genétiva unidade 3

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Unidade 3 – Polimorfismo genético, técnicas de análise molecular e investigação de parentesco
Polimorfismo genético
Você já parou para pensar por que, dentro de uma mesma raça, encontramos animais tão diferentes? | pelagens variadas? Por que existem cavalos com tantas pelagens diferentes? Por que existem animais com a cor dos olhos diferentes? Por que existem animais com pele pigmentada e outros com a pele totalmente despigmentada? Por que alguns animais sofrem mais com lesões de pele e outros não? Todas essas perguntas podem ter várias respostas, mas, em geral, conseguimos começar a respondê-las com apenas duas palavras: polimorfismo genético. 
O que seria um polimorfismo? Se pensarmos na origem da palavra, podemos dizer que morfismo se refere a forma ou formato, e poli refere-se a muitos. Dessa forma, podemos entender que um polimorfismo genético é a capacidade genética de assumir diferentes formas. Realmente, essa definição nos ajuda a caracterizar o tema.
O polimorfismo genético, basicamente, é a alteração no DNA de um indivíduo, que origina vários alelos. Agora, você deve estar pensando: mas isso não seria mutação? A mutação também é uma alteração no DNA, então, qual a maior diferença? 
As mutações são alterações no DNA nas quais a frequência na população é menor do que 1%. Já os polimorfismos são alterações no DNA que ocorrem com frequência maior que 1% na população.
É importante destacar que existe outra nomenclatura utilizada para evitar dúvidas entre mutação e polimorfismos: variante alélica. A variante alélica é a nomenclatura adotada para se referir a qualquer alteração que se observe no DNA de um indivíduo quando comparado a um DNA-referência (tanto faz se essa alteração é maior ou menor que 1%).
Essas informações fazem-nos elaborar outra pergunta: por que, então, existem alterações no DNA que são mais frequentes e outras que são menos frequentes? 
Vamos pensar juntos. Se um animal tem uma doença que apresenta sintomas de ferimentos na pele, e, após muitos exames, os médicos veterinários descobrem que essa doença é proveniente de uma alteração no DNA daquele indivíduo, concordam comigo que uma doença de origem genética não tem cura, apenas tratamento e paliativos, para que aquele animal tenha uma vida o mais confortável possível? 
Com isso, esse animal não será selecionado para reprodução, pois os produtores já sabem que ele tem uma doença de origem genética, e não vão correr o risco de passá-la para as próximas gerações, ou, algumas vezes, dependendo da manifestação no fenótipo, o indivíduo tem tantas complicações que nem chega à fase reprodutiva. Por isso, a tendência é a diminuição de frequência da doença na população.
Agora, vamos pensar em outro exemplo: os cavalos de pelagem pampa são animais muito valorizados economicamente, tanto que os cavalos pampas não são considerados raça, pois não são reconhecidos pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) e, mesmo assim, têm uma Associação Brasileira dos Criadores do Cavalo Pampa (ABCPampa), justamente para registrar e valorizar animais de pelagem pampa. 
Na Associação, são realizados testes genéticos para encontrar animais que têm o alelo homozigoto para pelagem pampa. Dessa forma, esses animais são mais selecionados para reprodução e, consequentemente, aumenta-se a frequência dessa alteração genética na população. 
Os polimorfismos, portanto, são alterações no DNA que podem ser benéficas, maléficas ou neutras para o indivíduo. Essas alterações no DNA podem ou não se manifestar no fenótipo. Além disso, os polimorfismos são responsáveis por definir as características únicas de cada indivíduo. No genoma humano, por exemplo, os indivíduos são semelhantes em 99%, e as diferenças que caracterizam especificamente cada ser humano estão nesse 1%, que, basicamente, é relacionado aos polimorfismos genéticos. Devemos ter em mente que os polimorfismos podem gerar:
Alterações que mudam a sequência do DNA, mas não mudam a sequência de proteínas;
· Alterações que mudam a sequência de proteínas, mas não mudam a função da proteína;
· Alterações que geram diferentes proteínas com atividades diferentes;
· Alterações que geram proteínas que não são funcionais.
O polimorfismo genético, então, é a coexistência de alelos múltiplos em um mesmo lócus. Então, qualquer lócus que tenha alelos múltiplos como componentes estáveis na população é um polimorfismo genético.
Os polimorfismos são frequentemente utilizados como marcadores genéticos, pois têm uma posição que pode ser conhecida no genoma. Existem vários tipos de polimorfismos, e vamos aprender os mais estudados e frequentes na população animal.
MICROSSATÉLITES OU STR
O primeiro tipo de polimorfismo que vamos ver são denominados microssatélites ou pequenas regiões repetidas em série: STR (do inglês short tandem repeats). Também podem ser nomeadas pequenas repetições in tandem, ou pelas siglas: SSR (simple sequence repeats), STMS (sequence tagged microsatellites) e SSLP (single sequence length polymorphisms). 
São áreas do genoma com regiões repetidas. Nesse caso, essas regiões têm de um a cinco nucleotídeos repetidos em série. Esses loci em que ocorrem as repetições são denominados, então, STR ou microssatélites.
Para entender melhor os polimorfismos, precisamos entender algumas definições. O genoma é o conjunto de todo o DNA do indivíduo. Os nucleotídeos do DNA são representados por uma base nitrogenada do DNA (guanina, timina, adenina ou citosina), mais o açúcar desoxirribose e um grupo fosfato. No DNA, os nucleotídeos são representados por códons. Cada códon contém três nucleotídeos. 
A nomenclatura lócus é representada pelo local em que um gene se encontra no DNA: é uma região conhecida no genoma. Quando dizemos loci, referimo-nos ao plural de lócus. 
O significado de alelo no polimorfismo, por sua vez, refere-se às diferentes versões de uma sequência de DNA em um lócus específico. 
Os polimorfismos do tipo microssatélites ocorrem devido ao número de vezes em que os nucleotídeos se repetem, e não porque as sequências são repetidas. O número de repetições da sequência de nucleotídeo varia entre os indivíduos da população e podem variar de alelo para alelo em um mesmo gene.
Caso os alelos em um mesmo gene e no cromossomo homólogo tenham o mesmo número de repetições, denomina-se que esses são indivíduos homozigotos para determinada característica. Caso contrário, se os alelos em um mesmo gene apresentarem a sequência repetida em número de vezes diferentes, denomina-se que são indivíduos heterozigotos para determinada característica. 
