. Especialidad en Genética Médica 31 6. Los productos de la reacción de ligación pueden ser almacenados a temperatura ambiente por varias horas a 4°C hasta por una semana. 16.7.5.5 Reacción PCR 1. Se dio vortex a los primer SALSA PCR antes de usar. Se calentó la polimerasa por 10 segundos en la mano para reducir la viscosidad. 2. Se preparó la master mix polimerasa, agregando a cada reacción: 7.5 µl dH2O + 2 µl de mezcla primer SALSA PCR (tapón café) + 0.5 µl salsa polymerase (tapa naranja), se mezcló bien usando pipeta, no dio Vortex. Se almaceno en hielo hasta su uso. 3. A temperatura ambiente se agrego 10 µl de la mezcla de polimerasas a cada tubo, se mesclaron bien con pipeta y continuaron con el termociclador: 35 ciclos: 30 segundos a 95°C: 30 segundos a 60°C, 60 segundos a 72°C. se terminar con 20 minuto de incubación a 72°C y una pausa a 15°C 4. Después de la reacción de PCR no abrimos los tubos en la habitación con el termociclador para evitar contaminación, usamos diferentes tipos de micropipetas para realizar reacción MLPA y para el manejo de los productos de la MLPA PCR 5. Los productos de la PCR se pueden almacenaron hasta por una semana a 4°C. Para almacenamiento más prolongados a -15°C A -25°C, en caja oscura. 16.7.6 Análisis de datos Se evaluaron los picos de altura que corresponden a las fluorescencias detectadas por el instrumento de electroforesis. Estos picos se comparan con muestras normalizadas. Para esto utilizamos el programa conocido como Coffalyser. Los picos de las sondas control deben estar entre 0.8 y 1.2. Las dos etapas principales de un análisis MLPA son la normalización y la inferencia de alteraciones en el número de copias. Normalización para controlar la variación de la eficiencia de la PCR se hace a través del uso de sondas control. El método más simple de normalización, determina la señal normalizada de cada sonda en una muestra dada dividiendo la intensidad máxima por la suma de todas intensidades de pico de la muestra. Este método fue inicialmente propuesto y recomendado por MRC- Holand. Porcentajes inferiores a 0,7 se consideron pérdidas y relaciones de más de 1.33 son como ganancias en el número de copias. La salsa MLPA probemix contiene varios fragmentos control los cuales nos sirven para detectar errores comunes en la reacción de MLPA. Fragmentos Q. Son 4 (64,70,76,82 nt), son oligonucleótidos presentes en todas las salsas MLPA. Ellos no hibridan o ligan durante la reacción de PCR. Cuando las puntas de los fragmentos son bajas o invisibles, esto significa que suficiente muestra de ADN está presente y la reacción de ligación fue exitosa. Al contrario cuando las puntas de los fragmentos Q son mayores que un 1/3 que el control 92 nt, esto significa que se utilizó muestra insuficiente de ADN o la reacción de ligación fallo. Fragmentos D. La mayoría de las salsas MLPA contiene 2 fragmentos de desnaturalización (88 y 96 nt), cuya función es detectar islas CpG, las cuales son regiones cromosómicas que tienen al contenido de CG, que dificultan la Especialidad en Genética Médica 32 desnaturalización. En caso de que las puntas de los fragmentos 88 y 96 nt sean mucho más bajas que la punta 92 nt (<40%), indica que la desnaturalización del ADN es incompleta, esto puede ser debido a la contaminación con sales de la muestra. Para un análisis fiable, se deben cumplir dos criterios: primero la desviación estándar de todas sondas debe ser ≤ 0.1, segundo los valores de la muestra de referencia y de la muestra de corrimiento debe estar entre 0.8 y 1.2. 16.8 Validación de datos 16. 8.1 Bases de datos y programas de cómputo Los datos se registraron en el formato diseñado ex profeso para el estudio (Anexo 1) y posteriormente se capturaron en una base de datos realizada en el programa Excel. Se escribió un formato de consentimiento informado para ser explicado y firmado por alguno de los progenitores a fin de obtener la muestra sanguínea para la obtención de ADN y realización del ensayo de MLPA (Anexo 2). 16.9 Consideraciones éticas Este trabajo de investigación se realizó en un laboratorio clase 1, riesgo 1, que no implica peligro para el ambiente, ni para el investigador, sin embargo se desecharon los productos residuales de acuerdo a la norma 080. Cumple con lo establecido en el reglamento de la Ley General de Salud en Materia de investigación, Título I, capitulo único, Título II, capítulo I y especialmente cumple con el Título IV de Bioseguridad, capítulo II en Investigación y manejo de DNA, cumpliendo los artículos 85 al 88. (Ley Federal, 1984. Ultima Reforma DOF 07-06- 2012). 16.10 Cronograma de actividades ACTIVIDADES Años 2013 2014 2015 2016 Revisión de bibliografía y X X Elaboración de protocolo X X Realización y estandarización de técnicas y procedimientos X X Procesamiento y análisis de datos X X X Elaboración de informe técnico final X Divulgación de resultados X 16.11 Recursos 16.11.1 Recursos humanos Especialidad en Genética Médica 33 Investigador principal Jehú Rivera Vargas Actividad Realización de protocolo, estandarización y realización de procedimientos, análisis de datos Horas 10 horas a la semana Investigador responsable Dr. en C. Jorge Román Corona Rivera Actividad Responsable del proyecto en todas sus etapas Horas 2 horas a la semana Investigador responsable Dra. en C. Lucina Bobadilla Morales Actividad Co-responsable del proyecto en todas sus etapas Horas 1 hora cada 15 días Investigador asociado Dr. en C. Alfredo Corona Rivera Actividad Asesoría metodológicas y disciplinar Horas 1 hora cada 15 días Investigador asociado Dr. Eugenio Zapata Aldana Actividad Apoyo en la recolección de datos Horas 2 horas a la semana 16.11.2 Recursos materiales Se utilizó el equipo e instalaciones de la Unidad de Citogenética del Servicio de OHP de la División de Pediatría para la realización de los ensayos de MLPA. 16.11.3 Recursos financieros El presente proyecto conto con el apoyo del Laboratorio de Citogenética Genotoxicidad y Biomonitoreo del Instituto de Genética Humana “Dr. Enrique Corona Rivera” del Centro Universitario de Ciencias de la Salud, de la Unidad de Citogenética del Servicio de Hemato-Oncología Pediátrica, División de Pediatría, HCGJIM y del Centro de Registro e Investigación sobre Anomalías Congénitas, y del servicio de Genética del HCGJIM tanto en sus aspectos logísticos como operativos, así como del Programa PROINPEP de la Universidad de Guadalajara. Especialidad en Genética Médica 34 17. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 17.1 FRECUENCIA DE DETECCIÓN DE SÍNDROMES DE MICRODELECIÓN Y DE PÉRDIDAS O GANANCIAS SUBELOMÉRICAS Durante el periodo 2011-2015 se realizaron ensayos de MLPA en 186 pacientes (104 hombres y 82 mujeres), con edades a la evaluación de un mes a 35 años: 96 fueron evaluados con la SALSA MLPA probemix P245 para la búsqueda de VNCde los síndromes reconocibles de microdeleción o microduplicación y 105 con la SALSA MLPA probemix P036 para la búsqueda de VNC tipo microdeleciones/duplicaciones subteloméricas. El cariotipo detectó alteraciones en 6 pacientes (3.2%). La frecuencia de detección de VNC para la el conjunto de sondas P245 fue de 11.4% y para las sondas P036 de 18.5% (Figura 3). Figura 3. Frecuencia de identificación de variaciones en el número de copias (VCN) en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual evaluados mediante el ensayo de MLPA con las mezclas de sondas MLPA probemix P245-B1 para síndromes de microdeleciones y MLPA P036 para deleciones/duplicaciones subteloméricas. VCN: variación del número de copias. 17.2. SÍNDROMES DE MICRODELECIÓN (SALSA MLPA PROBEMIX P245-B1) Se estudiaron 96 pacientes con la salsa MLPA P245 (51 mujeres y 45 hombres). Las características clínicas, hallazgos citogenéticos y los estudios de FISH identificados en los 11/106 pacientes con ACM y/o DI en los se demostró algún síndrome de microdeleción se incluyen en la Tabla 5 y se desglosan por separado. En todos estos casos existió previamente la sospecha clínica de un síndrome de microdeleción y todos tuvieron un cariotipo normal. 85 110 11 25 MLPA P245 MLPA P036 N úm er o de p ac ie nt es Sin VNC Con VNC Especialidad en Genética Médica 35 Tabla 3. Síndromes de microdeleción encontrados mediante MLPA y/o FISH en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual con cariotipo normala. Paciente Sexo Diagnóstico clínico Resultado FISH Resultado MLPA (P245) MD01 M Atresia pulmonar nuc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) del 22q11.21 MD02 M Paladar hendido nuc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) del 22q11.21 MD03 M Estenosis pulmonar nuc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) del 22q11.21 MD04 F Tetralogía de Fallot nuc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) del 22q11.21 MD05 F Tetralogía de Fallot nun ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) del 22q11.21 MD06 F Estenosis pulmonar nuc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) del 22q11.21 MD07 M DI/facies peculiar nuc ish(ELN,D7S486)x2 del 7q11.23 MD08 M DI/facies peculiar nuc ish(ELN,LMK1,D7S613)x1(7q11)x2 del 7q11.23 MD09 M DI/dismorfia facial nuc ish (WHSC1X1) del 4p16.3 MD10 M DI/facies nuc ish(D15S11X1),(D15Z1X2) del 15q11.2 MD11 M Síndrome West nuc ish(LSI1x1,RARAx2) del 17p13.3 DI: discapacidad intelectual. aExcepto el paciente MD07: 46,XY(9)/47,XY+mar(11). 17.2.1. Síndrome de deleción 22q11.21 a) Paciente MD01. Masculino de 6 años postoperado de atresia pulmonar a los 3 días de vida. Es producto de G2 de madre de 30 años y padre de 31 años, ambos sanos y no consanguíneos. Un primo materno y tío paterno con cardiopatía congénita no especificada. Embarazo sin complicaciones, parto eutócico, peso de 3500 g, talla de 51 cm. Presentó hipocalcemia neonatal, hernia inguinal izquierda, hidronefrosis transitoria, estrabismo e infecciones recurrentes el primer año de vida. El desarrollo inicial fue adecuado. Exploración: facies peculiar (Fig. 3b), voz hipernasal, telecanto, orejas pequeñas, lóbulo bulboso e hipoplasia malar. Presenta déficit de atención y problemas de aprendizaje. La radiografía de tórax con hipoplasia de timo. TAC de cráneo, potenciales auditivos normales. El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245-B1 demostró deleción 22q11.21(Fig. 3a- b), confirmado con la FISH en células interfásicas (Fig. 3d). b) Paciente MD02. Masculino de 8 años que acude por agresividad, problemas de atención y paladar hendido. Es hijo de madre de 37 años G2, P3 y padre de 39 años, ambos sanos y no consanguíneos. Gestación de término con amenaza de aborto al 2º. mes e hipomotilidad fetal. Parto vaginal con peso de 2100 g y al nacimiento con paladar hendido posterior y hernia umbilical. Presentó hipoacusia y retraso psicomotor, cursa 2º. grado de primaria con mal aprovechamiento escolar. A la exploración con frente corta, orejas en copa, lóbulos hipoplásicos, telecanto, blefarofimosis, epicanto superior, punta nasal bulbosa, filtrum borrado, hipoplasia malar, caries dental, cicatriz de corrección de paladar e hiperlaxitud articular. La evaluación por Oftalmología no reportó alteraciones. El ecocardiograma, USG renal, TAC de y radiografías de columna fueron normales. El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245-B1 demostró deleción 22q11.21 (Fig. 3a, b y d). Especialidad en Genética Médica 36 c) Paciente MD03. Recién nacido masculino hijo de madre G1 de 20 años y padre de 29 años, sanos y no consanguíneos. Embarazo de 38.2 semanas sin complicaciones. Peso al nacimiento de 3300 g, talla de 53 cm, Apgar de 8-9. El USG cardiaco reportó doble salida del ventrículo derecho con estenosis pulmonar severa, ducto arterioso permeable, comunicación interventricular perimembranosa e hipoplasia de ventrículo derecho. A la exploración sin datos dismórficos relevantes (Fig. 4c). El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245-B1 demostró una deleción pequeña en 22q11.21 (Fig. 4a, b) , confirmado con la FISH en células interfásicas (Fig. 4d). d) Paciente MD04. Recién nacido femenino producto de madre de 24 años G1 y padre de 25 años, ambos sanos y no consanguíneos. Embarazo sin complicaciones, nació por cesárea a las 39 semanas, peso de 2330 g, talla de 45 cm, perímetro cefálico (PC) de 33 cm, Apgar de 8-9. A la exploración: facies peculiar, nariz bulbosa, orejas pequeñas, línea Sydney variante y primeros ortejos largos. Se detectó tetralogía de Fallot compensada en vigilancia por Cardiología. La evaluación oftalmológica fue normal. La radiografía de tórax con hipoplasia de timo. No presentó hipocalcemia y las pruebas tiroideas fueron normales, al igual que el USG renal. Mostró linfopenia y disminución del conteo de subpoblaciones linfocitarias y se encuentra en vigilancia por Inmunoalergias. El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245-B1 demostró deleción 22q11.21, confirmado con la FISH en células interfásicas (Fig. 3a, b y d). e) Paciente MD05. Recién nacido femenino producto de la G2 de madre de 31 años y padre de 34 años, sanos. Un tío materno con atresia esofágica. Cursó con amenazas de aborto y preeclampsia. Nació a las 38.4 semanas con peso de 2600 g y talla de 46 cm. Se detectó tetralogía de Fallot en manejo por Cardiología. A la exploración física facies peculiar (Fig. 4d), orejas rotadas, nariz bulbosa, apéndice pretragal izquierdo, Radiografía sin sombra tímica. USG renal normal. No presentó hipocalcemia. El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245-B1 demostró deleción pequeña en 22q11.21 (Fig. 4a, b), confirmado con la FISH en células interfásicas (Fig. 4c). f) Paciente MD06. Femenino producto de la G1 de madre de 19 años y padre de 20 años, sanos. Nació a las 33.4 semanas, peso 1800 g, talla 42 cm, Apgar 8-9. A la exploración con orejas pequeñas, nariz bulbosa como datos relevantes (Fig. 3c). Presento aplasia tímica, hipocalcemia por hipoparatiroidismo, hipoplasia de nervios ópticos, infecciones recurrentes. El USG cardiaco con estenosis de la rama izquierda de la arteria pulmonar y comunicación interventricular. Su desarrollo psicomotor ha sido retrasado. El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245-B1 demostró deleción 22q11.21 (Fig. 3a, b), confirmado con la FISH en células interfásicas (Fig. 3d). Correlación genotipo-fenotipo en los casos con deleción 22q11.21 El síndrome de microdeleción 22q11.21 afecta a 1:4000 recién nacidos (Bumside, 2015). Los genes-exones evaluados mediante la mezcla de sondas de MLPA Especialidad en Genética Médica 37 demostraron la deleción típica de ~3 Mb que incluye las regiones agrupadas de bajo número de copias (LCR) A-D (Fig. 6) en los pacientes MD01, MD02, MD04 y MD06 (Fig. 3), acorde a lo reportado en casi el 90% de los casos (Delorme et al., 2010). Los pacientes MD02 y MD05 (Fig. 4) se encontró una deleción pequeñade ~1.5 Mb que incluye las LCR A-B (Fig. 5). En la Tabla 4 se presentan las principales características de nuestros pacientes, resaltando que los dos casos que tuvieron deleciones pequeñas presentaron estenosis pulmonar, acorde a lo reportado para deleciones proximales con la frecuencia más alta de cardiopatías congénitas (Bumside, 2015), aunque la correlación fenotípica es difícil ya que fue la única manifestación en el paciente MD03, mientras que en el paciente MD05 se presentaron otras manifestaciones sistémicas de la deleción 22q11.21, que incluyeron hipoplasia de timo, inmunodeficiencia celular e hipocalcemia. Figura 4. Histograma de la RPH para cada sonda evaluada mediante la SALSA MLPA probemix P245-B1 mostrando (flechas) la deleción 22q11.21 (a) y su distribución de la RPH para la deleción de los genes-exones CLDN5-1*, GP1BB-2* y SNAP29-3* que indican la deleción más común ~3 Mb, contenidos en las LCR A- D (b). Este hallazgo se encontró en los pacientes MD01 (b), MD02, MD04 y MD06 Especialidad en Genética Médica 38 (c), confirmado con el mismo resultado del FISH: nunc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) (d). Figura 5. Histograma de la RPH para cada sonda evaluada mediante la SALSA MLPA probemix P245-B1 mostrando (flechas) la deleción 22q11.21 (a) y su distribución de la RPH para la deleción en los paciente MD03 (c) y MD05 (d), que incluyó los genes CLDN5-1* y GP1BB-2* (deleción pequeña) de ~1.5 Mb en los LCR A-B (b). Tuvieron FISH confirmatio: nunc ish (TUPLE1x1, SHANK3 X2) (d). Figura 6. Deleción típica de 22q11.21 de ~3 Mb que incluyó las LCR A-D evaluada por MLPA en los pacientes MD01, MD02, MD04 y MD06. Los pacientes Especialidad en Genética Médica 39 MD03 y MD05 la deleción incluyó las LCR A-B, indicando una deleción pequeña de ~1.5 MB. Fuente: modificado de Delorme et al. (2010). Tabla 4. Hallazgos comparativos en los pacientes estudiados con síndrome de microdeleción 22q11.21 demostrada por MLPA. Hallazgos Pacientes MD01 MD02 MD03 MD04 MD05 MD06 Gen-Exón (LCR) CLDN5-1* (LCR A, B) GP1BB-2* (LCR A, B) SNAP29-3* (LCR C, D) PPIL2-20* (distal