01_Programa_e_labotatorial_2019__Modo_de_Comp

Prévia do material em texto

GENÉTICA MOLECULAR 
2018-2019
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
1
Docentes
Prof.ª Dr.ª Elsa 
Bronze da Rocha
Prof.ª Dr.ª 
Margarida Borges
1 - Estrutura do DNA
2 - Código genético
3 - Replicação do DNA
4 - Transcrição do DNA
5 - Tipos de RNA e processamento
6 - Tradução e síntese proteica
7 - Recombinação genética
8 - Mapeamento
9 - Genética de bactérias
10 - Genética de fagos
11 - Mutações do DNA
12 - Reparação do DNA
13 - Técnicas de DNA 
recombinante
14 - Aplicações das técnicas 
de DNA recombinante
15 - Regulação da expressão 
genética nos procariotas
16 - Regulação da expressão 
genética nos eucariotas
17 - Regulação do ciclo celular
18 - Mecanismos moleculares 
de indução do cancro. 
Oncogenes e anti-oncogenes
Programa das aulas teóricas de Genética Molecular
(2018-2019)
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
2
T0 - Introdução aos trabalhos práticos
T1 - Infeção de bactérias por fagos/pesquisa de homologias
T2 - Cinética de crescimento de uma população bacteriana/ pesquisa 
de homologias
T3 a- Transformação de bactérias por um DNA 
recombinante/ artigo
b - Isolamento de DNA plasmídico
T4 a - Corte do DNA plasmídico com enzimas de 
restrição/ artigo
b - Eletroforese de DNA digerido
com enzimas de restrição
T5 - Elaboração de um mapa de restrição 
de um plasmídeo recombinante
T6 - Exame laboratorial
Programa das aulas laboratoriais de Genética Molecular
(2018-2019)
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
3
Objectivos Específicos
1) entendimento dos conceitos básicos e fundamentais inerentes à
transmissão da informação genética
• processos básicos necessários à transmissão da informação contida no DNA
até à formação de uma proteína, em procariotas e eucariotas
• consequências das alterações dos processos biológicos normais, por
mecanismos e agentes que modificam genes e cromossomas
• utilidade de modelos biológicos e aplicação de um conjunto de ferramentas
disponibilizadas pelas tecnologias de DNA recombinante
GENÉTICA MOLECULAR
2) aplicação destes conhecimentos e competências adquiridas no
estudo da regulação genética
• estudo e análise da regulação da expressão génica, em procariotas e eucariotas
• regulação do ciclo celular
• causas e agentes que promovem ou inibem a proliferação celular por ação de
fatores endógenos, exógenos e epigenéticos
• as várias estratégias de terapia génica para doenças com índole genética ou não
• 
E
B
R
 -
G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
4
Objectivos Globais para os Estudantes 
GENÉTICA MOLECULAR
• 
E
B
R
 -
G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
i) deterem os conhecimentos científicos, no
contexto da genética molecular, de forma
integrada e coordenada
ii) reconhecerem a aplicabilidade e a relevância
destes saberes na área da saúde e noutros
âmbitos científicos
iii) desenvolverem a capacidade de aprendizagem individual
e em grupo
5
• Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Matthew P, Bretscher SA, Ploegh H & 
Matsudaira P (2016). “Molecular Cell Biology”. W. H. Freeman, 8th Ed*.
• Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K., and Walter, P. (2014).
Molecular Biology of the Cell (6th Ed). New York: Garland Press.*.
• Videira A (2011). “Engenharia Genética: princípios e aplicações”. Lidel, Edições
Técnicas 2ª Ed*.
• Bronze-da-Rocha E & Videira A (2010). “Noções de Genética”, pp 220-259, do livro
“Microbiologia”- Lidel Edições Técnicas.
• Krebs JE, Goldstein ES & Kilpatrick, ST. (2014) “Lewi’s-Genes X“. Jones & Bartlett
Publishers, 10th Ed*.
• Sambrook J & Russell D (2001). “Molecular cloning - a laboratory manual”. 3rd Ed.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, USA*.
Complementar
• Arraiano CM & Fialho, A M (2007). “O Mundo do RNA” - Lidel, Edições Técnicas.
• Watson JD, Gilman M, Witkowski J & Zoller M (1992). "Recombinant DNA" - Scientific
American Books, 2sd Ed.
