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Revisão de Estrutura: DNA e RNA DNA: armazém e transmissão da informação de controle biológico: CARACTERÍSTICAS + HEREDITARIEDADE Evolução x DNA: O DNA tem fidelidade para assegurar a continuidade das espécies, porém, mesmo assim, também é capaz de permitir o surgimento de novas características, garantindo a variabilidade genética e o surgimento de novas espécies. Nucleotídeos: MONOMERO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS (DNA E RNA) Composto por: 1 pentose (monossacarídeo com 5C) – ribose (RNA) ou desoxirribose (DNA). Base nitrogenada – uracila, guanina, timina, adenina, citosina. Grupo fosfato (PO4-). Nucleotídeos de DNA: desoxirribonucleotídeos. 1. Pentose: o RNA é mais susceptível a sofrer mutações devido a presença de OH no carbono 2 de sua ribose. Diferente do açúcar do DNA que possui apenas H no 2C’. 2. Bases nitrogenadas: Compostos aromáticos com anéis (C e N). Derivadas das pirimidinas – bases nitrogenadas menores (com 1 anel com C e N): citosina, timina e uracila. Derivadas das purinas – bases nitrogenadas maiores (com 2 anéis C/N): adenina e guanina. 3. Fosfato: Covalentemente ligado ao C5’ das pentoses – por ligação do tipo ester. 1 P: nucleotídeo monofosfato. 2P: nucleotídeo difosfato. 3P: nucleotídeo trifosfato. Sem fosfato ligado ao carbono 5: nucleosídeo. O fosfato confere ao nucleotídeo carga negativa. Outras funções: ATP – quebra das ligações entre fosfatos, liberando energia. Estrutura Primária: POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS, OU SEJA, CADEIA DE NUCLEOTÍDEOS Unidade funcional: nucleotídeo. Estrutura formada através da polimerização/ligação covalente fosfodienter. Ela acontece entre os nucleotídeos – grupo PO4- com 3’OH- Os nucleotídeos são adicionados por: o DNA Polimerase. o RNA Polimerase. Todo nucleotídeo novo é obrigatoriamente trifosfato. De maneira simplificada, a nova ligação fosfodiester formada entre os nucleotídeos só ocorre porque utiliza a energia derivada da quebra de ligações fosfato-fosfato de alta energia presente no nucleotídeo trifosfato a ser adicionado. Nesse processo o nucleotídeo passam por duas hidrolises: Substrato: nucleotídeo trifosfato – hidrolise – formação do pirofosfato (2 fosfatos). Pirofosfato - novamente hidrolisado. Sendo assim, os nucleotídeos entram na enzima, sofrem hidrolise e fornecem energia para a polimerização. Após a polimerização (união das cadeias): Ponta 5’: grupo PO4- não ligado/livre. Ponta 3’: grupo OH- não ligado/livre. No meio: nucleotídeos ligados por ligação fosfodiester. Convenção: a nova sequência de DNA é escrita de 5’(esquerda) para 3’(direita). Esqueleto covalente do DNA (solúvel em água): pentose – fosfato – pentose – fosfato – pentose (...) Bases nitrogenadas – grupos mediais e hidrofóbicos. Estrutura Secundária: UNIÃO DAS FITAS SIMPLES – 2 FITAS DE DNA Bases nitrogenadas complementares. Solúvel em meio aquoso – PO4 e pentoses estabelecem ligações de H. Entre bases nitrogenadas: ligação fosfodienter. Fitas antiparalelas: possuem sentidos contrários. Exemplo: fita 1: 3’ ---- 5’ / fita 2: 5’ ---- 3’. Estrutura Terciária: Watson e Crick se basearam na lei do pareamento* (Chargaff) e na imagem do cristal de DNA (Rosalinda F.) e concluíram que o DNA: Possui duas cadeiras helicoidais (fitas de nucleotídeos) em volta do mesmo eixo: dupla-hélice. Seu giro é para a direita. Esqueleto externo está em contato com a água do meio, realizando pontes de H. Hidrofílico. Bases nitrogenadas: empilhadas perpendicularmente umas às outras e localizadas dentro da dupla hélice. São hidrofóbicas. Fitas tem polaridades opostas – 5’ --- 3’ e 3’ --- 5’. Fitas não são idênticas, mas sim complementares (composição das bases nitrogenadas). * Lei do pareamento: pirimidina se une a uma purina, formando um