AP1 - IMUNULOGIA

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●ROTEIRO DE 
ATIVIDADE PRESENCIAL 
01 - ALUNO 
Disciplina: Imunologia Clínica 
Unidades Temáticas do Material Didático: aulas: 03, 04 – Unidade I; aulas: 02, 03, 
05, 07 – Unidade II 
Professor: Everton Padilha 
1. Atividade: Práticas de imunocromatografia e testes de floculação, com 
diluição seriada para titulação. 
2. Conteúdos: 
1º dia: Dengue: imunocromatografia de antígenos e anticorpos; VDRL- 
Sífilis: teste de floculação; β-HCG: imunocromatografia. 
2º dia: RPR-Sífilis: teste de floculação; Rubéola: Imunocromatografia; 
3. Objetivo da atividade: desenvolver a prática no diagnóstico 
imunocromatográfico (teste rápido) e aprimorar a capacidade do 
diagnóstico correto ou estágio da doença como a sífilis, Rubéola ou 
dengue. 
4. Importância do Conteúdo: O aluno conseguirá diferenciar testes 
positivos de negativos ou não reagentes para o teste de gravidez. 
Identificar com acurácia a titulação para acompanhamento da sífilis. 
Identificar a fase da doença no caso de anticorpos e antígeno para 
Dengue. Identificar a presença de anticorpos contra Rubéola e nortear 
sobre a fase da doença (principalmente em gestantes). 
5. Contextualização e preparação para o estudo: 
Dengue: Atualmente, os testes rápidos se tornaram uma forma segura 
para o diagnóstico da infecção primária e secundária da Dengue, pois as 
informações obtidas estão associadas à resposta imune e são 
essenciais para a tomada de conduta do paciente. A produção de IgM 
ocorre por volta do 5° ao 8° dia a partir do aparecimento dos sintomas, 
persistindo geralmente por 30 a 60 dias, podendo, em alguns casos, 
estar presente por meses; seu aparecimento indica uma infecção recente 
ou fase aguda da doença. Já a produção de IgG ocorre por volta do 14° 
dia, podendo persistir por toda a vida e caracteriza uma infecção 
pregressa. Como a infecção por um subtipo não confere imunidade aos 
demais subtipos, podem ocorrer reinfecção ou infecção secundária, com 
aumento de IgG específica após 1 a 2 dias do aparecimento dos 
sintomas e surgimento de IgM específica mais tardiamente. PRINCÍPIO 
DO MÈTODO: Quando imunoglobulinas específicas da Dengue, IgG e/ou 
IgM, estão presentes na amostra, elas ligam-se aos antígenos 
recombinantes (DEN-1, DEN-2, DEN-3 ou DEN-4) do envelope viral 
conjugados com ouro coloidal. Esta reação forma um complexo 
antígeno-anticorpo que migra por capilaridade pela membrana da placa-
teste e são capturados por anti-IgG e/ou anti-IgM humanas imobilizadas 
em duas áreas distintas, determinando o surgimento de uma banda rosa 
característica nas áreas correspondentes. Se a amostra não contiver 
anticorpos anti-Dengue, nenhuma banda colorida aparecerá nas 
respectivas áreas. Um reagente controle imobilizado na membrana da 
placa-teste determinará o surgimento de uma terceira banda rosa, cuja 
presença demonstrará que os reagentes estão funcionando 
corretamente (área controle “C”). 
β-HCG: A detecção imunológica do hormônio gondotrofina coriônica (β-
HCG) é universalmente reconhecida como um teste diagnóstico da 
gravidez. A gonadotrofina coriônica é um hormônio glicoprotéico, com 
peso molecular de aproximadamente 37 kd, produzido pelas células 
trofoblásticas da placenta durante a gravidez. Ele é composto de 2 
cadeias diferentes, designadas alfa e beta; sendo a alfa idêntica físico-
química e imunologicamente à molécula de LH, enquanto a fração beta 
se diferencia desta por possuir 30 aminoácidos no carboxi terminal, não 
presentes na LH. O HCG é secretado 
6 a 8 dias após a concepção, aumentando rapidamente até um pico de 
50.000 a 200.000mUI/ml na 6 a 8 semana. 
O VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) e o RPR (Rapid 
Plasma Reagin) são testes sorológicos para sífilis classificados como 
não treponêmicos, usados mais comumente para a triagem, ou 
acompanhamento da doença: 
O RPR é um teste de floculação, não treponêmico, para 
diagnóstico da sífilis, através da pesquisa de anticorpos (reaginas) no 
soro ou plasma. É uma forma modificada do clássico. Ele contém 
partículas de carvão, possibilitando a leitura visual dos resultados e 
evitando-se a necessidade de utilização do microscópio. O teste pode 
ser realizado em soro ou plasma inativados ou não. 
O VDRL é um teste de floculação, não treponêmico, para 
diagnóstico da sífilis, através da pesquisa de anticorpos (reaginas) no 
soro, plasma, Líquido Céfalo- Raquidiano (LCR). A interação de 
anticorpos contra cardiolipina e colesterol indicam a presença da 
infecção por T. pallidum (acima da diluição de 1/8). 
Rubéola: Durante uma infecção aguda com o vírus da Rubéola, os 
anticorpos IgM podem ser detectados 3-6 dias após o início dos 
sintomas e geralmente diminuem para níveis não detectáveis dentro de 
12-14 semanas. Os anticorpos IgG podem ser detectados no espaço de 
2-3 semanas após a infecção e os níveis podem aumentar durante a 
fase aguda da doença para valores acima de 200 UI/mL. A imunidade 
contra uma infecção pelo vírus da Rubéola é indicada por um nível de 
IgG maior ou igual a 10 
-15 UI/mL. Contudo, a presença de IgG anti-rubéola maior ou igual a 10 
-15 UI/mL não assegura necessariamente proteção contra uma futura 
infecção pelo vírus da Rubéola. Uma paciente com anticorpos IgG anti-
rubéola abaixo dos níveis de proteção (<10 -15 UI/mL) é considerado 
como estando em risco de contrair uma infecção pelo vírus da Rubéola 
durante a gravidez. Este teste permite a diferenciação de uma elevada 
titulação de IgG anti-rubéola (>250 UI/mL) de uma baixa titulação de IgG 
anti-rubéola (>15 UI/mL e <250 UI/mL). 
6. Descrição da atividade: 
1º dia: DENGUE, β-HCG e 
VDRL 
Para o teste de Dengue: Usar soros ou plasmas obtidos com EDTA, 
Citrato de sódio e Heparina, livres de hemólise, lipemia e contaminação. 
Recomenda-se usar amostras frescas. Se isto não for possível, as 
amostras devem ser conservadas em geladeira entre 2-8 ºC por 1 
semana. Para longos períodos devem ser mantidas no freezer a –20ºC. 
Atenção: Se a amostra for mantida no freezer, ela deverá ser descongelada e 
homogeneizada completamente, mantendo-a, posteriormente, em posição 
vertical para permitir que qualquer partícula que possa existir em suspensão 
seja sedimentada. Não agitar a amostra. Amostra diluída pode ocasionar 
resultado falso-negativo. 
Procedimento 
Placa-Teste 
1.Deixe a placa-teste, amostras e solução diluente atingirem a temperatura 
ambiente, caso estejam armazenadas em geladeira, antes de realizar o 
teste. 
2.Remova a placa-teste da embalagem e use imediatamente. 
3.Coloque a placa-teste em uma superfície plana e seca. 
4.Adicionar 5µL da amostra no espaço destinado para esta (figura 1). 
5.Adicionar 3 gotas (90µL) da solução diluente no orifício destinado para esta. 
6.Fazer a leitura dos resultados entre 20 e 25 minutos. Não considerar 
resultados lidos após 25 minutos. 
Figura 1: local de adicionar a amostra e a solução diluente para o teste de Dengue. 
Interpretação dos resultados 
Negativo: Somente uma banda rosa clara aparecerá na área do controle (C). 
Não foram detectados anticorpos IgG e IgM anti-dengue. Faça um novo teste 
após 3 a 5 dias se ainda ocorrer suspeita de infecção da Dengue (figura 2). 