• Richard M, Myers RM, Caudy AA & Witkowski, JA (2006). “Recombinant DNA: Genes and
Genomes - A Short Course”, W. H. Freeman 3rd Ed.
(*) - Existem na Biblioteca da Faculdade de Farmácia da U. P. 
BIBLIOGRAFIA
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
6
• AVALIAÇÃO TEÓRICA:
- AVALIAÇÃO DISTRIBUÍDA (2 FREQUÊNCIAS) SEM EXAME FINAL 
(16 valores = 80% da classificação final)
- incide sobre toda a matéria lecionada nas aulas teóricas
* escolha múltipla: desconta um por meio
* perguntas de resposta aberta
AVALIAÇÃO
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• avaliação teórica vale 80% (16 valores) da nota final e cada frequência está 
cotada para 8 valores 
• o estudante requer a classificação mínima de 9,5 valores (escala numérica 
de 0-20 valores) no exame laboratorial (a realizar na última semana de aulas 
ou na época normal) que incidirá sobre a componente teórico-prática e 
laboratorial
• a aprovação teórica nas duas frequências requer a classificação final mínima 
7,60 valores (correspondente a 9,5 numa escala de 0-20) e só depois é 
somada a nota da laboratorial 7
• AVALIAÇÃO LABORATORIAL: 4 valores 
a) Análise de 2 artigos científicos relacionados com uma
técnica laboratorial (disponíveis no Moodle):
- na área da Genética Molecular (fornecido pelo professor) aplicado à
investigação clínica ou investigação fundamental (grupos de 3
ou 4 estudantes).
- na ficha correspondente a este ponto o estudante deve colocar a
referência do artigo, qual o fundamento da técnica, o porquê da
utilização desta técnica no trabalho encontrado e quais os
resultados obtidos especificamente da técnica em questão e
como contribuíram para a conclusão final do trabalho.
b) Bioinformática (Moodle):
1. pesquisa de informação relevante na área da bioinformática,
disponível na plataforma Moodle e onde os estudantes terão de
explorar uma plataforma de dados biológicos e a procura de
informação biológica a partir do nome de um gene.
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
8
AVALIAÇÃO
c) Exame laboratorial: decorre na última semana de
aulas, obrigatório para todos os estudantes, e incide
sobre qualquer um dos trabalhos laboratoriais
efetuados durante o semestre .
Cotação das várias componentes da avaliação laboratorial
0,75 valores artigos científicos
0,75 valores bioinformática
0,5 valores questões teóricas 
2 valores exame laboratorial
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
b) Bioinformática(disponíveis no Moodle):
2. Pesquisa de homologias em sequências de DNA e/ou proteínas.
- UniProt (Universal Resource Protein) é o catálogo mais abrangente do
mundo de informações sobre proteínas.
- BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), é uma ferramenta que
permite encontrar regiões de similaridade de uma nova
sequência em estudo e outras já existentes conhecidas,
fornecendo assim, pistas funcionais eevolutivas sobre a estrutura
e função da uma nova sequência.
9
• NÚMERO DE FALTAS permitidas às aulas laboratoriais: 3
RECOMENDAÇÕES
• NÃO ESQUECER
- trazer para cada aula laboratorial: 
* um par de luvas
* bata
* trabalho estudado
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
ou
10
HORÁRIO DE ATENDIMENTO
Os estudantes podem tirar dúvidas da componente teórica e 
laboratorial à terça-feira das 18-19h (Prof.ª Elsa)
Se necessitarem de vir noutro horário e para tirarem dúvidas com 
a Prof.ª Margarida ou comigo podem enviar um email 
e combinamos a melhor hora
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
Na aula teórica de 13 de Setembro de 2018 será exibido o 
vídeo sobre “Técnicas de DNA recombinante”
11
- genoma do bacteriófago ou fago lambda (λ) é constituído 
por DNA de cadeia dupla com o tamanho de 50 kb
- fago λ apresenta dois tipos de ciclo de vida:
* o ciclo lítico
* o ciclo lisogénico
T1 - infecção de bactérias por fagos
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
12
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
lar 
-
F
F
U
P
 
- ciclo lítico e lisogénico
- a adesão do fago à bactéria é facilitada pela adição ao meio de cultura de 
magnésio (10 mM) 
- a maltose promove a formação da proteína Ompc, que faz parte dos recetores 
para o bacteriofago λ existentes na membrana exterior da bactéria, através da 
indução do operão da maltose que contém o gene lamB
- após a lise da bactéria que foi infetada por um fago há a libertação da 
descendência vírica que pode ser visualizada em meio semi-sólido de Top-agarose, 
pela formação de placas fágicas (halo lítico)
13
• a plaque is a clear area on an otherwise 
opaque bacterial lawn on the agar surface of 
a petri dish
• theoretically, each plaque results from 
infection by a single virus particle. The virus 
plaque is analogous to the bacterial colony.