Por exemplo, um indivíduo (4,4) é homozigoto, pois cada alelo tem o mesmo número de repetições nos cromossomos homólogos, e cada cromossomo apresenta quatro repetições de nucleotídeos que caracterizam um microssatélite. 
Já um indivíduo (3,4) é um heterozigoto, pois tem um número de repetições diferentes: em um alelo há três repetições e, no outro, quatro repetições que caracterizam os microssatélites. Um alelo no cromossomo homólogo é proveniente da influência paterna, e o outro, da influência materna. 
As repetições são denominadas: mononucleotídeos, quando ocorre a repetição de apenas uma base nitrogenada; dinucleotídeos, quando há repetição de duas bases nitrogenadas; trinucleotídeos, quando ocorre a repetição de três nucleotídeos; tetranucleotídeos, quando se repetem quatro nucleotídeos; e assim sucessivamente. 
Figura 1. Exemplo de microssatélites trinucleotídeos em dois alelos do mesmo indivíduo: região de repetição com três bases nitrogenadas (GTA) em cada alelo.
Na Figura 1, vemos que cada indivíduo tem um número de alelos para cada gene. Nesse exemplo, o gene tem dois alelos, sendo a primeira sequência o alelo 1 e a segunda sequência o alelo 2. Na primeira sequência, a região em que há o microssatélite tem o número de repetições igual a três, ou seja, a mesma sequência de nucleotídeos (GTA) se repete três vezes. Já no alelo 2, a sequência GTA repete-se cinco vezes. Nesse exemplo, dizemos que para este gene o indivíduo é heterozigoto, ou seja,um alelo tem três repetições e outro cinco repetições. Caso seja observado o mesmo número de repetições em cada alelo, o denominaríamos homozigoto. 
O número de repetições em cada lócus, normalmente, ocorre devido a erros na replicação do DNA, provavelmente no deslocamento da DNA-polimerase durante a replicação do DNA. As repetições das bases nitrogenadas guanina e adenina são mais frequentes em microssatélites nos mamíferos.
Os microssatélites ocorrerem ao longo de todo o genoma, tanto nos cromossomos autossômicos quanto nos cromossomos sexuais. Normalmente, estão localizados em regiões intergênicas (entre genes) ou regiões itrônicas (íntrons). Essas regiões não são funcionais, ou seja, não codificam proteína e nem sempre são manifestadas no fenótipo. Quando, porém, esse tipo de polimorfismo ocorre em regiões gênicas (éxons), há codificação de proteínas e o polimorfismo é manifestado no fenótipo de forma positiva, negativa ou neutra. 
Como as proteínas são codificadas através dos aminoácidos que constam do código genético, que é degenerado, pode ocorrer que sequências com bases nitrogenadas diferentes deem origem ao mesmo aminoácido. Dessa forma, a proteína final se mantém a mesma, e dizemos que o polimorfismo foi neutro. 
Uma vez que o DNA dos indivíduos da mesma espécie tem a maior parte de semelhança, quando há uma diferença no número de repetições, como os microssatélites, eles são utilizados como marcadores genéticos e auxiliam na identificação de cada indivíduo, de suas linhagens e, também, são utilizados em testes de paternidade. Para essas análises, são observadas as regiões de STR ou microssatélites.
POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP)
O segundo tipo de polimorfismo que vamos aprender é o de nucleotídeo único, ou, como frequentemente é chamado, SNPs. Como o nome já diz, nesse polimorfismo ocorre uma alteração em um único nucleotídeo do DNA. A alteração é visível nas bases nitrogenadas, que podem mudar de adenina para citosina, de guanina para timina e vice-versa. Os SNPs ocorrem em um mesmo lócus.
Os SNPs podem ocorrer em todo o genoma, tanto em regiões intergênicas e intrônicas quanto em regiões exônicas. Os SNPs podem ou não se manifestar no fenótipo. Os SNPs são responsáveis por 80 a 90% da variabilidade genética do DNA nas espécies domésticas.
EXPLICANDO
Qualquer polimorfismo genético ocorre em termos de genótipo, ou seja, as alterações ocorrem no DNA. Quando dizemos fenótipo, referimo-nos à visualização externa do genótipo. O fenótipo é o genótipo expressado mais a influência do ambiente. Inclusive, usa-se uma fórmula no melhoramento genético para descrever essa dependência: fenótipo = genótipo + ambiente. Todas as alterações que ocorrem no genótipo podem ou não ser visíveis no fenótipo, que é o que vemos ao olhar o animal. Tudo depende de se a alteração gerou proteínas diferentes, funcionais ou não funcionais. 
A característica de cor dos olhos, por exemplo, é determinada em um único gene, porém as variações de cores são determinadas por SNPs, ou seja, as alterações que ocorrem em um único nucleotídeo geram diferentes alelos que originam tonalidades de cores diferentes para os olhos. Assim também ocorre para a cor de pele, a metabolização de medicamentos etc. 
Quando pensamos em genes de interesse econômico, como o gene da marcha em equinos (DMRT3), por exemplo, vemos que ele ocorre devido a um SNP no cromossomo 23, no qual acontece a alteração de uma citosina por uma adenina (Andersson et al., 2012, p. 642).
A maioria dos SNPs são dialélicos, ou seja, há alteração em um ou outro alelo do gene. Os SNPs trialélicos podem ocorrer, mas são menos frequentes e visualizados mais em plantas. 
As alterações mais frequentes nos SNPs são as transições de uma purina para outra purina, ou de uma pirimidina para outra pirimidina. As bases nitrogenadas purinas são adeninas e citosinas, e as pirimidinas são citosinas e timinas. As transições entre pirimidinas e purinas podem ocorrer, mas são menos frequentes.
Quando ocorre um SNP no DNA, normalmente, é gerado um alelo correspondente a um par de bases adenina/timina e um outro alelo correspondente ao par de bases guanina/citosina.
Figura 2. Exemplo fictício de SNP. Fonte: NeuroRelief, 2014. Acesso em: 11/12/2020. (Adaptado). 
Observem que, na Figura 2, há três cavalos, ou seja, animais da mesma espécie (Equus caballus), com semelhanças ao longo do DNA. Ao observarmos o mesmo lócus do DNA para os três indivíduos, podemos observar uma diferença em um único nucleotídeo, o que denominamos SNP. Na posição número 4, do primeiro indivíduo, tem-se uma adenina; no segundo indivíduo, uma guanina; e, no terceiro indivíduo, uma timina. Em toda a sequência exposta de bases nitrogenadas há semelhança. Somente na região do quarto nucleotídeo há alteração da base nitrogenada. Esse SNP poderia estar ligado, por exemplo, a diferentes pelagens nos equídeos. A Figura 2 é apenas um exemplo para entendermos melhor como funciona o polimorfismo de nucleotídeo único. 