Figura 2: Teste negativo para Dengue. 
Positivo: para IgM (infecção primária da dengue). Aparecerão duas bandas 
rosa clara, uma na área (2) e outra na área do controle (C) (figura 3). 
Figura 3: Teste positivo para IgM. 
Positivo: para IgG (infecção secundária ou passada da dengue). Aparecerão 
duas bandas rosa clara, uma na área (1) e outra na área do controle (C) (figura 
4). 
Figura 4: Teste positivo para IgG. 
Positivo: para IgG e IgM (infecção primária tardia ou infecção secundária precoce da 
dengue). Aparecerão três bandas rosa clara, uma na área (2), outra na área (1) e outra 
na área do controle 
(C) (figura 5). 
Figura 5: Teste positivo para IgM e para IgG. 
Obs.: Qualquer intensidade de cor rosa nas áreas testes deve ser 
considerada como positivo. 
Inválido: Se não surgir nenhuma banda visível nas áreas (2), (1) e do controle(C), ou se não surgir banda na área do controle (C). Os resultados devem ser 
ignorados após o tempo determinado para leitura (figura 6). 
Figura 6: Teste inválido, mesmo se houver marcação para linha teste. 
Deve-se utilizar uma nova placa teste. 
Para a realização do teste de gravidez (β-HCG) que é imunocromatográfico 
podemos utilizar soro ou urina. 
Usar amostras de soro livre de hemólise, lipemia e contaminação. O soro pode 
ser conservado em geladeira entre 2 a 8ºC por 48 horas. Para armazenagens 
mais longas, deve ser guardado no freezer a -20ºC por até 1 ano. 
Amostras congeladas devem ser descongeladas homogeneizadas e 
trazidas à temperatura ambiente antes de serem testadas. Evitar a formação 
de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto 
causará resultados falsos. 
As amostras de urina devem ser coletadas em recipiente limpo e sem 
conservantes. A amostra ideal para detecção precoce da gravidez é a obtida na 
primeira urina da manhã, uma vez que contém a mais alta concentração de 
HCG. Entretanto, amostras colhidas em qualquer horário podem ser usadas. 
As urinas não testadas imediatamente devem ser conservadas em geladeira 
entre 2 a 8ºC por 24 horas. Para mais que 24 horas, devem ser guardadas no 
freezer. 
Amostras congeladas devem ser descongeladas homogeneizadas e 
trazidas à temperatura ambiente antes de serem testadas. Evitar a formação 
de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto 
causará resultados falsos. 
Procedimento: 
1.Utilizando a tira teste, mergulhar a tira na amostra durante 10 segundos, 
tendo o cuidado de não deixar ultrapassar o limite indicado pelas setas. 
2.Aguardar 5 minutos. Fazer leitura. Obs.: Não considerar resultados lidos após 10 
minutos. 
Resultados das leituras: 
Reação negativa: Apenas a área controle estará 
marcada. Reação positiva: Área controle e a área 
teste estão marcadas. Reação descartada: Quando a 
área controle não estiver marcada. 
TESTE DE VDRL 
Para essa técnica de triagem e/ou acompanhamento da Sífilis é necessário 
ter uma fonte de luz microscópica (pode-se avaliar a olho nu apenas para o 
aprendizado). 
Amostras: Soro, plasma ou Líquido Céfalo-Raquidiano (LCR), livre de 
hemólise, lipemia e contaminação. Em caso de necessidade, as amostras 
podem ser conservadas no máximo por 4 a 6 semanas no freezer à -20°C. Não 
inativar as amostras (não aquecer a elevadas temperaturas). 
Procedimento 
A.Teste Qualitativo 
Objetivo: para triagem e eliminação das amostras não reagentes. 
1.Pipetar 50µl das amostras ou soros controles nas cavidades da placa escavada. 
2.Pipetar 20µl da suspensão antigênica homogeneizada nas mesmas 
cavidades das amostras e soros controles. Não é necessário misturar esses 
dois componentes. 
3.Agitar a placa durante 4 minutos a 180rpm. 