• it is caused by the lysis of bacterial cells as a 
result of the growth & reproduction of phages
- placas fágicas
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
14
1 - inocular uma colónia de E. coli P2 em meio de LB
contendo 0,2% de maltose e incubar ON (“overnight”) a 37ºC
2 - centrifugar a cultura bacteriana
3 - rejeitar o sobrenadante e ressuspender (vortexar) o sedimento celular em cerca de 2 
ml de MgSO4 10 mM. 
4 - incubar a suspensão celular 1 hora a 37ºC com agitação suave
5 - utilizar esta suspensão celular para posterior infeção pelo fago. 
A - preparação de bactérias para serem 
infectadas pelo fago PTB
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 - cuidados:
* todo material a usar deve ser estéril (pontas, matrazes, tubos)
* o meio de cultura deve ser estéril
* manter as condições de assepsia durante as manipulações 
(trabalhar junto ao bico de Bunsen)
15
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
B- infecção de bactérias pelo bacteriófago PTB
1 - fazer diluições seriadas (factor 10) do fago em tampão λ ou SM
Colocar 0,1 ml de cada diluição num falcon de 15 ml
2 - adicionar a cada tubo que contém a diluição 
dos fagos 0,1 ml das bactérias preparadas no
passo anterior (A). Misturar e incubar 20’- 37ºC
3 - adicionar Top-agarose (0,7% agarose em meio
de LB) aquecida a 42ºC, vortexar e espalhar de 
modo homogéneo em placas de L-agar.
4 - deixar as placas 5 minutos à temperatura ambiente e depois colocá-las 
invertidas a 37ºC. As placas fágicas formadas podem ser visíveis ao fim 
de 7 horas e a contagem deve ser feita ao fim de 12-16 horas 16
Cálculos
- cálculo da concentração do stock de fagos em PFU/ml (unidade formadora 
de placas fágicas) tendo em conta as várias diluições 
Tubo Diluição Nº de placas PFU/ml
fágicas 
1
2
3
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 PFU/ml = Nº DE PLACAS FÁGICAS X FACTOR de DILUIÇÃO
INÓCULO (µl)
Concentração stock de fagos = somatório das 3 diluições/3 
17
- o ciclo de crescimento celular é uma processo linear em que uma célula se divide 
e origina duas células filhas
- o crescimento de uma população bacteriana é um processo exponencial, expresso 
por tempo de geração, e que corresponde ao tempo necessário para que a 
população duplique
- tempo de geração é característico para cada bactéria
- a representação gráfica do crescimento de uma população de bactérias apresenta 
quatro fases distintas:
T2 - cinética de crescimento de uma população de bactérias
Curva da 
concentração 
celular
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
18
-
C
ell cycle o
f E
.c
o
li
• EBR Genética Molecular - FFUP 
1
9
- determinação do tempo de geração de uma cultura:
* métodos diretos: - contagem de células ao microscópio
- contagem por métodos eletrónicos
* métodos indiretos: 
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- por medição da densidade óptica
20
- por plaqueamento em 
caixa de Petri
- determinação do tempo de geração de uma cultura:
* métodos indiretos: 
- o plaqueamento em caixa de Petri é o único método que permite fazer
a distinção entre células vivas e células mortas
- cuidados:
* todo material a usar deve ser estéril (pontas, matrazes, tubos)
* o meio de cultura deve ser estéril
* manter as condições de assepsia durante as manipulações (trabalhar 
junto ao bico de Bunsen)• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
21
- protocolo:
1 - da cultura de E. coli Y1090 que cresceu
durante a noite ON (“OverNight”) fazer
uma Diluição de 1:50 em meio de LB 
(Luria-Bertani) num Falcon de 50ml
2 - incubar a 37ºC com agitação durante 2h e fazer 
leituras no espectrofotómetro (Abs=600 nm)
ao fim de 30 min e depois em intervalos sucessivos de 20 mins 