diâmetro de tamanho igual ao da dupla-hélice, já que uma é menor e a outra é maior, respectivamente. o Purina + purina: diâmetro superior ao diâmetro da dupla-hélice. o Pirimidina + pirimidina: diâmetro inferior ao dupla-hélice. A. Nucleotídeos unidos pela ligação fosfodiester B. Dupla hélice (união de duas simples) C. Visão tridimensional da fita dupla de DNA – estrutura terciária Por que o DNA foi escolhido ao invés do RNA ou da proteína? Proteínas não são capazes de se autoduplicarem. Repositório da informação genética estável. (O que o torna superior ao RNA). Entre outros fatores. Desnaturação do DNA: Calor. Alterações de pH. Ambos causam a separação da dupla-hélice: DESENOVELAMENTO. As ligações fosfodiester não são rompidas com o aquecimento. Renaturação: Ela é rápida. RESFRIAMENTO – fitas se alinham em nucleotídeos complementares e as ligações de H são formadas. Temperatura de Melting (TM): Uma metade do DNA se encontra na forma de dupla-hélice e a outra metade na forma de fitas simples. Determinada pela: 1. Composição de nucleotídeos do DNA: Maior concentração de uniões guanina/citosina (3 ligações de hidrogênio) – maior será a TM, pois terão mais ligações de H a serem rompidas até que metade da fita se torne fitas simples. Maior concentração de uniões adenina/timina (2 ligações de H) – menor será a TM. 2. Tamanho: Maior número de nucleotídeos – maior a TM. Menor o número de nucleotídeos – menor a TM. MACETE: CONTAR O NÚMERO DE LIGAÇÕES DE H A SEREM ROMPIDAS Organização do: material genético 1. Cromossomo bacteriano: Presente em células procarióticas das bactérias. É único, circular, formado por DNA dupla-fita sem histonas associadas, com pontos de ancoragem à membrana plasmática e está empacotado na forma de nucleoide. 2. Plasmídeo: elemento genético extracromossômico que sofre replicação independente dos cromossomos e apresenta informação genética de valor adaptativo (resistência antibióticos) → fungos pluricelulares, leveduras e bactérias. 3. Cromossomo eucariótico: Encontrado dentro do núcleo → cada um deles contém uma única molécula de DNA dupla-fita longa → são em número variado de acordo com a espécie e possuem várias formas (posição do centrômero e tamanho relativo dos braços). Partes dos cromossomos eucarióticos: centrômero + braços (curtos ou longos) + telômeros. Células que não estão em divisão (G0 ou em intérfase – G1 e G2) → material organizado em nível de cromatina (fibras de proteína + DNA). Histonas: empacotam e organizam o DNA. DNA associado fortemente a histonas que empacotam e organizam o DNA em unidades estruturais de empacotamento, os nucleossomos (DNA + histonas). Cada “conta” de nucleossomo contém 8 histonas + uma volta de 200 pares de base de DNA. DNA: 2 metros lineares. Núcleo da célula humana: 6 micrômetros – necessidade de empacotamento do material genético. CROMATINA → CROMOSSOMO: Solenoides → alças de cromatina unidas a um esqueleto proteico (andaime): 4. DNA de organelas: mtDNA (mitocôndria) e cpDNA (cloroplasto). Cada organela possui de 2-10 cópias de DNA circular (vestígio do DNA bacteriano, de acordo com a teoria da endossimbiose) → codificam tRNAs e rRNAS usados no metabolismo da organela mas poucas proteínas (95% das proteínas de uma organela são codificadas pelo DNA dos cromossomos que estão no núcleo → replicação do mtDNA ou cpDNA é independente do ciclo celular e ocorre antes e durante a divisão celular DNAs que formam os cromossomos são muitas ordens de magnitude maiores que as células ou vírus em que eles são concentrados → necessidade de empacotamento e organização do DNA para “caber” dentro dos vírus e células → organização de cromomatina e cromossomos. Genoma: todo o conteúdo genético de um organismo. replicação do DNA Metabolismo do DNA: Replicação. Reparo. Recombinação. PROCESSO E MAQUINARIA ALTAMENTE