4.Imediatamente após 4 minutos, observar ao microscópio. 
ATENÇÃO: para evitar efeito de pró-zona sugerimos que o teste qualitativo 
seja realizado com a amostra pura (sem diluir) e diluído (1/8). 
Resultados das leituras 
Reação Negativa: Ausência de agregados. Aspecto homogêneo. 
Reação Fracamente Positiva: Presença de pequenos agregados dispersos. 
Reação Positiva: Presença de médios e grandes agregados. 
B.Teste Semi-Quantitativo 
1.Fazer diluição de amostra em solução salina a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, e 
mais se necessário (vide vídeo-aula informativa). 
2.Pipetar 50µl de cada diluição em uma cavidade da placa escavada. 
3. Pipetar 20µl da suspensão antigênica homogeneizada em cada diluição. 
Não é necessário misturar esses dois componentes. 
4.Agitar a placa durante 4 minutos a 180rpm. 
5.Imediatamente após 4 minutos, observar ao microscópio. 
TÍTULO DA AMOSTRA: Será a última diluição onde, ainda, se visualiza a 
presença de agregados. 
2º dia: RPR-SÍFILIS e RUBÉOLA 
RPR-Sífilis: Suspensão antigênica: deixar em temperatura ambiente antes 
de utilizá-la. Homogeneizá-la bem antes de usar. Estável entre 2-8ºC até a data 
do vencimento. . 
Soro controle positivo: pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do 
vencimento. Contém azida sódica 0,095%. Deixar em temperatura ambiente 
antes de usar. 
Soro controle Negativo: pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do 
vencimento. Contém azida sódica 0,095%. Deixar em temperatura ambiente 
antes de usar. 
a.Teste qualitativo: 
Objetivo: para triagem e eliminação das amostras não reagentes. 
1.Pipetar 25 µL de soro ou plasma do paciente em uma área do cartão-teste. 
2.Com uma vareta plástica espalhar a amostra por toda a superfície da área. 
3.Pipetar 25 µL da suspensão antigênica sobre a amostra a ser testada. 
4.Agitar o cartão-teste em agitador automático a 100rpm durante 8 minutos. 
5. Imediatamente após os 8 minutos, observar sob uma boa fonte de luz a 
presença ou não de agregados. 
ATENÇÃO: Para cada série de testes devem ser feitos controles positivo e 
negativo para verificar a correta execução da técnica e o estado de conservação 
dos reagentes. 
RESULTADOS DAS LEITURAS 
Reação Negativa: AUSÊNCIA de agregados. Aspecto acinzentado 
homogêneo. Reação Fracamente Positiva: PRESENÇA de 
pequenos agregados dispersos. Reação Positiva: PRESENÇA de 
médios e grandes agregados. 
b.Teste Semi-Quantitativo 
1.Fazer diluição da amostra em solução salina a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 e mais, se 
necessário (vide vídeo explicativo da aula prática). 
2.Pipetar 25 µL de cada diluição em cada área do cartão-teste. 
3.Com uma vareta plástica, espalhar as várias diluições por toda a superfície da área. 
4.Pipetar 25 µL da suspensão antigênica em cada área. Utilizar uma vareta para cada 
diluição. 
5.Agitar o cartão-teste em agitador automático a 100rpm, durante 8 minutos. 
6. Imediatamente após os 8 minutos, observar sob uma boa fonte de luz, 
a presença de agregados em cada diluição. 
Título da amostra: Será o da última diluição onde, ainda, se visualiza a presença de 
agregados. 
Rubéola: O Rubéola IgG/IgM ECO Teste é um ensaio imunocromatográfico de 
fluxo lateral. O cassete consiste em: 1) uma almofada conjugada de cor 
vermelha que contém os antígenos do vírus da Rubéola conjugados com ouro 
coloidal e um anticorpo de controle conjugado com ouro coloidal. 2) uma tira de 
membrana de nitrocelulose com três linhas de teste (linhas M, G1 e G2) e uma 
linha controle (linha C). A linha M está pré-revestida com anticorpos de rato 
anti-IgM humano para a detecção de IgM contra o vírus da Rubéola. As linhas 
G1 e G2 estão pré- revestidas com anticorpos de rato anti-IgG humano para a 
detecção de diferentes níveis de IgG. A linha C está pré-revestida com um 
anticorpo controle. Quando amostra e tampão diluente são adicionados no 
cassete, a amostra migra por ação capilar através do cassete. Se presente na 
amostra, os anticorpos IgM anti-rubéola irão ligar-se aos conjugados. 