Assim como nos microssatélites, nos SNPs utilizamos a nomenclatura de alelos homozigotos e heterozigotos, porém o mecanismo é diferente. Quando o indivíduo tem a mesma base nitrogenada no SNP, o classificamos como SNP homozigoto, ou seja, os dois alelos têm o SNP com a mesma base nitrogenada. Já o SNP heterozigoto é caracterizado por um SNP com bases nitrogenadas diferentes em cada alelo. 
Figura 3. Exemplo fictício de SNP homozigoto e SNP heterozigoto.
Observem que, na Figura 3, temos uma sequência de bases nitrogenadas de um alelo-referência e duas sequências dos alelos resultantes, sendo um de origem paterna e outro de origem materna. No SNP homozigoto, reparamos que em um SNP, quando comparado com o alelo-referência, houve alteração da adenina por uma guanina. No entanto, este SNP é igual, tanto no alelo paterno quanto no materno, e por isso que o denominamos SNP homozigoto. Já no exemplo do SNP heterozigoto, também podemos observar um SNP, de uma adenina para uma citosina, porém, este SNP é somente observado no alelo materno, ou seja, o indivíduo tem um alelo paterno com SNP diferente do materno. Dessa forma, o denominamos SNP heterozigoto. 
Os SNPs são, frequentemente, encontrados em várias regiões do genoma e, por isso, são muito utilizados como marcadores genéticos, ou são utilizados como base para outros tipos de marcadores genéticos, principalmente em relação às características com valorização econômica para produção. Além disso, são mais estáveis que os microssatélites, pois têm baixa taxa de mutação. 
Os SNPs são utilizados em testes de paternidade, identificação animal, detecção de doenças genéticas, rastreabilidade de características de produção no genoma, auxílio no diagnóstico de determinadas doenças e na farmacologia, a fim de encontrar os melhores resultados nas respostas aos fármacos.
Caso seja do seu interesse acessar o genoma de alguma espécie animal de produção, saiba que algumas espécies já possuem seu sequenciamento completo, no qual é possível observar os polimorfismos de nucleotídeo único e várias outras informações. Os ovinos, por exemplo, apresentam em torno de 50 mil marcadores de SNPs; suínos têm, aproximadamente, 60 mil SNPs; e equinos, 50 mil SNPs em todo genoma. 
INDEL
O terceiro tipo de polimorfismo que vamos estudar é o INDEL. Esse polimorfismo é caracterizado por pequenas inserções e/ou deleções que podem ocorrer no DNA. Nesse caso, em alguns loci pode existir a inserção de um ou mais nucleotídeos, ou pode existir a deleção de um ou mais nucleotídeos. Os tamanhos dos INDELs variam de uma base nitrogenada a milhões de bases, podendo até ocorrer em grandes regiões do cromossomo. 
O polimorfismo do tipo INDEL, por caracterizar inserções ou deleções de bases nitrogenadas no DNA, acaba influenciando no tamanho do genoma de cada espécie. Dessa forma, esse polimorfismo está diretamente ligado à evolução do tamanho do genoma. 
Os INDELs ocorrem em todo o genoma, e devemos ficar atentos ao tamanho das suas inserções e/ou deleções, pois não podemos esquecer que o DNAé dividido em códons, e cada códon tem uma sequência de três nucleotídeos. Se a inserção ou deleção ocorrer em três bases nitrogenadas ou em algum múltiplo de três, ocorrerá a eliminação ou a adição de aminoácidos, caso isso ocorra em uma região de éxons.
De outra forma, se os INDELs ocorrem em um número diferente de três, e diferente de algum múltiplo de três, a inserção ou a deleção ocasionará uma alteração em toda a cadeia de leitura do DNA e, por isso, serão geradas alterações benéficas ou maléficas no DNA. 
Dessa forma, as inserções e as deleções que ocorrem em regiões de éxons comprometem a sequência de aminoácidos e, consequentemente, a expressão de proteínas. As alterações no DNA com origem de polimorfismo INDEL podem ser ou não expressas no fenótipo. 
Quando a inserção ou deleção ocorre em apenas uma base nitrogenada do nucleotídeo, podemos dizer o polimorfismo também é do tipo SNP.
Figura 4. Exemplo fictício de INDEL.
Observem que, na Figura 4, temos uma sequência de bases nitrogenadas de um alelo-referência e depois exemplos de indivíduos com INDEL. No INDEL 1, observamos o primeiro indivíduo com uma sequência de nucleotídeos na qual houve uma inserção de uma guanina no alelo materno. Essa inserção, por ser de apenas um nucleotídeo, altera toda a sequência de aminoácidos que seriam formados. No INDEL 2, referente ao segundo indivíduo, observamos uma deleção de duas bases nitrogenadas timinas, quando comparado ao alelo-referência. Da mesma forma, a deleção de duas bases nitrogenadas altera toda a sequência de aminoácidos na tradução da síntese proteica. 
Os polimorfismos do tipo INDEL, assim como os microssatélites e o SNP, são utilizados como marcadores genéticos. É mais comum analisar os marcadores com vários tipos de polimorfismos, para facilitar a identificação do indivíduo, de características de interesse e de doenças. Se, por exemplo, um gene que causa uma doença está no marcador com polimorfismo ou próximo de um, é possível identificar a doença e iniciar um tratamento preventivo nas próximas gerações, uma vez que os indivíduos afetados na progênie recebem tanto o marcador quando o gene causador da doença.
Técnicas de análise molecular
Já percebemos que o DNA é o início de tudo. Se queremos tratar doenças de origem genética, precisamos analisar o DNA. Se queremos encontrar polimorfismos para testes genéticos, precisamos analisar o DNA. Se queremos realizar testes de paternidade, promover o melhoramento genético no rebanho, fixar características etc., precisamos analisar o DNA. Não temos para onde fugir: precisamos analisar o DNA. Como fazemos isso? Como, de fato, encontramos os polimorfismos? A resposta para todos esses questionamentos é: pelas técnicas de análise molecular.
As técnicas de análise molecular são técnicas utilizadas para analisar os ácidos nucleicos (tanto o DNA quanto o RNA). Também existe a possibilidade de analisarmos diretamente as proteínas. Para nosso estudo, vamos focar nas análises de DNA, porém os protocolos são semelhantes para outras moléculas. 