CONSERVADOS Ou seja, as enzimas+ os processos de replicação são muito semelhantes entre os seres vivos. Sendo assim, com a replicação de uma fita molde é possível determinar as sequências: possível, previsível e complementar. Funções biológicas: Reposição de células somáticas. Exemplo: renovação das áreas da pele que foram desgastadas. Reprodução (uni e pluricelular). Crescimento dos organismos pluricelulares – aumento de células a partir da mitose, realizada após a replicação do DNA na fase S da interfase. Quando acontece a replicação do DNA na vida de uma célula? A vida de uma célula é o intervalo de tempo entre a divisão celular que a deu origem e a próxima divisão, marcada pela citocinese (divisão do citoplasma de uma dada célula de forma a originar outras células) – ciclo celular. Maior intervalo de tempo do ciclo celular: interfase – momento em que a célula será preparada para a divisão celular. Fases da Interfase: G1: crescimento da célula. Torna-se fisicamente maior, copia organelas, e fabrica os componentes moleculares que precisará nas etapas posteriores. S: síntese de DNA. Também duplica o centrômero – ele ajuda a separar o DNA durante a fase M. G2: crescimento da célula. Produz proteínas e organelas, e começa a reorganizar seu conteúdo em preparação para a mitose. Toda célula sofre ciclo celular? NÃO. Aquelas que não passam pelo ciclo ficam ESTAGNADAS NO G0: Nessa fase a célula não está ativamente se preparando para dividir, está apenas desempenhando suas funções. É um estado permanente para algumas células, enquanto outras podem reiniciar a divisão caso recebam os sinais corretos. Alguns tipos de células mais especializadas como os neurônios, hemácias e células musculares, nunca se dividem. O que acontece com o DNA durante o ciclo celular? Fase G1: DNA pouco enrolado. Cromossomo simples. Fase S: duplicação do DNA (2 moléculas de DNA). Cromossomo simples → cromossomo duplicado. Metáfase: maior grau de condensação. Anáfase: separação das cromátides. Possíveis mecanismos para replicar o DNA: 1. Replicação semiconservativa: 1 fita molde (original) e 1 fita-filha (nova) formam uma nova dupla-hélice. Metade do material genético é conservado ao dar origem a uma nova molécula de DNA, ou seja, cada fita na dupla hélice atua como modelo para a síntese de uma nova fita complementar. 2. Replicação conservativa: a dupla-hélice original é totalmente conversada, enquanto as duas fitas-filhas sintetizadas a partir dela dão origem a uma nova dupla-hélice. 3. Replicação dispersiva: quebra da dupla-hélice original, unindo fragmentos aleatórios a partir de novas sínteses. Replicação semiconservativa: REPLICAÇÃO QUE REALMENTE OCORRE NA MOLÉCULA DE DNA Origem de replicação: ponto de abertura – região rica AT (adenina-timina). Forquilha de replicação: bolhas onde se processa a replicação o Bidirecional: direção de crescimento para ambos os lados, direita e esquerda. A síntese do DNA sempre acontecerá de 5’→ 3’: C 3’ com OH- é ponto de alongamento do DNA → adição de novos nucleotídeos trifosfato. Síntese semidescontínua: fita de síntese contínua + fita de síntese descontínua. o Fita nova de síntese contínua: síntese DNA = sentido da abertura da forquilha. o Fita nova de síntese descontínua: síntese DNA = sentido oposto ao da forquilha (em blocos 5’→3’ : fragmentos de Okasaki). Sendo assim, toda fita nova é de síntese contínua e também descontínua, a depender dos sentidos de abertura e síntese. METADE DA FORQUILHA FORQUILHA COMPLETA: Enzimas e Proteínas Envolvidas na replicação do dna 1. DNA Polimerase: Pré-requisitos para exercer sua função: Fita molde – guia de síntese pelas regras de pareamento de bases. Desoxirribonucleotideo trifosfato (dNPT) – substrato. Presença de um primer – RNA iniciador. Grupo 3OH livre ao qual será adicionado um dNPT. Importante: A