* procurar manter a cultura o menos tempo possível fora das condições de incubação
3 - em paralelo retirar um amostra para determinação do número de células viáveis, 
plaquear (fazer diluições de 10-5 de cada amostra retirada e inocular 0,1 ml 
de cada diluição/placa) em meio sólido (L-agar) e incubar as placas invertidas, 
depois de secas, a 37ºC, ON 
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
22
Nota:
- uma cultura saturada de bactérias contem cerca de 109 cél vivas/ml
- a visualização de colónias isoladas requer que a cultura seja diluída 10 
milhões de vezes, o que é obtido através do método de diluições 
sucessivas ou seriadas
* uma diluição de 10-1 requer a diluição de 0,1 ml da cultura 
bacteriana em 0,9 ml de tampão de diluição em eppendorfs
* partir desta diluição (10-1) fazer uma nova diluição de 10-1 e temos uma 
diluição de 10-2
* para se obter uma 
diluição final de 10-6
teremos de usar uma 
série de tubos de 
3 diluições de 10-2:
10-2 x 10-2 x 10-2 = 10-6
10µl 10µl
100µl 
Cultura 990µl 990µl
original
Diluição = 
1 x 10-2 x 10-2
= 10-4
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
23
- grown on solid surface of agar 
- colonies develop from individual bacteria if the original suspension is dilute
and spread over the surface of the agar
- individual colonies can be 
selected for study
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- método de diluições sucessivas ou seriadas
* para minimizar os erros 
experimentais devem 
efetuar-se múltiplas 
determinações 24
Cálculos:
- resultados (tabela)
- gráfico da absorvência em função do tempo
- gráfico do número de células viáveis em função do tempo
número de células viáveis = nº de colónias x factor dilução
inóculo (µl)
- calcular o tempo de geração da cultura
Tempo Diluição Inóculo Nº de Colónias Nº de células Absorvância
(min) (µl) viáveis (600 nm)
30
50
70
90
110
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
25
• métodos: 
- espectofotométrico
- plaqueamento
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
26
* métodos: 
- cálculo do tempo de geração:
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
* células viáveis
27
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• Tecnologia de DNA recombinante
- DNA
- enzimas de restrição
- vetores de clonagem e de expressão
- células competentes
- transformação
- isolamento DNA plasmídico
- eletroforese
- mapa de restrição
- PCR
28
* reconhecem pequenas sequência específicas com 4 a 6 pares de bases (bp)
* são designadas por 3 letras: EcoRI, HindIII
* ao cortarem podem gerar extremidades:
• enzimas de restrição
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
© 2012 Pearson Education, Inc.
* palíndromas - sequências alvo das 
enzimas de restrição
* enzimas do tipo II (Mg2+)
- reconhecem uma sequência 
particular e cortam o DNA num 
local específico dessa mesma 
sequência
* isosquisómeros
- enzimas de diferentes espécies que reconhecem o mesmo local de 
restrição numa sequência de DNA: Ex: as enzimas MspI e HpaII 
reconhecem a sequência 5’-CCGG-3’
- podem ser perfeitos ou imperfeitos
29
• enzimas de restrição
- SmaI (Serratiamarcescens) corta e dá 
extremidades cegas
- BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 
corta e dá extremedidades salientes a 5’ 
- PstI (Providencia stuartii) corta e dá 
extremidade salientes a give a 3’
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• podem reconhecer sequências degeneradas
AvaI 5’...CPyCGPuG...3’ 5’...C PyCGPuG...3’
3’...GPuGCPyC...5’ 3’...GPuGCPy C...5’
AsuI 5’...GGNCC...3’ 5’...G GNCC...3’
3’...CCNGG...5’ 3’...CCNG G...5’ 
30
3
1
•en
zim
as d
e restrição
• EBR Genética Molecular - FFUP 
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