Existem várias técnicas de análise molecular, técnicas feitas em laboratórios, umas que utilizam kits comerciais prontos e outras que são formuladas para cada protocolo. Para qualquer tipo de técnica, é necessário, inicialmente, coletar uma amostra do indivíduo que será analisado, para que seja extraído o DNA e se iniciem as análises moleculares.
As coletas das amostras para análise do DNA podem ser feitas de qualquer material biológico de animais vivos, como saliva, sangue, pelo (bulbo capilar), dentes, muco, pele, fezes etc. Também podem ser coletadas de cadáveres e de ossos. As amostras mais frequentes em animais são do pelo e amostras de sangue.
Devemos salientar que, as amostras de pelo (em média um tufo de 30–40 pelos da base da cauda ou da crina), devem conter o bulbo capilar, que é a região onde se encontram as células para extração do DNA. Já nas amostras de sangue, para extração do DNA são utilizadas as células brancas, uma vez que a hemácia é anucleada.
Figura 5. Exemplos de coleta de amostras para extração de DNA. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 11/12/2020.
Na Figura 5a, observamos a coleta de muco em um bezerro. Na Figura 5b, observamos a coleta de saliva com swab em um bezerro. N Figura 5c, observamos a coleta de sangue. Na Figura 5d, podemos ver a coleta de amostras de fezes. É importante destacar que os profissionais qualificados para coleta de amostras precisam estar com equipamento de proteção individual (EPI). As amostras são transferidas para tubos de ensaio e levadas ao laboratório. 
EXTRAÇÃO DO DNA
Após coletados os tecidos de amostra de cada indivíduo, é necessário extrair o DNA da célula amostral. Para extração de DNA, os laboratórios usam kits comerciais ou seguem protocolos baseados na literatura de cada área. No entanto, independentemente do protocolo, existe um padrão de etapas. Inicialmente, é necessário fazer a liberação do complexo DNA-proteínas, através da lise das membranas celulares e nucleares de cada célula. 
Uma célula apresenta os ácidos nucleicos (DNA e RNA), várias proteínas e lipídeos, carboidratos diversos e oligoelementos (cálcio, fosforo, potássio, magnésio, vitaminas). Se queremos extrair o DNA, todos os outros conteúdos da célula, chamados de contaminantes, não interessam para nós. Precisamos descartá-los e isolar o DNA. Por isso, a próxima etapa da extração é a purificação do DNA. Ou seja, ocorre a separação dos constituintes celulares, como lipídeos, carboidratos e proteínas. Com a purificação, ocorre a precipitação do DNA, a lavagem e a ressuspensão da molécula de DNA.
Vamos ver mais a fundo como ocorre a extração do DNA. A primeira etapa da extração, então, é a liberação do complexo DNA-proteína. Essa etapa depende do tipo de amostra que chega ao laboratório. Caso sejam amostras líquidas, como urina, sangue ou sêmen, elas são, inicialmente, centrifugadas, para que haja separação das células nucleadas e se forme o precipitado no tubo de ensaio.
Caso chegue, ao laboratório, uma amostra proveniente de tecidos sólidos, como folhas, músculos, pele ou ossos, é necessário que ela passe por uma etapa inicial de quebra das estruturas rígidas, a fim de que a superfície de contato aumente e promova uma melhor ação dos reagentes das próximas etapas. A etapa de quebra pode ser realizada por picotagem, com uso de tesouras, ou maceração, com pistilo, além do congelamento das amostras com nitrogênio líquido. 
Após a centrifugação ou maceração das amostras, inicia-se o rompimento das células com soluções tamponadas, normalmente contendo um detergente e os reagentes tris-hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno diamino tetra-acético (EDTA). 
As membranas das células são fosfolipídicas e, por isso, o detergente é necessário. Ele atua sobre os lipídeos, levando ao rompimento das membranas e à liberação do conteúdo intracelular. Dessa forma, o DNA vai sendo liberado e, para que não haja a degradação pelas enzimas desoxirribonucleases (DNases), o reagente Tris mantém o pH da solução-tampão estável (próximo a 8,0), o que evita ação das DNases, que atuam em pH 7,8. A ação do EDTA:
Também auxilia na inibição da ação das DNases, por se ligar aos cofatores Ca+2 e Mg+2 da enzima DNase. O NaCl contribui rompendo ligações iônicas das cadeias peptídicas, auxiliando na desnaturação das proteínas e adicionalmente promove a aglomeração das moléculas de DNA (BRUNO, 2017). 
A próxima etapa da extração do DNA é a purificação do DNA. Nessa etapa, ocorre a separação do DNA de outros componentes celulares. Isso é feito por meio da adição de substâncias que tornam a solução heterogênea, fazendo com que o DNA fique dissolvido em apenas uma das fases no tubo de ensaio. Para a purificação, são utilizados solventes orgânicos, como o fenol, clorofórmio ou ambos, que desnaturam proteínas. Também há incorporação de proteinase K, o que facilita a separação do DNA das histonas.
Após a ação dos reagentes, a solução no tubo de ensaio vai para uma centrífuga e, após a centrifugação,o DNA permanece solúvel na fase aquosa (sobrenadante). O sobrenadante é transferido para um novo tubo, separando os ácidos nucleicos (que é o que queremos) de proteínas e demais constituintes celulares presentes na interfase. 
Com essas condições, o resultado é a precipitação do DNA, que forma, na solução, um aglomerado de filamentos esbranquiçados que podem ser capturados com um bastão de vidro ou concentrados no fundo do tubo por centrifugação. Com isso, temos a extração do DNA. 
Finalmente, após a separação completa do DNA no tubo de ensaio, é realizada uma lavagem final do DNA, normalmente feita com etanol 70%, para a remoção dos sais, detergentes e outras impurezas. Após a secagem por evaporação, o DNA é solubilizado em solução-tampão TE (Tris-HCl e EDTA) ou água ultrapura. 
Figura 6. Praticamente todas as etapas da extração do DNA passam por uma centrífuga. Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 11/12/2020.
Na Figura 6, podemos observar uma centrífuga com os eppendorfs. Para extração, também podem ser utilizados tubos de ensaio. Existem vários modelos de centrífugas, e elas permitem a inserção de várias amostras de uma única vez. O objetivo das centrífugas é separar as fases da amostra, como ocorre na extração do DNA. É importante destacar que, em uma rotina de laboratório, é imprescindível que as amostras estejam corretamente identificadas, como podemos observar, também, na Figura 6.