forquilha é bidirecional. Replicação semidescontínua – duas sínteses: uma continua e a outra descontínua. o Contínua: sintetizada no mesmo sentido da abertura da forquilha, utilizando apenas um primer. o Descontínua: fragmentos de Okazaki. TODAS SÃO SINTETIZADAS DE 5’ PARA 3’ Características: Enzima de alta processividade – adiciona muitos nucleotídeos sem se dissociar. Alta fidelidade. Sistema de reparo: revisa duas vezes os nucleotídeos mal pareados. Como ela reconhece o erro? Quando a ligação é inadequada, a geometria do sitio ativo dela é alterada. Desse modo, ela trabalha de 3’ para 5’ (durante o reparo) – atividade de exonuclease 3’ - 5’. ATIVIDADES DA ENZIMA: REVISÃO E POLIMERIZAÇÃO 2. Helicase: Função: separação das duas fitas de DNA – desnaturação – movimenta a forquilha abrindo a dupla-hélice usando ATP. Nos seres vivos: sentido bidirecional – são utilizadas 2 helicases. Causa super torção da hélice durante a abertura das fitas – quando a tensão não é aliviada, pode haver o rompimento do DNA. 3. Topoisomerase: Atua a frente da helicase – alivia a supertorção. A enzima corta, diminui a torção e liga novamente a fita. Necessita de energia. Em um forquilha – 2 topoisomerases (1 para cada helicase). 4. Proteínas de Ligação à Fita Simples (SBP): Se ligam às fitas simples de DNA dentro da forquilha, impedindo a renaturação antes da síntese. 5. Primase: RNA polimerase que fabrica um pequeno RNA – primer (gerando a extremidade 3’OH livre). Na fita contínua: uma primase. Descontinua: algumas primases. DNA Polimerase 1 + DNA Ligase: remoção de primers e substituição por DNA. Último nucleotídeo adicionado no lugar do primer tem extremidade 3’OH livre, enquanto a outra extremidade 5’PO4- (monofosfato) também é livre. Tal ligação será feita pela DNA ligase. Revisão – estrutura do DNA: DNA dupla-hélice: estrutura terciária. Forma que o DNA é replicado, e não como dupla fita. Dupla fita: estrutura secundária. Regras de pareamento. Esqueleto covalente: pentose, fosfato, pentose, fosfato. Entre as bases: ligações de H. Extremidades: 5’ (primeiro nucleotídeo com grupo fosfato livre) e 3’ (OH livre). Polaridades contrarias: antiparalelas. Etapas da Replicação: 1. Início: reconhecimento da origem de replicação – forquilha bidirecional – proteínas de ligação a fita simples + topoisomerase. Etapa extremamente regulada, para que cada molécula de DNA seja replicada 1 vez a cada ciclo celular – mantem o número de cromossomos, permitindo que as espécies de mantenham. 2. Alongamento: primase faz um primer ou em fragmentos de Okasaki. 3. Término: remoção e substituição dos primers. Complexo enzimático formado por DNA-Polimerase e helicase – em cada extremidade: 1 DNA-Polimerase com 2 sítios ativos. Na prova, esse fato não será cobrado. Resumindo: DNA Girase = DNA Topoisomerase Procariotos: Cromossomo circular – uma origem de replicação. Quando a bactéria multiplica seu cromossomo? Bactéria não faz mitose e sim, divisão binária. Eucariotos: Cromossomo linear – muitas origens de replicação. Telômero – sempre que a célula se replicada, o telômero diminui. Quando o primer de iniciação é removido, a região onde ele se localizava na fita é degenerada. Replicação da ponta dos cromossomos eucarióticos (telômeros) – atuação das telomerases: cresce a fita molde com a adição de primer depois da fita, evitando a perda de nucleotídeos. Acontece em apenas algumas células. Transcrição e processamento do mrnA Por que somos diferentes? A variação do DNA sozinha não é capaz de explicar a diversidade de características dos seres vivos. Proteínas: diferente intensidade de transcrição de cada gene, resultando em diferentes concentrações de RNA que serão traduzidos, produzindoproteínas específicas. A diferença do número de proteínas gera fenótipos diferentes. A DEPENDER DO TIPO E DA QUANTIDADE