* conceito de clonagem
- termo aplicado a um fragmento de DNA que foi isolado e inserido
num vector de clonagem, constituindo um DNA quimérico, híbrido
ou recombinante, que após transformação permite a produção de
grandes quantidade desse mesmo fragmento
* clone
- conjunto de células ou moléculas idênticas à célula ou molécula
ancestral
* vector de clonagem
- plasmídeo ou fago que é capaz de
transportar uma sequência DNA
estranha dando origem a um
DNA híbrido ou recombinante
• vectores de clonagem
32
- plasmídeos são moléculas de DNA não cromossomal, de cadeia dupla ou 
simples circular
- contêm um local de origem de replicação própria
- o DNA dos plasmídeos é muito mais pequeno que o DNA 
cromossomal, mas pode conter genes específicos que são 
responsáveis pela conjugação, resistência a antibióticos, síntese 
de antibióticos, produção de toxinas e enzimas de degradação 
- os plasmídeos têm a capacidade de “hospedar” ou “transportar”
fragmentos de DNA estranho), uma vez que são vetores de clonagem, o 
que permite a manipulação e o estudo desses mesmos genes ou 
fragmentos do gene
- podem ser perigosos para a saúde humana uma vez que conferem 
às bactérias que os possuem resistência a antibióticos
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• vectores de clonagem
33
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
* vector de clonagem
- capacidade de se autoreplicar (replicão)
- conter, pelo menos, um gene que confere resistência a antibióticos
- possuir locais de restrição únicos, polylinker ou local de clonagem
múltiplo (MCS), que permitem a entrada do DNA a clonar
- fácil de purificar
34
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• tipos de vectores de clonagem
The λ genome 
contains “optional” 
DNA 
35
3
6
• EBR Genética Molecular - FFUP •
clo
n
ag
em
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• vectores de expressão
* resistência a um antibiótico
* local de origem de replicação
* promotor
* codão de iniciação
seguido de polylinker
* local de ligação ao ribossoma
* fácil purificação
37
• EBR Genética Molecular - FFUP •
o
p
erão
3
8
•
vecto
res d
e exp
ressão
• EBR Genética Molecular - FFUP 
3
9
White and blue selection with LacZ selection marker.
Encoded 
by LacZ 
gene
White and blue selection with LacZ selection marker.
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
40
AmpR
lacZ′
Vector
Foreign DNA
Opened vector
Recyclized vector without insert Vector plus foreign
DNA insert
Transformants blue
(β-galactosidase
active)
Transformants white
(β-galactosidase
inactive)
Digestion with restriction enzyme
Join with
DNA ligase
Transform into Escherichia
coli and select on ampicillin
plates containing Xgal
© 2012 Pearson Education, Inc.
• vectores 
de expressão
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
41
T3a - Preparação de células competentes
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
1 - Crescer uma cultura de E. coli em meio LB durante
a noite a 37ºC, com agitação
2 - Fazer uma diluição de 1:100 da cultura ON em meio LB e incubar a 37ºC, com
agitação, durante 2 a 3 horas até que a densidade óptica (A=600 nm) seja entre
0,2 a 0,4
3 - Transferir a cultura para um Falcon de 50 ml e colocar a 0ºC durante 15 min
4 - Centrifugar a cultura a 4000 rpm durante 10 minutos, a 4ºC
5 - Rejeitar o sobrenadante e inverter os tubos durante 1 minuto para eliminar o
sobrenadante ainda existente nas paredes do Falcon
6 - Ressuspender o sedimento bacteriano em 2 ml de CaCl2 100 mM (por cada 50 ml
de cultura original) previamente arrefecido em gelo
7 - Repetir os passos 5 e 6
8 - Ressuspender o sedimento obtido em 0,2 ml de CaCl2 100 Mm
9 - Dividir em alíquotas de 100 µl com 10% de glicerol e conservar a -70ºC.