Imunocomplexos são capturados na membrana pelos anticorpos anti-IgM 
humano pré-revestidos, formando uma linha M de cor vermelha, indicando um 
resultado de teste reagente para IgM contra o vírus da Rubéola. Se presente na 
amostra, os anticorpos IgG anti-rubéola irão ligar-se aos conjugados. 
Procedimento: 
1º Passo: Levar a amostra e os componentes do teste para a temperatura 
ambiente, se refrigerados ou congelados. 
2º Passo: Colocar o cassete em uma superfície limpa e plana. 
3º Passo: Coletar 10uL de amostra utilizando a pipeta capilar até a marcação 
da linha preta. Segurando a pipeta capilar verticalmente, dispense toda 
amostra coletada no poço de amostra, certificando-se de que não haja bolhas 
de ar. Imediatamente adicione 2 gotas (cerca de 60-80 µL) de tampão diluente 
com o frasco posicionado verticalmente. 
4º Passo: Cronometrar o tempo. 
5º Passo: Ler o resultado do teste em 10 minutos. Resultados positivos podem 
ser visíveis em até 1 minuto. 
Os resultados negativos devem ser confirmados no final de 15 minutos. 
Qualquer resultado interpretado fora da janela de 10 a 15 minutos deve ser 
considerado inválido e deve ser repetido. 
Descarte os dispositivos usados após interpretar o resultadoseguindo os requisitos 
locais para descarte de material. 
Resultado não reagente: Caso apenas se desenvolva a linha C, o teste indica 
que os níveis de IgM e IgG na amostra estão abaixo dos limites de detecção do 
ensaio. O resultado é não reagente. 
Resultado reagente: Apenas as linhas controle e M estão marcadas (IgM 
Positivo IgG <15 UI/mL). 
Resultado reagente: As linhas controle, M e G1 estão marcadas (IgM 
Positivo IgG 15-250 UI/mL). 
Resultado reagente: Apenas as linhas controle e G1 estão marcadas (IgM 
Negativo IgG 15- 250 UI/mL). 
Resultado reagente: As linhas controle, G1 e G2 estão marcadas (IgM 
Negativo IgG >250 UI/mL). 
Resultado reagente: Todas as linhas estão marcadas (IgM Positivo IgG >250 UI/mL). 
Inválido: Caso não se desenvolva uma linha C, o ensaio é considerado 
inválido independentemente do desenvolvimento de cor em qualquer uma das 
linhas teste (M, G1, G2). Repita o ensaio com um dispositivo novo. 
Questões: 
1ª) Quais os sorotipos de Dengue mais comuns no Brasil? 
R: A dengue apresenta quatro sorotipos em circulação no Brasil: DEN-1, DEN-2, 
DEN-3 e DEN-4. 
2ª) Qual a importância entre detectar antígeno E1 do vírus da Dengue e os anticorpos 
IgG? 
R: A detecção destes anticorpos pode ser útil na diferenciação entre infecções 
primárias e secundárias. A detecção específica do vírus da Dengue por PCR 
pode ser realizada de forma precoce, além de permitir a diferenciação de 
outras infecções transmitidas pelo mesmo vetor (Chikungunya e Zika). 
3ª) Quando podemos encontrar o HCG alterado em homens? 
R: Altos níveis de HCG sugerem a formação de tumores de células 
germinativas, que podem se desenvolver nos testículos, ovários ou região 
retroperitoneal. 
4ª) O que o HCG faz para manter a gravidez? 
R: A função fisiológica do hCG é manter o corpo lúteo durante o início da 
gestação, aproximadamente por 10 semanas, e estimular a produção de 
esteroides. Com isso, impede-se que ocorra a perda do endométrio e haja o 
fim da gravidez. 