a 22q11.21) + + + - + + + - + + - - + + + - + + - - + + + - Deleción común/pequeña +/- +/- -/+ +/- -/+ +/- Dismorfia facial características + + - + + + Cardiopatía +a - +b +c +d +e Anomalías palatales + + - - - - Dificultades del lenguaje/ hipernasal + + N.I. - N.I. - Hipocalcemia + N.I. - - - + Infecciones de repetición + + N.I. + - + Hipoplasia de timo + N.I. - + + + Problemas de aprendizaje + + N.I. N.I. N.I. N.I. Problemas de conducta + + N.I. N.I. N.I. N.I. *LCR: Región de control de locus en 22q11.21. N.I.: no investigado o no aplica. aatresia pulmonar, b,eestenosis pulmonar, c,dtetratlogía de Fallot 17.2.2. Síndrome de deleción 7q11.23 g) Paciente MD07. Masculino de 8 años de edad, producto de la G2 de madre de 33 años y padre de 37 años, aparentemente sanos, no consanguíneos. Antecedente de G1 con trastorno de déficit de atención e hiperactividad. Nació vía cesárea, Apgar 8-9, con peso, talla y PC al nacimiento en el percentil 50. Buen desarrollo psicomotor con adquisición de hitos del desarrollo. A los 4 meses presentó hipercalcemia, hipercalciuria, cuadros frecuentes de constipación, cólicos prolongados, trastornos del sueño, hipersensibilidad a sonidos, problemas visuoespaciales y personalidad hipersociable. A la exploración con frente de apariencia amplia, telecanto, hipoplasia malar, nariz corta, narinas antevertidas, labios gruesos, filtrum largo, boca amplia, lóbulos de las orejas prominentes (Fig. 7a-c). Voz ronca y grave, hiperlaxitud articular. RMN de cerebro: Arnold Chiari tipo I (Fig. 7d). Ecocardiograma: Estenosis de la arteria supravalvular. Cariotipo: 46,XY(9)/47,XY+mar(11). FISH: nuc ish(ELN,D7S486)x2[200/200]. La evaluación mediante el ensayo de MLPA con la mezcla de sonda P245 mostró deleción de los genes ELN-20* y ELN-33* localizados en 7q11.23 (Fig. 9). h) Paciente MD08. Masculino de 14 años de edad, producto de la segunda gesta de madre de 28 años de edad, padre de 35 años de edad, aparentemente sanos, no consanguíneos. No antecedentes de importancia en la familia. Nació por parto Especialidad en Genética Médica 40 eutócico vaginal, peso y talla en percentiles 50. Acude a consulta los 6 años por falla para medrar, trastornos del aprendizaje. Exploración física: Epicanto, puente nasal deprimido, mejillas prominentes, boca amplia, labios gruesos, punta de la nariz en bulbo y base ancha, zonas orbiculares hundidas, maloclusión dental (Fig. 8a) e iris estellata (Fig. 8b). Personalidad hipersociable e hipersensibilidad a los sonidos. Diagnóstico de hipotiroidismo en tratamiento con Levotiroxina. Ecocardiograma: Estenosis aortica leve. FISH: nuc ish(ELN,LMK1,D7S613)x1(7q11)x2[200] (Fig. 8c). La evaluación mediante el ensayo de MLPA con la mezcla de sonda P245 mostró deleción de los genes ELN-20* y ELN-33* localizados en 7q11.23 (Fig. 9). Figura 7. Fenotipo de paciente (ver texto). Especialidad en Genética Médica 41 Figura 8. Fenotipo del paciente MD08 (a, b). FISH con deleción 7q11 (c). Figura 9. Histograma de la RPH para cada sonda de microdeleciones medida en los pacientes MD07 y MD08 mostrando deleción 7q11.23 que incluyó los genes ELN-20* y ELN-33* (a). La distribución de la RPH para la deleción 7q11.23 con el set de sondas P245. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo con la deleción 7q11.23 El fenotipo observado en los pacientes MD07 y MD08 es compatible con el del síndrome Williams-Beuren (SWB) (OMIM #194050) producido por microdeleción de la región crítica SWB en 7q11.23. Tiene una prevalencia es de 1 en 7500 (Strome et al., 2002). Clínicamente con una personalidad hipersociable, facies típica, cardiopatías y trastornos en el manejo del calcio (Pober, 2010). De los criterios clínicos diagnósticos el MD07 cumple con 12 puntos, y el paciente dos cumple con 10 puntos lo hizó el diagnóstico clínico de SWB. Más del 98% de los casos presenta la deleción demostrable con el estudio de FISH y solo el 2% es atípico, cuya deleción se expande alrededor de 1.5-1.8Mb, comprendiendo alrededor de 28 genes, siendo la deleción del ELN quien produce las alteraciones cardiovasculares, LIMK1 alteraciones en el desarrollo cerebral y GFT2IRD1 las alteraciones craneofaciales típicas del SWB (Schubert, 2009). Es relevante la utilidad de la MLPA, ya que en el paciente MD07 no se detecto la deleción mediante el estudio de FISH. 17.2.3. Síndrome de deleción 4p16.3 i) Paciente MD09. Masculino producto de G1 no complicada de madre de 16 años de edad y padre de 20 años de edad, sanos. Nacimiento a termino por vía vaginal, llanto y respiración espontanea, se ignora Apgar, peso 2270 g, talla 47 cm. Presentó retraso del crecimiento prenatal y postnatal, discapacidad intelectual leve y convulsiones. A la exploración con microcefalia, estrabismo, exoftalmos, cejas arqueadas, glabela prominente, micrognatia (Fig. 1a, c), comisuras labiales hacia abajo y facies de yelmo (Fig. 1b). A los 6 años presentaba vocabulario aproximado de 30 palabras, escribe vocales. A los 7 años asiste a primaria con apoyo especial. El USG renal evidenció hipoplasia renal izquierda. EEG anormal con múltiples paroxismos de punta, onda de 3 segundos de duración en semejanza a ondas de monje. TAC de cráneo y USG cardiaco fueron normales. Cariotipo: 46,XY (550 bandas). Análisis con MLPA: La evaluación con el set de Especialidad en Genética Médica 42 sondas SP13 microdeleciones demostró una microdeleción 4p16.3 correspondiente a los genes LETM1 y WHSC1 (Fig. 2) con un radio de 0.54 y 0.48 respectivamente. Figura 10. Distribución de la RPH para la deleción 4p16.3 usandoel set de sondas P245 con pérdida de los genes LETM1 y WHSC1 (a). Fenotipo del síndrome Wolf en el paciente MD09 (b). RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo en la deleción 4p16.3 La presentación clínica del síndrome de deleción distal 4p o síndrome Wolf es muy variable e incluye como manifestaciones relativamente consistentes la apariencia facial distintiva, retardo de crecimiento prenatal y postnatal, microcefalia, anomalías cardiacas, urogenitales y crisis convulsivas, compatible con el cuadro del paciente MD09 (Sukarova-Angelovska et al., 2014). La región crítica mínima se ha establecido en 165 kb en el comosoma 4p16.3 se han identificado genes potencialmente candidatos como WHSC1, WHSC2 y LETM1, no se ha establecido aún una relación directa entre estos genes y el amplio espectro clínico, se cree por modelos murinos que el gen WHSC1 es el responsable del fenotipo caracteristico, mientras que el gen LETM1 puede ser el responsable del fenotipo neuromuscular y convulsiones en los pacientes (Bergemann et al., 2005; Wieczorek et al., 2000). De la hipoplsaia renal izquierda que se encontró, en nuestra revisión se han presentado en pacientes reportados ureter doble, agenesia renal ureteral y reflujo vesico ureteral en 5 pacientes de un total de 19, por lo que se encuentra asociado este hallazgo al síndrome (Sukarova-Angelovska et al., 2014, Wieczorek et al., 2000). 17.2.4. Síndrome de deleción 15q11.2 j) Paciente MD10. Masculino de 3 años producto de madre de 24 años G1 y padre de 23 años de edad. Tío paterno y primo materno con autismo. Nació por cesárea a las 39 semanas, Apgar 8-9, peso 2100 g (<P3), talla 48 cm (P3-50). Presentó Especialidad en Genética Médica 43 dientes natales y al tercer día crisis convulsivas y neumonía. La exploración con microcefalia, remolinos frontales, frente estrecha, estrabismo, soplo cardiaco, mancha café con leche en abdomen, espasticidad e inestabilidad troncal y escoliosis, además de sonrisa fácil (Fig. 11c). Neurología diagnostica autoagresión, ansiedad y retraso del desarrollo psicomotor. Ecocardiograma: foramen oval permeable. PVETC: patrón reverso anormal, lesión desmielinizante de predominio derecho. RMN cráneo: colpocefalia, fosa posterior amplia y quistes basales bitemporales. PAETC: hipoacusia leve bilateral. Ortopedia: escoliosis lumbar (Fig. 1b) y displasia de cadera bilateral. Cariotipo: 46,XY (550 bandas). FISH: nuc ish(D15S11X1),(D15Z1X2) [96/100] (Fig. 1 c). Análisis con MLPA con el set de sondas P245 demostró deleción 15q11.2 correspondiente a los genes SNRPN-u1b, SNRPN-3, UBE3A-4, con un radio de 0.5, 0.5 y 0.51, respectivamente (Fig. 11a-b). La deleción se corroboró por FISH (Fig. 11d). Figura 11. Histograma de la RPH para cada sonda de microdelecion medida en el caso MD10 mostrando deleción 15q11.2 y la distribución de la RPH para la deleción 15q11.2 usando el set de sondas P245. Fenotipo del síndrome Angelman en el paciente MD10 (d), Estudio de FISH en células interfásicas: nuc ish(D15S11X1),(D15Z1X2). RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Especialidad en Genética Médica 44 Correlación genotipo-fenotipo deleción 15q11.2 El fenotipo de nuestro paciente corresponde al del síndrome Angelman. La presentación clínica del síndrome de deleción distal 15q11.2 es muy variable y varía dependiendo los sitios de interrupción (breakpoints), los cuales se enumeran del 1 al 5 (BP1-BP5); si el sitio de es distal al BP3, se originará el síndrome Angelman y Prader-Willi, dependiendo el origen paterno o materno de impronta. (Cox et al., 2015). El síndrome de Angelman es un desorden cuyas principales características son déficit intelectual, dificultad para el lenguaje, anomalías del movimiento (ataxia), convulsiones, además de un comportamiento específico que incluye una fácil excitación, risa frecuente, dificultad para la concentración, hipermovilidad y alteraciones del patrón del sueño. Como características dismórficas se encuentra coloración de piel y cabello más clara que el resto de familia, microcefalia,macrostomía, lengua protruyente, dientes espaciados, prognatismo y dificultades gastrointestinales. La escoliosis, alteraciones oculares y estrabismo observado en nuestro paciente han sido reportados (Bird, 2015), al igual que los datos de parálisis cerebral infantil (Molofetta, et al., 2004). 17.2.5. Síndrome de deleción 17p13.3 k) Paciente MD11. Propositus producto de madre de 29 años G3, P3 y padre de 34 años, sanos. Embarazo normal, parto eutócico a las 40.3 semanas, Apgar 8-9, peso de 3200 g, talla de 50 cm, PC de 33 cm. A los 20 días de vida inició con espasmos infantiles. EEG con hipsarritmia. A la exploración con estrechamiento bitemporal, respuesta visual pobre, estrabismo, nistagmus puente nasal prominente y espasticidad. TAC de cráneo (Fig. 12c): paquigiria-lisencefalia, ventriculomegalia, dilatación del III y IV ventrículos, colpocefalia, doble corteza en bordes posteriores de ventrículos laterales. USG renal y tamizaje metabólico normales. Cariotipo: 46,XY. El ensayo con MLPA SALSA MLPA probemix P245- B1 mostró deleción 17p13.3 que incluye los genes PAFAH1B1-3* y PAFAH1B1-5* (Fig. 12a,b), confirmado con la FISH para la región crítica del gen PAFAH1B1 (LIS1) en células interfásicas (Fig. 12d). Correlación genotipo-fenotipo en la deleción 17p13.3 La deleción de la región crítica de 400 kb localizada en 17p13.3 incluye el gen PAFAH1B1 (LIS1) y produce fenotipos que van desde la agiria-paquigilia- lisencefalia (65% de los casos), hasta el síndrome Miller-Dieker (Cardoso et al., 2003). PAFAH1B1 codifica para una proteína de 45 kDa altamente conservada que contiene una homodimerización N-terminal, un extremo enrrollado y 7 dominios C-terminales y su función es indispensable para una adecuada migración neuronal (Fry et al., 2014). Alrededor del 83% desarrollan epilepsia de inicio temprano como en nuestro paciente MD11, quién comparte características con el síndrome Miller-Dieker, aunque en menor grado. Especialidad en Genética Médica 45 Figura 12. Histograma de la RPH para cada sonda evaluada mediante la SALSA MLPA probemix P245-B1 mostrando (flechas) la deleción 17p13.3 (a) y su distribución de la RPH para la deleción el paciente MD11 que incluyó los genes PAFAH1B1-3* y PAFAH1B1-5* (b). La TAC mostró paquigiria-lisencefalia. El FISH fue: nunc ish(LSI1x1,RARAx2) (d). 17.3. SÍNDROMES DE MICRODELECIONES O MICRODUPLICACIONES SUBTELOMÉRICAS En 105 pacientes se realizó la evaluación mediante la SALSA MLPA probemix P036 y en la mayoría de casos positivos se contó con la confirmación mediante el set de sondas P070. En 25/135 (18.5%) pacientes se encontraron VNC, que agrupamos y describimos según su resultado de cariotipo normal o anormal en las Tablas 5 y 6. Especialidad en Genética Médica 46 Tabla 5. Alteraciones subteloméricas encontradas mediante MLPA en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual con cariotipo anormal. Caso Sexo Diagnóstico clínico Cariotipo Resultados MLPA (P036) Pérdida Ganancia ST01 F LPH/ACC/DI 46,XX,add (20)(p13) del 20p13 dup 3p26.3 ST02 M VACTERL/ACC 46,XY,del (13)(q34) del 13q34 ST03 F HPE/ACC 47,XY,+13 dup 13q12.11 dup 13q34 ST04 M DI/ACC 46,XY,r(18)(p11.3q23) del 18p11.32/ del 18q23 ST05 F Síndrome Down 47,XX+21,add(15)(p11.2) dup 21q11.2 dup21q22.3 ST06 M PH/ACC mos 47,XXY[190]/46,XY[10] dup Xp22 dup Xq28 LPH: labio y paladar hendido, ACC: anomalías congénitas múltiples, DI: discapacidad intelectual, HPE: holoprosencefalia, *Corroborada con la MLPA P070. Tabla 6. Alteraciones subteloméricas por MLPA en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual con cariotipo normal.Caso Sexo Diagnóstico clínico Resultado cariotipo Resultados MLPA (P036) Pérdida Ganancia ST07 M ACC 46,XY del 1p36.33 ST08 M DI 46,XYqh- del 1p36.33 ST09 F Espectro autista/DI 46,XX del 1p36.33 ST10 F ACC/DI 46,XX dup 3q29 ST11 F DI/incisivo único dup 4p16.3 ST12 M ACC/aniridia del 6p25.3 ST13 M ACC 46,XY dup 7p22.3* ST14 M DI dup 7p22.3* ST15 M OEIS/ACC 46,XY dup 7p22.3* ST16 M Espectro autista/DI 46,XY dup 7p22.3 ST17 F DI 46,XX dup 7p22.3 ST18 F DI 46,XX del 8p23.3* ST19 M ACC 46,XY del 10q26.3 ST20 F DI 46,XX del 12p13.33 ST21 M DI 46,XY del 13q12.11* ST22 F VACTERL 46,XX dup 15q26.3 ST23 F DI del 18p11.32 dup 20p13 ST24 M DI del 18p11.32 dup 20p13 ST25 M DI del 18p11.32 dup 20p13 ACC: anomalías congénitas múltiples, DI: discapacidad intelectual. *Corroborada con la SALSA MLPA P070. Especialidad en Genética Médica 47 17.3.1. SÍNDROMES DE MICRODELECIONES O MICRODUPLICACIONES SUBTELOMÉRICAS CON CARIOTIPO ANORMAL 17.3.1.1 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo inicial 46,XX,add (20)(p13): del 20p13 y dup 3p26.3 a) Paciente ST01. Femenino de finado a los 10 meses de edad, madre de 22 años de edad y padre de 21 años de edad, sanos, no consanguíneos y ambos de etnia huichola. Antecedentes familiares sin importancia. Nació a las 38 semanas de gestación por vía vaginal, Apgar 4-6-9, peso 3,010 g y talla 50 cm, hipoxia al nacimiento. Exploración física: fontanela anterior muy amplia, lóbulos auriculares hipoplasicos, puente nasal ancho, labio y paladar hendido bilateral (Fig.13a-c), pliegue de flexión palmar único derecho, mancha café con leche en pierna izquierda y reflejos osteotendinosos aumentados. Posteriormente con falla para medrar e infecciones frecuentes. Evaluación neurológica: crisis convulsivas tónico clónicas. Ecocardiograma: comunicación interventricular y PCA. Radiografía AP de columna hemivertebras en T4 a T8 (Fig. 13 d). TAC de cráneo, atrofia cortical, fosa posterior amplia y colpocefalia. Cariotipo inicial de la proposita: 46,XX,add(20)(p13) (Fig.2 a). El cariotipo en la mamá: 46,XX,t(3;6;20)(p13;q14;q13) [20] (Fig.2 b) y el del papá:46,XY. Por lo anterior, el cariotipo final quedó: 46,XX,der(20),t(3,6;20)(p13;q14;q13)mat. Figura 13. Fenotipo en la paciente ST01 (ver texto). Especialidad en Genética Médica 48 Figura 14. Cariotipos en la paciente ST01 (a) y su madre (b): 46,XX,t(3;6;20) (p13;q14;q13). Se concluyó un cariotipo final en la proposita: 46,XX,der(20),t(3,6;20) (p13;q14;q13)mat, que consecuentemente produjo trisomía 3p y monosomía 20p parciales. Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación de 3p26.3 correspondiente al gen CHL1 (Fig. 15) con un Especialidad en Genética Médica 49 ratio de 1.34 y también, deleción 20p13 correspondiente al gen SOX12 con ratio 0.47 Figura 15. Paciente ST01 mostrando duplicación de 3p26.3 y deleción 20p13 subteloméricas por la distribución de la RPH usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo duplicación 3p26.3 y deleción 20p13 Producto de una segregación 3:3 materna de una translocación múltiple balanceada, la proposita ST01 recibió el der(20) y consecuentemente, cursó con una trisomía 3p y una monosomías 20p parciales. Esto concurda con los hallazgos encontrados en el análisis de MLPA, donde las sondas subteloméricas del kit P036 demostraron una duplicación de 3p26.3 y una deleción 20p13. Los hallazgos clínicos en reportes previos sugieren una gran variabilidad fenotípica. Se ha descrito como parte de reordenamientos familiares complejos. Además se describen pacientes con deleciones terminales del brazo corto del cromosoma 20 que abarcan el gen JAG1 que es conocido por causar síndrome Alagille. Sin embargo esta región delecionada no alberga al gen JAG1. La microdelecion pura en esta banda es muy rara. Las características clínicas exhibidas por estos pacientes se muestran en la tabla 1. Además hay reporte de un paciente con paladar en hendido submucoso y úvula bífida, además de infecciones de respiratorias recurrentes. Esta región tiene un tamaño de 1.15 Mb que contiene 26 genes (Jezela-Stanek et al., 2013). La deleción 20p ha sido reportada en pacientes con discapacidad intelectual, retraso del desarrollo, epilepsia, pabellones auriculares de implantación baja. La mayoría de la deleciones son de novó, además hay casos reportados de deleción heredada por los padres, estando ellos fenotípicamente afectados, lo que resalta la patogenicidad de esta deleción. También predispone aun mayor riesgo de autismo (An, et al., 2013). Especialidad en Genética Médica 50 La microduplicación 3p26.3 involucrando el gen CHL1 es rara, la mayoría de casos descritos son de novo y unos pocos casos son familiares. El síndrome clínico incluye discapacidad intelectual, bajo peso al nacer, microtrigonocefalia, ptosis, telecanto, fisuras palpebrales hacia abajo y micrognatia (Weehi, et al., 2014). La consecuente trisomía 3p/monosomía 20p parciales causo un fenotipo combinado en nuestra proposita de no fácil correlación fenotípica, aunque por lo revisado en la Tabla 7, concurda más con el de la deleción 20p, aunque manifestaciones relevantes como el labio y paladar hendido bilateral, no han sido reportados en ninguno de éstos dos desbalances cromosómicos. Tabla 7. Hallazgos reportados en pacientes con deleción 20p13 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=3a Paciente ST01 Cordón umbilical con dos vasos 1/2 - Polihidramnios 3/3 - Fontanelas amplias 2/3 + Frente estrecha 2/3 + Estrechamiento bitemporal 1/3 - Epicanto 1/3 - Coloboma coriorretiniano 1/3 - Telecanto 1/3 - Anormalidades de oído 2/3 - Hoyuelos en oído 1/3 - Nariz corta 1/3 + Filtrum plano 1/3 + Paladar alto 2/3 + Surco en mentón 1/3 - Micrognatia 1/3 + Edema 1/3 - Defectos cardiacos 1/3 + Anomalías vertebrales 1/3 + Pliegue palmar único 1/3 + Anomalías de pulgar 1/3 - Uñas hipoplasicas 2/3 - Superposición dedos del pie 1/3 - Retraso del desarrollo 3/3 + Discapacidad intelectual 2/2 NA Convulsiones 2/3 + Retraso de erupción dentaria 1/2 - Retraso menstrual 1/2 NA Alteraciones visuales 1/3 - Peso bajo 2/3 + aModificada de Jezela-Stanek et al. (2013). Especialidad en Genética Médica 51 17.3.1.2 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo 46,XY,del (13)(q34): del 13q34 b) Paciente ST02. Masculino producto de G1 no complicada de madre de 19 años de edad y padre de 18 años de edad, sanos y no consanguíneos. Tío paterno con cardiopatía, por rama materna primo con craneosinostosis y bisabuela con bocio. USG obstétrico hidranencefalia. Nació a las 36.3 semanas por vía cesárea, Apgar 6-8, peso 2100 g, talla 46 cm y perímetro cefálico 39.4 cm. Exploración física: macrocefalia, fontanelas amplias, sutura metópica prominente, fisuras palpebrales hacia arriba, microtia bilateral, ausencia de pulgar bilateral, clinodactilia de quintos dedos, con pliegue único de flexión bilateral, atresia anal, hipospadias, criptorquidia y transposición peno escrotal (Fig. 16 a-c). TAC de cráneo: hidranencefalia (Fig. 16 d). Ecocardiograma: normal. Cariotipo: 46,XY,del (13)(q34) (Fig. 17). Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una deleción 13q34 correspondiente al gen F7 (Fig. 18) con una relación de 0.42. Figura 16. Fenotipo de paciente (ver texto). Especialidad en Genética Médica 52 Figura 17. Cariotipo en el paciente ST02 que muestra la deleción terminal 13q. Figura 18. Paciente ST02 que mostró deleción 13q34 subtelomérica por su distribución de la RPH usando el setde sondas P036. RPH: relative peak height. Correlación genotipo-fenotipo microdeleción 13q34 La deleciones parciales del 13q son raras. Se han clasificado en tres grupos: Grupo 1, deleciones proximales a 13q32 se caracterizan por discapacidad intelectual de leve a moderada y rasgos dismorficos faciales; las deleciones 13q14 asociadas a retinoblastoma y las deleciones. Grupo 2, deleciones de 13q32, asociadas a fenotipo más grave, incluyen malformaciones cerebrales, oculares, genitourinarias, gastrointestinales y defectos de extremidades. Grupo 3, Especialidad en Genética Médica 53 deleciones en 13q33-34 que causan discapacidad intelectual, microcefalia y malformaciones genitales en hombres. Las características más comunes de la deleción 13q 33-34 son el retraso del desarrollo, discapacidad intelectual, microcefalia, dismórfia facial y ambigüedad de genitales (Walczak-Sztulpa et al., 2008). Defectos de extremidades principalmente la hipoplasia o ausencia de pulgares; anomalías del sistema nervioso central, defectos del tubo neural, holoprosencéfalia, malformación Dandy Walker y agenesia de cuerpo calloso (Witters et al., 2009). La deleción 13q la podemos encontrar asociada a VACTERL. La malformación anorrectal es otra característica encontrada, se propone al gen EFNB2 como el principal gen involucrado (Dworschak et al., 2013). Nuestro caso cumple con las características principales de la deleción 13q34, habiendo correlación con la deleción y el fenotipo. 17.3.1.3 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo 47,XY,+13: dup 13q12.11 y dup 13q34 c) Paciente ST03. Recién nacido femenino producto, madre G7 de 39 años de edad y padre de 39 años de edad, sanos y no consanguíneos. Nació vía vaginal a las 39 semanas de gestación, Apgar 7-9, peso 1965 g y talla 47 cm. El USG obstétrico del tercer trimestre reportó cardiopatía, labio hendido y microcefalia. Al nacimiento presentó microcefalia, microtia grado I bilateral, blefarofimosis, arrinia, agenesia de premaxila, lengua bífida, labio y paladar hendido medio, cuello corto, teletelia, pectus excavatum y espasticidad de miembros superiores ((Fig. 19a-c). Radiografía de columna displasia de sacro y fusiones vertebrales (Fig. 19d). La TAC de cráneo mostró holoprosencefalia semilobar (Fig. 19f). Ecocardiograma con cardiopatía congénita compleja cianógena simulando canal auriculoventricular, con atresia de arteria pulmonar y aurícula única. Figura 19. Fenotipo de paciente ST03 (ver texto). Especialidad en Genética Médica 54 Figura 20. Cariotipo en la proposita: 47, XY +13 (Fig.18) Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación 13q12.11 correspondiente al gen PSPC1 y una duplicación de 13q34 correspondiente al gen F7-6 (Fig. 21) con un ratio de 1.43 y de 1.55 respectivamente. Figura 21. Distribución de la RPH para la duplicaciónes 13q12.11 y 13q34 en la paciente ST03 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Especialidad en Genética Médica 55 Correlación genotipo-fenotipo microduplicación 13q12.11 y 13q34 Los hallazgos relacionados con la duplicación distal parcial de 13q comprenden retraso de crecimiento intrauterino, holoprosencefalia, polidactilia, hemangioma, cuello corto, hernia umbilical/inguinal, anormalidades cardiacas y urogenitales. Características craneofaciales incluyen microcefalia, implantación baja de orejas, tricomegalia de pestañas, hipotelorismo, puente nasal prominente, paladar alto, filtrum largo, y labio superior delgado (Jonch et al., 2012). Amplificaciones de 13q34 han sido reportadas en cáncer de pulmón, adenocarcinoma de intestino delgado, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas del esófago y cáncer de mama. La sobreexpresión de genes de esta región puede ser causalmente relacionada con el desarrollo o progresión de estas malignidades (Moscovich et al., 2013). Los pacientes con trisomía 13q parcial para segmentos distales tienen características similares a aquellos con trisomía para segmentos proximal, pero estas pueden ser diferenciadas, los pacientes con trisomía 13q proximal tienen persistencia de la hemoglobina fetal y múltiples proyecciones nucleares en neutrófilos, los pacientes con trisomía 13q distal es más común que presenten polidactilia, hemangioma, paladar alto y criptorquidia (Rogers, 1984). Este paciente con síndrome Patau se incluyó por el hecho de que no se realizó el diagnóstico clínico inicial y por contar primero con el resultado del análisis de MLPA, antes del cariotipo donde se corroboró la trisomía 13 regular. 17.3.1.4 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo 46,XY,r(18)(p11.3;q23): del 18p11.32 y del 18q23 d) Paciente ST04. Masculino producto de G1 no complicada de madre de 21 años de edad y padre de 23 años de edad, sanos y no consanguineos. Abuela paterna con tiroiditis de Hashimoto, la cual tiene un hermano con parálisis cerebral infantil. Se desconocen los antecedentes natales. A los 3 años peso 12 kg (-2.46 DE), talla 89 cm (-2.4 DE), perímetro cefálico 46.5 (-2.64 DE), a su exploración física: braquicefalia, cara redonda, hipertricosis frontociliar, puente nasal ancho, epicanto, pabellones auriculares prominentes y rotados hacia atrás, estrabismo, blefaroptosis, punta lingual bífida, quintos dedos cortos, acortamiento de cuartos ortejos, sobreposición de segundo sobre tercer ortejo, pie equinovaro corregido quirúrgicamente, escroto hipoplásico, criptorquidia y micropene (Fig. 22a-e). Evaluación neurológica, retraso psicomotor, retraso de lenguaje y trastorno de déficit de atención e hiperactividad. Ultrasonido renal fue normal. Ecocardiograma con insuficiencia mitral al nacimiento. Potenciales auditivos con hipoacusia bilateral de leve a moderada. TAC de cráneo: colpocefalia y atrofia frontal. Cariotipo: 46,XY,r(18)(p11.3 q23) [30] (550 bandas) (Fig. 23). Cariotipo de ambos padres normal. Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una deleción 18p11.32 gen USP14 y 18q23 gen RBFA (Fig. 24) con un ratio de 0.51 y 053. Especialidad en Genética Médica 56 Figura 22. Fenotipo de paciente ST04 (ver texto). Figura 23. Cariotipo, mostrando anillo del cromosoma 18 en paciente ST04. Especialidad en Genética Médica 57 Figura 24. Distribución de la RPH en paciente ST04 que muestra para las deleciones 18p11.32 y 18q23 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo deleción 18p11.32 y 18q23 Las deleciones 18p11.32 y 18q23 se encuentran presentes en inversión pericentrica del cromosoma 18, las características clínicas presentadas incluyen talla baja, crestas supraorbital y glabela prominente, ptosis palpebral leve, nariz bulbosa, microrretrognatia, pabellones auriculares de implantación baja, retraso del habla y discapacidad intelectual leve. (Prontera et al., 2010). Además se han descrito tres pacientes con esta deleciones que no presentaban alteraciones fenotípicas (Vermeulen et al., 2005). Múltiples casos de deleción 18q23 se han descrito, los cuales correlacionan con el fenotipo reportado en el paciente: microcefalia, talla baja, dismorfia facial y retardo en el desarrollo, así como la hipoacusia (Strathdee et al., 1997). Resalta un reporte donde se mencionan las anomalías en genitales (Linnankivi et al., 2006). Puede considerarse que el paciente presenta las características clínicas de un síndrome de deleción 18 q. 17.3.1.5 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo 47,XX+21,add(15)(p11.2): dup 21q11.2 y dup 21q22.3 e) Paciente ST05. Femenino de 1 año 7 meses de edad, producto de G6 de madre de 24 años de edad y padre de 26 años de edad, sanos yno consanguinidad. Nació a las 36 semanas vía cesárea, Apgar 8-9, peso 2400 g (p) y talla 51 cm (p). A la exploración física se encuentra hipotonía, reflejo de moro disminuido, fontanela anterior amplia, remolino parietal derecho, facies redonda, perfil facial plano, hipoplasia mesofacial, epicanto superior, fisuras palpebrales Especialidad en Genética Médica 58 oblicuas hacia arriba, arrugamiento palpebral al llanto, nariz corta, narinas pequeñas, comisuras labiales hacia abajo, apertostoma, protrusión lingual, hélix plegado superior, orejas de forma cuadrada, lóbulo auricular hipoplásico, micrognatia, cuello corto y ancho, piel redundante en nuca, hernia umbilical, diástasis de rectos, manos de apariencia corta y ancha, línea sydney clásica bilateral, clinodactilia de quintos dedos, pies de apariencia corta y ancha con diástasis entre el I-II ortejos del pie, surco plantar profundo, laxitud articular distal, piel marmórea y seca. El ecocardiograma con comunicación interventricular de tipo perimembranosa, comunicación interauricular tipo foramen oval permeable e insuficiencia tricuspídea leve funcional. Cariotipo: 47,XX,+21,add(15)(p11.2)[20]. Además se muestra el cariotipo de la madre de la paciente, el cual es 46,XX,15pst+[20] (Fig.25). Figura 25. Cariotipo de paciente (a), cariotipo de mamá (b) Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación 21q11.2 correspondiente al gen RBM11 y duplicación 21q22.3 del gen PRMT2 (Fig. 26) con radios de 1.52 y 1.47, respectivamente. Correlación genotipo-fenotipo duplicación 21q11.2 y 21q22.3 En nuestra paciente existe una total correlación de 21q11.2 y 21q22.3 con la trisomías 21 y el fenotipo de síndrome Down observado. Sin embargo, la razón de la realización del MLPA fue para verificar o descartar el hallazgo del marcador 15p11.2, no siendo informativo el estudio de MLPA a ese respecto. La incidencia de un marcador en la población general es aproximadamente 0.25 por 1000 (Annerén et al., 1984), y según un estudio de análisis citogenético a una muestra de 1921 casos con Down, este hallazgo sería extremadamente raro, pues no fue encontrado (Flores-Ramírez et al., 2015). Existe en la literatura el reporte de un caso único encontrado de un masculino con síndrome de Down mosaico y un marcador que por varias técnicas moleculares, se confirma es un derivativo del Especialidad en Genética Médica 59 cromosoma Y (Dutta et al., 2012). El hallazgo del marcador 15p11.2 en nuestra paciente fue eliminado pues, al realizar MLPA, no se encuentra, pero la madre es portadora de un incremento de la longitud de los satélites del brazo corto (pst+), no es de extrañarse que nuestra paciente también lo presente. Figura 26. Distribución de la RPH para las duplicaciones 21q11.2 y 21q22.3 en el caso ST05 con el set de sondas P036. Relative peak height (altura relativa del pico). 17.3.1.6 Desbalances subteloméricos en paciente con cariotipo mos 47,XXY[190]/46,XY[10]: dup Xp22PAR y dup Xq28 f) Paciente ST06. Masculino producto de G3 de madre de 36 años y padre de 41 años, sanos, no consanguíneos. No antecedentes heredofamiliares de importancia. En ultrasonido obstétrico se detecta restricción de crecimiento intrauterino y oligohidramnios. Nació a las 36 semanas de gestación vía vaginal, peso 1350gr (<P3), talla 36 cm (<P3), perímetro cefálico 28.8 cm (<P3). A la exploración física (Fig. 27), se encontró paciente con hipotonía, hipertricosis frontociliar, frente prominente, orejas con rotación posterior, foseta preauricular, telecanto, hipertelorismo, epicanto, estrabismo, puente nasal plano y ancho, nariz pequeña), paladar hendido y ojival), frenillo corto, labio superior delgado, micrognatia, hipospadias, criptorquidia bilateral, lesiones hipocrómicas que siguen las líneas de Blaschko. Se realiza laringoscopia con conclusión de laringomalacia tipo I/estenosis subglótica. PAETC: hipoacusia derecha. Ecocardiograma: Especialidad en Genética Médica 60 comunicación interauricular de tipo foramen oval permeable. USG testicular: no se observan imágenes sugestivas de testículos en región escrotal y canal inguinal bilateral. USG renal: ectopia renal derecha. TAC hipoplasia del cuerpo calloso, trastorno de migración neuronal, ventriculomegalia ex-vacuo. TAC oído: agenesia de celdillas mastoideas (Fig. 1h). Cariotipo: mos 47,XXY[19]/46,XY[1] (550 bandas). FISH: nuc ish(DXZ1X2, DYZ1X1) [190]/(DXZ1,DYZ1)X1[10]. Figura 27. Fenotipo de paciente (ver texto). Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación Xp22PAR y Xq28 correspondiente al gen SHOX-4, VAMP7. (Fig. 28) con un radio de 1.38 y 1.39, respectivamente. Correlación genotipo-fenotipo deleción Xp22PAR y Xq28 Existe en la literatura la descripción de pacientes con duplicación Xp22, específicamente a la región Xp22.31, los cuales concuerdan en la discapacidad intelectual, convulsiones, alteraciones en la deglución, espectro autista, hipotonía y pie equinovaro (Esplin et al., 2014). Por otra parte, existen estudios que analizan el efecto de la duplicación en Xq28, y los pacientes muestran también déficit intelectual, regresión del comportamiento, comportamiento autista y microcefalia, al involucrarse MECP2, si se involucra GDI1, IKBKG, RAB298, tienen otra variedad de manifestaciones; y en el particular caso de IKBKG, origina incontinencia pigmenti, además de otros desórdenes alélicos, lo cual quizá Especialidad en Genética Médica 61 originaría las manifestaciones dérmicas en nuestro paciente (Yumamoto et al., 2014). Por otro lado, las líneas de Blaschko son vistas en una variedad de condiciones donde existe un mosaico dérmico, dentro de tales patologías se encuentra el síndrome Klinefelter, aunque solo ocasionalmente (Molho-Pessach et al., 2011; Vreeburg et al., 2014; Sun et al., 2008). Figura 28. Caso S1 con duplicación Xp y Xq por la distribución de la RPH para los exones-genes en Xp22PAR y Xq28 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). 