42
- a transformação de células bacterianas requer a incubação prévia com uma
solução estéril de cloreto de cálcio arrefecida a 4ºC seguida de um 
choque térmico a 37ºC ou a 42ºC
- o mecanismo que permite a entrada 
do DNA recombinante dentro das
bactérias ainda não é conhecido
- as células competentes 
podem ser conservadas 
em alíquotas (100 µl a 200 µl, 
contendo 10% de glicerol) a -70ºC
- a eficiência da transformação 
é de 105-106 colónias
transformantes/µg de DNA 
plasmídico/ml de células
competentes uma 
T3b - transformação de bactérias por um DNA recombinante
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
43
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
1 - Misturar 10 µl de DNA (contendo 10 a 100 ng 
de DNA) a transformar com 100 µl de células
competentes em eppendorfs estéreis
2 - Colocar os tubos (eppendorfs) em gelo durante 
30 min
T3b - transformação de células competentes
3 - Transferir os eppendorfs para um banho a 
42ºC durante exatamente 45 segundos ou a
37ºC durante exatamente 2 min
4 - Retirar do banho e colocar os eppendorfs 
rapidamente em gelo durante 2 min 
(choque térmico)
44
5 - Adicionar 400 µl de meio LB ou meio 
SOC previamente aquecido a 37ºC
6 - Incubar durante 30 a 60 minutos, a 
37ºC, com agitação suave (tempo 
requerido para a bactéria expressar a 
resistência ao antibiótico conferida 
pelo plasmídeo)
T3b - transformação de células competentes
7 - Plaquear 100 µl das células transformadas em placa de L-agar com 50 µg de 
ampicilina, 40 µg/ml X-gal e 0,1 mM IPTG 
8 - Centrifugar os restantes 400 µl a 2500 rpm durante 10 min, remover 300 µl de 
LB e plaquear os restantes 100 µl em L-agar contendo 50 µg de 
ampicilina, 40 µg/ml X-gal e 0,1 mM IPTG
9 - Deixar as placas à temperatura ambiente durante 10 min
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
45
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
10 - Inverter as placas e incubar a 37ºC; o aparecimento de colónias pode ser 
detetado ao fim de 12 a 16 horas
11 - Determinar a eficiência de transformação, ou seja, 
- o número de total de transformantes (brancas e azuis) /ml/µg de DNA
- a % de transformante /ml/µg de DNA, de recombinados e não recombinados
(eficácia)
T3b - Transformação de células competentes
46
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
Eficiência da transformação 
- número total de transformantes (brancas e azuis) /ml/ug/DNA
Eficácia da transformação 
- % de transformantes recombinados e não recombinados
Um exemplo clássico que ajuda a visualizar a diferença entre a eficiência e a eficácia: 
- um homem que cava um poço com perfeição e atempadamente, realiza um 
trabalho com eficiência;
- um homem que sabe o local correto para cavar o poço e achar água, 
executa um trabalho com eficácia
47
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- uma etapa essencial para a utilização de um plasmídeo corresponde ao 
isolamento (ou separação) do DNA plasmídico da bactéria hospedeira ou 
seja, a separação do DNA do plamídeo do DNA genómico da bactéria, 
promovendo a lise da bactéria 
- pode ser feito 
* em pequena escala (“mini-prep”) 
* em grande escala (“maxi-prep”)
- a escolha do método que permite 
a lise de uma bactéria depende: 
* do tamanho do plasmídeo
* da estirpe de E. coli utilizada
* da técnica queposteriormente é
usada para purificar o plasmídeo 
T3c - isolamento de DNA plasmídico
48
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- a lise bacteriana pode ser feita por:
* tratamento com detergentes não iónicos 
ou iónicos
* com solventes orgânicos
* com agentes alcalinos 
* com a lisozima e 
aquecimento 
• isolamento de DNA plasmídico
phospholipid bilayer
How detergent disrupts the plant cell membrane
49
1 - inocular 5 ml de meio LB contendo 50 µg 
de ampicilina com uma colónia bacteriana 
e colocar a 37ºC, ON, com agitação forte
2 - centrifugar as células durante 20 seg (4ºC 
ou TA) e e remover o sobrenadante
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
3 - adicionar 50 µl de tampão TE e ressuspender
4 - adicionar 200 µl de solução de lise (0,2 M 
NaOH, 1% SDS), misturar por inversão e 
colocar em gelo 5’
5 - Adicionar 150 µl de solução de neutralização
(2,55M acetato de potássio), misturar e 
colocar em gelo durante 5’ 
7 - centrifugar durante 10 min à TA