5ª) Qual a importância de detectar o VDRL no líquido céfalo-raquidiano? 
R: A presença de uma reação de VDRL reagente em qualquer título é 
considerada como diagnóstico de neurossífilis, sendo esse exame usado, 
habitualmente, como screening. 
6ª) Quando o paciente já foi diagnosticado com Sífilis, por que realizar o 
VDRL? 
R: O teste VDRL também pode ser solicitado pelo médico para acompanhar o 
estado da doença em pacientes com diagnóstico positivo prévio, verificando a 
efetividade do tratamento proposto. 
7ª) Qual a importância de associar o HCG positivo com o VDRL? 
R: Importante para detectar sífilis na gravidez. Deve-se realizar o teste VDRL 
ou RPR no primeiro trimestre da gravidez ou na primeira consulta, e outro no 
início do terceiro trimestre da gravidez (para detectar infecção próximo ao final 
da gestação). 
8ª) Por que analisar o tempo de infecção da Rubéola em pacientes com HCG 
positivo? 
R: A infecção por rubéola na gravidez acarreta inúmeras complicações para a 
mãe, como aborto e natimorto (feto expulso morto) e para os recém-nascidos, 
como malformações congênitas (surdez, malformações cardíacas, lesões 
oculares e outras). 
9ª) Qual a diferença entre o VDRL e o RPR? 
R: O exame de VDRL, que significa “Venereal Disease Research Laboratory”, 
é um exame de sangue que serve para diagnosticar a Sífilis ou Lues, que é 
uma doença sexualmente transmissível. Esse exame serve também para 
acompanhar a doença em pacientes portadores da Sífilis. 
O RPR CORADO (Rapid Plasm Reagin) consiste em uma suspensão de 
VDRL estabilizada e pronta para uso, que emprega como amostra soro não 
inativado ou plasma. A leitura final da prova é a olho nu, dispensando o uso do 
microscópio. 
10ª) Quais doenças podem alterar o VDRL além da sífilis? 
R: A alteração no VDLR pode ocorrer por diversas razões, como no caso de 
portadores de hepatite crônica, hanseníase, doenças autoimunes, algumas 
doenças infecciosas febris (malária, varicela ou sarampo), em casos de 
imunização recente ou após infarto do miocárdio. 
7. Fontes de pesquisa 
ECO diagnóstica, Rubéola IgG/IgM ECO Teste – TR.0028. Edição: 001/2018, 
aprovada em 12/12/2018. 
WAMA Diagnóstica, Imuno-Rápido Dengue IgG/IgM. II Edição: Rev. 01/2016. 
WAMA Diagnóstica, Imuno-Rápido HCG. VI Edição: Rev. 02/2011. 
WAMA Diagnóstica, RPR Sífilis. VI Edição: Rev. 02/2011. 
WAMA Diagnóstica, VDRL/Sífilis. Edição VI Rev.: 08/2021. 
8. Referências bibliográficas 
AVELLEIRA JCR, BOTTINO G. Sífilis: Diagnóstico, tratamento e controle. An 
Bras Dermatol. 2006;81(2):111-26. 
ROSANNA W. PEELING; DAVID MABEY1, MARY L. KAMB, et al. Syphilis. 
Nature, Nº 17073 | Vol 3, 2017 
Sífilis congênita - Pediatria - Manuais MSD edição para profissionais. ©Springer 
Science+Business Media 
OMAR LUPI, CARLOS GUSTAVO CARNEIRO, IVO CASTELO BRANCO 
COELHO. Manifestações mucocutâneas da dengue. An. Bras. Dermatol. 82 
(4), Ago 2007. 
SALAZAR M.I, et al, The role of cell proteins in dengue virus infection, J Prot 
(2014). 
DAS PK, KIELIAN M. Molecular and structural insights into the life cycle of 
rubella virus. J Virol 95:e02349-20, 2021. 
MARGARET HUNT. Rubella (German Measles) Virus, Virology, Cap. 5, 2016.