17.3.2. SÍNDROMES DE MICRODELECIONES O MICRODUPLICACIONES SUBTELOMÉRICAS CON CARIOTIPO NORMAL 17.3.2.1 Síndrome de microdelecion subtelomérica 1p36.33 g) Paciente ST07. Recién nacido masculino producto de G1, madre de 20 años de edad y padre de 20 años edad, sanos, no consanguíneos. Antecedente de un aborto y tía paterna con hipoacusia. Nació de 38.4 semanas por vía cesárea, Apgar 8-7-9, peso 2310 (<P3), talla 51 (P75) perímetro cefálico 32.5 (P3-P10). A la exploración física: fontanelas amplias, foseta en hélix derecho, orejas prominentes, nariz de base ancha, columnela corta (Fig. 29a-b), úvula bífida, pectus carinatum, pliegue único de flexión en quinto dedo izquierdo, línea Sídney izquierda (Fig. 29c), hipospadias glandular, cabalgamiento de ortejos en pie derecho. A los 10 meses aún sin sostén cefálico, no sigue con la mirada y tiene crisis convulsivas. Radiografía de tórax normal. La TAC de cráneo con atrofia frontoparietal, hipoplasia cuerpo calloso y cavum septum vergae (Fig. 29d). Ecocardiograma con persistencia del conducto arterioso y comunicación interauricular. USG renal normal. Perfil tiroideo normal. Cariotipo: 46,XY (550 bandas). Análisis con MLPA con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una deleción 1p36.33 correspondiente al gen TNFRSF4 con un radio de 0.53 (Fig. 32). Especialidad en Genética Médica 62 Figura 29. Fenotipo de paciente ST07 (ver texto). h) Paciente ST08. Masculino de 4 años, producto de G2, madre de 25 años de edad y padre de 52 años de edad, ambos sanos. Antecedente familiar de hermana con epilepsia más insuficienciarenal secundaria a hipoplasia renal. Cursó con sangrado transvaginal moderado al tercer mes e hipomitilidad fetal. Nació vía vaginal a las 39 semanas, parto distócico con uso de fórceps, no lloró al nacimiento, peso de 3,000 g (p25). A los tres años presentó crisis convulsiva tónico clónicas febriles. A la exploración neurológica con retraso global del desarrollo e hipotonía. Exploración física: braquicefalia, occipucio plano, sinofridia, tricomegalia de pestañas, puente nasal ancho, orejas antevertidas y rotadas hacia atrás, cuello corto y ancho, obesidad, manos cortas y anchas, clinodactilia de quinto dedos, cicatriz de orquidopexia y sobreposición de ortejos (Fig. 30a-c). RMI cráneo: cisterna magna amplia, hipoplasia de vermis cerebeloso, hipoplasia de tercio medio de cuerpo calloso y colpocefalia (Fig. d). Cariotipo: 46,X,Yqh (550 bandas). Análisis con MLPA con el set de sondas P036 subtelomérica demostró Especialidad en Genética Médica 63 una deleción 1p36.33 correspondiente al gen TNFRSF4 con un radio de 0.53 (Fig. 32). Figura 30. Fenotipo de paciente ST08 (ver texto) i) Paciente ST09. Femenina de 6 años, producto de madre G4 de 36 años y padre finado a los 42 años por insuficiencia renal aguda sin antecedente de consanguinidad. Nació vía cesárea por oligodramnios leve. Nació a las 35 semanas, Apgar 7-9, peso al nacimiento 1600 g (<p3), talla 45 cm (p50) y perímetro cefálico 32 cm (p50). Hospitalizada a los dos meses por crisis convulsivas. A la exploración física: fisuras oblicuas hacia arriba, orejas cuadradas, lóbulos hipoplasicos, dermatitis atópica, filtrum corto, diastemas dentarios y foseta pilonidal (Fig. 31). Evaluación por neurología: trastorno espectro autista y discapacidad intelectual. TAC de cráneo con atrofia cortical frontal y temporal, ventriculomegalia, colpocefalia, hipoplasia cuerpo calloso y cisterna magna amplia. Cariotipo: 46,XX (550 bandas). Análisis con MLPA con el set de Especialidad en Genética Médica 64 sondas P036 subtelomérica demostró una deleción 1p36.33 correspondiente al gen TNFRSF4 con un radio de 0.53 (Fig. 32). Figura 31. Fenotipo de la paciente ST09 (ver texto). Correlación genotipo-fenotipo deleción 1p36.33 La deleción 1p36.33 es una de las microdeleciones subteloméricas más frecuentes, con una incidencia estimada en 1 en 500. Se caracteríza por hipotonía, discapacidad intelectual, retraso del desarrollo, anomalías del sistema nervioso central, convulsiones, pérdida de la audición, defectos cardiacos, dismorfias faciales y lenguaje pobre o ausente (Buck et al., 2011). Especialidad en Genética Médica 65 Figura 32. Histograma de la RPH para cada sonda subtelomérica medida en los pacientes caso ST07, ST08 y ST09 mostrando deleción subtelomérica (superior) y la distribución de la RPH para la deleción 1p36.33 usando el set de sondas P036 (inferior). RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Especialidad en Genética Médica 66 Tabla 8. Hallazgos reportados en pacientes con deleción 1p36.33 Hallazgos Reportes previos n=10a Pacientes ST07 ST08 ST09 Talla baja 2/8 - - - Microcefalia 4/10 - - - Fontanela anterior amplia 1/6 + - - Cejas rectas 6/8 + + + Enoftalmia 8/4 - - - Orejas displasicas 7/9 + + + Epicanto 1/6 - - Fisuras palpebrales oblicuas hacia arriba 7/5 - + + Hipoplasia mesofacial 4/7 - - - Punta nasal prominente 6/7 + + - Mentón prominente 4/7 - + - Braquidactilia 3/7 + - + Clinodactilia 1/7 + - + Retraso del desarrollo 8/10 + + + Discapacidad intelectual 6/9 NA + + Retraso del habla 6/8 + + + Trastorno de conducta 476 NA + + Convulsiones 8/4 + - + Hipotonia 4/7 - - + Problemas visuales 6/2 + - - Hipoacusia 1/6 - - - Hiperfagia 6/2 - - - Obesidad 3/6 - - + Microdontia oligodontia 1/6 NA + - Paladar alto 6/2 - - - Apéndice preauricular 1/6 - - - Escoliosis 1/7 - - - Anomalias renales 1/6 + - - Comportamiento autista 1/7 NA + - TDHA 1/6 NA - - aModificada de Buck et al. (2011). Dentro de las características craneofaciales se incluyen braquicefalia, cierre tardío de fontanela anterior, cejas rectas y puente nasal ancha. El retraso en el desarrollo y discapacidad intelectual está presente en todos, hipotonía (95%), lenguaje expresivo ausente (75%) o se limita a pocas palabras. Los defectos del sistema nervioso están presentes en el 88%, e incluyen ventriculomegalia, atrofia cortical difusa, hipoplasia o ausencia de cuerpo calloso, retraso de mielinizacion e Especialidad en Genética Médica 67 hiperintensidades multifocales en la sustancia blanca. Las convulsiones ocurren en el 44-58% de casos, la edad de inicio varia de pocos días de vida a dos años. El 20% tienen espasmos infantiles asociado a hipsarritmia en el EEG. El estrabismo, nistagmo, errores de refracción, falta de atención visual son las manifestaciones oftalmológicas más comunes. Las manifestaciones genitourinarias ocurren en el 22% de los afectados e incluyen la hidronefrosis, ectasia renal quiste renal y ectasia pélvica unilateral; además criptorquidia, hipospadias, hipoplasia escrotal y micropene, en una minoría. (Battaglia, 2013). Las características más comunes de esta microdelecion son la discapacidad intelectual, fontanela anterior amplia, retraso motor, hipotonía, problemas visuales y auditivos, convulsiones y retraso de crecimiento. No se ha encontrado correlación entre el tamaño de la deleción y el número de características clínicas observadas (Gajecka et al., 2007). Nuestros pacientes presentan una gran variabilidad fenotípica, un cuadro clínico más florido en el caso ST07 y ST09 y menos severo en caso ST02, resaltamos las manifestaciones compartidas, principalmente neurológicas: retraso del desarrollo, discapacidad intelectual, retraso del habla y anomalías neurológicas las cuales son las principales manifestaciones reportadas. Por tanto los pacientes presentan los hallazgos descritos en esta deleción (Tabla 8), por lo que hay una correlación genotipo fenotipo. 17.3.2.2 Síndrome de microduplicación subtelomérica 3q29 j) Paciente ST10. Femenino de 4 años de edad, producto de G1, madre de 21 años de edad, sana; padre de 20 años padece trombastenia de Glanzmann. Antecedente de tío materno con discapacidad intelectual y tío paterno con soplo congénito.Nació vía cesárea por RCIU de 38 .5 SDG por Capurro, Apgar 9, peso 1,850 (<P3) y talla 37 (<P3). Postoperada de craneosinostosis a los cinco meses. Neurológicamente con retraso global del desarrollo. Exploración física (Fig. 33): peso y talla bajos, microcefalia, plagiocefalia frontal izquierda, asimetría facial izquierda, frente amplia, puente nasal amplio, telecanto, fisuras palpebrales oblicuas hacia abajo, blefaroptosis bilateral, pabellones auriculares de implantación baja y rotación posterior, paladar alto, soplo paraesternal grado ll, pectus excavatum, hernia umbilical, laxitud articular distal, pulgares anchos, braquifalangia y fosetas en nudillos, clinodactilia de quintos dedos, segundos dedos cortos, línea Sídney bilateral, pie plano valgo y ortejos cortos. Serie osea: braquidactilia A3 y engrosamiento del primer ortejo. USG renal: Normal. TAC cráneo 3D: Craneosinostosis coronal derecha. RMN cráneo: Cisterna magna amplia, polimicrogiria frontal y quiste aracnoideo basal. Oftalmología: Epiblefaron inferior, pseudoexotropia, descartar ametropía. Cariotipo: 46,XX. Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación 3q29 correspondiente al gen BDH1 (Fig. 34) con un ratio de 1.36. Especialidad en Genética Médica 68 Figura 33. Fenotipo de paciente en la pacientes ST10 (ver texto). Figura 34. Paciente ST10 que mostró una duplicación subtelomérica en 3q29 por la distribución de la RPHpara la usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Especialidad en Genética Médica 69 Correlación genotipo-fenotipo duplicación 3q29 La recombinación homóloga no alélica entre los repetidos de bajo número de copias es un mecanismo conocido que lleva a reordenamientos cromosómicos, y son la causa de las microdeleciones y microduplicaciones. La duplicación 3q es una condición bien definida con rasgos faciales característicos, incluyendo microcefalia, pabellones auriculares de implantación baja, malformaciones genitourinarias, defectos cardiacos, retraso del crecimiento y discapacidad intelectual. Hay 29 genes principalmente descritos en este intervalo (Lisi et al., 2008). Entre los individuos con microduplicación de diferentes tamaños, craneosinostosis, paladar alto, convulsiones y defectos septales ventriculares se han descrito (Ballif et al., 2008). La duplicación 3q29 también puede acompañarse de discapacidad intelectual severa, epilepsia y parálisis cerebral (Fernández et al., 2014). La región critica minima es de aproximadamente 1.6Mb comprendida entre los genes TFRC y BDH1. Nosotros estamos presentando el segundo caso de craneosinostosis asociado a la duplicación 3q29. Concluimos que hay una correlación genotipo fenotipo. Tabla 9. Hallazgos reportados en pacientes con duplicación 3q29 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=8a Paciente ST10 Discapacidad intelectual de leve a moderada 6/8 + Craneosinostosis 1/8 + Macrocefalia 1/8 - Microcefalia 5/8 + Paladar alto 1/8 + Defecto septal ventricular 1/8 Soplo Pliegues excesivos en manos 2/8 - Pie plano 2/8 + Obesidad 4/8 - aModificada de Ballif et al. (2008). 17.3.2.3 Síndrome de microduplicación subtelomérica duplicación 4p16.3 k) Paciente ST11. Femenino producto de G1 no complicada de madre de 20 años de edad y padre de 20 años de edad, sanos y no consanguíneos. Abuelo, tío y primo materno con epilepsia. Nació a las 38 semanas vía abdominal, Apgar, peso, talla y perímetro cefálico al nacimiento se desconocen. A los 2 años ocho meses mostró microcefalia, implantación baja de cabello posterior, recesión bitemporal, pico de viuda puente de nariz estrecho, raíz nasal ancha, narinas antevertidas, filtrum borrado (Fig. 35a) implantación baja de orejas, lóbulos auriculares espatulados e hipoplásicos, cuello corto, clinodactilia de quintos dedos, dedos ahusados, pezones hipoplásicos, pliegues palmares poco profundos, apéndice facial en mejilla derecha, escleras azules, incisivo central único (Fig. 35b) Especialidad en Genética Médica 70 ausencia de frenillo labial superior, paladar ojival y labios delgados con borramiento de bermellón. Neurológicamente: retraso psicomotor leve y del lenguaje y crisis convulsivas tónico-clónicas de difícil control. El US cardiaco y la radiografía AP de tórax fue normal (Fig. 35c). Los estudios de neuroimagen mostraron colpocefalia (Fig. 35d) atrofia subcortical global, valles silvianos amplios e hipoplasia de cuerpo calloso (Fig.35e). Figura 35. Fenotipo de paciente ST11 (ver texto). Figura 36. Distribución de la RPH para la duplicación 4p16.3 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Especialidad en Genética Médica 71 Análisis con MLPA: La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación 4p16.3 correspondiente al gen PIGG-7 con un ratio de 1.4 (Fig.36). Correlación genotipo-fenotipo duplicación 4p16.3 La presentación clínica del síndrome de la duplicación 4p16.3 es muy variable e incluye como manifestaciones relativamente consistentes la implantación baja de orejas, convulsiones, microcefalia, y trastornos del neurodesarrollo (Palumbo et al.,2015). Las alteraciones estructurales de SNC y el retraso del desarrollo y lenguaje correlacionan con el fenotipo reportado en pacientes con la duplicación 4p. Dentro las manifestaciones a nivel de SNC en la duplicación 4p, lo más frecuentemente reportado son alteraciones en la mielinización. (Cyr et al., 2011). En nuestra revisión no encontramos reportes previos referentes a la presencia de incisivo central único observado en nuestra paciente (Fig. 35b), por lo que puede considerarse una contribución al fenotipo de la duplicación 4p16.3 en espera de su confirmación en futuros reportes o como una asociación variante de línea media. 17.3.2.4 Síndrome de microdelecion subtelomérica 6p25.3 l) Paciente ST12. Recién nacido masculino, madre G2 de 21 años de edad y padre de 25 años de edad, sanos y no consanguíneos. Tío por rama materna con microtia unilateral, atresia de conducto auditivo externo, hipoacusia y discapacidad intelectual. Infección de vías urinarias en tercer de embarazo tratada con antibiótico. Nació a las 37.1 semanas por vía cesárea, Apgar 9-9, peso 2540 g, talla 46 cm, y perímetro cefálico 33.5. Exploración física: tres remolinos (central y biparietal), fontanelas amplias, recesión bitemporal, hipertricosis frontal, telecanto, cejas escasas, puente nasal ancho y plano, narinas antevertidas, orejas pequeñas y de implantación baja, ptosis palpebral, megalocornea bilateral, aniridia, escleras azules, buftalmos y opacidad corneal bilateral, fimosis y micropene (Fig. 37a-d). A la exploración neurológica retraso global del desarrollo e hipotonía. La evaluación oftalmológica encontró glaucoma congénito. El USG renal encontró ectasia renal izquierda. Ecocardiograma normal. La TAC de cráneo con atrofia frontal, prominencia de valles silvianos y colpocefalia (Fig. 37e). El USG renal y abdominal fue normal. Pruebas de función tiroidea normal, biometría hemática con anemia microcitica. La evaluación con el set de sondas MLPA P036 subtelomérica demostró una deleción 6p25.3 correspondiente al gen IRF4-2 (Fig. 38) con un radio de 0.54. Correlación genotipo-fenotipo deleción 6p25.3 La deleción subtelomérica 6p ha sido recientemente reconocida como un síndrome clínicamente identificable con un distintivo fenotipo consistente de retraso de desarrollo, discapacidad intelectual, alteración de lenguaje, hipoacusia, anomalías oftalmológicas, cardiacas, y anormalidades craneofaciales consistentes de hipertelorismo, hipoplasia mesofacial, paladar alto y nariz corta. En pacientes Especialidad en Genética Médica 72 con deleción 6p25 se ha identificado un gen candidato de glaucoma congénito, gen FOXC1 el cual es un factor de transcripción (Nakane et al., 2013). Figura 37. Fenotipo de paciente ST12 (ver texto). Especialidad en Genética Médica 73 Figura 38. Distribución de la RPH para la deleción 6p25.3 en el pacientes ST12 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Los loci genéticos asociados a anomalías de la camara anterior ocular del tipo anomalía Axenfeld- Rieger han sido mapeado en tres regiones cromosómicas: 4q25, 6p25 y 13q14. Estos pacientes muestran un patrón reconocible de malformaciones que incluyen hipertelorismo, fisuras palpebrales hacia abajo, anomalía de Axenfeld- Rieger, hipoacusia, anomalías del sistema nervioso central y retraso en el desarrollo. La mayoría de las manifestaciones clínicas de estos pacientes se cree es debido a la haploinsuficiencia de múltiples genes. La mayoría de pacientes con manifestaciones únicamente oculares exhiben mutaciones únicamente en gen FOXC1, por lo que en pacientes con manifestaciones extraoculares deben estar afectados otros genes. El hipertelorismo y las anomalías cardiacas se asocian a menudo con mutaciones en FOXC1. Correlaciones genotipo-fenotipo de pacientes previamente publicados (Tabla 10), han sugerido fuertemente las anomalías de la cámara anterior del ojo como una de las principales malformaciones en la deleción 6p25.3y si involucra el gen FOXC1 (Paccione et al., 2011). En conclusión nuestro presenta las características principales de la deleción 6q25.3, encontrando correlación genotipo-fenotipo. Nuestro gen IRF4 no explica las características clínicas presentadas, siendo este un gen relacionado a respuesta inmunitaria principalmente. Tabla 10. Hallazgos reportados en pacientes con deleción 6q25.3 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=32a Paciente ST12 Defectos de cámara anterior 28/32 + Braquicefalia y frente amplia 3/3 + Hipertelorismo 23/26 + Fisuras palpebrales oblicuas hacia abajo 9/10 - Nariz pequeña y antervertida 3/3 + Anomalía palatina 1/4 - Anomalías dentales - NA Anomalías de oído 5/11 NA Pérdida de audición 21/26 - Anomalías umbilicales 2/7 - Anomalías del SNC 13/23 + Defectos cardiacos 18/25 - Hipoplasia pulmonar 1/4 - Anomalías genitourinarias 2/5 + Hipotonía 5/7 + Retraso del desarrollo 11/12 + aModificada de Tonoki et al. (2011). 