É preciso lembrar que existem protocolos e métodos variados para extração de DNA: métodos de solução salina, kits comerciais, método com fenol/clorofórmio e chelex. Independentemente da técnica utilizada, todos realizam a lise das membranas, para expor o DNA, e a purificação do DNA.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Após a extração do DNA, iniciam-se, de fato, as técnicas de análise molecular, e, para isso, precisamos de uma grande quantidade de sequências de DNA in vitro, que serão analisadas, a fim de que todas as análises possam ser feitas com certa margem de erro. Para isso, a primeira técnica que vamos estudar é a reação em cadeira da polimerase (PCR). 
A PCR é uma técnica que se baseia na amplificação in vitro de uma sequência única e específica de DNA, repetida milhões de vezes. A técnica de PCR pode ser feita a partir de qualquer material biológico, no qual foram feitos os procedimentos de extração de DNA. 
CURIOSIDADE
Você sabe a diferença de in vitro para in vivo? Os testes in vitro são simulações do indivíduo vivo. São ensaios que ocorrem em tecidos e células que estão fora do organismo vivo e são feitos em laboratório. Já os testes in vivo são realizados diretamente em tecidos vivos, ou seja, em um organismo vivo.
A técnica de PCR é utilizada para o diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas e para determinação da variabilidade genética. Ela é muito utilizada na reprodução para sexagem de embriões, estudo da expressão gênica, determinação de linhagens animais, identificação de patógenos e teste de paternidade. 
Para dar início à PCR, colocamos em um tubo de ensaio apropriado o DNA que será amplificado, os primers, os nucleotídeos (dNTPs) e a Taq DNA polimerase. Os primers são sequências de DNA que são sintetizadas para complementarem a sequência de DNA amplificada. Existem vários primers, de diferentes tipos e tamanhos, para cada espécie e característica. 
Os dNTPs são os nucleotídeos com as bases nitrogenadas do DNA: adenina, citosina, timina e guanina; e a Taq DNA polimerase é a enzima que auxilia na extensão da cadeia complementar de DNA. Lembrem-se de que o objetivo da PCR é amplificar a sequência de DNA em milhões de vezes, por isso faz sentido haver todos esses elementos no tubo de ensaio. A reação de PCR depende de um gradiente de temperatura para ocorrer. Podemos dividi-la em três etapas: 
Iniciação e Desnaturação - Ocorre a desnaturação da dupla fita do DNA, o que é realizado pelo aumento da temperatura a 95 °C, de 20 a 30 segundos. O aumento da temperatura leva ao rompimento das pontes de hidrogênio e o DNA fica em fita simples;
Anelamento dos Primes - Feito com ligação dos primers às sequencias complementares à fita de DNA (que está aberta). Ocorre em temperaturas que variam de 50 °C a 63 °C, por 20 a 40 segundos. Vale ressaltar que cada primer tem uma temperatura ótima;
Extensão - Nessa etapa, a Taq polimerase auxilia na introdução dos nucleotídeos que vão complementar a cadeia que está sendo sintetizada. Ocorre em temperaturas de 72 °C a 80 °C, que é uma temperatura ótima para a Taq polimerase. Nessa etapa, a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA complementar à cadeia inicial de DNA, por adição dos dNTPs livres. 
Dessa maneira, cada ciclo de uma PCR engloba esses três passos de mudança de temperatura. Em média, um PCR normal tem por volta de 36 ciclos e, em cada ciclo, tem-se a amplificação exponencial da sequência de DNA. Ao final, por exemplo, do primeiro ciclo de PCR tem-se duas moléculas de DNA; ao final do segundo ciclo, tem-se quatro moléculas de DNA; ao final do terceiro ciclo, tem-se oito moléculas de DNA, e assim sucessivamente de forma exponencial. Ao final de 36 ciclos, tem-se bilhões de cópias de DNA que podem ser analisadas no laboratório. 
A técnica completa de PCR é feita por um equipamento denominado termociclador ou máquina de PCR, no qual as amostras são processadas. As amostras podem ser processadas em tubos individuais ou em placas que permitem mais tubos (em torno de 96 tubos de ensaios ou eppendorfs). O termociclador tem como função principal elevar e diminuir a temperatura para que possam ocorrer as três etapas em cada ciclo da PCR. As temperaturas são controladas previamente pelo pesquisador. 
Figura 7. A técnica de PCR é realizada em um equipamento chamado termociclador. Fonte: Shutterstock. Acesso em: 11/12/2020.
Existem vários tipos e modelos de atermocicladores, mas o seu objetivo sempre é controlar as três temperaturas, equivalentes às etapas da PCR. Na Figura 7a, podemos observar o termociclador, com um painel para controlar a temperatura. Na Figura 7b, observamos os eppendorfs, com a amostra de DNA a ser amplificada mais os primers, os nucleotídeos (dNTPs) e a Taq DNA polimerase.
ELETROFORESE
Os produtos provenientes da PCR são visualizados em laboratório pela técnica de géis de eletroforese. A eletroforese é um método de separação dos fragmentos (DNA) que visa à mobilidade desses fragmentos ao longo de um gel conforme é aplicada uma corrente elétrica. A eletroforese ocorre em uma cuba horizontal ou vertical, e ambas têm um poço no qual é pipetada a amostra e um espaço para que o gel se estabilize. 
Para iniciar a técnica de eletroforese, é adicionada uma solução-tampão à amostra de DNA. A solução-tampão contém um corante para auxiliar na visualização da corrida da amostra na cuba da eletroforese. Além disso, é adicionado um açúcar (como o glicerol) para aumentar a densidade da amostra, para que ela permaneça no fundo de cada poço de aplicação.
A cuba de eletroforese, por possuir carga elétrica, é dividida em um polo negativo e um polo positivo. O DNA, por ter carga negativa, migra ao longo do gel para o eletrodo positivo da eletroforese. Dessa forma, os fragmentos do DNA são separados de acordo com o tamanho: os fragmentos mais leves correm na frente, e os fragmentos mais pesados e maiores ficam mais atrás, perto de onde se iniciou a corrida do DNA.
Os géis para corrida do DNA podem ser de dois tipos: agarose (polissacarídeo natural) ou poliacrilamida (matriz sintética). A maior diferença entre os dois é na visualização do gel pronto. No gel de poliacrilamida, a visualização é feita por meio da coloração pelo nitrato de prata, enquanto, na agarose, a visualização do resultado é pela incorporação de um corante intercalado, chamado brometo de etídio. Esse corante é intercalado na molécula de DNA, e a visualização é por uma luz ultravioleta. 