DA PROTEÍNA Dogma central da biologia molécula: Replicação do DNA: garantindo capacidade de se reproduzir Transcrição de RNA a partir de pedaços de DNA RNA é traduzido produzindo proteínas EXCEÇÃO: Alguns vírus são capazes de realizar transcrição reversa, produzindo uma molécula de DNA a partir do seu material genético (RNA). Exemplo: retrovírus, podendo ser representado pelo vírus HIV. Definição: Processo molecular que envolve a produção de um tipo de RNA a partir de um segmento de DNA molde contido em uma unidade chamada gene. Processo molecular que explica a diferenciação celular. É a transcrição que determina o gene a ser expresso e a quantidade de proteínas que serão expressas. Alteração da transcrição das enzimas a depender da necessidade do organismo. Garante a adaptação de um organismo as variações do meio ambiente, permitindo, por exemplo, a camuflagem. Além disso, também garante a diferenciação celular (ex: embriogênese). Ela muda de acordo com o tecido, alimentação (via metabólica a ser utilizada no momento), estímulos ambientais. Conjunto de genes ativos: transcriptoma. RNA: POLÍMERO DE RIBONUCLEOTÍDEOS Ribonucleotídeos são formados por ribose, bases nitrogenadas e grupo fosfato. O polímero é unido por ligações fosfodiester. Ele é mais instável – a hidroxila sofre ataque nucleofilico, principalmente, de íons OH-, fato que desestabiliza a molécula. Sofre hidrolise espontânea. É solúvel em água. Pontas livres: 5’ e 3’. o 5’: grupo fosfato livre. o 3’: grupo hidroxila livre. Mesmo estando na mesma fita, nucleotídeos que contem bases nitrogenadas complementares podem realizar, espontaneamente, ligações de hidrogênio – gera uma estrutura secundária. Quais os tipos de RNA a célula produz? Intermediários entre a informação codificada no DNA e a informação necessária para produzir uma proteína 1. RNA Mensageiro: Mais abundante. Tamanhos variados. Determina a sequências de ribonucleotideos que vão determinar diretamente a proteína a ser produzida. 2. Transportadores: Transporte de aminoácidos. Pequenos. 20 RNAs transportadores na célula. Elaborada estrutura secundária devido a sua função de transporte. 3. Ribossômico: Forma o ribossomo. Pequenos e grandes. Elaborada estrutura secundária – garante o formato do ribossomo. 4. RNA de interferência: Controle de quantidade de proteína sintetizada em uma célula. Alguns controlam a meia vida do RNA mensageiro, determinando o número de vezes que ele será lido. São exclusivos dos eucariotos. 5. RNA ? Protegem a célula contra a invasão de um vírus bacteriófago, através da degradação de sequências especificas do material genético desses vírus. Procarióticos. TODOS FORAM TRANSCRITOS A PARTIR DO DNA Localização dos RNAs: 1. Procariotos: possuem apenas o citoplasma. Sendo assim, a transcrição e a tradução ocorrem no mesmo lugar e podem ocorrer ao mesmo tempo. 2. Eucariotos: dois grandes compartimentos celulares principais: núcleo (transcrição) e citoplasma (RNAm maduro é transportado para o citoplasma, onde ocorre a tradução). Primeiro ocorre a transcrição e depois a tradução. Gene: fragmento de DNA que produz algum produto gênico final: RNA ou proteína, com função catalítica ou estrutural. Os genes eucarióticos tem grandes blocos de sequência que não serão traduzidos. Sendo assim, os genes são muito maiores que a quantidade necessária para traduzir a proteína em questão. Essas estruturas são removidas e recebem o nome de INTRONS. EXONS: sequência codificadora de proteínas. O RNA maduro é menor que aquele que foi transcrito inicialmente, pois os introns são removidos após a transcrição. IMPORTANTE: nos procariotos os íntrons são inexistentes, pois praticamente toda a sua informação genética é funcional, transcrita em proteínas. Estrutura do Gene: Todo gene é fita dupla – ele é um fragmento de DNA. A escolha da