17.3.2.5 Síndrome de microduplicación subtelomérica 7p22.3 Especialidad en Genética Médica 74 m) Paciente ST13. Masculino de 14 años de edad, madre G5 de 51 años de edad asmática, padre de 35 años de edad, sano. No consanguinidad. Dentro de los antecedentes heredofamiliares, por rama materna abuelo con cáncer basocelular. Nace a las 39 semanas vía vaginal, peso 3000 g, resto se desconoce. A la exploración neurológica, retraso global del desarrollo, crisis convulsivas tónico clónicas generalizadas y conducta agresiva. Exploración física: estatura baja, obesidad troncal, facies larga, enoftalmos, hipotricosis difusa de cejas, frente amplia, narinas hipoplasicas, puente nasal plano, filtrum borrado, labio inferior delgado, labios con maculas violáceas, comisuras labiales hacia abajo, prognatismo, orejas cuadradas, hélix hipoplasico, pabellones auriculares rotados hacia atrás, acantosis nigricans, seudoginecomastia, pezones hipoplasicos e invertidos, pliegue de flexión palmar único bilateral, dedos ahusados (Fig.39a-d), ausencia de vello púbico, escroto hipoplasico, pene enterrado, foseta pilonidal en sacro, luxación de rotulas, hipoplasia de ortejos en miembros inferiores, sindactilia II-III ortejos y primer ortejo ancho. Endocrinología, hipogonadismo hipogonadotro. Neurología, discapacidad intelectual profunda, trastorno de espectro autista, afasia motora, hipotonía y marcha neuropatica basculante. TAC de cráneo con ventriculomegalia y discreta atrofia cortical frontal (Fig. 39e). Cariotipo: 46, XY (350 bandas). Figura 39. Fenotipo de paciente ST13 (ver texto). n) Paciente ST14. Masculino producto de G2, madre de 18 años de edad es asmática, padre de 19 años de edad se refiere sano. No consanguíneos. Por rama materna tía con síndrome Down, hermana de bisabuela con síndrome Down. Nació vía cesárea a las 38.4 SDG, Apgar 9/9, peso 2500 g (P3-P10), talla 43.5 cm (<P3), perímetro cefálico 32.5 cm (P50-P75). Exploración física: recesión bitemporal, frente amplia, puente nasal elevado, puente nasal ancho, narinas antevertidas, cuello corto (Fig. 40a-b), meningocele sacro, onfalocele, extrofia Especialidad en Genética Médica 75 cloacal/vesical, afalia, pliegues genitales, atresia anal (Fig. 1 c-d), pie equino varo (Fig. 40e). Radiografía de columna, displasia de sacro por presencia de hemivértebras y fusión de cuerpos vertebrales. La tomografía de abdomen muestra pérdida de continuidad de los tejidos blandos de pared abdominal en región umbilical, con protrusión de epiplón y asas intestinales por fuera de cavidad abdominal, ectopia renal izquierda y no se identifica vejiga y (Fig. 40f). Ecocardiograma, comunicación interauricular de 3 mm. Cariotipo 46,XY. Figura 40. Fenotipo de paciente ST14 (ver texto). ñ) Paciente ST15. Recién nacido masculino producto de embarazo gemelar, madre G7 de 36 años de edad y padre de 37 años de edad, sanos. No consanguinidad, antecedente de dos abortos, por rama materna prima fallecida con anencefalia. El USG obstétrico, embarazo gemelar biamniótico, gemelo II con anencefalia y gemelo I con labio y paladar hendido. Obtenidos vía cesárea a las 31 semanas de gestación, gemelo l con peso 1280 g (P3-P10), talla 25 cm (P10- P25), perímetro cefálico 29 cm (P50-75). El gemelo ll fallece al nacimiento, a su exploración física: anencefalia, labio paladar hendido derecho, ectrodactilia mano y pie derecho, atresia anal y criptorquidia. Gemelo l, exploración física: frente abombada, occipucio prominente, microtia izquierda con agenesia de conducto auditivo externo, telecanto, asimetría facial con microsomía hemifacial izquierda, macrostomía, labio y paladar hendido izquierdo, línea Sídney clásica bilateral, clinodactilia de quintos dedos e hipoplasia de pezones (Fig. 41). Ultrasonido cardíaco con ducto arterioso permeable y foramen oval de 1 mm. TAC de cráneo con hemorragia de matriz germinal, lisencefalia frontal, prominencia de valles silvianos, megacisterna magna, atrofia cerebelosa, IV ventrículo dilatado, colpocefalia, hipoplasia cuerpo calloso e hipomielinización (Fig. 41d). Falleció a los 73 días de vida. Cariotipo 46,XY. Especialidad en Genética Médica 76 Figura 41. Fenotipo de paciente ST15 (ver texto). o) Paciente ST16. Masculino de 13 años 6 meses producto madre G1 de 40 años, con hoyuelos preauriculares y padre de 52 años. Antecedentes familiares, por rama materna primo con hoyuelos preauriculares, prima con pie equino varo, displasia de cadera y artrogriposis múltiple y tía con síndrome convulsivo. Nació vía cesárea a las 34 semanas de gestación por ruptura prematura de membranas, peso 3000g talla 60 cm. Exploración física: peso y talla bajos, microbraquicefalia, macroblefaron, tricomegalia de pestañas, telecanto, puente nasal alto y ancho, facies inexpresiva, pabellones auriculares prominentes, cejas arqueadas, epicanto, oligodontia, cojinetes fetales prominentes (Fig. 42), escoliosis, línea Sídney derecha, clinodactilia y pie equino varo bilateral. Presenta discapacidad intelectual. Potenciales visuales normales y auditivos con hipoacusia severa bilateral. TAC coronal de oídos hipoplasia coclear y otomastoiditis crónica bilateral. Radiografía de columna: escoliosis lumbar y coxa valga. Figura 42. Fenotipo de paciente ST16 (ver texto). Especialidad en Genética Médica 77 p) Paciente ST17. Femenina de 11 años de edad, producto de G3, madre de 35 años de edad y padre de 39 años de edad, aparentemente sanos y no consanguíneos. Nació a las 38 semanas de gestación por cesárea, peso 3800 g, Apgar 8-9-10. Exploración física: frente amplia, estrechamiento frontotemporal, hipertricosis frontociliar, sinofridia, epicanto, nariz de base ancha, mordida abierta, mentón prominente, pabellones auriculares de implantación baja, cuello corto, cubitus valgus, pulpejos prominentes, teletelia, pezón supernumerario, mancha café con leche en región abdominal, hernia umbilical, hemangioma capilar plano en cuádriceps derecho, primer ortejo en retroflexión, cuarto ortejo acortado, pie cavo, separación primer y segundo ortejo. Neurológicamente presenta discapacidad intelectual. Radiografías de miembros pélvicos y pies: evidencian disminución de la densidad ósea. Resonancia magnética de cráneo con zonas de leucoencefalopatía focal a nivel de sustancia blanca subcortical bilateral y quistes paraventriculares adyacentes a las astas anteriores de ventrículos laterales. Cariotipo 46, XX normal La evaluación con el set de sondas MLPA P036 subtelomérica en los pacientes ST13 a ST17 demostró una duplicación 7p22.3 correspondiente al gen ADAP1 (Fig. 43) con un ratio de 1.46. Figura 43. Distribución de la RPH para la duplicación 7p22.3 usando el set de sondas MLPA P036 encontrada en los pacientes ST13 a ST17. RPH: relativepeak height. Correlación genotipo-fenotipo duplicación 7p22.3 La duplicación 7p22.3 se ha asocia trastorno de espectro autista, únicamente descrita en un paciente. Se ha descrito como parte de los reordenamientos Especialidad en Genética Médica 78 complejos en pacientes con discapacidad intelectual principalmente. Duplicaciones parciales de esta región se han descrito en padres sanos con hijos autistas, en los cuales también se investigado alteración y no se ha encontrado. La ganancia en 7p22.3 puede ser solamente un factor que contribuye al desarrollo de síndrome de Asperger (Vulto-van Silfhout et al., 2012). Más de 60 casos se han descrito de deleciones y duplicaciones de 7p22. Se han descrito 16 casos sin otras anomalías cromosómicas concomitantes, varios casos de duplicación de novó se han descrito, casos familiares ocurren por una mala segregación de una translocación equilibrada parental o recombinación anormal causada por una inversión parental (Goitia et al., 2015). La mayoría de casos son por una translocación desbalanceada y rara vez son de novó. El espectro fenotípico de la duplicación es variado debido al tamaño, localización y contenido de genes de la región duplicada (Chui et al., 2011). Las características fenotípicas principales incluyen: retraso del desarrollo, discapacidad intelectual, problemas de comportamiento, trastorno de lenguaje, trastorno de espectro autista, hipotonía, fontanelas amplias, frente ancha, hipertelorismo, fisuras palpebrales oblicuas hacia abajo, pabellones auriculares de implantación baja y displasicos, micrognatia, retrognatia, pliegues palmares anormales, pulgares anchos, alteraciones esqueléticas, luxaciones articulares, contracturas y criptorquidia. Se propone para explicar la gran variabilidad clínica una penetrancia incompleta y/o expresividad variable de las microduplicaciones y microdeleciones de la misma región (Goitia et al., 2015). Nosotros estamos presentado las características clínicas en cinco pacientes con duplicación 7p22.3. Los cuales presentan un espectro fenotípico muy amplio; el paciente ST13 es el de mayor correlación con las características clínicas descritas para la duplicación 7p22.3, resaltando el mayor espectro de severidad clínica en nuestro paciente. Los casos dos y tres presentan un cuadro clínico muy severo por lo que consideramos no hay correlación clínica, no descartando alteraciones cromosómicas adicionales. La duplicación subtelomérica 7p22.3 se asocia principalmente a discapacidad intelectual por lo que la podemos considerar asociada en los pacientes cuatro y cinco. 17.3.2.6 Síndrome de microdeleción 8p23.3 subtelomérica q) Paciente ST18. Femenino de 14 años producto de G2 no complicada de madre de 37 años de edad y padre de 38 años de edad. Sin antecedentes familiares de relevancia para el padecimiento. Nació vía abdominal, con un peso de 5440 g. Sostén cefálico a los 4 meses, sedestación a los 10 meses, deambulación al año 7 meses, menarca a los 13 años, pubarca a los 13 años 4 meses. Problemas de conducta a los 3 años, se refiere inquieta y con caídas frecuentes. Acude a escuela especial, no sabe leer ni escribir. A la exploración física (14 años), se observa obesidad truncal, braquicefalia, frente amplia, cara ovalada con leve asimetría, cejas arqueadas y ralas, endoftalmos, epiblefaron superior, ojos almendrados, nariz afilada con puente-punta curvados (facies ornítica), orejas simplificadas con hipoplasia de lóbulo, labio superior delgado, incisivos centrales superiores prominentes, tercio inferior de la cara ancho, voz grave, discreta Especialidad en Genética Médica 79 acantosis nigricans en cuello, dedos ahusados, diastasis de 1er y 2° ortejo, primer ortejo ancho con hipoplasia ungueal, pie plano (Fig. 44). La evaluación oftalmológica encontró estrabismo convergente. TAC de cráneo normal. Determinación de CI: 46 (deficiente medio). Cariotipo: 46,XX. Figura 44. Fenotipo de paciente ST18 (ver texto). La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una deleción 8p23.3 correspondiente al gen FBXO25 (Fig. 45) con un radio de 0.51. Especialidad en Genética Médica 80 Figura 45. Distribución de la RPH para el caso ST18 que muestra la deleción 8P23.3 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo deleción 8p23.3 El locus 8p23.3 corresponde al gen FBXO25 (F-box protein 25), que codifica para el componente de reconocimiento de sustrato del complejo proteico SCF cuya función es la ubiquitinización dependiente de fosforilación y juega un papel principal en la acumulación de repetidos de poliglutanminas de la proteína Huntingtina. Las enfermedades relacionadas con esta deleción (OMIM) son la anemia Diamond-Blackfan y la lipofuscinosis ceroide neuronal. La porción terminal del cromosoma 8 es propensa a reareglos cromiosómicos, y la deleción terminal que involucra 8p23 se ha relacionado con malformaciones cardiacas, hernias diafragmáticas congénitas, retrasos del desarrollo y alteraciones neurospiquiatricas (Chien et al, 2010). La paciente reportada por Magari et al, (2012), presentó un fenotipo semejante al de nuestra paciente con la forma de la nariz peculiar, y las mejillas prominentes, además de un CI de 55-65, y defectos en el lenguaje y la lectoescritura, esta paciente además de presentar la monosomía 8p23, muestra también una copia doble de la región 12p13 a la cual podría deberse las alteraciones estructurales que esta presenta. Se ha encontrado relación entre rearreglos subtelomericos y variación del número de copias en esas regiones con el déficit intelectual, en Christofolini et al. (2010), podemos encontrar la relación de siete pacientes con discapacidad intelectual y la deleción que nos compete, 8p23.3 con la afectación específica del gen FBXO25. 17.3.2.7 Síndrome de microdeleción subtelomérica 10q26.3 r) Paciente ST19. Masculino producto de G1 no complicada de madre de 17 años de edad y padre de 18 años de edad, sanos y no consanguineos. Tíos maternos con atresia esofágica y pie equino varo bilateral, respectivamente. Nació a las 37.1 semanas por vía vaginal, Apgar 7-8, peso 2570 g (P25-50), talla 50 cm (P75-90) y PC 34.3 cm (P75). A los 5 meses mostró con fontanela anterior amplia, hipertricosis frontociliar, frente abombada, ojos protruyentes, escleras azules, nariz ganchosa, hélix plegado derecho, labio superior delgado, micrognatia (Fig. 46a-c), línea simiana variante bilateral, mancha mongólica sacra, micropene de 1.3 cm, escroto hipoplásico, criptorquidia izquierda (Fig. 46d), distancia ano-escrotal aumentada, retroflexión del primer ortejo y zigodactilia bilateral (Fig. 46g); hipotonía axial con espasticidad de las cuatro extremidades. La evaluación oftalmológica encontro hipoplasia bilateral de ambos nervios ópticos (Fig. 46e). El USG cardiaco y renal fueron normales y el pélvico-inguinal identificó cuerpos cavernosos y testículo derecho de 5 mm, sin localizar el izquierdo. La TAC de cráneo mostró cisterna magna amplia, atrofia cortical frontal, hipoplasia de cuerpo calloso ventriculomegalia, valles silvianos amplios (Fig. 46f). El perfil de lípidos y niveles de testoterona, androstenediona, FSH, LH y perfil tiroideo fueron normales. Cariotipo: 46,XX (550 bandas). La evaluación con el set de sondas MLPA P036 subtelomérica mostró una deleción 10q26.3 correspondiente al gen PAOX-3, Especialidad en Genética Médica 81 confirmada con la SALSA MLPA 070 que mostró deleción del gen ECHS1-8*, localizado también en 10q26.3 (Fig. 47a) con un radio de 0.51. La evaluación con la SALSA MLPA P245 mostró además, deleción del gen SHANK3-3* en 22q13.33 (Fig. 47b) Figura 46. Fenotipo de paciente ST19 (ver texto). Figura 47. Distribución de la RPHpara la deleción 10q26.3 usando el set de sondas P070 mostrando una deleción subtelomérica 10q26.3 con pérdida del gen ECHS1-8* (a). En el mismo paciente ST19 la sonda MLPA P245 identificó deleción del gen SHANK3-3* en 22q13.33 (b). RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo deleción 10q26.3 La presentación clínica del síndrome de deleción distal 10q es muy variable e incluye como manifestaciones relativamente consistentes la apariencia facial distintiva, anomalías cardiacas, urogenitales, falla de medro y trastornos del neurodesarrollo (Vera-Carbonell et al., 2009). La falla de medro, retraso del Especialidad en Genética Médica 82 desarrollo, facies característica y anomalías ano-genitales correlacionan con el fenotipo reportado en pacientes con la deleción distal de 10q (Tabla 1). De las manifestaciones oftalmológicas en la deleción 10q distal, resalta un reporte único de cataratas (Chang et al., 2013), y en nuestra revisión no encontramos reportes previos referentes a la hipoplasia de nervios ópticos observada en nuestro paciente (Fig. 46e), por lo que puede considerarse una contribución al fenotipo de la deleción 10q distal en espera de su confirmación en reportes futuros. El retraso del desarrollo en nuestro paciente puede además relacionarse con la deleción de SHANK3-3* identificada con la SALSA MLPA P245, por se un gen altamente relacionado con problemas neuropsiquiátricos (Delorme et al., 2010). Tabla 11. Hallazgos reportados en pacientes con deleción 10q26.3 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=16a Paciente ST19 Nariz prominente 16/16 + Anomalías auriculares 14/16 + Hipertelorismo 7/14 - Microcefalia 10/16 - Estrabismo 6/14 - Cardiopatía congénita 10/16 - Anomalías nefrourológicas 6/6 - Criptorquidia 2/16 + Anomalías ano-genitales 2/3 + Déficit de atención e hiperactividad 7/9 NA Trastorno opositivo desafiante 6/9 NA Trastorno autista 1/9 NA Discapacidad intelectual/desarrollo 9/9 + aModificada de Yatsenko et al. (2009), solo de pacientes con la deleción 10q26.3. 