Para o processamento do gel de agarose basta adicionar o tampão à agarose aquecida sobre a base da cuba de eletroforese. Antes de endurecer o gel, adiciona-se o pente, para formar os poços onde serãopipetadas a amostra. Após 15 a 20 minutos, o gel endurece e já podem ser pipetadas as amostras em cada poço. Ao final do carregamento das amostras, a base da cuba é adaptada à fonte de energia, que fará com que o DNA corra do polo negativo para o polo positivo.
 Figura 8. Momento de aplicação da amostra em cada poço no gel, dentro da cuba de eletroforese. Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 12/11/2020.
Na Figura 8a, observamos a cuba horizontal de eletroforese, já com a placa de gel aplicada e pronta para aplicação da amostra. N Figura 8b, observamos mais de perto os poços e, em azul, as amostras já pipetadas. Após pipetar todos os poços, é colocada a tampa da cuba com a corrente elétrica. 
Após o término da corrida da amostra de DNA, é feita a visualização do gel, por um equipamento denominado fotodocumentador. No fotodocumentador, é possível observar os fragmentos de DNA separados de acordo com o tamanho.
Figura 9. Visualização da corrida dos fragmentos de DNA. Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 12/11/2020. (Adaptado).
Na Figura 9a, é possível observar o gel sendo lido pelo fotodocumentador. Na Figura 9b, é possível observar o resultado dos fragmentos de DNA, que foram pipetados nos poços (indicados pela seta laranja). Os fragmentos mais leves foram os que correram na frente, e os mais pesados ficaram mais próximos dos poços, de onde se iniciou a corrida do DNA. 
SEQUENCIAMENTO
Já vimos como coletar o DNA, como extraí-lo e como amplificá-lo, mas como fazemos para realmente identificar a sequência de bases nitrogenadas? Por meio do sequenciamento. A técnica molecular de sequenciamento é a técnica que determina a ordem precisa de nucleotídeos dentro de uma molécula de DNA.
O sequenciamento pode ser feito de uma sequência específica ou em todo o genoma do indivíduo. O sequenciamento gera informações que auxiliam na identificação de polimorfismos responsáveis, por exemplo, pelas doenças hereditárias. Dessa forma, os pesquisadores conseguem desvendar o mecanismo molecular das doenças por meio de técnicas moleculares. 
Existem, basicamente, três formas de se realizar o sequenciamento. Os sequenciamentos de 1ª geração são baseados nos trabalhos de Maxam e Gilbert (1977) e de Sanger, Nicklen e Coulson (1977), e são denominados semiautomáticos.
O sequenciamento de 1ª geração foi aperfeiçoado por Smith e colaboradores, 1985, e não são mais utilizados compostos radioativos prejudiciais à saúde humana no procedimento. Além disso, houve a adição de corantes aos nucleotídeos que emitem fluorescência quando excitados em um comprimento de onda específico.
Existem, também, os sequenciamentos de 2ª e 3ª geração, que são os denominados NGS (sequenciamento de nova geração), os sequenciamentos automatizados. No sequenciamento automatizado, os géis foram substituídos por finíssimos capilares, nos quais os fragmentos de DNA são separados em altíssima velocidade. É possível sequenciar 96 fragmentos de DNA em um intervalo de uma a três horas. 
De qualquer forma, para a técnica ser realizada, é necessário fazer a reação de sequenciamento, que é semelhante à PCR. Para o sequenciamento, é colocado no tubo de ensaio o DNA, os nucleotídeos dNTPs, os primers e a Taq DNA polimerase. Além disso, é necessário acrescentar os nucleotídeos ddNTPs (que são nucleotídeos A, C, T e G, quimicamente modificados) marcados com fluorocromos de cores diferentes.
A diferença de um nucleotídeo quimicamente modificado para um normal é que no nucleotídeo normal há um terminal hidroxila no carbono-3, que permite que um novo nucleotídeo seja inserido para formação da cadeia peptídica. Já no nucleotídeo quimicamente modificado, não há o terminal hidroxila, não sendo possível a inserção de um novo nucleotídeo. 
Portanto, o que ocorre na reação do sequenciamento (dentro do termociclador) é que a sequência complementar vai sendo construída a partir da sequência-molde com a inserção dos nucleotídeos normais. À medida que um ddNTP é incorporado, ele bloqueia a continuação da complementariedade da cadeia, ou seja, o sequenciamento para nesse nucleotídeo químico marcado que foi incorporado. O ddNTP funciona como uma parada da inserção da sequência complementar. 
Dessa forma, é feita a reação de sequenciamento. O ddNTP trava uma sequência, e inicia-se outra, até ser feito o sequenciamento de todo do genoma. Ao final da reação do sequenciamento do genoma, há milhões de fragmentos de tamanhos distintos, cujo último nucleotídeo (modificado) é marcado difere de um fragmento para o outro.
Após o produto do sequenciamento sair do termociclador, no sequenciamento de 2ª e 3ª geração, esse produto é colocado dentro do sequenciador automático de DNA. Nesse equipamento, ocorre uma eletroforese capilar, cuja propriedade é semelhante à eletroforese realizada em gel (ou seja, os fragmentos são separados de acordo com a diferença de tamanho). Entretanto, no caso da eletroforese capilar, conforme os fragmentos passam por um laser, há uma excitação do fluorocromo, que emite um comprimento de onda correspondente à cor marcada que, por sua vez, é traduzida pelo sequenciador na base correspondente. 
À medida que todos os fragmentos passam pelo leitor a laser, vão sendo completadas e traduzidas todas as sequências de nucleotídeos específicas daquele fragmento. O resultado do sequenciamento é a tradução do equipamento, do comprimento de onda, correspondente a cada uma das bases nitrogenadas marcadas com cores diferentes. Graficamente, são picos de diferentes cores que correspondem aos diferentes nucleotídeos marcados com cores diferentes, representando, então, a sequência completa do fragmento inicialmente sequenciado.
Figura 10. Exemplo de um eletroferograma. Fonte: Adobe Stock. Acesso em: 11/12/2020.
Na Figura 10, podemos observar os picos que são lidos pelo sequenciador automático do DNA. Os picos em vermelho correspondem à base nitrogenada timina, os picos em preto correspondem à guanina, os em azul correspondem à citosina e os em verde correspondem à adenina. As cores dos picos correspondentes a cada base nitrogenada são padronizadas. A partir do sequenciamento, é possível verificar a ordem nos nucleotídeos e verificar alguns polimorfismos.