(sedimentação dos restos celulares e do DNA 
cromossómico)
- protocolo:
50
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
8 - transferir o sobrenadante para novo eppendorf, 
adicionar 900 µl de etanol absoluto. Misturar bem 
e colocar em gelo (30 min) ou a - 20ºC (10 min) 
para a precipitação do de ácidos nucleicos
9 - centrifugar durante 10 min a 4ºC para 
sedimentar o DNA e o RNA. Rejeitar o sobrenadante
10 - lavar o sedimento com 1 ml de etanol a 70%, centrifugar de novo durante 5 a 
10 min e rejeitar o sobrenadante
11 - deixar secar o sedimento à temperatura 
ambiente (30 min) ou na 
estufa a 37ºC (15 min)
12 - ressuspender o sedimento em 20 µl de 
TE ou água destilada estéril 
e conservar a -20ºC
51
- a electroforese em gel de agarose é 
uma técnica que permite determinar o 
tamanho de um DNA ou dos seus 
fragmentos, depois de este ser 
digerido com uma ou mais enzimas de 
restrição 
- a electroforese permite separar os 
fragmentos de DNA com base no seu 
peso molecular, apenas quando estes 
estão na forma linear
- as moléculas de DNA que estão na 
forma super-enrolada ou na forma 
relaxada têm uma migração no gel 
que não corresponde ao 
verdadeiro peso molecular, ou seja, 
ao número de bp que possuem
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
T4 - análise electroforética de DNA digerido 
com enzimas de restrição
superenrolada 
linear
relaxada 
52
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- a agarose é um composto que depois de dissolvido a alta temperatura em 
tampão apropriado, tampão TAE (Tris-HCl, Acetato, EDTA), forma após 
arrefecimento um polímero (gel) em que a porosidade depende da 
concentração de agarose usada
- quanto mais elevada for a concentração
em agarose, menos poroso será o gel
e, consequentemente, maior resistência
será exercida sobre as moléculas de DNA
- a % de agarose para fazer o gel permite definir 
intervalos de separação de moléculas de 
DNA, tendo por base o 
seu tamanho expresso 
em pares de 
nucleotídeos ou 
pares de bases (bp)
T4 - análise electroforética de DNA digerido 
com enzimas de restrição
53
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
T4 - análise electroforética de DNA digerido 
com enzimas de restrição
- a separação de fragmentos de DNA em gel de agarose requer:
* a dissolução da agarose e posterior seu arrefecimento (45ºC) 
para se poder adicionar o brometo de etídio
* um molde que determina a forma do gel
* um pente que permite a formação 
de poços no gel de agarose, 
de forma a que a amostra de
DNA possa ser aplicada
* uma tina de electroforese que contem o tampão de corrida (1xTAE) e onde 
se mergulha o gel
* uma fonte que permite a aplicação de um campo eléctrico (30 a 100 volts) 
para separar os fragmentos de DNA através da migração do pólo (-), onde 
se aplica a amostra, para o pólo (+)
* a utilização de marcadores de peso molecular, uma vez que a distância de 
migração depende do tamanho do DNA
54
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
T4 - análise electroforética de DNA digerido 
com enzimas de restrição
- brometo de etídio
* composto que vai interagir com o DNA intercalando-se entre as bases do 
DNA
* a adição de brometo de etídio à agarose dissolvida permite a visualização do 
DNA uma vez que este composto emite fluorescência quando exposto à 
luz ultravioleta (300 nm)
* é um composto altamente 
cancerígeno, evitar
qualquer contacto com a pele
* manusear o gel sempre 
com luvas 55
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
T4 - análise electroforética de DNA digerido 
com enzimas de restrição
- transiluminador
* emite raios UV de alta intensidade aos quais tanto a pele como a 
retina são extremamente susceptíveis
* nunca expor qualquer parte das mãos ou da cara à luz que é emitida
* usar luvas e o visor de protecção ocular
56
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• curva de calibração
Kb
10
8
2
1
6
5
4
0,3
0,1
57
5
8
• EBR Genética Molecular - FFUP • cu
rva d
e calib
ração
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- a quantificação do DNA a ser digerido ou das bandas 
resultantes da sua digestão pode ser feita por:
* método espetofotométrico 
* por estimativa em gel de agarose
(por comparação com um DNA padrão)
- a quantificação do DNA e do RNA é feita 
no comprimento de onda de 260 nm (U.V.)