17.3.2.8 Síndrome de microdelecion subtelomérica 12p13.33 s) Paciente ST20. Femenina producto de G2 no complicada de madre de 23 años de edad y padre de 23 años. Tío materno con polidactilia postaxial. Nació a las 40 semanas por vía vaginal, peso 3500 (P50). Presentó problemas de aprendizaje, retardo psicomotor y del lenguaje. A los 3 años con obesidad generalizada, (Fig. 48a), braquicefalia, perfil facial plano, implantación baja de cabello en nuca, lobulos auriculares hipoplásicos, hipertricosis frontociliar y dorsal, sinofridia, tricomegalia de pestañas, distriquiasis, estabismo, epicanto superior, nariz bulbosa, comisuras labiales hacia abajo, cuello corto y ancho (Fig. 48b-d), Manos de apariencia ancha, microclinodactilia de 6to dedo de mano derecha, Polidactilia post axial tipo A, cicatrices de exéresis de polidactilia postaxiales en las 3 extremidades restantes tipo B (Fig. 48e-h). La evaluación oftalmológica encontró agudeza visual 20/120, astigmatismo e hipermetropía. Ultrasonido cardiaco, renal y pélvico: normales. En SEGD se encontró estenosis de duodeno. La TAC de Especialidad en Genética Médica 83 cráneo: colpocefalia y calcificación de plexos coroideos y hoz (Fig. 48i-j). Cariotipo: 46,XX (550 bandas). Figura 48. Fenotipo de paciente ST20 (ver texto). La evaluación con el set de sondas MLPA P036 subtelomérica demostró una deleción 12p13.33 correspondiente al gen SLCA6A (Fig. 49) con un ratio de 0.66. Especialidad en Genética Médica 84 Figura 49. Distribución de la RPH para la deleción subtelomérica 12p13.33 en la paciente ST20 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo deleción 12p13.33 La presentación clínica del síndrome de deleción 12p13.33 se encuentra relacionado a manifestaciones psiquiátricas como trastorno de ansiedad (Saus et al., 2010), Un caso de autismo puro ha sido descrito sin otros hallazgos (Silva et al., 2014) Además se ha descrito en 5 pacientes con discapacidad intelectual moderada, retardo adquisición de habilidades de lenguaje, microcefalia, hipotonía y laxitud articular (Fanizza et al., 2014). Se encontró apraxia del lenguaje en 5 de 9 pacientes, además se describió retardo psicomotor, autismo, trastorno de déficit de atención e hiperactividad y ansiedad; un paciente presentaba macrocefalia, facies grotesca, y otro paciente hipertelorismo con comisuras labiales hacia abajo. Existen otros reportes de pacientes con retardo en la adquisición de habilidades del lenguaje y psicomotor, ansiedad, agresividad y uno con defecto septo ventricular y otra con síndrome oculo auriculo vertebral (Baker et al., 2002; Mac Donald et al., 2010; Rooryck et al., 2009; Abdelmoity et al., 2011). Las características de delecion 12p13.33 más constantes son retardo en adquisición de habilidades del lenguaje o alteraciones en el mismo, así como discapacidad intelectual (Tabla 12). De las manifestaciones como polidactilia y obesidad que presenta la paciente no se han reportado en ningún caso previo. Tabla 12. Hallazgos reportados en pacientes con deleción 12p13.33 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=22 Paciente ST20 Discapacidad intelectual 14/18 + Retardo adquisición de lenguaje 17/18 + Microcefalia/ macrocefalia 6/6 + Retardo psicomotor 11/13 + Hipotonia 5/5 - Laxitud articular 5/5 - Apraxia del lenguaje 5/9 - Autismo 2/10 - Déficit de atención e hiperactividad 7/10 - Ansiedad 3/10 - Facies grotesca 1/9 + aModificada de Abdelmoity et al. (2011). 17.3.2.9 Síndrome de microdeleción subtelomérica 13q12.11 t) Paciente ST21. Masculino de 4 años de edad, producto de G1 no complicada de madre de 20 años de edad y padre de 20 años de edad, sanos y no consanguíneos. Tío materno con apéndice preauricular izquierdo. Nació a las 37 Especialidad en Genética Médica 85 semanas por vía abdominal, Apgar 8-9, peso 2660 g, talla 46 cm y PC 31.5 cm. Exploración física: frente amplia, pelo escaso, cejas arqueadas, endoblefaron, nariz de base ancha, punta nasal ancha (Fig. 50), línea palmar única izquierda y mancha mongólica sacra. Evaluación neurológica, retraso global del desarrollo, nistagmo horizontal, estereotipias en manos, no obedece órdenes, movimientos de manoteo, poco contacto visual y auditivo, risa espontánea, desinterés por el entorno y autoagresión. Valoración oftalmológica hipermetropía con astigmatismo. PEATC normal. El USG renal fue normal. La RMN de cráneo mostró cisterna magna amplia, colpocefalia, atrofia subcortical de predominio frontal y parieto- temporal, heterotopías de sustancia gris, dilatación IV ventrículo, cavum septum vergae, hipoplasia de cuerpo calloso, quiste aracnoideo basal y leve hipomielinización. Cariotipo: 46,XY (550 bandas). La evaluación con el set de sondas MLPA P036 demostró una deleción subtelomérica en 13q12.11 correspondiente al gen PSPC1 (Fig. 51) con un ratio de 0.53. Figura 50. Fenotipo de paciente ST21 (ver texto). Especialidad en Genética Médica 86 Figura 51. Distribución de la RPH para la deleción subtelomérica 13q12.11 en el paciente ST21 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo deleción 13q12.11 La deleción 13q12.11 es extremadamente rara, esta región involucra principalmente 12 genes conocidos. Se describe un paciente con escafocefalia, cejas arqueadas, asimetría facial, sinofridia, frente amplia, nariz prominente, filtrum largo, paladar alto, torticolis, fusión de vértebras cervicales, un desarrollo e intelecto cerca de lo normal (Tanteles et al., 2011). Una deleción denovo de 250 Kb que abarca únicamente dos genes el PSPC1 y ZMYM5 fue identificada en un paciente con retraso del desarrollo psicomotor, hipotonía, microftalmia unilateral con ptosis y malformación ocular congénita. La correlación genotipo fenotipo es poco clara (Bartnik et al., 2014). Los tres casos reportados se han producido de novo , uno de ellos fue producto de una translocación balanceada entre los cromosomas 13 y 14 (Lagou et al., 2014). Nuestro caso cumple con algunas de las características reportadas (Tabla 13), correlacionando con fenotipo leve, en lo referente principalmente a dismorfias faciales y anomalías oculares: frente amplia, cejas arqueadas, nariz prominente, filtrum largo e hipermetropía y astigmatismo. Tabla 13. Hallazgos reportados en pacientes con deleción 13q12.11 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=3a Paciente ST21 Discapacidad intelectual 1/3 NA Retraso de lenguaje 3/3 + Hipotonía 2/3 - Falla para medrar 1/3 - Talla baja - - Anormalidades cerebrales 1/3 + Anomalías cardiacas 1/3 - Anormalidades oftalmológicas 2/3 + Alteraciones de la deglución 1/3 - Escoliosis 1/3 - Anomalías renales 1/3 - Clinodactilia 2/3 - Anomalías de pies 1/3 - Microcefalia 1/3 + aModificada de Lagou et al. (2014). 17.3.2.10 Síndrome de microduplicación subtelomérica 15q26.3 u) Paciente ST22. Femenino producto de G1 de madre de 22 años de edad y padre de 28 años de edad, sanos y consanguinidad presente, primos de segundo grado. Al 3er mes se detecta placenta previa, resto sin complicaciones. Nació a las 30 semanas por vía cesárea, Apgar 8-9, peso 1640 g (P50-75), talla 41.5 cm (P50-75) y perímetro cefálico 24 cm (<P3). A la exploración física hipertricosis Especialidad en Genética Médica 87 frontociliar, puente nasal ancho y elevado, hipotonía, micrognatia leve (Fig. 52a), fístula anorrectal, ano anterior (Fig. 52b). El ultrasonido renal con riñón en herradura (Fig. 1c), radiografía de columna con displasia de sacro y hemivértebra en S3 (Fig. 1d). Radiografía torácica, ultrasonido transfontanelar y ecocardiograma sin hallazgos patológicos, cariotipo 46,XX (550 bandas). Figura 52. Fenotipo de paciente ST22 (ver texto). La evaluación con el set de sondas P036 subtelomérica demostró una duplicación 15q26.3 correspondiente al gen ALDH1A3 (Fig. 53) con un ratio de 1.35. Especialidad en Genética Médica 88 Figura 53. Distribución de la RPH para la duplicación subtelomérica 15q26.3 en el paciente ST22 usando el set de sondas P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo duplicación 15q26.3 Específicamente en la región 15q26.3, se encuentran dos genes: aldehído- deshidrogenasa 1 (ALDH1A3) y el receptor del factor similar a la insulina tipo 1 (IGF1R). ALDH1A3 se relaciona a anoftalmia/microftalmia (Fares-Taie et al., 2013; Dupé et al., 2003), e IGF1R con sobrecrecimiento, por exceso de dosis de éste. La presentación clínica del síndrome de duplicación distal 15q es muy variable e incluye sobrecrecimiento, apariencia facial distintiva además de dificultades del aprendizaje y como otras menos frecuentes: anomalías cardiacas, urogenitales y renales tales como las mencionadas en la Tabla 14 (Chen et al., 2011). La nariz promiente y el riñón en herradura concuerdan con el fenotipo reportado en pacientes con dicha entidad, que incluyen las regiones duplicadas en nuestro paciente (Tabla 14). Tabla 14. Hallazgos reportados en pacientes con duplicación 15q26.3 por diferentes métodos citogenéticos y moleculares. Hallazgos Reportes previos n=18a Paciente ST01 Sobrecrecimiento 11/18 - Dificultad del aprendizaje 16/18 - Cara larga 16/18 - Nariz prominente 16/18 + Prognatismo 16/18 - Agenesia renal 1/18 - Riñón en herradura 2/18 + Hidronefrosis 2/18 - Escoliosis 2/18 - Craniosinostosis 5/18 - Cardiopatía 2/18 - aModificada de Tatoon-Brown et al. (2008), solo pacientes con duplicación que incluyen región 15q26.3. 17.3.2.11 Síndrome de microdelecion 18p11.32 y microduplicación subtelomérica 20p13 v) Paciente ST23. Masculino de 14 años de edad, producto de G1 no complicada de madre de 35 años de edad y padre de 36 años de edad. Bisabuelo, abuela, tres tías y un tío paterno con talla alta y abuela paterna con astigmatismo. Padre con talla alta, aracnodactilia y trastorno de déficit de atención. Nació a las 31.7 semanas por vía vaginal, Apgar 8-9, peso 1740 g (P50), talla 30 cm (<P10). Evaluación neurológica: discapacidad intelectual leve, trastorno de déficit de Especialidad en Genética Médica 89 atención e hiperactividad y problemas de comportamiento. A a los 7 años: habitus dolicoestenomelico, pectus excavatum distal, cubitus recurvatum, hiperlordosis, hipertrofia gingival, diastema dental múltiple, borramiento de pliegues interfalangicos distales I-III, aracnodactilia y pulgares cuadrados (Fig. 54e-g). Evaluación oftalmologica: hipermetropia. Ecocardiograma normal. w) Paciente ST25 (hermano menor). Masculino de 3 años de edad, hijo de padre de 32 años el cual se refiere sano. Nació de término por parto vaginal eutócico, peso 3,070 kg (p50), talla 53 cm (p90), perímetro cefálico de 35 cm (p75) Apgar 8- 9. Exploración física al año: occipucio prominente, hélix derecho plegado, epicanto, nariz ancha, teletelia, fimosis, hipertricosis dorsal, mancha mongólica y pie plano (Fig. 54h). TAC de cráneo atrofia cortical frontal y sutura sagital estrecha. x) Paciente ST24 (Madre). 35 años de edad, con talla de174 cm (1.8 DE), peso 50 kg (p3), perímetro cefálico 53 cm (-1.6 DE). Con antecedente de luxación congénita de cadera, desarrollo psicomotor normal, depresión grave, bradipsiquia, trastorno de déficit de atención e hiperactividad. A la exploración física filtrum largo, aracnodactilia y habitus dolicoestenomelico (Fig. 541a-d). Interconsulta a oftalmología hipermetropía astigmática. Figura 54. Fenotipo de los paciente ST24 (propositus), ST24 (hermano menor) y ST25 (madre) (ver texto). Especialidad en Genética Médica 90 La evaluación con el set de sondas MLPA P036 subtelomérica demostró una deleción en 18p11.32 correspondiente al gen USP14 con un ratio de 0.52 y duplicación 20p13 correspondiente al gen SOX12 con un ratio de 1.45 (Fig. 55). Figura 55. Distribución de la RPH para la deleción 18p11.32 y la duplicación 20p13 en los pacientes ST23, ST24 y ST25 usando el set de sondas MLPA P036. RPH: Relative peak height (altura relativa del pico). Correlación genotipo-fenotipo deleción 18p11.32 y duplicación 20p13 La deleción 18p11.32 se ha descrito en pacientes con retraso en el desarrollo, estatura corta, hipertelorismo, puente nasal amplio, micrognatia, dientes mal alineados, genitales hipoplasicos, clinodactilia, discapacidad intelectual y distonía (Wester et al., 2006). La presentación clínica del síndrome duplicación distal 20q es muy variable e incluye como manifestaciones como discapacidad intelectual, hiperactividad, dismorfia facial y braquifalangia (Barolini et al., 2013; Blank et al., 2008). Existe cuatro casos previos que reportan la deleción 18p y la duplicación 20p. Wieczorek et al. (2002) describen un niño con cara delgada, plenitud periorbitaria, nariz corta, comisuras labiales hacia abajo, micrognatia, retardo mental profundo, tetralogía de Fallot y displasia renal. Las cuales no son manifestaciones encontradas en nuestros pacientes y en nuestra revisión no encontramos reportes previos referentes a dolicoestenomelia y talla alta en pacientes con deleción 18p y la duplicación 20p por lo que puede considerarse una contribución al fenotipoen espera de su confirmación en reportes futuros. Especialidad en Genética Médica 91 17.4. COMPARACIÓN DE NUESTROS HALLAZGOS CON LOS ESTUDIOS PREVIAMENTE PUBLICADOS La MLPA es la técnica de elección en países en desarrollo como el nuestro, para el abordaje del paciente con ACM y con o sin discapacidad intelectual. Otras técnicas innovadoras son inviables en nuestro medio por su alto costo. Nuestra frecuencia de detección de alteraciones por cariotipo fue de 6.5%. En un estudio de 261 pacientes con ACM y o DI, cariotipo convencional detecto en 17 anormalidades (6.5%) (Jehee et al., 2011). La MLPA en su conjunto con las mezclas de sondas MLPA P245 y salsa MLPAP036 encontraron VNC en 35 casos (18.8%), en la literatura se reportan desequilibrios cromosómicos en 87/261 (33.3%, según Jehee et al. (2011) y 21/150 (14%), en el trabajo de Pohovski et al. (2013). En el caso ST23 se estudió a los padres, encontrándose una VNC en las mismas regiones en la madre y en un medio hermano. En el caso ST01 se estudiaron a los padres, no encontrando VNC en los padres por MLPA, en el cariotipo en la madre encontró una translocación compleja balanceada. En 30 casos consideramos que hay asociación de la anomalía encontrada en la MLPA y el fenotipo del paciente. Por tanto la MLPA comparándola con el cariotipo detecta tres veces más desequilibrios cromosómicos. 17.4.1 Hallazgos con salsa MLPA P245 Microdeleciones Encontramos VNC en el 11.8% de los pacientes evaluados con la SALSA MLPA P245 para la identificación de síndromes de microdeleciones. En el estudios Pohovski et al. 2013) encontraron VNC en 10/150 casos estudiados (6.6%). Se realizó FISH sonda específica en los 11 pacientes, además de llevar acabo la correlación genotipo – fenotipo, haciendo una amplia revisión de la literatura de las regiones delecionadas, así como de los genes involucrados, encontrando correlación en todos los casos. La deleción 22q11.21 fue la anomalía más frecuente encontrada (6 casos). En la revisión 12/261 casos (4.6%) tuvieron deleción 22q11.2 (Jehee et al 2011). De estos, en todos se tuvo la sospecha diagnostica, considerando como datos clínicos principales: las anomalías cardiacas y anomalías del paladar. Se encontraron dos pacientes con síndrome de microdelecion 7q11.23, resaltando que en el caso MD07 donde la técnica FISH no detectó la microdeleción, por tanto, aunque solo fue en un caso, demuestra una mayor sensibilidad de la MLPA que la FISH para detectar VNC. 17.4.1 Hallazgos con salsa MLPA P036/ P070 Subtelomerica En nuestra cohorte de 135 pacientes evaluados mediante la salsa MLPA P036, encontramos 25 casos (18.5%) con VNC subteloméricas. En una revision de 150 pacientes con ACM y/o DI, en 11 casos (7.3%) se encontraron desequilibrios Especialidad en Genética Médica 92 subtelomericos (Pohovski, et al 2013), revisión de 261 con ACM y/o DI en 19 pacientes (7.2%) se encontraron alteraciones subteloméricas (Jehee et al., 2011). Seis pacientes con alteración en el cariotipo: tres aneuploidías, resaltando en un caso con cariotipo 47,XX+21add(15)(p11.2), que la MLPA no puedo determinar este material adicional del cromosoma 15. En el caso ST01 se realizó estudio citogenético y molecular a los padres en quienes la MLPA no fue capaz de detectar alteración alguna, mientras el estudio de cariotipo encontró una translocación compleja en la madre, en caso ST01 se encontró un desequilibrio subtelomérico doble (perdida y ganancia), el cual puede ser explicado por el cariotipo de madre. En 19 pacientes (14%) con cariotipo normal se encontró desequilibrio subtelomérico, lo cuál es más de dos veces lo reportado (Jehee et al, 2011). La alteración más común fue la microduplicación subtelomérica de 7p22.3, encontrada en cinco pacientes, la cual representa el 14.2% de las alteraciones encontradas, tres pacientes con un espectro fenotipo ligeramente más severo que el reportado para esta duplicación, pero encontrando correlación con los hallazgos fenotípicos principales; dos pacientes con malformaciones severas en las que consideramos no hay asociación causal. La comprobación con salsa MLPA P070 se hizo en tres de estos pacientes. La deleción 1p36.33 fue el segundo hallazgo más común, tres pacientes representando el 8.5%. Con la misma incidencia encontramos la microdeleción subtelomerica 18p11.32 y microduplicación 20p13; correspondiendo estos pacientes a una familia, en la que la madre y sus dos hijos tienen este desequilibrio, por lo que la podemos considerar una alteración no causal, resaltando que la madre se encuentra fenotípicamente afectada pero en una forma menor, por lo que no podemos descartar del todo este hallazgo como parte del fenotipo, que puede ser explicado por una penetrancia incompleta o impronta. Especialidad en Genética Médica 93 18. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 1. La frecuencia de detección de alteraciones por cariotipo en los pacientes evaluados con ACM y/o DI fue de 6.5% en la muestra estudiada. 2. La frecuencia de detección de VNC en pacientes con ACM y/o DI para la el conjunto de sondas MLPA P245 fue de 11.4% en la muestra estudiada. 3. La frecuencia de detección de VNC en pacientes con ACM y/o DI para la el conjunto de sondas MLPA P245 fue de 18.5% en la muestra estudia. 4. Los casos con síndromes de microdeleciones evaluados mediantes la SALSA MLPA P245 tuvieron correlación con la clínica y con su correspondiente comprobación con FISH, con excepción de un paciente donde solo se comprobó por MLPA. 5. En los casos con alteraciones cromosómicas estructurales la SALSA MLPA P036 correlacionó con los hallazgos del cariotipo, siendo un completo útil en la evaluación de éstos pacientes. 6. En todo paciente que encontremos VNC, debe hacerse siempre la comprobación por otra técnica o sonda MLPA específica, aunque una buena revisión de los hallazgos clínicos su correlación con los resultados de la MLPA pueden ser suficientes para confirmar el diagnóstico. 7. La MLPA es una técnica de bajo costo y eficaz para el abordaje de pacientes con ACC y o discapacidad intelectual. 8. Aunque nuestra muestra es pequeña, corroboramos que la detección de VNC por MLPA es al menos igual de específica en comparación con la FISH. Especialidad en Genética Médica 94 19. AGRADECIMIENTOS A mi familia: a mi padre, madre y hermano por su apoyo incondicional y por siempre estar ahí en todo momento. Dr. Jorge Román Corona Rivera, Director de Tesis, por ser parte de mi formación profesional, por sus enseñanzas impartidas, por esos valores transmitidos, por forjarme en la investigación científica y por siempre procurar mi superación profesional durante este recorrido. Dra. Lucina Bobadilla Morales y Dr. Alfredo Corona Rivera por haber dado la oportunidad rotar en la Unidad de Citogénica, realizar nuestro proyecto y analizar la información. Dra. Lisette Arnaud López, por sus enseñanzas, por su paciencia, por la confianza brindada y sobre todo por escucharnos y comprendernos en momentos difíciles. Dra. Carmen Abreu Fernández por sus enseñanzas y alegrías brindadas Dr. Alejandro Vázquez Reyes por su apoyo en la realización de los ensayos A todo el personal de la unidad de citogenética, por la confianza brindada, por su apoyo, por las enseñanzas, comprensión, disponibilidad y por esos momentos gratos. A mis compañeras, amigas y grandes personas Ana Karen Sandoval Talamantes, Elizabeth Solís Hernández y Susana Solís por su amistad y apoyo en todo momento A mis demás compañeros de la Especialidad y Doctorado de Genética: Eugenio Zapata Aldana, Christian Peña Padilla, Estrella Lizbeth Mellín Sánchez, Francisco Javier Martínez, Mireya Orozco y Roció Silva. A todo el personal del Hospital Civil “Dr. Juan I Menchaca”,en especial a la División de Pediatría. A nuestros pacientes sin los que nada de esto hubiera sido posible A todos los que han sido parte de este proyecto gracias por su apoyo y por todos esos momentos que pasos juntos. Especialidad en Genética Médica 95 20. BIBLIOGRAFÍA Ahn JW, Ogilvie CM, Welch A, Thomas H, Madula R, Hills A, Donaghue C, Mann K. Detection of subtelomere imbalance using MLPA: validation, development of an analysis protocol, and application in a diagnostic centre. BMC Med Genet 2007; 8: 9. Abdelmoity AT, Hall JJ, Bittel DC, et al. 1.39 Mb inherited interstitial deletion in 12p13.33 associated with developmental delay. Eur J Med Genet. 2011;54:198–203. An Y, Amr SS, Torres A, Weissman L, Raffalli P, Cox G, Sheng X, Lip V, Bi W, Patel A, Stankiewicz P, Wu BL, Shen Y. SOX12 and NRSN2 are candidate genes for 20p13 subtelomeric deletions associated with developmental delay. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2013 Andrew B. Cyr AB, Nimmakayalu M, Longmuir SQ, Patil SR, Keppler-Noreuil KM, Annerén G, Wahlström J, Tommerup N. Marker chromosomes in parents to children with Down’s syndrome. Clinical Genetics 1984; 25: 140-147. Baker E, Hinton L, Callen DF, Haan EA, Dobbie A, Sutherland GR. A familial cryptic subtelomeric deletion 12p with variable phenotypic effect. Clin Genet. 2002;61:198–201 Ballif BC, Theisen A, Coppinger J, Gowans GC, Hersh JH, Madan-Khetarpal S, Schmidt KR, Tervo R, Escobar LF, Friedrich CA, McDonald M, Campbell L, Ming JE, Zackai EH, Bejjani BA, Shaffer LG. Expanding the clinical phenotype of the 3q29 microdeletion syndrome and characterization of the reciprocal microduplication. Mol Cytogenet. 2008 Apr 28;1:8. Bartnik M, Nowakowska B, Derwińska K, Wiśniowiecka-Kowalnik B, Kędzior M, Bernaciak J, et al. Application of array comparative genomic hybridization in 256 patients with developmental delay or intellectual disability. J Appl Genet. 2014; 55(1): 125–144. Battaglia A. 1p36 Deletion Syndrome. GeneReviews 2013. Bergemann AD, Cole, F, Hirschhorn, K. The etiology of Wolf–Hirschhorn syndrome. Trends in genetics 2005; 21: 188-195. Bird LM. Angelman syndrome: review of clinical and molecular aspects. Appl Clin Genet, 2014; 7: 93-104. Blanc, P, Gouas, L, Francannet, C, Giollant, M, Vago P, Goumy, C. Trisomy 20q caused by interstitial duplication 20q13.2: Clinical report and literature review. American Journal of Medical Genetics Part A. 2008;146(10): 1307 – 1311. Blank P, Gouas L, Francannet C, Giollant M, Vago P, Goumy C. risomy 20q caused by interstitial duplication 20q13.2: clinical report and literature review. Am J Med Genet A. 2008 May 15;146A(10):1307-11. Boormans EMA, Birnie E, Hoffer MJV, Macville MVE, Galjaard RJ, Schuring-Blom GH, Bhola SL, Huijsdens K, Smits A, van Lith JMM. Economic evaluation of multiplex ligation-dependent probe amplification and karyotyping in prenatal diagnosis: a cost-minimization analysis. Arch Gynecol Obstet 2011; 285: 67-75. Buck A(1), du Souich C, Boerkoel CF. Minimal genotype--phenotype correlation for small deletions within distal 1p36. Am J Med Genet A. 2011 Dec;155A(12):3164-9. Burnside RD. 22q11.21 deletion syndromes: a review of proximal, central, and distal deletions and their associated features. Cytogenet Genome Res 2015; 146:89-99. Especialidad en Genética Médica 96 Cáceres A, Armengol L, Villatoro S, González JR. MLPAstats: An R GUI package for the integrated analysis of copy number alterations using MLPA data. BMC Bioinformatics 2011; 12: 1-7. Cardoso C, Leventer RJ, Ward HL, Toyo-Oka K, Chung J, Gross A, Martin CL, Allanson J, Pilz DT, Olney AH, Mutchinick OM. Refinement of a 400-kb critical region allows genotypic differentiation between isolated lissencephaly, Miller-Dieker Syndrome, and other phenotypes secondary to deletions of 17p13.3. Am. J. Hum. Genet 2003; 72:918-930. Chang YT, Chou IC, Wang CH, Chin ZN, Kuo HT, Lin CC, Tsai CH, Tsai FJ. Chromosome 10q deletion del (10)(q26.1q26.3) is associated with cataract. Pediatr Neonatol 2013; 54:132-136. Chen CP, Lin YH, Au HK, Su YN, Hsu CY, Liu YP, Wu Pc, Chern SR, Chen YT, Chen LF, Hsieh AHM, Wang W. Chromosome 15q overgrowth syndrome: prenatal diagnosis, molecular cytogenetic characterization, and perinatal findings in a fetus with dup(15)(q26.2q26.3). Taiwan J Obstet Gynecol 2011; 50: 359-365. Chien WH, Gau SS, Wu YY, Huang YS, Fang JS, Chen YJ, Soong WT, Chiu YN, ChenCH. Identification and molecular characterization of two novel chromosomal deletions associated with autism. Clin Genet. 2010 Nov;78(5):449-56. Christofolini DM, de Paula Ramos MA, Kulikowski LD, da Silva Bellucco FT, Belangero SI, Brunoni D, Melaragno MI. Subtelomeric rearrangements and copy number variations in people with intellectual disabilities. J Intellect Disabil Res. 2010 Oct;54(10):938-42. Chui JV, Weisfeld-Adams JD, Tepperberg J, Mehta L. Clinical and molecular characterization of chromosome 7p22.1 microduplication detected by array CGH. Am J Med Genet A. 2011 Oct;155A(10) Committe on Genetics. Health Care Supervision for Children With Williams Syndrome.Pediatrics. 2001;107:1192-2007 Corona-Rivera JR, Ramírez-Dueñas ML. Dismorfologia. En Renteria-Cardenas A, editor. Martínez y Martínez salud y enfermedad del niño y del adolescente 7a. ed. México: El manual moderno, 2013. Cox DM, Butler MG. The 15q11.2 BP1-BP2 microdeletion syndrome: a review. Int J Mol Sci, 2015; 16: 4068-4082. Czeizel A, Métneki J. Empirical recurrence risk after unidentified multiple congenital abnormalities. J Med Genet 1983; 20:367-371. Czeizel AE, Puho EH, Acs N, Banhidy F. Delineation of a multiple congenital abnormality syndrome in the offspring of pregnant women affected with high fever-related disorder: a population-based study. Congenit Anom (Kyoto) 2008; 48:158-166. Delorme R, Moreno-De-Luca D, Gennetier A, Maier W, Chaste P, Mössner R, Grabe HJ, Ruhrmann S, Falkai P, Mouren MC, Leboyer M, Wagner M, Betancur C. Search for copy number variants in chromosomes 15q11-q13 and 22q11.2 in obsessive compulsive disorder. BMC Med Genet. 2010; 11:100. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. 5ta ed. Arlington, VA, American Psychiatric Association, 2013. Dupé V, Matt N, Garnier JM, Chambon P, Mark M, Ghyselinck NB. A newborn lethal defect due to inactivation of retinaldehyde dehydrogenase type 3 is prevented by maternal retinoic acid treatment. PNAS, 2003; 100: 14036-14041. Especialidad en Genética Médica 97 Dutta UR, Pidugu VK, Goud V, Dalal AB, Mosaic Down syndrome with a marker: molecular cytogenetic characterization of the marker chromosome. Gene 2012; 495: 199-204. Dworschak GC, Draaken M, Marcelis C, de Blaauw I, Pfundt R, van Rooij IA, Bartels E, Hilger A, Jenetzky E, Schmiedeke E, Grasshoff-Derr S, Schmidt D,Märzheuser S, Hosie S, Weih S, Holland-Cunz S, Palta M, Leonhardt J, Schäfer M, Kujath C, Rissmann A, Nöthen MM, Zwink N, Ludwig M, Reutter H. De novo 13q deletions in two patients with mild anorectal malformations as part of VATER/VACTERL and VATER/VACTERL-like association and analysis of EFNB2 in patients with anorectal malformations. Am J Med Genet A. 2013 Dec;161A(12):3035-41. Erjavec SA, Stangler HS, Zagorac A, Zagradisnik B, Kokalj VN. Subtelomeric chromosome rearrangements in children with idiopathic mental retardation: applicability of three molecular-cytogenetic methods. Croat Med J 2006; 47: 841- 50. Esplin ED, Li B, Slavotinek A, Novelli A, Battaglia A, Clark R, Curry C, Hudgins L. Nine patients with Xp22.31 microduplication, cognitive deficits, seizures and talipes anomalies. Am J of Genet Part A; 2014: 1-7A. Fanizza I, Beruzzo S, Beri S, Scalera E, Massagli A, Sali M, Giorda R, Bonaglia M. Genotype-phenotype relationship in a child with 2.3 Mb de novo interstitial 12p13.33-p13.32 deletion. Eur J Med Genet. 2014 Jul;57(7):334-8.Fares-Taie L, Gerber S, Chassaing N, Clayton-Smith J, Hanein S, Silva E, Serey M, Serre V, Gérard X, Buamann C, Plessis G, Demeer B, Brétillon L, Bole C, Nitschke P, Munnich A, Lyonnet S, Calvas P, Kaplan J, Ragge N, Rozet JM. ALDH1A3 mutations cause recessive anophtalmia and microphtalmia. Amer J of Hum Genet 2013; 92: 265-270. Fatema K, Begum F, Akter N, Zaman SMM. Major congenital among newborns in BSMMU hospital. Bangladesh Medical Journal 2011; 40: 7-12. Fernández-Jaén A, Castellanos Mdel C, Fernández-Perrone AL, Fernández-Mayoralas DM, de la Vega AG, Calleja-Pérez B, Fernández EC, Albert J, Hombre MC. Cerebral palsy, epilepsy, and severe intellectual disability in a patient with 3q29 microduplication syndrome. Am J Med Genet A. 2014 Aug;164A(8):2043-7. Flores-Ramírez F, Palacios-Guerrero C, García-Delgado C, Morales-Jiménez AB, Arias- Villegas CM, Cervantes A, Morán-Barroso VF. Cytogenetic profile in 1,921 cases of trisomy 21 syndrome. Arch of Med Research 2015; 46: 484-489. Fry AE, Cushion TD, Pilz DT. The genetics of lissencephaly. Am J Med Genet Part C Semin Med Genet 2014; 166C:198-210. Gajecka M. Mackay KL y Shaffer LG. Monosomy 1p36 deletion síndrome. Am J Med Genet A. 2007 Nov: 346-356. Garne E, Dolk H, Loane M, Wellesley D, Barisic I, Calzolari E, Densem J. Paper 5: surveillance of multiple congenital anomalies: implementation of computer algorith in European registers for classification of cases. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 2011; 91: 44-50. Gilbert BE, Spicer DE, Steffensen TS. Congenital Abnormalities. In: Gilbert BE, Spicer DE, Steffensen TS. Handbook of pediatric autopsy pathology. 2nd. ed . New York: Springer, 2014. pp.197-227. Especialidad en Genética Médica 98 Goitia V, Oquendo M y Stratton R. Case of 7p22.1 Microduplication Detected by Whole Genome Microarray (REVEAL) in Workup of Child Diagnosed with Autism. Case Rep Genet. 2015. Gonzalez JR, Carrasco JL, Armengol L, Villatoro S, Jover L, Yasui Y, Estivill X. Probe- specific mixed- model approach to detect copy number differences using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). BMC Bioinformatics 2008; 9: 1- 15. Hills A, Ahn JW, Donaghue C, Thomas H, Mann K, Ogilvie CM. MLPA for confirmation of array CGH results and determination of inheritance. Mol Cytogenet 2010; 3: 1-7. Jehee FS, Takamori JT, Medeiros PFV, Pordeus ACB, Latini FRM, Bertola DB, Kim CA, Passos-Bueno MR. Using a combination of MLPA kits to detect chromosomal imbalances in patients with multiple congenital anomalies and mental retardation is a valuable choice for developing countries. Eur J Med Genet 2011; 54: 425- 432. Jezela-Stanek A, Kucharczyk M, Pelc M, Gutkowska A, Krajewska-Walasek M. 1.15 Mb microdeletion in chromosome band 20p13 associated with moderate developmental delay-additional case and data's review. Am J Med Genet A. 2013 Jan;161A(1):172-8. Jonch AE, Larsen LG, Pouplier S, Nielsen K, Brondum-Nielsen K, Tumer Z. Partial duplication of 13q31.3-q34 and deletion of 13q34 associated with diaphragmatic hernia as a sole malformation in a fetus. Am J Med Genet 2012:Part A 158A:2302-2308. Kaufman L, Ayub M, Vincent JB. The genetic basis of non-syndromic intellectual disability: a review. J Neurodev Disord 2010; 2(4):182-209. Kim EU, Kim YK, Kim MK, Jung JM, Jeon GW, Kim HR, Sin JB. A case of de novo duplication of 15q24-26.3. Korean J Pediatr 2011; 54: 267-271. Lagou M, Papoulidis L, Orru S, Papadopoulos V, Daskalakis G, Kontodiou M, et al. A de novo 2.9 Mb interstitial deletion at 13q12.11 in a child with developmental delay accompanied by mild dysmorphic characteristics. Mol Cytogenet. 2014; 7: 92. Linnankivi, T., Tienari, P., Somer, M., Kahkonen, M., Lonnqvist, T., Valanne, L., Pihko, H. 18q deletions: clinical, molecular, and brain MRI findings of 14 individuals. Am. J. Med. Genet. 140A: 331-339, 2006. Lisi EC, Hamosh A, Doheny KF, Squibb E, Jackson B, Galczynski R, Thomas GH, Batista DA. 3q29 interstitial microduplication: a new syndrome in a three- generation family. Am J Med Genet A. 2008 Mar 1;146A(5):601-9. MacDonald AH, Rodríguez L, Aceña I, et al. Subtelomeric deletion of 12p: description of a third case and review. Am J Med Genet A. 2010;152:1561–1566. Margari L, Di Cosola ML, Buttiglione M, Pansini A, Buonadonna AL, Craig F, Cariola F, Petruzzelli MG, Gentile M. Molecular cytogenetic characterization and genotype/phenotype analysis in a patient with a de novo 8p23.2p23.3 deletion/12p13.31p13.33 duplication. Am J Med Genet A. 2012 Jul;158A(7):1713- 8. Mejia-Baltodano, G., Bobadilla, L., Gonzalez, R.-M., Barros-Nunez, P. High recurrence of recombinants in a family with pericentric inversion of chromosome 18. Ann. Genet. 