Investigação de parentesco
Com aumento da produtividade na agropecuária, os produtores começaram a buscar técnicas que auxiliassem no melhoramento genético do rebanho, e não somente em grandes rebanhos bovinos, mas na equideocultura, caprinocultura, ovinocultura, avicultura, cinotecnia etc. A busca pelos famosos animais com pedigree tornou-se um selo de qualidade para os animais. Nos leilões, por exemplo, os animais são anunciados por seus valores de produção, morfologia e pelo pedigree. 
Tanto a avaliação do pedigree, no qual se analisa a descendência do indivíduo, quanto os testes de progênie, nos quais se analisam os produtos gerados pelo indivíduo, são realizados por meio da investigação de parentesco. 
A investigação de parentesco, justamente como o nome indica, é uma análise que enumera o quanto os indivíduos são parentes. O que são indivíduos parentes? Dizemos que os animais são parentes quando têm um ou mais ancestrais comuns. Dessa forma, os indivíduos parentes possuem uma proporção adicional de genes idênticos devido à ascendência comum. Não podemos esquecer que os indivíduos de uma mesma espécie já possuem genes semelhantes, independentemente de serem parentes ou não. Na prática, como é utilizada a investigação de parentesco?
Equinos que são campeões, de exposição, de morfologia, de corridas e de salto; bovinos que possuem alta de produção de leite e de rendimento de carcaça; linhagens de caprinos com alta produção de leite; cachorros de raça etc., em todos esses casos, os consumidores, produtores, tutores e proprietários querem, cada vez mais, comprar animais que tenham genética boa. 
É comum ouvir esse termo no campo, o que na verdade significa animais que têm algum grau de parentesco com os animais de alta produção, para que categoria for. Para isso, são feitas as investigações de parentesco, pois quanto mais os indivíduossão geneticamente parecidos com os animais de referência e de alta produtividade, existe uma maior probabilidade de o animal que está sendo testado apresentar as mesmas características do indivíduo-referência. 
DICA
Como pesquisadores e profissionais da área, devemos ficar atentos à probabilidade. Qualquer característica fenotípica é influenciada pelo genótipo e pelo ambiente (fenótipo = genótipo + ambiente). Dessa forma, mesmo um animal que tem genética conhecida e favorável à produção específica, só manifestará essa característica no fenótipo se o ambiente for favorável. Devemos manter o equilíbrio entre genética e ambiente: não basta apenas investir na genética e não investir no ambiente. 
A identificação do parentesco pode ser feita por meio de pedigrees, marcadores como grupos sanguíneos e polimorfismos de DNA. Para minimizar os erros, o uso de testes genéticos como a avaliação de vários tipos de polimorfismos é mais seguro. As técnicas mais comumente utilizadas para avaliação de parentesco pelos polimorfismos são as técnicas de PCR, sequenciamento e eletroforese.
Para selecionar os indivíduos para reprodução, com objetivo de realizar um melhoramento genético na prole, deve-se tomar as decisões pelo grau de parentesco, endogamia e exogamia e, se possível, pelos testes genéticos.
GRAU DE PARENTESCO
O grau de parentesco é a identificação do quanto aqueles indivíduos são parentes, ou seja, o quanto possuem de ancestrais comuns e o quanto são semelhantes geneticamente. Para calcular o grau de parentesco, usamos a representação Rxy, sendo x e y a representatividade de dois indivíduos diferentes. 
Por exemplo, R1,2 = grau de parentesco entre o indivíduo 1 e o indivíduo 2. O grau de parentesco varia de 0% a 100%. Se Rxy = 0, significa que x e y não possuem ancestrais comuns, e não são parentes. Se Rxy = 100, significa que x e y são gêmeos idênticos. Se 0 < Rxy < 100, significa que x e y possuem Rxy dos genes idênticos a mais do que a média da população devido ao fato de possuírem um ou mais ancestrais comuns.
Segue o exemplo (Figura 11):
Figura 11. Exemplo 1 de heredograma.
Nesse exemplo de heredograma (Figura 11), temos os indivíduos B, C e D, considerados em uma reprodução (B com C e B com D). Do cruzamento de B com C, tem-se o produto M, e do cruzamento B com D, tem-se o produto N. Podemos observar que M e N são meio-irmãos, pois têm um dos pais em comum (B).
Para se calcular grau de parentesco em pedigrees, utiliza-se o método de passagem ou o método tabular, este último utilizado para heredogramas maiores. 
No método de passagem, deve se contar o número de caminhos (setas) que ligam os indivíduos ao ancestral comum. Cada caminho ou seta, representa ½ ou 50%, pois somente metade do material genético é transmitido de pai para filho. 
Para se calcular o grau de parentesco pelo método de passagem, utiliza-se a fórmula da Equação (2) (Wright, 1922): 
Em que:
· bullet
n é o número de passagens gênicas (setas) entre os indivíduos x e o ascendente comum;
· bullet
n’ é o número de passagens gênicas (setas) entre o ascendente comum e o indivíduo y.
Sempre analisem o heredograma de baixo para cima e da esquerda para direita. Outra dica é sublinhar o ancestral comum, para não se perder. Observem o exemplo (Figura 12):
Figura 12. Exemplo 2 de heredograma.
Podemos dizer que os indivíduos P e Q possuem 25% dos genes idênticos a mais do que a média da população, devido ao fato de possuírem um ancestral comum (M).
ENDOGAMIA
Para que se realizem cruzamentos no rebanho com base na identificação de parentesco, deve-se levar em consideração o coeficiente de endogamia. A endogamia é o acasalamento entre indivíduos que apresentam maior parentesco entre si do que a média de parentesco da população geral. 
Como a endogamia é influenciada pelo tamanho populacional, esse parâmetro está relacionado ao número de animais que contribuem para a variabilidade genética daquela população. Dessa forma, o tamanho efetivo da população é inversamente proporcional ao coeficiente de endogamia. Então, quanto maior a endogamia na população, menor o tamanho efetivo da população.
Representamos o coeficiente de endogamia pela letra F. Ele corresponde ao percentual provável de genes homozigotos que um indivíduo apresenta a mais que os outros indivíduos, pelo fato de seus pais serem parentes. A endogamia é muito utilizada para fixar características dentro de cada raça, e garantir a uniformidade no padrão racial. Além disso, é utilizada para formação de raças e linhagens. 
Quando pensamos em endogamia, precisamos levar em consideração algumas consequências que podem ocorrer pelos acasalamentos entre parentes. Claramente, os produtores querem fixar as características de interesse econômico, porém, ao acasalarmos indivíduos parentes, a probabilidade de se expressarem, no fenótipo, doenças genéticas de caráter recessivo aumenta, pelo aumento da frequência de genes idênticos. Normalmente, os genes deletérios são expressos em homozigose recessiva.
Além disso, a frequência genotípica é alterada, pois aumenta-se o número de indivíduos homozigotos e diminui-se o número de heterozigotos, levando a uma menor variabilidade genética entre os animais. Para minimizar problemas com os acasalamentos endogâmicos, utilizam-se estratégias de seleção e de endogamia nos acasalamentos, para que, dessa forma, haja um equilíbrio entre a fixação de características de interesse econômico e o surgimento de doenças genéticas com caráter recessivo.
O coeficiente de endogamia (F), varia de 0 a 1, ou de 0% a 100%. Se F = 30%, significa que 30% dos loci do indivíduo são homozigotos, devido ao grau de parentesco entre seus pais. Para o cálculo do coeficiente de endogamia, pode-se utilizar o método de passagem ou o método tabular, semelhantemente ao grau de parentesco. 
O coeficiente de endogamia (Fx) com método de passagem é calculado pela fórmula da Equação (4):
· n = número de passagens gênicas (caminhos) que vai de um dos pais do indivíduo x até o ancestral comum;
· bullet
n’ = número de passagens gênicas (caminhos) que vai do ancestral comum até o outro pai de x.
EXOGAMIA
Já vimos que a endogamia é o acasalamento entre indivíduos mais aparentados, agora se em uma propriedade ocorre o cruzamento entre indivíduos menos aparentados, como denominamos a situação e como proceder? Nesse caso, estamos falando da exogamia. A exogamia também é uma estratégia para o melhoramento genético baseado no parentesco, só que, nesse caso, são acasalamentos entre indivíduos menos aparentados do que a média da população a que pertencem.
Na exogamia, utilizamos o cruzamento como estratégia de seleção e melhoramento genético. O cruzamento é o acasalamento entre indivíduos de raças diferentes ou linhagens diferentes, e essas raças podem ser puras ou compostas.
Os tipos de cruzamentos são: cruzamento industrial, cruzamento rotacionado e o cruzamento contínuo. Para se escolher o tipo de cruzamento, deve-se levar em consideração o objetivo do cruzamento.
CURIOSIDADE
Será que também podemos chamar de cruzamento, o acasalamento entre espécies diferentes, como é comum nos equídeos (quando há o cruzamento do jumento (Equus asinus) com a égua (Equus caballus), para formação das mulas e burros)? Frequentemente, vocês podem ouvir a definição de cruzamento também aplicada para espécies distintas; porém, o termo correto é hibridização, pois ao cruzar espécies diferentes formam-se híbridos. 
A exogamia leva ao aumento da heterozigose, ao contrário da endogamia (que leva ao aumento da homozigose). A heterozigose ocorre quando os alelos de um determinado lócus são diferentes e possuem funções distintas. É a probabilidade de que os alelos de um determinado lócus deem origem a raças ou linhagens diferentes. 
Com a exogamia e a heterozigose há o mascaramento dos alelos recessivos que, normalmente, ficam na forma heterozigota. Dessa forma, os genes deletérios de caráter homozigoto recessivo ficam mascarados, pois para serem expressos no fenótipo precisariam estar na forma de homozigoto recessivo.Quando o alelo recessivo fica mascarado, isso dificulta a seleção contra o alelo recessivo. Somente é possível observar a presença dos alelos recessivos em testes genéticos. 
Por outro lado, a exogamia fixa características influenciadas por um alto grau de dominância, levando a um ganho no valor da combinação gênica ao ser feito o cruzamento. Esse ganho é denominado vigor híbrido ou heterose.
A heterose é calculada em termos de porcentagem (H%) e mensura a superioridade do desempenho médio da primeira geração (F1) em relação ao desempenho médio das raças ou linhagens parentais, ou seja, a diferença do desempenho entre a média dos pais e da progênie. O valor da heterose pode ser individual, materna ou paterna e pode apresentar valores positivos, negativos ou nulos. Dessa forma, pela identificação do grau parentesco, seja para endogamia, seja para exogamia, são feitas as estratégias de seleção e melhoramento genético em um rebanho. 
SINTETIZANDO
Os polimorfismos genéticos são responsáveis por individualizar cada animal. Percebemos que, dentro da mesma espécie, os animais apresentam muitas características semelhantes, e realmente a sequência de bases nitrogenadas do DNA são semelhantes. O que, porém, caracteriza cada indivíduo são as mutações e os polimorfismos genéticos. 
Os polimorfismos são alterações nas bases nitrogenadas do DNA que originam vários alelos e ocorrem com frequência maior que 1% na população. Existem vários tipos de polimorfismos, mas os mais estudados são os polimorfismos de microssatélites ou STR, os polimorfismos de nucleotídeos únicos ou SNP e os polimorfismos de inserção e deleção ou INDEL. Independentemente do tipo de polimorfismo, cada um é utilizado em testes genéticos para caracterização dos indivíduos, testes de paternidade, análise do DNA etc. 
Para descobrir qual sequência de bases nitrogenadas do DNA é responsável por expressar, no fenótipo, uma característica de interesse econômico, ou para realizar testes de paternidade e encontrar os polimorfismos genético, são utilizadas as técnicas de análise molecular. Para dar início às técnicas, é necessário coletar o material que será analisado. Qualquer material biológico pode ser utilizado, como sangue, bulbo capilar, ossos, pele, fezes, muco etc. 
Existem várias técnicas de análise molecular, que vão variar conforme o objetivo de cada laboratório e do produtor. No entanto, independentemente da técnica, as amostras são coletadas e inicia-se o processo de extração do DNA, que é feito por protocolos e/
ou kits comerciais. Após o DNA ser extraído, iniciam-se as análises propriamente ditas, e as mais frequentes são as reações em cadeia da polimerase, ou PCR, a eletroforese e o sequenciamento do DNA.
Todos os estudos com base na genética, os polimorfismos e as análises moleculares visam ao melhoramento genético da população e ao melhoramento das características de interesse econômico individual. Para isso, uma outra técnica utilizada, em termos de fenótipo, é a investigação de parentesco. Nessa investigação, utilizam-se estratégias para encontrar animais com níveis de parentesco. Para isso, calcula-se a probabilidade de um indivíduo apresentar ancestrais comuns. Além do grau de parentesco, dependendo do objetivo da criação, são feitas análises de endogamia e exogamia.