fita molde depende da localização e orientação do promotor (5’ do gene). Promotor: determina quem é a fita molde e qual será o sentido trabalhado pela RNA polimerase (direita para a esquerda ou esquerda para a direita). Retomando e resumindo: Procariotos – mRNA do tipo policistrônico: cada mRNA contém informação para traduzir muitos peptídeos (genes). o Operon: região do DNA que é transcrita em um mRNA policistrônico com peptídeos envolvidos no mesmo processo biológico – Operon Lac. Eucariotos – RNA mensageiro do tipo monocistrônico: para cada gene é transcrito um mRNA. Ambos tem: Região 5’ regulatória – marca o início da transcrição. Não transcrita. 3’ regulatória – fim da transcrição. RNA Polimerase: Adiciona a formação de um polímero de nucleotídeos de RNA no sentido 5’ para 3’. Realizam a formação de ligações fosfodiester. Pré-requisitos: Nucleotídeos trifosfato – hidrolisa as ligações fosfoanidro. Molde de DNA. Não precisam de extremidade 3’ OH livre. NOS PROCARIOTOS TODOS OS RNAS SÃO TRANSCRITOS POR APENAS UM TIPO DE RNA POLIMERASE. Nos eucariotos: RNA – Polimerase I: maioria dos genes para rRNA. RNA – Polimerase II: é a principal. Todos os genes que codificam proteínas (RNA mensageiro), mais alguns genes que codificam pequenos RNAs. RNA – Polimerase III: genes tRNA, genes para rRNA. Bolha de codificação: Sentido unidirecional. Menor que a forquilha. Prova: qual é o sentido que RNA polimerase está trabalhando? 5’ para 3’. A ---- U G ---- C Fita codificadora e RNA: Mesma sequência de nucleotídeos, trocando apenas T por U. Polaridades iguais. Fita codificadora fica fora do sitio ativo da RNA polimerase, pois não é utilizada diretamente. A medida que a transcrição acontece, o RNA sai pelo canal de saída do RNA. Após transcrita a fita molde volta a se ligar com a fita codificadora. Calda CTD: fundamental para o início da transcrição. Fases da transcrição: 1. Inicio. 2. Alongamento (bolha de transcrição). 3. Término. 1. Inicio: Região Regulatória 5’. Promotor principal: TATA BOX. Outros: iniciadores e enhancers. Função: sequências de posicionamento da RNA polimerase (tata box e iniciadores) e sequências que modulam a ligação da RNA polimerases ao tata box/iniciador (enhancers). TATA BOX: local onde a DNA polimerase se liga, fazendo com que seu sitio catalítico se encontre encima do primeiro nucleotídeo a ser transcrito. INICIADOR: próximo a região tata box. ENHANCERS: se encontram longe da região tata box. Local onde enzimas ativadoras e repressoras se ligam e regulam o acesso a tata box e, consequentemente, a modulação do complexo (?) Todo gene tem como promotor principal a região tata box. Desse modo, essa região é definida como ubíquo. A região pode apresentar sequência de nucleotídeos diferentes do esperado – a RNA polimerase se liga com menos afinidade, diminuindo o nível de afinidade. Quanto mais próximo a região tata box se encontra próxima a sequência ideal/padrão, mais forte é o promotor. Fatores de Gerais de Transcrição: Proteínas que: Posicionam a RNA polimerase no promotor (tata box) Abertura da fita de DNA – formam a bolha de transcrição Coloca a fita molde na RNA polimerase Após todos os fatores de transcrição estão ligados a região tata box, a calda CTD da RNApol é fosforilada, dando início a transcrição. Outras proteínas também auxiliam a montagem do complexo de iniciação da transcrição: fatores específicos de transcrição. Possuem papel ativador ou opressor. Ativadores e repressores: Mecanismos moleculares: 1. Auxilia ou reprime a ligaçãoentre os fatores gerais e a RNApol se ligem a região promotora principal. Quando há repressão não ocorre transcrição. 