- a razão das densidade óptica a 260 nm 
e 280 nm (OD260/OD280) fornece uma 
estimativa do grau de pureza do ácido 
nucleico
• quantificação de ácidos nucleicos
Large DNA fragments
Small DNA fragments 59
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
• quantificação de ácidos nucleicos
- nas preparações puras de DNA o valor do quociente OD260/OD280 é maior ou 
igual a 1,8 e menor ou igual a 2,0
- para o RNA este quociente é igual 2 
- contaminações resultantes da
presença de fenol ou de proteínas 
diminuem significativamente 
a razão OD260/OD280
- a concentração do DNA de cadeia dupla (cd), do DNA de cadeia simples (cs) e 
do RNA de cadeia simples (cs) é feita a 260 nm e as unidades de conversão 
são as seguintes:
1 unidade de A260 de DNAcd = 50 µg/ml
1 unidade de A260 de DNAcs = 33 µg/ml
1 unidade de A260 de RNAcs = 40 µg/ml
DNA Absorption Spectra
60
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
- comparação com os vários fragmentos resultantes da digestão do fago λ com 
a enzima HindIII e a concentração dos mesmos, por estimativa, após a 
aplicação de 2 µg de DNA de λ-HindIII
Tamanho dos fragmentos 
do λ-HindIII (kb) e respectiva 
concentração (µg)
λ-HindIII [DNA]/banda
23,130 kb 0,950 µg
9,416 kb 0,400 µg
6,557 kb 0,270 µg
4.371 kb 0,185 µg
2,322 kb 0,090 µg
2,027 kb 0,080 µg
0,564 kb 0,020 µg
0,125 kb 0,005 µg
% Agarose Separação (bp)
0,3 60.000 - 5.000
0,6 20.000 - 1.000
0,7 10.000 - 800
0,9 7.000 - 500
1,2 6.000 - 400
1,5 4.000 - 200
2,0 3.000 - 100
61
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
T4c - elaboração de um mapa de restrição de um 
plasmídeo recombinante
- é feita à custa da digestão do plasmídeo com enzimas de restrição
- podem efectuar-se cortes simples (uma enzima de restrição), duplos (duas 
enzimas de restrição) ou múltiplos (várias enzimas) 
- o tamanho dos fragmentos obtidos é determinada por comparação da sua 
migração em gel de agarose (ou de poliacrilamida) com um DNA padrão cujo 
tamanho dos fragmentos é conhecido (λ-HindIII)
- fotografar o gel, fazer a curva padrão e determinar o tamanho de cada 
fragmento obtido
- construir o mapa de restrição do plasmídeo recombinante
62
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
1 - digerir 2 µg de DNA plasmídico seguindo a ordem indicada:
DNA 2 µl
Tampão da enzima (10x) 2 µl 
H2O destilada 15 µl
Enzima (*) 1 µl
Volume final 20 µl
(*) As enzimas de restrição são altamente susceptíveis à desnaturaçãoquando 
expostas a temperaturas superiores a -20ºC ou ao ar. Por estes motivos, a 
enzima depois de retirada do congelador deve ser conservada em gelo e 
a sua adição à mistura da reacção deve ser feita no fim
2 - incubar a mistura de digestão, depois de centrifugada, a 37ºC, 1h
3 - adicionar a cada tubo 5 µl do tampão da amostra e centrifugar
4 - noutro eppendorf colocar 1 µl de DNA plasmídico não digerido e adicionar 5µl 
de tampão da amostra
5 - deixar os tubos em gelo enquanto não se aplicam as amostras no gel de 
electroforese
T4a - Digestão de DNA plasmídico
63
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
T4b - análise electroforética de DNA digerido 
com enzimas de restrição
64
T4c - elaboração 
de um mapa 
de restrição 
de um 
plasmídeo 
recombinante
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
65
* permite a amplificação de pequenas sequências conhecidas de DNA, a 
partir de dois primers ou iniciadores 
* pequenas quantidades de DNA (< 1µg)
* dois “primers” 
* magnésio, desoxinucleótidos
* Taq DNA polimerase
* banho programável: - desnaturação (94º- 5’)
- ligação dos “primers” (30º a 65º- 30’’) 
- síntese de DNA (72º- 3’ a 4’)
- controlos (+) e (-)
- ciclos repetidos (até 60)
PCR (Polymerase Chain Reaction ou reação de polimerização em cadeia)
• 
E
B
R
 G
en
ét
ic
a 
M
o
le
cu
la
r 
-
F
F
U
P
 
Mg2+
66
P
C
R
• EBR Genética Molecular - FFUP 
6
7