40: 164-168, 1997. Especialidad en Genética Médica 99 Merks JHM, Karnebeek CDM, Caron HN, Hennekam RCM. Phenotypic abnormalities: terminology and classification. Am J Med Genet A 2003; 123A:211-230. Molho-Pessach V, Schaffer JV. Blaschko lines and other patterns of cutaneous mosaicism. Clin in Derm, 2011; 29: 205-225. Molofetta GA, Muñoz MV, Santos AC, Silva WA, Wagstaff J, Pina-Neto JM. Discordant phenotypes in firs cousins with UBE3A frameshift mutation. Am J Med Genet A, 2004; 127A: 258-262. Moscovich M, LeDoux MS, Xiao J, Rampon GL, Vemula SR, Rodriguez RL, Foote KD, Okun MS. Dystonia, facial dysmorphism, intellectual disability and breast cancer associated with a chromosome 13q34 duplication and overexpression of TFDP1: case BMC Med Genet. 2013 Jul 13;14:70. Mundhofir FEP, Nilesen WM, Van Bon BWM, Smeets D, Pfundt R, Ven-Schobers G, Ruiterkamp-Versteeg, Winarmi TI, Hamel BCJ, Yntema HG, Faradz SMH. Subtelomeric chromosomal rearrangements in a large cohort of unexplained intellectually disabled individuals in Indonesia: A clinical and molecular study. Indian J Hum Genet 2013; 19: 171–178. Nakane T, Kousuke N, Sonoko H, Yuko K, Sato H, Kubota T, Sugita K. 6p subtelomere deletion with congenital glaucoma, severe mental retardation, and growth impairment. Pediatr Int. 2013 Jun;55(3):376-81. O’Connnor R, Al-Murrani A, Aftimos S, Asquith P, Mazzaschi R, Eyrolle-Guignot D, George AM, Love DR. Pure duplication of the distal long arm of chromosome 15 with Eibsten anomaly and clavicular anomaly. Case Reports in Genetics 2011; 1- 5. Palumbo O, Palumbo P, Ferri E, Riviello FN, Cloroformio L, Carella M, Di Giacomo MC. Report of a patient and further clinical and molecular characterization of interstitial 4p16.3 microduplication. Mol Cytogenet. 2015; 8: 15. Patel D, Merrick J. Neurodevelopmental disabilities: introduction and epidemiology. In: Patel DR, Greydanus DE, Omar HA, Merrick J, editors. Neurodevelopmental disabilities. Clinical care for children and young adults. Dordrecht: Springer, 2011. pp. 161-171. Piccione M, Antona R, Salzano E, Cavani S, Malacarne M, Morreale Bubella R, Pierluigi M, Viaggi CD, Corsello G. Array-CGH and clinical characterization in a patient with subtelomeric 6p deletion without ocular dysgenesis. Am J Med Genet A. 2012 Jan;158A(1):150-4. Pober B. Williams-Beuren Syndrome. N Engl J Med. 2010;362:239-52 Pohovski LM, Dumic KK, Odak L, Barisic I. Multiplex ligation-dependent probe amplification workflow for the detection of submicroscopic chromosomal abnormalities in patients with developmental delay/intellectual disability. Mol Cytogenet 2013; 6: 1-6. Prontera, P., Buldrini, B., Aiello, V., Rogaia, D., Mencarelli, A., Gruppioni, R., Bonfatti, A., Beltrami, N., Donti, E., Sensi, A. Familial pericentric inversion of chromosome 18: intrafamilial variability of the recombinant dup(18q). Genet. Counsel. 21: 91- 97, 2010. Rauch A, Hoyer J, Guth S, Zweier C, Kraus C, Becker C, Zenker M, Hüffmeier U,Thiel C, Rüschendorf F, Nürnberg P, Reis A, Trautmann U. Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation. AmJ Med Genet A 2006;140A: 2063-2074. Especialidad en Genética Médica 100 Raymond FL, Tarpey P. The genetics of mental retardation. Hum. Mol. Genet. 2006; 15: 110-116. Repetto GM. Congenital malformation syndromes. In: Elzouki AY, Harfi HA, Nazer HM, Stapleton F.B, Oh W, Whitley RJ, editors. Textbook of clinical pediatrics. 2nda ed. Dordrecht: Springer, 2012. pp. 25-38. Rogers JF. Clinical delineation of proximal and distal partial 13q trisomy. Clin Genet 1984: 25:221-229. Rooryck C, Stef M, Burgelin I, et al. 2.3 Mb terminal deletion in 12p13.33 associated with oculoauriculovertebral spectrum and evaluation of WNT5B as a candidate gene. Eur J Med Genet. 2009;52:446–449. Saus E, Brunet A, Armengol L, Pino A, Crespo J, Férnandez-Aranda F, et al. Comprehensive copy number variant (CNV) analysis of neuronal pathways genes in psychiatric disorders identifies rare variants within patients. J Psychiatr Res. 2010 Oct;44(14):971-8. Schubert C. The genomic basis of the Williams-Beuren syndrome. Cell Mol LIfe Sci. 2009;66:1178-1197 Serra-Juhé C, Rodrıíguez-Santiago B, Cusco I, Vendrell T, Camats N, Perez-Jurado LA. Contribution of rare copy number variants to isolated human malformations. Plos One 2012; 7: 1-9. Shchelochkov OA. A Novel 4p16.3 Microduplication distal to WHSC1 and WHSC2 characterized by oligonucleotide array with new phenotypic features. Am J Med Genet Part A 155:2224–2228. Silva I, Rosenfeld J, Antoniuk S, Raskin Sm, Sotom V. A 1.5 Mb terminal deletion of 12p associated with autism spectrum disorder. Gene. 2014 May 25;542(1):83-6. Slavotinek AM. Eye Development genes and known syndromes. Mol Genet Metab 2011; 104: 448-456. Strathdee G, Sutherland R, Jonsson JJ, Sataloff R, Kohonen-Corish M, Grady D, Overhauser J. Molecular characterization of patients with 18q23 deletions. Am J Hum Genet. 1997 Apr;60(4):860-8. Strome P, Bjomstad P, Ramstad K. Prevalence estimation of Williams Syndrome. J Child Neurol. 2002; 17:269-271 Stuppia L, Antonucci I, Palka G, Gatta V. Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases. Int J Mol Sci 2012; 13: 3245-3276. Sukarova-Angelovska E, Kocova M, Sabolich V, Palcevska S, Angelkova N. Phenotypic Variations in Wolf-Hirschhorn Syndrome. BJMG 2014; 17: 23-30. Sun BK, Tsao H. X-chromosome inactivation and skin disease. J of Inv Derm, 2008; 128: 2753-2759. Tanteles GA, Dixit A, Smith N, Martin K, Suri M. Mild phenotype in a patient with a de- novo 2.9-Mb interstitial deletion at 13q12.11. Clin Dysmorphol. 2011 Apr;20(2):61- 5. Tanteles GA, Suri M. Classification and aetiology of birth defects. Paediatric Child Health 2007; 17: 233-243. Tatton-Brown K, Pilz DT, Örstavik KH, Patton M, BarberJCK, Collinson MN, Maloney VK, Huang S, Crolla JA, Marks K, Ormerod E, Thompson P, Nawaz Z, Lese- Martin C, Tomkins S, Waits P, Rahman N, McEntagart M. 15q overgrowth Especialidad en Genética Médica 101 syndrome: a newly recognized phenotype associated with overgrowth, learning difficulties, characteristic facial appearance, renal anomalies and increased dosage of distal chromosome 15q. Am J of Med Genet Part A 2008; 147-154. Thevenon J, Callier P, Andriex J, Delobel B, David A, Sukno S, Minot D, Mosca AL. et al. 12p13.33 microdeletion including ELKS/ERC1, a new locus associated with childhood apraxia of speech. Eur J Hum Genet. 2013 Jan; 21(1): 82–88. Tonoki H, Harada N, Shimokawa O, Yosozumi A, Monzaki K, Satoh K, Kosaki R, Sato A, Matsumoto N, Iizuka S. Axenfeld-Rieger anomaly and Axenfeld-Rieger syndrome: clinical, molecular-cytogenetic, and DNA array analyses of three patients with chromosomal defects at 6p25. Am J Med Genet A. 2011 Dec;155A(12):2925-32. Vera-Carbonell A, López-González V, Bafalliu JA, Ballesta-Martínez MJ, Fernández A, Guillén-Navarro E, López-Expósito I. Clinical comparison of 10q26 overlapping deletions: Delineating the critical region for urogenital anomalies. Am J Med Genet Part A 2015; 167A:786-790. Vermeulen, S. J., Speleman, F., Vanransbeeck, L., Verspeet, J., Menten, B., Verschraegen-Spae, M.-R., De Wilde, P., Messiaen, L., Michaelis, R. C., Leroy, J. G. Familial pericentric inversion of chromosome 18: behavioral abnormalities in patients heterozygous for either the dup(18p)/del(18q) or dup(18q)/del(18p) recombinant chromosome. Europ. J. Hum. Genet. 13: 52-58, 2005. Vreeburg M, Sallevelt SCEH, Stegmann APA, van Geeel M, Detisch YJHA, Scharnder- Stumpel CTRM, van Steensel MAM. Cutaneous clues for diagnosing X- chromosomal disorders. Clin Genet 2014; 85: 328-335. Vulto-van Silfhout AT, de Brouwer AF, de Leeuw N, Obihara CC, Brunner HG, de Vries BB. A 380-kb Duplication in 7p22.3 Encompassing the LFNG Gene in a Boy with Asperger Syndrome. Mol Syndromol. 2012 Apr;2(6):245-250. Walczak-Sztulpa J, Wisniewska M, Latos-Bielenska A, Linné M, Kelbova C, Belitz B, Pfeiffer L, Kalscheuer V, Erdogan F, Kuss AW, Ropers HH, Ullmann R, Tzschach A. Chromosome deletions in 13q33-34: report of four patients and review of the literature. Am J Med Genet A. 2008 Feb 1;146A(3):337-42. Weehi LT, Maikoo R, Cormack AM, Mazzaschi R, Ashton F, Zhang L, George AM, Love DR. Microduplication of 3p26.3 Implicated in Cognitive Development. Case Rep Genet. 2014 ; 2014: 295359. Wester, U., Bondeson, M.-L., Edeby, C., Anneren, G. Clinical and molecular characterization of individuals with 18p deletion: a genotype-phenotype correlation. Am. J. Med. Genet. 140A: 1164-1171, 2006. Wieczorek D, Krause M, Majewski F, Albrecht B, Horn D, Riess O, Gillessen-Kaesbach G. Effect of the size of the deletion and clinical manifestation in Wolf-Hirschhorn syndrome: analysis of 13 patients with a de novo deletion. EJHG 2000: 8: 519- 526. Wieczorek D, Bartsch O, Gillessen-KaesbachG. Distal monosomy 18p/distal trisomy 20p--a recognizable facial phenotype? Am J Med Genet A. 2003;20A(3):429-33. Witters I, Chabchoub E, Vermeesch JR, Fryns JP. Submicroscopic distal deletion of the long arm of chromosome 13(13q34) with corpus callosum agenesis. Am J Med Genet A. 2009 Aug;149A(8):1834-6. Wu Y, Ji T, Wang J, Xiao J, Wang H, Li J, Gao Z, Yang Y, Cai B, Wang L, Zhou Z, Tian L, Wang X, Zhong N, Qin J, Wu X, Jiang Y. Submicroscopic subtelomeric Especialidad en Genética Médica 102 aberrations in Chinese patients with unexplained developmental delay/mental retardation. BMC Med Genet 2010; 11:1-12. Wyandt H E, Milunsky J, Lerner T, Gusella JF, Hou A, MacDonald M, Adekunle S, Milunsky A.Characterization of a duplication in the terminal band of 4p by molecular cytogenetics. Am J Med Genet 1993; 72-76. Yan JB, Xu M, Xiong C, Zhou DW, Ren ZR, Huang Y, Mommersteeg M, van Beuningen R, Wang YT, Liao SX, Zeng F, Wu Y, Zeng YT. Rapid screening for chromosomal aneuploidies using array-MLPA. BMC Med Genet 2011; 12: 1-11. Yatsenko SA, Kruer MC, Bader PI, Corzo D, Schuette J, Keegan CE, Nowakowska B, Peacock S, Cai WW, Peiffer DA, Gunderson KL, Ou Z, Chinault AC, Cheung SW. Identification of critical regions for clinical features of distal 10q deletion syndrome. Clin Genet 2009: 76: 54-62. Yumamoto T, Shimojima K, Shimada S, Yokochi K, Yoshitomi S, Yanagihara K, Imai K, Okamoto N. Clinical impacts of genomic copy number gains at Xq28. Hum Gen Var, 2014; 1-6. Especialidad en Genética Médica 103 ANEXO 1 FORMATO DE CAPTURA Detección de pérdidas o ganancias genómicas en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual evaluadas mediante el uso combinado de kits de amplificación de sondas dependientes de ligandos múltiples (MLPA) Nombre del paciente: __________________________________ Edad (años): _________ Sexo: ___________ Registro Hospital: ____________ Registro UCT: ________________ Sospecha diagnósticaclínica: ________________________________________________ Anomalías mayores (enumerar): Anomalías menores (enumerar): Discapacidad intelectual: ( ) Si ( ) No Métodos de evaluación de la discapacidad intelectual y resultados: Resultado de cariotipo: _______________________________________________ Anormalidad en el cariotipo: ( ) Numérica ( ) Estructural ( ) Ambas Resultado MLPA subtelomérico: ( ) Normal ( ) Anormal Anormalidades en el MLPA subtelomérico: Tipo de anormalidad subtelomérica: ( ) Hereditaria ( ) No relacionada ( ) Inconclusa ( ) Causal Correlaciona con el fenotipo: ( ) Si ( ) No Correlaciona con el cariotipo: ( ) Si ( ) No Fue posible el estudio de MLPA en los padres: ( ) Si ( ) No Resultado: Resultado MLPA para microdeleciones: ( ) Normal ( ) Anormal Anormalidades en el MLPA para microdeleciones: Tipo de anormalidad en el MLPA para microdeleciones: ( ) Hereditaria ( ) No relacionada ( ) Inconclusa ( ) Causal Correlaciona con el fenotipo: ( ) Si ( ) No Correlaciona con el cariotipo: ( ) Si ( ) No Fue posible el estudio de MLPA en los padres: ( ) Si ( ) No Resultado: Especialidad en Genética Médica 104 ANEXO 2 CARTA DE CONSENTIMIENTO BAJO INFORMACIÓN PARA OBTENER LA MUESTRA SANGUÍNEA PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN Y REALIZACIÓN DEL ENSAYO DE MLPA Guadalajara, Jalisco a: -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ Nombre del paciente: ------------------------------------------------------------------------------------ Edad: -------------------Sexo: -----------------------------------------Registro: ----------------------- Nombre del representante legal: --------------------------------------------------------------------- Relación a parentesco: --------------------------------------------------------------------------------- Domicilio: -------------------------------------------------------------------Teléfono: ------------------- Las anomalías congénitas y/o discapacidad son un problema frecuente en las que no se identifica el defecto genético con las evaluaciones disponibles en nuestro medio. La técnica MLPA (amplificación de sondas dependientes de ligandos múltiples), es un novedoso ensayo que permite detectar pérdidas o ganancias de material genético en un porcentaje significado de pacientes anomalías congénitas y/o discapacidad intelectual. Por esta razón lo invitamos a participar en esta investigación para identificar si existen pérdidas o ganancias de información genética en su hijo o hija. Su participación en esta investigación consiste en la toma de muestra de sangre (menos 5 ml) a su familiar para realizar un análisis de ADN en busca de alteración. La toma será tomada por personal calificado, la única complicación de la toma de la muestra es dolor leve al introducir la aguja de la jeringa, el cual será tratado posteriormente con un analgésico (paracetamol a dosis de 10mg por kilogramo peso) y se procesara en la unidad de citogénica, sin costo alguno. Los resultados de esta investigación se informaran a los padres o representante legal, en forma personalizada, tanto si presento o no presento alteración genética. En caso de que no desee participar, esta institución no tomara represalias (mal) encontra de su hijo o su familia y continuara con la misma calidad de atención que se le brindo desde un inicio. Quienes con nuestra firma validamos este documento, manifestamos que el medico investigador ha explicado con lenguaje simple y de forma suficientemente clara en que consiste mi participación el proyecto de investigación y ha respondido a cada una de las preguntas que le planteo. Especialidad en Genética Médica 105 HEMOS LEÍDO Y ESTAMOS ENTERADOS PLENAMENTE DE ESTA FORMA DE CONSENTIMIENTO Y ENTENDEMOS QQUE NO DEBEMOS FIRMAR SI NO COMPRENDO TODAS LAS PALABRAS DE ÉSTE FORMATO O QUE NUESTRAS PREGUNTAS NO HAYAN SIDO ACLARADAS A NUESTRA ENTERA SATISFACCIÓN. --------------------------------------------------- Nombre y firma del representante legal -------------------------------------------------- ------------------------------------------- Testigo (1) Testigo (2) Declaración de los médicos investigadores Nosotros los investigadores hemos explicado el proyecto de investigación al representante legal y familiares del sujeto en estudio, nos comprometemos a guardar confidencialidad, anonimato y ha utilizar la información y el material genético en forma adecuada sin dañar a los participantes o la comunidad con el fin de entender mejor esta patología para beneficio de la humanidad. Igualmente, consideramos que han sido adecuadamente enterados los representantes legales de los participantes y han firmado bajo su libre decisión. --------------------------------------------------------- Nombre y firma de investigador principal -------------------------------------------------------------- Nombre y firma de investigador colaborador CONTACTO DE INFORMACIÓN: Dr. Jehú Rivera Vargas, teléfono 3334027145 de lunes a domingo las 24 hrs. Dr. Jorge Román Corona Rivera 36178738 de lunes a Viernes de 8:00–16:00 horas. Salvador Quevedo y Zubieta No.750 C.P. 44340, Guadalajara, Jal., México. Teléfono 36189326, 36180362 Especialidad en Genética Médica 106 JUNTA ACADÉMICA PROGRAMA DE ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MÉDICA HOSPITAL CIVIL DE GUADALAJARA “DR. JUAN I. MENCHACA” P R E S E N T E Me permito informar a ustedes, que habiendo revisado el Trabajo de Tesis del alumno M.C.P. Jehú Rivera Vargas del programa académico de Especialidad en Genética Médica con sede Nuevo Hospital Civil de Guadalajara “Dr. Juan I Menchaca”, titulado “Detección de pérdidas o ganancias genómicas en pacientes con anomalías congénitas múltiples y/o discapacidad intelectual evaluadas mediante el uso combinado de kits amplificación de sondas dependientes de ligandos múltiplex (MLPA)”, que se llevó cabo durante los años 2013 a 2015 y después de haberlo revisado cuidadosamente, manifiesto que el documento se encuentra debidamente concluido para que pueda ser presentado en Examen de Tesis para la obtención del Diploma de Especialidad en Genética Médica. Sin otro particular, agradezco de antemano su atención. A T E N T A M E N T E “LA SALUD DEL PUEBLO ES LA SUPREMA LEY” Guadalajara, Jalisco, a 01 de Diciembre de 2015 ________________________________________ DR. EN C. JORGE ROMAN CORONA RIVERA DIRECTOR DE TESIS