2. Nível de compactação – modulação da estrutura de cromatina. Quando a cromatina está condensada, a região tata box está inacessível, impedindo a transcrição. Cromatina condensada – heterocromatina: genes silenciados ou transcritos em níveis muito baixos (repressores da expressão). Eucromatina (cromatina frouxa): ativadores da expressão. Sendo assim, 3 elementos atuam no início da transcrição são: RNA polimerase. Fatores gerais de transcrição. Fatores específicos. Alongamento: Ocorre dentro da BOLHA DE TRANSCRIÇÃO – formada por 18 nucleotídeos; unidirecional. DNA polimerase: Fita de DNA molde. Ribonucleotídeos trifosfato – produz ligações fosfodiester de 5’ para 3’. Final do gene (3’ regulatória): sequência de termino da transcrição. Produz dois tipos de sequencias de termino: ALÇAS NO MRA – gera uma redução na velocidade de transcrição, ou seja, reduz a velocidade da enzima, indicando o fim desse processo. LIGAÇÕES DE PROTEÍNAS TIPO RÔ – desliga a RNA polimerase e ela é liberada. Após todo o processo o DNA volta a se tornar fita dupla. Pré mRNA/ mRNA primário – eucariotos: 5’: pedaço de RNA + EXON 1 5’ UTR: transcrito, mas não traduzido. A região após último éxon é transcrita, mas não é traduzida – 3’ UTR. Gene: é um pedaço de DNA que produz um produto gênico – proteína ou RNA. mRNA maduro: Para que se torne maduro, o pré RNA passa por 3 processamentos: Proteção contra degradação (adição do 5’ CAP) e poliadenilação da 3’ (adição da cauda poli A). Splicing. Após todo o processamento é direcionado para o citoplasma. Esse processamento ocorre durante a transcrição nas etapas de: Alongamento; Término. Proteínas utilizadas estão ligadas a cauda CTD fosforilada da RNApol II. CAP 5’: ribonucleotídeo modificado – metilguanosina. Ponte trifosfato 5’ para 5’ entre o CAP e o RNA. Essa ligação não é reconhecida pelas enzimas de RNA, desse modo, não fazem a destruição do RNA a partir da extremidade 5’. Aumenta o tempo de durabilidade do RNA no citoplasma. Função além da proteção da extremidade 5’: auxilia no inicio do processo de tradução, pois é reconhecido pelo ribossomo. Poliadenilação 3’: Sequencia conservada – sinal de poliadenilação: AAUAAA. Adição da sequência GU. Ambas sequências são reconhecidas pelos fatores de poliadenilação, dando início a clivagem do RNA mensageiro e liberando a extremidade livre 3’. Adição cauda poliA na extremidade livre 3’. o Quanto maior forma a cauda PoliA, maior será o tempo de duração do RNA no citoplasma. o Também auxilia no início da tradução. Splicing (recomposição): 2 reações de transesterificação sequenciais – cada ligação fosfodiester é substituída por outra sem consumo de energia. O intron é retirado na forma de laço. Todo intron apresenta alguns nucleotídeos conversados: o Começa com GU – onde ocorre a quebra da ligação fosfodiester. A guanina faz a nova ligação com a adenina perto da 3’ do intron, formando uma forquilha. o Termina com AG. Dois éxons são unidos por uma ligação fosfodiester comum: 5’(segundo éxon) - 3’(primeiro éxon). As ligações são quebradas por spliceossomos ao liberarem enzimas. Y: pode haver U ou C. N: qualquer nucleotídeo. Splincing Alternativo: Formas alternativas de unir os exons Ao remover um intron, também pode haver a remoção de um éxon, gerando uma proteína diferente. Exemplo: tropomiosina – sofre o splincing de modo a depender da sua função, alterando as proteínas que serão expressas. Trans-splicing: Protistas. Os organismos são capazes de unir exons provenientes de genes diferentes, produzindo RNA maduro. mRNA maduro: Forma como chega no citoplasma Primeiro éxon inicia com um códon de iniciação: AUG. Último éxon: stop códon. Como regular a quantidade de proteína produzida/ virulência? Tamanho da cauda PoliA: quanto maior, mais proteína será traduzida, pois é a cauda PoliA quem garante a durabilidade do mRNA no citoplasma. Adição do CAP. Regulação do início da transcrição: ponto mais importante para controlar a expressão do gene. Em eucariotos: Eucariotos x Procariotos: